CN102212512B - 一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇化葡激酶突变体,是将野生型葡激酶的71-87位氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变,将其替换为半胱氨酸,在大肠杆菌高效表达,色谱层析纯化出葡激酶突变体,然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰,得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。所制备的聚乙二醇化葡激酶突变体的免疫原性显著下降,体内血浆半衰期显著延长,药效更持久,溶解血栓的纤溶活性基本得到保留,可以作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用,属于生命科学技术领域。
背景技术
天然葡激酶(staphylokinase,Sak)是来源于金黄色葡萄球菌的一种蛋白质,由136个氨基酸组成。Sak是一“间接型”纤溶酶原激活剂,它不能直接使纤溶酶原(Plg)转变为纤溶酶(plasmin,Plm),而是先与纤溶酶原按1∶1比例结合形成无活性的复合物Sak·plg,在少量纤溶酶启动下,纤溶酶原活性部位暴露,由单链变为双链的纤溶酶,形成活性Sak·plm复合物,后者进一步激活纤溶酶原分子,使之转变为纤溶酶,纤溶酶溶解血栓基质纤维蛋白从而溶解血栓。在血浆中,Sak·plm很快被α2-抗纤溶酶抑制,不激活纤溶系统;有血栓存在时Sak·plm复合物与血栓中的纤维蛋白结合,α2-抗纤溶酶对Sak·plm复合物的抑制速度会下降100倍。临床研究结果表明,它与美国治疗急性心肌梗塞的标准溶栓药物阿特普酶有等同的溶栓疗效,且葡激酶激活纤溶酶原的纤维蛋白特异性更强(Collen D.et al.Nature Medicine.4.279-284(1998))。
尽管葡激酶在临床上表现出诸多优点,但是它还存在明显的缺点。葡激酶是异体蛋白,在人体内会产生免疫反应,产生高滴度的中和抗体,甚至会发生超敏反应。因此,降低葡激酶的免疫原性,已经成为将其广泛应用于临床亟待解决的问题。研究表明,Sak存在三个互不重叠的B细胞抗原决定簇,抗原表位1包括K74,E75,R77,抗原表位3包括K35,E38,E80,D82,抗原表位2尚无具体定位,可能包括一些与二聚体形成相关的氨基酸。Petra A.M.等对SakSTAR的T细胞表位进行了分析,筛选得到了6个不同的免疫原性区域,其中Sak的71-87氨基酸序列(C3区)可刺激90%的T淋巴细胞克隆的特异性增殖(Warmerdam P.A.,et al.J.Immunol.,2002,168:155-161)。进一步研究发现C3区肽段包含S1(72-82)和S2(75-85)二个重叠的T细胞表位序列,其中Y73、F76位氨基酸分别为两个表位的关键氨基酸,将它们替换为A,则肽段S1、S2与HLA-DR的结合能力下降。以上研究结果表明,C3区段是B细胞抗原表位和T细胞抗原表位非常集中的区域。对蛋白质的关键性抗原表位进行聚乙二醇定点修饰,既可以去除B细胞抗原表位,也可以去除T细胞抗原表位,可以显著降低蛋白质的免疫原性,并且可以延长蛋白质药物的体内半衰期。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇化葡激酶突变体及其制备方法。
本发明的目的还在于提供一种所述聚乙二醇化葡激酶突变体作为血栓栓塞性疾病溶栓治疗药物的应用。
本发明的构思是这样的:本发明选择葡激酶71-87位氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变,将其替换为半胱氨酸(简写为C),然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对此半胱氨酸进行定点修饰,希望对该位点进行的聚乙二醇修饰能够综合破坏这个区段内的T、B细胞表位,所构建的聚乙二醇化葡激酶突变体的免疫原性大大降低,并延长其在体内的血浆半衰期,同时保留其溶解血栓的纤溶活性。所选择的突变氨基酸包括第74位赖氨酸(简写为K74)、第75位的谷氨酸(简写为E75)、第77位精氨酸(简写为R77)、第80位的谷氨酸(简写为E80)和第82位天冬氨酸(简写为D82)。
具体地,本发明设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)是将野生型Sak的K74替换为半胱氨酸(简写为C)后,再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇(简写为P5)对葡激酶突变体Sak(K74C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经纯化后得到的产物,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。
本发明设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C-SP5)是将野生型Sak的E75替换为半胱氨酸(简写为C)后,再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇(简写为P5)对葡激酶突变体Sak(E75C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经纯化后得到的产物,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。
本发明设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(R77C-SP5)是将野生型Sak的R77替换为半胱氨酸后,再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(R77C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经纯化后得到的产物,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。
本发明设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)分别是将野生型Sak的E80替换为半胱氨酸后,再用分子量为5000和10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(E80C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经纯化后得到的产物,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。
本发明设计的突变体Sak(D82C-SP5)是将野生型Sak的D82替换为半胱氨酸后,再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(D82C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经纯化后得到的产物,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。
本发明所述的聚乙二醇化的葡激酶突变体的制备方法包括以下步骤:
(1)本发明选择K74、E75、R77、E80和D82作为突变位点,使用基因工程方法分别将它们突变为半胱氨酸后,经过表达和纯化后得到葡激酶突变体,再用分子量为5000或10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)中的半胱氨酸进行定点修饰,经过纯化后得到聚乙二醇化葡激酶突变体,聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连;与野生型葡激酶相比,所构建聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)的免疫原性显著降低,纤溶活性基本保留,体内的血浆半衰期明显延长;
(2)根据步骤(1)设计Sak突变体的突变引物,并以野生型Sak的表达质粒pBV-Sak为模板,使用突变引物进行PCR扩增,直接得到表达质粒,并转化感受态大肠杆菌DH5α,转化产物涂布在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆;使用质粒提取试剂盒提取阳性克隆的质粒DNA,核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变;
(3)Sak突变体的表达质粒转化宿主细胞得到各个突变体的工程菌,所使用的细胞为大肠杆菌,菌株可以是DH5α、JF1125、JM109或BL21;通过升高培养温度(达到42℃)可以诱导Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)基因的表达,表达产物以胞内可溶性蛋白的形式存在;
(4)发酵技术:以M9CA培养基培养Sak突变体工程菌,pH=6.5-7.5,温度37℃时,培养菌体,在42℃时诱导表达目的蛋白;
(5)Sak突变体工程菌发酵后,离心收集菌体,重悬后超声破碎菌体,离心并收集上清液,用色谱法纯化产品,色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱和阴离子交换色谱,得到高纯度的葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C);
(6)根据葡激酶突变体浓度,加入20倍摩尔量的二硫苏糖醇(DTT),37℃水浴反应1.5小时后,凝胶过滤色谱除去未反应的二硫苏糖醇;用0.1M的乙酸或氢氧化钠将浓度为100μM的葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)溶液的pH调整到5.0-7.5,加入修饰剂分子量为5000或10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇,室温反应1小时;用色谱法纯化产品,色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱,得到高纯度的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)。
(7)与野生型Sak性质比较表明,聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)和Sak(D82C-SP5)纤溶活性略有降低,Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)纤溶活性稍有增高;将野生型Sak及聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)免疫Balb/c小鼠,测定小鼠体内的IgG抗体水平,发现聚乙二醇定点修饰的突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)所诱导产生的特异性抗体滴度显著下降(p<0.05);新西兰兔体内的药代动力学研究发现,聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)的体内半衰期与野生型Sak相比显著延长(p<0.05)。
实验结果表明,与野生型Sak相比,聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)的免疫原性显著降低,但是溶解血栓的纤溶活性却得到了保留,同时,血浆半衰期得到了延长,药效更持久,可以作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物使用。
本发明取得的有益效果如下:本发明的技术方案提供了对葡激酶分子中抗原表位较为集中的区域71-87内氨基酸进行定点突变和聚乙二醇定点修饰的方法以及聚乙二醇化葡激酶突变体制备的工艺,所得到的聚乙二醇化葡激酶突变体纯度和产率均较高,易于工业化生产;本发明所提供的聚乙二醇化葡激酶突变体具有免疫原性显著下降,体内血浆半衰期显著延长,药效更持久,溶解血栓的纤溶活性得到保留的特点,可以作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物使用。
附图说明
图1为野生型Sak、Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和Sak(D82C-SP5)在Balb/c小鼠体内诱导的特异性抗体滴度随时间变化图(n=5)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1
1、葡激酶突变体Sak(K74C)基因及原核表达质粒的构建
应用基于PCR反应原理的定点突变技术,以含野生型Sak基因的表达质粒载体pBV-Sak为模板,利用完全互补的含突变碱基的引物扩增表达载体,然后用Dpn I酶切消化甲基化的模板DNA(PCR产物的线性载体不含甲基化位点,因而不被Dpn I酶消化)后,直接转化处于感受态的大肠杆菌DH5α(由常规分子生物学方法制备),重组子接种含有50-100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养,使用质粒提取试剂盒(北京鼎国生物技术公司)提取阳性克隆的质粒DNA。经酶切鉴定和核苷酸序列分析证实已发生设计的突变,序列分析由北京华大基因生物技术公司完成。
所述寡核苷酸突变引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
所述寡核苷酸突变引物的序列如下:
Sak(K74C):
引物1:GCGACAGCATATTGTGAGTTTAGAGTAG
引物2:CTACTCTAAACTCACAATATGCTGTCGC
用上述筛选得到的突变质粒分别转化大肠杆菌DH5α、JF1125、JM109、BL21,含有50-100mg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选得到工程菌单克隆,单克隆接种摇瓶中的M9CA(Na2HPO4,KH2PO4,NaCl,MgSO4,葡萄糖,酪蛋白水解物)液体培养基,首先在37℃培养,后经升温到42℃诱导表达。15%SDS-PAGE分析表达产物,经考马斯亮兰染色,可见诱导后细菌裂解液在分子量约15.5kD处有一浓集条带,选择表达量高的克隆作为工程菌。取部分细菌裂解液滴于纤维蛋白凝胶平板的小孔中,37℃孵育数小时,有明显的溶圈,可见表达产物具有纤溶活性。菌体经超声破碎后,SDS-PAGE分析结果显示,突变体表达产物的15.5kD条带主要位于上清中,说明突变体的表达产物以胞内可溶形式存在。
2、工程菌的诱导表达
将摇瓶筛选Sak(K74C)的高表达菌株作为工程菌,然后以2L发酵摇瓶于M9CA中进行低密度发酵,培养基pH6.9,37℃培养菌体,42℃诱导3小时,离心收集菌体,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,-70℃保存待用。2L发酵液得菌体15g左右,湿菌用PBS缓冲液按1∶20(W/V)重悬,超声波破碎仪破碎,功率400W,每次20min循环破碎,共破碎3次。显微镜镜检确定细胞破碎完全。细胞裂解液离心后收集上清。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,DH5α、JF1125、JM109、BL21均可高效表达Sak(K74C),Sak(K74C)的表达量约占菌体蛋白总量的40%~50%;
3、重组蛋白的分离纯化
SP-Sepharose FF层析柱(5.0×30cm)先用10倍柱床体积0.02mol/LpH5.6NaAc-HAc缓冲液平衡。将步骤2收集的上清液加入层析柱,上样完成后,以0.02mol/L pH 5.6NaAc-HAc洗脱至基线,以含0-1mol/L NaCl梯度的0.02mol/L pH 5.6NaAc-HAc缓冲液进行连续梯度洗脱,分部收集洗脱组分,15%SDS-PAGE鉴定目的蛋白分布,合并含目的蛋白收集液。
用10倍柱床体积0.01mol/L磷酸钠(pH8.5)缓冲液平衡Sephadex G-50层析柱(2.5×100cm),将含目的蛋白SP柱收集液加入层析柱,0.01mol/L磷酸钠(pH8.5)缓冲液洗脱。分部收集洗脱组分,15%SDS-PAGE鉴定目的蛋白分布,合并含目的蛋白收集液。
Q-Sepharose FF层析柱(2.5×30cm)上样前,先用10倍柱床体积0.01mol/L磷酸钠(pH8.5)缓冲液平衡;将含目的蛋白的Sephadex G-50柱收集液加入层析柱中,0.01mol/L磷酸钠(pH8.5)缓冲液洗脱至基线,以含0-1mol/L NaCl梯度的0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5)进行连续梯度洗脱,收集含目的蛋白质的组分;层析过程中HD-4电脑核酸蛋白监测仪监测蛋白峰,SDS-PAGE分析收集组分目的蛋白分布,合并含目的蛋白的收集液。并以Bradford法(蛋白定量试剂盒II)测定蛋白浓度。
蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示,Sak(K74C)上样量为10μg时呈现单带,未见杂质蛋白条带;反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析结果显示其纯度达到97.8%;纤维蛋白平板溶圈法测定纯化过程中葡激酶突变体在各个纯化组分中的纤溶活性,主要过程如下:琼脂糖溶于0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4),加热溶解,冷却至60℃后与纤维蛋白原和凝血酶溶液混合,加入NaN3和纤溶酶原,混匀,浇灌于平板上。凝胶形成后用打孔器打直径3-4mm小孔。在各孔中加等体积葡激酶标准品或样品,37℃湿盒保温过夜。测定各孔溶圈直径,以标准品(购自中国药品生物制品检验检定所)活性的对数和溶圈直径的对数作标准曲线,计算样品的活性单位。结果表明纯化过程中葡激酶突变体Sak(K74C)纤溶活性收率达到45%。
4、突变体Sak(K74C)的聚乙二醇修饰
根据Sak(K74C)浓度,加入20倍摩尔量的二硫苏糖醇(DTT),37℃水浴,反应1.5小时。上样前用10倍柱体积的0.02mol/L NaAC-HAC缓冲液(PH5.6)平衡Sephadex G-50层析柱(2.5×30cm),将上述反应完成后的样品以3ml/min速度上Sephadex G-50层析柱,用0.02mol/L NaAC-HAC(PH=5.6)的缓冲液洗脱,分部收集洗脱组分,15%SDS-PAGE鉴定目的蛋白分布。将含葡激酶的收集液调浓度为100μmol/L,PH调到7.4,加入10倍摩尔量的修饰剂甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇(MAL-PEG,分子量为5000,购自北京凯正生物工程发展有限责任公司)室温下反应1小时。上样前用10倍柱体积的0.02mol/L NaAC-HAC缓冲液(PH5.6)平衡SP-Sepharose FF层析柱(1.0×10cm),将上述反应完成后的样品调PH值5.6后,加样SP-Sepharose FF层析柱,0.02mol/L NaAc-HAc(PH5.6)洗脱至基线,以含0-1mol/L NaCl梯度的0.02mol/LNaAc-HAc缓冲液(PH5.6)进行连续梯度洗脱,分部收集洗脱组分,15%SDS-PAGE鉴定目的蛋白分布,合并含目的蛋白收集液。用10倍柱体积的0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡Sephadex G-75层析柱(2.5×100cm),将上述0.16mol/L NaCL洗脱下的样品上样Sephadex G-75层析柱,用0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱,分部收集洗脱组分;用0.22μm的滤膜过滤除菌,分装,冻干,-80℃保存。
冻干的Sak(K74C-SP5)蛋白样品进行15%SDS-PAGE,考马斯亮兰R-250染色,上样10μg蛋白为单带,分子量大约30kD;RP-HPLC分析纯度达到97.5%;纤维蛋白平板溶圈法测定葡激酶突变体的纤溶活性,聚乙二醇修饰和纯化过程中Sak(K74C-SP5)纤溶活性收率达到82%。
5、聚乙二醇化葡激酶突变体纤溶活性的测定
纤维蛋白平板溶圈法测定葡激酶突变体的纤溶活性,以Bradford法(蛋白定量试剂盒II)测定蛋白浓度,计算可知,野生型葡激酶的比活性为9.4×104HU/mg,Sak(K74C-SP5)的比活性为8.8×104HU/mg,基本保留了野生型葡激酶的纤溶活性。
6、野生型Sak和Sak(K74C)诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力10只6-8周的Balb/c小鼠随机分成2组,每组5只。采用皮下注射的方法分别注射(10μg/200μl)野生型Sak和Sak(K74C-SP5),初次免疫记为第0天,以后每隔14天免疫一次,一共免疫4次,每次免疫后第10天取血,将制备好的血清分装,-20℃保存。
间接ELISA法分析野生型Sak和Sak(K74C-SP5)在小鼠体内的抗体水平:将野生型Sak和Sak(K74C-SP5)样品用包被缓冲液稀释至10μg/ml,100μl/孔包被酶标板(每一样品包被3个复孔),4℃湿盒过夜,含0.5%吐温-20的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4,简称PBST)洗涤3次。每孔中分别加入封闭液(1%BSA溶液)100μl,37℃湿盒温育2小时,PBST洗涤3次。用PBS将阴性小鼠血清以及野生型Sak和Sak(K74C-SP5)免疫后的小鼠血清分别稀释250~100000倍,加入对应的包被了野生型Sak和Sak(K74C-SP5)的孔中(100μl/孔),37℃湿盒温育1小时,PBST洗涤3次。每孔分别加入1∶4000稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG 100μl,37℃湿盒温育1h,PBST洗涤3次。加入TMB-过氧化氢溶液100μl,避光显色15min,加入终止液50μl终止反应,在酶标仪上检测OD450值,确定抗原诱导的抗体滴度。大于或者等于阴性对照孔OD450值2倍的确定为阳性,低于阴性对照孔OD450值2倍的确定为阴性。
结果如附图1所示,与野生型Sak诱导的抗体滴度(滴度为80000)对比,突变体Sak(K74C-SP5)所诱导特异性抗体滴度(滴度为16000)显著下降(p<0.05)。
7、野生型Sak及其聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学
药代动力学实验在新西兰兔体内进行,耳缘静脉2%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉,静脉内500μg/kg野生型Sak和Sak(K74C-SP5)注射给药,分别于给药后1、2.5、5、10、15、20、30、45、60、90min股动脉插管取血,取血后立即以8000rpm离心5min,离心后血浆立即置于-40℃冰箱保存。
血浆中Sak和Sak(K74C-SP5)浓度采用双抗体夹心ELISA法分析:将鼠源野生型Sak多克隆抗体(由石家庄赛尔生物技术有限公司制备)用包被缓冲液稀释至10μg/ml,100μl/孔包被酶标板(每一样品包被3个复孔),4℃湿盒过夜,PBST洗涤3次;每孔中分别加入封闭液(1%BSA溶液)100μl,37℃湿盒温育2h,PBST洗涤3次;用PBS将适当稀释的兔血浆和葡激酶标准品加入对应的包被了多克隆抗体的孔中(100μl/孔),37℃湿盒温育1h,PBST洗涤3次(3min/次);每孔分别加入1∶3000稀释的HRP标记的兔源野生型Sak多克隆抗体(由石家庄赛尔生物技术有限公司制备)100μl,37℃湿盒温育1h,PBST洗涤3次;加入TMB-过氧化氢溶液100μl,避光显色15min,加入终止液50μl终止反应,在酶标仪上检测OD450值。根据葡激酶标准品浓度与OD450值之间的关系,计算血浆样品中野生型Sak和Sak(K74C-SP5)的浓度;
根据给药后不同时间血药浓度的测定数据,采用中国药理学会数学专业委员会编制的3p87药代动力学软件在微机上拟合药物浓度-时间曲线,计算药代动力学参数。结果表明,野生型Sak的血浆分布半衰期(t1/2α)为3.2min,血浆清除率为13±0.3ml/min;而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)的t1/2α为7.5min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为6.2±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05)。
实施例2
1、葡激酶突变体Sak(E75C)基因及原核表达质粒的构建
葡激酶突变体Sak(E75C)原核表达质粒的构建过程与Sak(K74C)基本相同,不同的地方仅是PCR扩增引物的差异,Sak(E75C)所用的PCR扩增引物为:
Sak(E75C):
引物1:GCGACAGCATATAAATGTTTTAGAGTAGTTG
引物2:CAACTACTCTAAAACATTTATATGCTGTCGC
Sak(E75C)的DH5α、JF1125、JM109、BL21工程菌单克隆筛选过程与Sak(K74C)相同,其表达产物同样以胞内可溶形式存在。
2、工程菌的诱导表达
将摇瓶筛选Sak(E75C)的高表达菌株作为工程菌,然后以2L发酵摇瓶于M9CA中进行低密度发酵,37℃培养菌体,42℃温度诱导3小时,离心收集菌体,PBS洗涤后,-70℃保存待用。2L发酵液得菌体15g左右,湿菌用PBS缓冲液按1∶20(W/V)重悬,超声波破碎仪破碎,功率400W,每次20min循环破碎,共破碎3次。显微镜镜检确定细胞破碎完全。细胞裂解液离心后收集上清。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,DH5α、JF1125、JM109、BL21均可高效表达Sak(E75C),Sak(E75C)的表达量约占菌体蛋白总量的40%~50%;
3、Sak(E75C)重组蛋白的分离纯化
Sak(E75C)的分离纯化过程与Sak(K74C)相同,蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示,Sak(E75C)上样量为10μg时呈现单带,未见杂质蛋白条带;RP-HPLC分析结果显示其纯度达到97.1%;纯化过程中葡激酶突变体Sak(E75C)纤溶活性收率达到47%;
4、Sak(E75C)的聚乙二醇修饰
Sak(E75C)的聚乙二醇修饰和产物纯化过程与Sak(K74C-SP5)相同,冻干的Sak(E75C-SP5)蛋白样品进行15%SDS-PAGE,考马斯亮兰R-250染色,上样10μg蛋白为单带,分子量大约30kD,未见杂质蛋白的条带;冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0mg/ml,RP-HPLC分析纯度达到97.7%;聚乙二醇修饰和纯化过程中Sak(E75C-SP5)纤溶活性收率达到81%。
5、Sak(E75C-SP5)的纤溶活性测定
Sak(E75C-SP5)的生物活性测定方法与Sak(K74C-SP5)相同,计算结果表明,野生型葡激酶的比活性为9.4×104HU/mg,Sak(E75C-SP5)的比活性为7.5×104HU/mg,基本保留了野生型葡激酶的纤溶活性。
6、Sak(E75C-SP5)诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力
Sak(E75C-SP5)免疫Balb/c小鼠过程和诱导的抗体滴度测定方法与Sak(K74C-SP5)相同;结果如附图1所示,与野生型Sak诱导的抗体滴度(滴度为80000)对比,突变体Sak(E75C-SP5)所诱导产生的特异性抗体滴度(滴度为20000)显著下降(p<0.05)。
7、聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学
Sak(E75C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学实验方法、血浆中Sak(E75C-SP5)浓度测定方法和药代动力学参数计算方法均与Sak(K74C-SP5)使用的方法相同。研究结果表明,野生型Sak的血浆分布半衰期(t1/2α)为3.2min,血浆清除率为13±0.3ml/min;而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C-SP5)的t1/2α为7.8min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为6.2±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05)。
实施例3
1、葡激酶突变体Sak(R77C)基因及原核表达质粒的构建
葡激酶突变体Sak(R77C)原核表达质粒的构建过程与Sak(K74C)基本相同,不同的地方仅是PCR扩增引物的差异,Sak(R77C)所用的PCR扩增引物为:
Sak(R77C):
引物1:GCATATAAAGAGTTTTGTGTAGTTGAATTAGATC
引物2:GATCTAATTCAACTACACAAAACTCTTTATATGC
Sak(R77C)的DH5α、JF1125、JM109、BL21工程菌单克隆筛选过程与Sak(K74C)相同,其表达产物同样以胞内可溶形式存在。
2、工程菌的诱导表达
将摇瓶筛选Sak(R77C)的高表达菌株作为工程菌,然后以2L发酵摇瓶于M9CA中进行低密度发酵,37℃培养菌体,42℃温度诱导3小时,离心收集菌体,PBS洗涤后,-70℃保存待用。2L发酵液得菌体15g左右,湿菌用PBS缓冲液按1∶20(W/V)重悬,超声波破碎仪破碎,功率400W,每次20min循环破碎,共破碎3次。显微镜镜检确定细胞破碎完全。细胞裂解液离心后收集上清。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,DH5α、JF1125、JM109、BL21均可高效表达Sak(R77C),Sak(R77C)的表达量约占菌体蛋白总量的40%~50%;
3、Sak(R77C)重组蛋白的分离纯化
Sak(R77C)的分离纯化过程与Sak(K74C)相同,蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示,Sak(R77C)上样量为10μg时呈现单带,未见杂质蛋白条带;RP-HPLC分析结果显示其纯度达到97.2%;纯化过程中Sak(R77C)纤溶活性收率达到49%。
4、Sak(R77C)的聚乙二醇修饰
Sak(R77C)的聚乙二醇修饰和产物纯化过程与Sak(K74C-SP5)相同,冻干的Sak(R77C-SP5)蛋白样品进行15%SDS-PAGE,考马斯亮兰R-250染色,上样10μg蛋白为单带,分子量大约30kD,未见杂质蛋白的条带;冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0mg/ml,RP-HPLC分析纯度达到97.3%;聚乙二醇修饰和纯化过程Sak(R77C-SP5)纤溶活性收率达到74%。
5、Sak(R77C-SP5)的纤溶活性测定
Sak(R77C-SP5)的生物活性测定方法与Sak(K74C-SP5)相同,计算结果表明,野生型葡激酶的比活性为9.4×104HU/mg,Sak(R77C-SP5)的比活性为7.0×104HU/mg,基本保留了野生型葡激酶的纤溶活性。
6、Sak(R77C-SP5)诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力
Sak(R77C-SP5)免疫Balb/c小鼠过程和诱导的抗体滴度测定方法与Sak(K74C-SP5)相同;结果如附图1所示,与野生型Sak诱导的抗体滴度(滴度为80000)对比,突变体Sak(R77C-SP5)所诱导产生的特异性抗体滴度(滴度为20000)显著下降(p<0.05)。
7、聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(R77C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学
Sak(R77C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学实验方法、血浆中Sak(R77C-SP5)浓度测定方法和药代动力学参数计算方法均与Sak(K74C-SP5)使用的方法相同。研究结果表明,野生型Sak的血浆分布半衰期(t1/2α)为3.2min,血浆清除率为13±0.3ml/min;而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(R77C-SP5)的t1/2α为7.6min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为6.3±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05)。
实施例4
1、葡激酶突变体Sak(E80C)基因及原核表达质粒的构建
葡激酶突变体Sak(E80C)原核表达质粒的构建过程与Sak(K74C)相同,不同的地方仅是PCR扩增引物的差异,Sak(E80C)所用的PCR扩增引物为:
引物1:GAGTTTAGAGTAGTTTGTTTAGATCCAAGCG
引物2:CGCTTGGATCTAAACAAACTACTCTAAACTC
Sak(E80C)的DH5α、JF1125、JM109、BL21工程菌单克隆筛选过程与Sak(K74C)相同,其表达产物同样以胞内可溶形式存在。
2、工程菌的诱导表达
将摇瓶筛选的Sak(E80C)高表达菌株作为工程菌,然后以2L发酵摇瓶于M9CA中进行低密度发酵,37℃培养菌体,42℃温度诱导3小时,离心收集菌体,PBS洗涤后,-70℃保存待用。2L发酵液得菌体15g左右,湿菌用PBS缓冲液按1∶20(W/V)重悬,超声波破碎仪破碎,功率400W,每次20min循环破碎,共破碎3次。显微镜镜检确定细胞破碎完全。细胞裂解液离心后收集上清。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,DH5α、JF1125、JM109、BL21均可高效表达Sak(E80C),Sak(E80C)的表达量约占菌体蛋白总量的40%~50%;
3、Sak(E80C)重组蛋白的分离纯化
Sak(E80C)的分离纯化过程与Sak(K74C)相同,蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示,Sak(E80C)上样量为10μg时呈现单带,未见杂质蛋白条带;RP-HPLC分析结果显示其纯度达到97.9%;纯化过程中Sak(E80C)纤溶活性收率达到51%。
4、Sak(E80C)的聚乙二醇修饰
Sak(E80C)的聚乙二醇修饰过程与Sak(K74C-SP5)相同,不同的地方是除使用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇进行聚乙二醇修饰外,还使用分子量为10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对Sak(E80C)进行聚乙二醇修饰,得到的两种聚乙二醇化葡激酶突变体分别为Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)。纯化后冻干的Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)样品分别进行15%SDS-PAGE分析,考马斯亮兰R-250染色,上样10μg蛋白均呈现单带,分子量大约30kD,未见杂质蛋白条带;Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)样品复溶后稀释为1.0mg/ml,RP-HPLC分析显示Sak(E80C-SP5)纯度达到98.1%,Sak(E80C-SP10)纯度达到97.9%;Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)聚乙二醇修饰过程中纤溶活性收率分别达到85%和87%。
5、Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)的纤溶活性测定
Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP 10)的生物活性测定方法与Sak(K74C-SP5)相同,计算结果表明,野生型葡激酶的比活性为9.4×104HU/mg,Sak(E80C-SP 5)的比活性为11.1×104HU/mg,Sak(E80C-SP10)的比活性为10.1×104HU/mg,两种产物的纤溶活性比野生型葡激酶均略有升高。
6、Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力
Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)免疫Balb/c小鼠过程和所诱导的抗体滴度测定方法均与Sak(K74C-SP5)相同;结果如附图1所示,与野生型Sak诱导的抗体滴度(滴度为80000)对比,突变体Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)所诱导产生的特异性抗体滴度均显著下降(p<0.05),诱导的特异性抗体滴度均是16000。
7、聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)在新西兰兔体内的药代动力学
Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)体内药代动力学实验方法、血浆中蛋白质浓度测定方法以及药代动力学参数计算方法均与Sak(K74C-SP5)使用的方法相同。研究结果表明,野生型Sak的血浆分布半衰期(t1/2α)为3.2min,血浆清除率为13±0.3ml/min;而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)的t1/2α为7.9min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为6.1±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05);聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP10)的t1/2α为10.2min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为4.1±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05)。
实施例5
1、葡激酶突变体Sak(D82C)基因及原核表达质粒的构建
葡激酶突变体Sak(D82C)原核表达质粒的构建过程与Sak(K74C)相同,不同的地方仅是PCR扩增引物的差异,Sak(D82C)所用的PCR扩增引物为:
引物1:GAGTAGTTGAATTATGTCCAAGCGCAAAGATC
引物2:GATCTTTGCGCTTGGACATAATTCAACTACTC
Sak(D82C)的DH5α、JF1125、JM109、BL21工程菌单克隆筛选过程与Sak(K74C)相同,其表达产物同样以胞内可溶形式存在。
2、工程菌的诱导表达
将摇瓶筛选Sak(D82C)的高表达菌株作为工程菌,然后以2L发酵摇瓶于M9CA中进行低密度发酵,37℃培养菌体,42℃温度诱导3小时,离心收集菌体,PBS洗涤后,-70℃保存待用。2L发酵液得菌体15g左右,湿菌用PBS缓冲液按1∶20(W/V)重悬,超声波破碎仪破碎,功率400W,每次20min循环破碎,共破碎3次。显微镜镜检确定细胞破碎完全。细胞裂解液离心后收集上清。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,DH5α、JF1125、JM109、BL21均可高效表达Sak(D82C),Sak(D82C)的表达量约占菌体蛋白总量的40%~50%。
3、Sak(D82C)重组蛋白的分离纯化
Sak(D82C)的分离纯化过程与Sak(K74C)相同,蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示,Sak(D82C)上样量为10μg时呈现单带,未见杂质蛋白条带;RP-HPLC分析结果显示其纯度达到97.5%;纯化过程中Sak(D82C)纤溶活性收率达到49%。
4、Sak(D82C)的聚乙二醇修饰
Sak(D82C)的聚乙二醇修饰和产物纯化过程均与Sak(K74C-SP5)相同,冻干的Sak(D82C-SP5)蛋白质样品进行15%SDS-PAGE,考马斯亮兰R-250染色,上样10μg蛋白为单带,分子量大约30kD,未见杂质蛋白条带;冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0mg/ml,RP-HPLC分析纯度达到98.0%;聚乙二醇修饰和纯化过程中Sak(D82C-SP5)纤溶活性收率达到86%。
5、Sak(D82C-SP5)的纤溶活性测定
Sak(D82C-SP5)的生物活性测定方法与Sak(K74C-SP5)相同,计算表明,野生型葡激酶的比活性为9.4×104HU/mg,Sak(D82C-SP5)的比活性为7.6×104HU/mg,基本保留了野生型葡激酶纤溶活性。
6、Sak(D82C-SP5)诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力
Sak(D82C-SP5)免疫Balb/c小鼠过程和所诱导的抗体滴度测定方法与Sak(K74C-SP5)相同;结果如附图1所示,与野生型Sak诱导的抗体滴度(滴度为80000)对比,突变体Sak(D82C-SP5)所诱导产生的特异性抗体滴度(滴度为24000)显著下降(p<0.05)。
7、聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(D82C-SP5)在新西兰兔体内的药代动力学
Sak(D82C-SP5)体内药代动力学实验方法、血浆中Sak(D82C-SP5)浓度测定方法和药代动力学参数计算方法均与Sak(K74C-SP5)使用的方法相同。研究结果表明,野生型Sak的血浆分布半衰期(t1/2α)为3.2min,血浆清除率为13±0.3ml/min;而Sak(D82C-SP5)的t1/2α为7.6min,血浆半衰期比野生型Sak显著延长(p<0.05),血浆清除率为6.3±0.2ml/min,血浆清除率比野生型Sak显著降低(p<0.05)。
Claims (3)
1.一种聚乙二醇化葡激酶突变体,其特征在于:聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)是将野生型Sak的E80替换为半胱氨酸,突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连,其中聚乙二醇的平均分子量分别为5000和10000。
2. 一种如权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以野生型Sak的表达质粒pBV-Sak为模板,使用突变引物进行PCR扩增,直接得到表达质粒,并转化感受态大肠杆菌DH5α,转化产物涂布在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变;
(2)Sak突变体的表达质粒转化大肠杆菌得到突变体的工程菌,通过升高培养温度诱导Sak(E80C)基因的表达,表达产物以胞内可溶性蛋白的形式存在;
(3)发酵技术:以M9CA培养基培养Sak突变体工程菌,pH=6.5-7.5,温
度37 ℃时,培养菌体,在42 ℃时诱导表达目的蛋白;
(4)Sak突变体工程菌发酵后,离心收集菌体,重悬后超声破碎菌体,离心并收集上清液,用色谱法纯化产品,色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱和阴离子交换色谱,得到高纯度的葡激酶突变体Sak(E80C);
(5)所得到的葡激酶突变体Sak(E80C)与过量的二硫苏糖醇反应后,Sephadex G-50层析柱除去未反应的二硫苏糖醇,然后,葡激酶突变体Sak(E80C)与分子量为5000或10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇室温下反应,用色谱法纯化产品,色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱,得到高纯度的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)。
3.一种如权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体在制备治疗血栓栓塞性疾病的药物中应用。
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