KR20220082035A - 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 및 백신 제조에서의 이의 용도 - Google Patents

부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 및 백신 제조에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 및 백신 제조에서의 이의 응용을 제공한다. 상기 운반체 단백질 상의 적어도 한 부위의 아미노산은 아지드기 또는 알키닐 말단기를 함유하는 비천연 아미노산으로 돌연변이된다. 본 발명의 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질은 다당류 항원과의 과도한 가교를 방지할 수 있어 다당류 단백질 결합 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.

Description

부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 및 백신 제조에서의 이의 용도
본 발명은 생물 약제학 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 및 백신 특히 폐렴 다가 결합 백신 제조에서의 이의 용도에 관한 것이다.
폐렴구균에 의한 감염은 전 셰계적으로 발병률과 사망률을 초래하는 주요 원인 중 하나이다. 폐렴, 열성 균혈증 및 뇌수막염은 침습성 폐렴구균 질환의 가장 흔한 징후이며, 호흡기관 내 세균 전파는 중이염, 부비동염 또는 재발성 기관지염을 유발할 수 있다.
단백질 운반체에 연결된 다당류를 사용하여 다당류-단백질 접합 백신을 제조하는데, 다당류와 단백질 운반체의 화학적 결합은 백신에 포함된 다당류를 표면에 표시하는 세균에 대한 면역 응답을 유도하여 질환을 예방할 수 있다. 따라서, 병원성 세균으로부터 유래된 다당류를 사용한 백신 접종은 숙주 면역력을 향상시키는 잠재적 전략이다.
다당류 자체가 면역원성이지만 다당류는 운반체 단백질에 접합하여 면역원성을 개선하는데 사용되어 왔으며, 운반체 단백질은 표적 병원체로부터 유래되고 해당 병원체의 특이적 면역 응답을 향상시키는 관련 단백질 항원, 또는 주로 보조제 또는 일반 면역 응답 자극제로서 작용하는 일반 면역원성 단백질일 수 있다.
종래의 다당류-단백질 결합 기술로, 중국 특허 ZL02159032.X에는 다당류-단백질 결합 백신의 제조 방법이 개시되었는데, 이 역시 현재 다당류 결합 백신의 제조에 있어서 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나이다. 상기 기술에서는 다당류와 단벽질을 결합하는 링커로 아디프산 디히드라지드(ADH)를 사용한다. 이러한 결합 방식은 먼저 다당류를 시아노겐 브로마이드로 활성화해야 하는 바, 즉 염기성 조건에서 시아노겐 브로마이드는 다당류 분자의 수산기에 작용하여 시아네이트 에스테르를 형성한 후, ADH와 반응하며; 시아네이트 에스테르 중 하나의 탄소-산소 결합이 끊어지고 ADH일단의 아미노기와 부가 반응이 일어나 에스테르 히드라지드(AH)기를 다당류 분자에 도입함으로써 다당류-AH 유도체를 형성하며; 다당류-AH 유도체는 카르보디이미드(EDAC)의 매개 하에 운반체 단백질과 안정적인 결합체를 형성한다. 이러한 결합 방식은 다당류와 운반체 단백질 결합의 입체 장해를 줄이고, 다당류의 항원성 에피토프를 유지하는 동시에 다당류 자체의 용해성을 방지하며, 다당류와 항혈청 반응의 부작용을 감소시키는 반면 다음과 같은 일부 단점이 존재한다. (1) 다당류-AH 유도체는 시아노겐 브로마이드로 활성화된 다당류와 계속 반응하여 다당류의 자체 중합체를 형성하므로 다당류-단백질의 결합 효율을 감소시키고; (2) EDAC는 ADH 유도체화 다당류와 운반체 단백질의 결합을 매개하는 동시에 운반체 단백질의 자가 가교를 쉽게 일으켜 다당류-단백질의 결합 효율을 감소시킨다. 따라서 다당류-단백질 결합 백신의 면역원성 및 항체 지속성은 여전히 추가로 향상시켜야 하는 바, 예를 들어 다당류 결합 백신은 3회 면역을 거쳐야 면역 효과를 발생할 수 있다. 이러한 단점으로 인해 다당류 결합 백신의 추가 발전이 제한된다.
아지드와 알킨의 Click 반응에 의한 생체 분자 시스템의 변형은 최근 연구의 인기 분야이다. Natalie W.Nairn 등은 메티오닌 결핍 박테리아를 이용하여 인터페론 β에 아지드기를 함유하는 비천연 아미노산을 도입한 후, 구리 촉매가 존재하는 Click 반응을 이용하여 단일 부위의 PEG 변형을 수행하였다(Natalie W.Narin etal,Bioconjugate Chem.2012).
최근 급속히 발전하고 있는 유전자 코드 확장 기술은 앰버 정지 코돈을 센스 코돈으로 사용하여 상응한 직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소를 도입함으로써, 설계된 비천연 아미노산을 최종적으로 단백질에 도입할 수 있으며, 비천연 아미노산의 성질에 따라 단백질에 특수한 기능을 부여할 수 있다. 지금까지 이 기술은 수십 종의 비천연 아미노산을 성공적으로 부위 지향적으로 생세포의 단백질에 발현시켰다. 관련된 비천연 아미노산에는 알키닐, 아지드 등이 포함되므로, 생체 중량에 원래 존재하지 않는 이러한 특수기(special group)를 이용하여 특이적으로 단백질에 대한 부위 지향적 변형을 수행할 수 있다. 결합 백신의 불균일한 결합 공정, 복잡한 분리 정제 공정 등 종래 기술의 문제점에 직면하여, 해당 분야에서는 임의의 부위에서 작용기를 특이적으로 변형시킬 수 있는 방법이 시급히 요구되고 있다.
CN106929482A는 부위 지향적 돌연변이를 갖는 인플루엔자 바이러스, 이의 생백신, 이의 제조 방법 및 응용을 설명하는 반면, 본 발명의 변형된 운반체 단백질 Hin47-HID는 비침습성 헤모필루스 인플루엔자를 예방할 수 있는 것으로 입증되었고, 본 발명의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 비천연 아미노산의 부위 지향적 도입을 위한 돌연변이 운반체 단백질 Hin47-HID 및 이의 부위 지향적 변형 방법을 제공하는 바, 해당 돌연변이 방법은 단백질의 특정 부위에 도입되는 비천연 아미노산인 Lys-아지도를 도입하는 것으로, 이의 독특한 아지드기는 변형제와 특이적으로 Click 반응을 일으켜 비천연 아미노산을 표적 단백질에 부위 지향적으로 커플링할 수 있다.
본 발명은 부위 지향적 돌연변이 및 부위 지향적 변형을 갖는 면역원성 조성물, 이의 제조 방법 및 그 응용에 관한 것으로, 상기 면역원성 조성물은 운반체 단백질 유전자의 특정 부위에 앰버 코돈 TAG를 도입하고, 직교된 아미노아실 tRNA 합성효소-tRNA를 이용하여 운반체 단백질의 특정 부위에 가교 성질을 갖는 비천연 아미노산 부위 지향적 돌연변이를 유발한다. 운반체 단백질과 다당류 항원 간의 상호 반응 과정에서 공유 결합이 형성되는 동시에 결합체가 비드형 상태를 나타내므로, 운반체 단백질과 다당류 항원 사이의 과도한 가교 발생을 효과적으로 피할 수 있고, 결합체 입경 분포는 현저하게 균일하며 제어 가능하여 다당류-단백질 결합 백신의 품질을 향상시키기 위한 효과적인 수단을 제공한다.
발명자들은 종래 기술에 대해 사고하고 연구한 결과, 메타노코쿠스 고세균의 tRNA(tRNAPyl) 및 피롤라이신-tRNA 합성효소(tRNAPyl/PylRS)의 단백질 번역 시스템을 이용하여 비천연 아미노산 부위를 지향적으로 단백질에 함침시켜 부위 지향적 돌연변이를 갖는 표적 펩티드 또는 HID-Hin47, Hin47-HID 또는 CRM197과 같은 단백질을 얻은 후, 상기 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질을 추가 부위 지향적 변형이 가능한 원료로 사용하여 해당 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질을 다당류와 접합시켜 단일 부위가 지향적으로 변형된 운반체 단백질의 다당류 백신을 얻었다.
이에 따라, 본 발명은 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질을 제공한다. 상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 톡신의 무독성 돌연변이체, 세균의 외막 단백질 및 세균 발현 단백질 중 1종 또는 2종 이상으로 형성된 융합 단백질로부터 선택되고, 상기 운반체 단백질에서 적어도 한 부위 상의 아미노산은 비천연 아미노산으로 돌연변이되며, 상기 비천연 아미노산은 아지드기 또는 알키닐 말단기를 함유한다.
상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 톡신의 무독성 돌연변이체 CRM197(서열번호 1), B군 수막구균 외막 단백질, 재조합 녹농균 외독소 A, 헤모필루스 인플루엔자 지단백질 HID 및 헤모필루스 인플루엔자 열충격 단백질 HIN47중 1종 또는 2종 이상으로 형성된 융합 단백질로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 운반체 단백질은 헤모필루스 인플루엔자 지단백질 HID, 융합 단백질 HIN47-HID 또는 융합 단백질 HID-HIN47로부터 선택된다.
상기 비천연 아미노산은 페닐알라닌 유도체, 티로신 유도체, 글루타민 유도체, 알라닌 유도체, 시스테인 유도체, 세린 유도체 또는 라이신 유도체이다. 바람직하게는, 상기 비천연 아미노산은 아지드기가 함유된 라이신 유도체이다. 보다 바람직하게는, 상기 비천연 아미노산은
Figure pct00001
이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 운반체 단백질은 HIN47-HID 융합 단백질이고, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 2 중 임의의 부위 상의 하나 이상의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 2에 제시된 서열의 부위 174R, 부위 217I, 부위 223N, 부위 226I, 부위 313R, 부위 315K, 부위 522K, 부위 557D, 부위 653E, 부위 684Y 또는 활성에 영향을 덜 미치는 다른 부위로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 운반체 단백질은 HID-HIN47 단백질이고, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 3 중 임의의 부위 상의 하나 이상의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 3에 제시된 서열의 부위 78K, 부위 113D, 부위 209E, 부위 240Y, 부위 527R, 부위 570I, 부위 576N, 부위 579I, 부위 666R, 부위 668K 또는 활성에 영향을 덜 미치는 다른 부위로부터 선택된다.
돌연변이 후 상기 부위 지향적 돌연변이를 갖는 단백질과 돌연변이 전 표적 단백질의 아미노산 서열의 구별점은 다음과 같다. 돌연변이 전 단백질 아미노산 서열의 N번째 아미노산은 Lys-아지도로 돌연변이되고, 상기 돌연변이 아미노산의 연결 방식은 하기 식으로 표시되며,
Figure pct00002
,
상기 식에서, 상기 N은 돌연변이 부위이고, AA는 돌연변이 부위 전후의 아미노산
Figure pct00003
이다.
본 발명은 또한 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체를 제공한다. 상기 접합체는 본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질과 알키닐 말단기가 함유되거나 변형된 분자로부터 제조되고, 상기 분자는 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물을 함유하거나, 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물의 말단 알키닐기를 변형시켜 수득된 변형체이다.
본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질과 알키닐 말단기가 함유되거나 변형된 분자는 Click 반응을 통해 제조된다. 상기 Click 반응은 1가 구리에 의해 매개되는 Click 반응이거나 사이클로옥틴 또는 이의 유도체에 의해 매개되는 무-구리 Click 반응일 수도 있다.
본 발명에 따른 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물은 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물의 말단 알키닐기의 변형체일 수 있고, 1가 구리의 촉매 작용을 통해 부위 지향적 커플링에 의해 접합체가 제조되거나, 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물은 사이클로옥틴 또는 이의 유도체를 변형기로 하는 변형체로, 부위 지향적 커플링을 직접 구현한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체, 돌연변이 전 단백질 아미노산 서열의 N번째 아미노산은 하기 구조로 돌연변이되고,
Figure pct00004
, 또는
Figure pct00005
상기 구조에서,
N은 돌연변이 부위이며, AA는 돌연변이 부위 전후의 아미노산이고,
R2는 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복실 말단 변형기이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 접합체는 당접합체이고, 상기 당접합체는 본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질과 알키닐 말단기가 함유되거나 변형된 다당류가 접합되어 형성된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 단백질과 다당류를 접합시키되, 상기 다당류:운반체 단백질의 비율(w/w)은 0.3 내지 3이다.
바람직하게는, 상기 다당류의 당 반복 단위는 10 내지 50개이고, 상기 운반체 단백질과 상기 다당류 사이에는 적어도 하나의 공유 결합이 직접 존재한다.
본 발명에 따른 다당류는 말단 알키닐기의 변형체일 수 있고, 1가 구리의 촉매 작용을 통해 부위 지향적 커플링에 의해 당접합체가 제조되거나, 다당류는 사이클로옥틴 또는 이의 유도체를 변형기로 하는 변형체로, 표적 다당류-단백질에 대한 부위 지향적 커플링을 직접 구현한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 당접합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 다당류는 피막 다당류로부터 선택되고, 예를 들어 피막 다당류는 폐렴구균의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 또는 33F 중 1종 또는 2종 이상의 조합이다.
본 발명은 또한 폐렴 다가 결합 백신을 제공한다. 상기 폐렴 다가 결합 백신은 다가 폐렴구균 다당류와 2종 이상의 본 발명에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질로 형성된다.
본 발명은 또한 백신 제조에서의 상기 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질, 상기 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체, 또는 상기 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 상기 백신은 인플루엔자 백신 또는 폐렴 백신이다.
다른 방법과 비교하여 본 발명의 이점은 하기 중 하나 이상으로 구현될 수 있다.
1. 단백질의 임의의 부위에 비천연 아미노산을 도입할 수 있어 해당 부위에만 특이적 변형이 가능한 운반체 단백질을 생성할 수 있고;
2. 비천연 아미노산의 독특한 활성기를 이용하여 고효율적이고 특이적인 변형 목적을 달성할 수 있으며;
3. 특정 부위의 변형은 특정 기능의 프로테아제 활성을 약화시키고 부작용을 감소시켜 운반체 단백질의 역할을 구현할 수 있으며;
4. 변형 조건의 최적화와 사이클로옥틴에 의해 매개되는 무-구리 Click 반응을 이용하여 고효율적이고 단백질에 무해하며 간단히 쉽게 수행할 수 있는 변형 반응을 구현할 수 있다.
도 1은 돌연변이된 단백질 Hin47-HID, click 화학 반응에 의해 수득된 다당류-단백질 결합체의 SDS-PAGE 겔 도면을 도시한다.
도 2a는 click 화학 반응에 의해 수득된 다당류-단백질 결합체의 입경 분포도를 도시한다.
도 2b는 종래의 커플링 방법에 의해 수득된 다당류-단백질 결합체의 입경 분포도를 도시한다.
도 3은 토끼에서 상이한 커플링 방식으로 수득된 3형 결합체의 3면역 Elisa 결과를 도시한다.
이하, 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예 1: 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질 발현 플라스미드의 구축
1: 돌연변이 부위의 선택
온라인 소프트웨어 phyre2를 이용하여 HID 및 HIN47의 3차원 구조를 각각 예측하였다.
융합 단백질인 HIN47-HID 및 HID-HIN47에서 각각 10개의 핵심 아미노산을 선택하고, 이러한 핵심 아미노산 부위를 교체하면 다당류를 부위 지향적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 HIN47 잔여 프로테아제 활성을 더욱 감소시킬 것으로 기대되는데, 이는 최종 다당류 결합 생성물의 안정성을 향상시키는데 유리하다. 구체적 돌연변이 부위에 대한 정보는 표 1-표 2에 나타낸 바와 같고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 2-3으로 표시되는 서열 상의 위치를 의미한다.
[표 1]
HIN47-HID 돌연변이 부위
Figure pct00006
[표 2]
HID-HIN47 돌연변이 부위
Figure pct00007
2: 발현 플라스미드의 수득
NCBI Gene Bank에서 공개한 HID 및 HIN47유전자 서열에 따라, 각각 완전한 유전자 합성을 통해 유전자의 전장 DNA 단편을 얻은 후, GGSGGS 이 6개의 아미노산 linker을 사용하여 HIN47과 HID 단백질을 각각 HIN47-linker-HID 및 HID-linker-HIN47의 서열로 pET9a 운반체에 융합시켜 구축함으로써 각각 pET9a-HIN47-HID 및 pET9a-HID-HIN47 발현 플라스미드를 수득하였다.
3: 부위 지향적 돌연변이
TransGen사의 Fast Mutagenesis System 부위 지향적 돌연변이 키트를 사용하여 지침에 따라 전술한 ET9a-HIN47-HID 및 pET9a-HID-HIN47 발현 플라스미드를 주형으로 사용하고, 표 3-4의 돌연변이 프라이머 쌍으로 각 돌연변이를 완료하였으며; 돌연변이 후에 얻은 플라스미드에 대해 시퀀싱 검증 작업을 수행하였다. 시퀀싱 결과, 각 돌연변이 부위의 유전자가 TAG로 성공적으로 돌연변이되었음을 알 수 있으며, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 10개의 플라스미드를 얻었다.
융합 단백질 pET9a-HIN47-HID의 10개 돌연변이 클론은 다음과 같이 명명된다.
pET9a-HIN47-HID-R174, pET9a-HIN47-HID-I217, pET9a-HIN47-HID-N223, pET9a-HIN47-HID-I226, pET9a-HIN47-HID-R313, pET9a-HIN47-HID-K315, pET9a-HIN47-HID-K522, pET9a-HIN47-HID-D557, pET9a-HIN47-HID-E653, pET9a-HIN47-HID-Y684.
융합 단백질 pET9a-HID-HIN47의 10개 돌연변이 클론은 다음과 같이 명명된다.
pET9a-HID-HIN47-K78, pET9a-HID-HIN47-D113, pET9a-HID-HIN47-E209, pET9a-HID-HIN47-Y240, pET9a-HID-HIN47-R527, pET9a-HID-HIN47-I570, pET9a-HID-HIN47-N576, pET9a-HID-HIN47-I579, pET9a-HID-HIN47-R666, pET9a-HID-HIN47-K668.
[표 3]
HIN47-HID 돌연변이 프라이머 리스트
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 4]
HID-HIN47 돌연변이 프라이머 리스트
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 2: 돌연변이 운반체 단백질의 발현 및 정제
돌연변이 단백질의 Lys-아지도함침 발현 및 정제
실시예 1에서 얻은 발현 플라스미드 pET9a-HIN47-HID-K522를 LB 배지에서 37℃에서 12~16시간 동안 배양한 후, 세균액의 OD값이 0.6~1.0이 될 때까지 2차 증폭하고, Lys-아지도를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하여 37℃에서 30분 동안 계속 증폭한 후, IPTG를 최종 농도 0.5mM이 되도록 첨가하고, 아라비노스를 최종 농도 0.2%가 되도록 첨가하여 24℃에서 12시간 동안 유도 발현한 후 균체를 수집하였다.
수집된 균체를 Ni-NTA-Bind-Buffer로 평형화 및 재현탁하고, 초음파 파쇄, 원심분리하여 세포 찌꺼기(cellular debris)를 제거하였으며, Ni-NTA 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피를 거친 후, Ni-NTA-Wash-Buffer로 충분히 세척하고, 마지막으로 Ni-NTA-Elute-Buffer로 용출시켜 예비 정제된 단백질 샘플 HIN47-HID--K522를 약 90%의 순도로 얻었다(도 1, line 4 참조).
실시예 3: 무-구리 촉매를 통한 돌연변이체 운반체 단백질과 다당류의 부위 지향적 커플링
무-구리 촉매의 Click 반응은 사이클로옥틴의 고리 장력에 의해 구현되어야 하는 바, 변형체와 DIBO(사이클로옥틴 구조의 다당류)를 커플링하여 아지드 함유 기(group)와 무-구리 촉매 Click 반응을 수행하였다.
Click 반응 시스템은 다음과 같다.
HIN47-HID--K522 단백질 1마이크로그램/마이크로리터, DIBO-폐렴 3형 다당류를 각각 분자량 200KD, 400KD으로 2Mm, 4℃에서 각각 2시간 동안 수직으로 현탁한 결과, 상이한 분자량(200KD, 400KD)을 갖는 폐렴 3형 다당류는 모두 단백질 F3-HIN47-HID--K522-200, F3-HIN47-HID--K522-400으로 성공적으로 변형될 수 있음을 알 수 있다(도 1, line 1, 2 참조).
상기 반응 조건을 거쳐 약 90%의 단백질이 1시간 이내에 부위 지향적으로 다당류에 커플링될 수 있고, 반응 후 재구성된 생성물을 탈염 후 이온 교환을 거쳐 다당류에 부위 지향적 커플링된 ＞95% 순도의 단백질을 얻었다.
실시예 4: 구리 촉매가 존재하는 Click 반응을 통한 다당류 커플링
반응 시스템은 다음과 같다.
HIN47-HID--K522 단백질 1마이크로그램/마이크로리터
폐렴 1형 다당류-알킨 20마이크로그램/마이크로리터
Cu2+ 1mM
BTTES 400마이크로몰
PBS 0.01M(pH
Figure pct00013
7)
작은 Cu와이어 조각(충분량)
참고: (1,2,3-triazol-1-yl)ethanesulfonic acid(약칭 BTTES)
반응 조건: 4℃에서 30분 동안 수직으로 현탁하고 반응 종료 후 EDTA를 1mM로 첨가하여 반응을 중지시켜 얻은 최종 생성물은 폐렴 3형 다당류와 HIN47-HID--K522 단백질 부위 지향적 커플링 결합체 F3-HIN47-HID--K522-Cu이다(도 1, line 3 참조). 도 1에서, 표적 단백질의 다당류 커플링은 구리 촉매가 존재하는 Click 반응에 의해 수행됨을 보아낼 수 있다.
실시예 5: 다당류 부위 지향적 커플링 단백질의 여과성 평가
Malvern 레이저 입도 분석기 Mastersizer 2000을 사용하여 결합체 입자 크기 분포를 분석한 결과, 다당류 부위 지향적 커플링 단백질을 통해 얻은 결합체의 제제 입도 분포는 균일하고, 명백한 응집체가 없는 반면, 종래의 다당류-단백질 커플링 방법을 통해 얻은 결합체 F3-HIN47-HID--K522-Cu 입도 분포는 불균일하고 응집체가 존재하였다. 도 2a-2를 참조하면, 종래의 다당류-단백질 커플링 방법은 다음과 같다. 3형 다당류를 60℃ 고온에서 가수분해한 후, 과요오드산나트륨 1리터당 0.5g의 조건으로 활성화 반응을 수행하여 얻은 다당류를 0.1M pH 6.5 인산염 완충액에서 운반체 단백질 HIN47-HID와 최종 농도 2g/L인 시아노수소화붕소나트륨에서 56시간 동안 반응시킨 후, 수소화붕소나트륨 2g/L를 첨가하고 2시간 동안 반응을 계속하고, 다음 생리 식염수로 한외 여과하여 결합체 F3-HIN47-HID를 얻었다.
실시예 6: 다당류 부위 지향적 커플링 단백질 결합체의 면역원성 평가
토끼 모델에서 상이한 커플링 방식으로 얻은 백신을 연구하였다. 관련된 구현예 3, 4, 5는 폐렴구균으로부터 유래된 3형 피막 다당류와 HIN47-HID 유사 단백질의 다당류-단백질 접합체 및 인산알루미늄(AlPO4) 보조제가 토끼의 1가 백신의 면역 응답에 미치는 영향 효과이다. 이러한 효과는 항원 특이적 Elisa로 혈청 IgG 농도를 측정하고 opsonophagocytosis assay(OPA)로 항체 기능을 측정하여 특성화할 수 있다. 도 3은 토끼에서 상이한 커플링 방식으로 얻은 3형 결합체의 3면역 Elisa 결과를 도시한다. 결과는 구현예 3, 4, 5에서 폐렴구균으로부터 유래된 3형 피막 다당류와 HIN47-HID 유사 단백질의 다당류-단백질 접합체가 대조군에 비해 유의한 항체 역가를 나타냄을 보여준다.
0, 2, 4주에 계획된 인간용 임상 용량(다당류2μg)의 4분의 1 용량(다당류0.5μg)을 뉴질랜드 흰토끼에 근육 내 면역화하고, 혈청을 상이한 시점에서 수집하였으며, Elisa를 통해 혈청 특이적 IgG를 측정하고 살균력(OPA)을 통해 기능 활성을 평가하였다.
[표 5]
3형 다당류-단백질 결합체의 검출 결과
Figure pct00014
[표 6]
3형 다당류-단백질 결합체 살균력(OPA) 결과
Figure pct00015
표 5는 3형 다당류-단백질 결합체의 검출 결과를 나타낸 것으로, 결과는 부위 지향적 커플링에 의해 수득된 3형 다당류-단백질 결합체의 유리 다당류 및 유리 단백질의 비율이 돌연변이되지 않은 단백질 운반체보다 현저히 작음을 보여준다. 표 6 은 3형 다당류-단백질 결합체 살균력(OPA) 결과를 나타낸 것으로, 부위 지향적 커플링에 의해 수득된 3형 다당류-단백질 결합체는 토끼에서 유의하게 높은 항체 응답 및 특이적 살균력을 유도함을 보여준다.
실시예 7: 다당류 부위 지향적 커플링 단백질 결합체의 안전성 검사
실시예 3, 4에서 제조된 3개의 다당류-단백질 결합체를 샘플링하되, 각 샘플의 경우, 체중 18-22g의 마우스 5마리와 체중 250-350g의 기니피그 2마리를 선택하여 마우스 마리 당 샘플 0.5ml를 복부에 피하주사하고, 기니피그 마리 당 샘플 5.0ml를 복부에 피하주사하였다. 7일 동안 관찰하여 체중 변화를 기록하였다. 결과는 관찰 기간 동안 모든 마우스와 기니피그가 생존하였고 이상 반응이 없었으며, 기간 만료 시 모든 마우스 및 기니피그의 체중은 주사 전과 비교하여 모두 증가함을 보여준다. 이는 본 발명에 의해 제조된 부위 지향적 커플링 결합 백신은 외인성 독성 물질의 오염이 없고, 예상치 못한 불안전 인자가 없음을 의미한다.
실시예 2-7은 HIN47-HID--K522를 예로 들어 돌연변이 운반체 단백질의 제조, 특성화, 검출 방법 및 면역원성 평가 등 효과를 나타내는 실험으로, 다른 HIN47-linker-HID 및 HID-linker-HIN47의 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질은 모두 상술한 방법으로 제조되었고, 면역원성 및 안전성 평가 결과 모두 HIN47-HID--K522와 동등한 수준에 도달할 수 있었다. 결과는 부위 지향적 커플링에 의해 수득된 3형 다당류-단백질 결합체는 토끼에서 유의하게 높은 항체 응답 및 특이적 살균력을 유도함을 보여준다.
이상에서 본 발명은 바람직한 실시예와 함께 개시되었지만, 특허청구범위를 제한하려는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 구상을 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 수정이 가능하다. 따라서 본 발명의 보호 범위는 본 발명의 특허청구범위에 정의된 범위를 기준으로 해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CANSINO BIOLOGICS INC. <120> CARRIER PROTEIN WITH SITE-DIRECTED MUTATION AND USE THEREOF IN PREPARATION OF VACCINE <140> PCT/CN2020/117825 <141> 2020-09-25 <150> CN 201910978406.X <151> 2019-10-15 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 1 Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp 20 25 30 Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr 35 40 45 Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys 50 55 60 Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser 65 70 75 80 Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn 85 90 95 Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly 100 105 110 Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys 115 120 125 Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly 130 135 140 Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn 165 170 175 Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe 180 185 190 Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala 195 200 205 Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu 210 215 220 Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr 225 230 235 240 Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser 245 250 255 Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu 260 265 270 Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu 275 280 285 Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala 290 295 300 Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp 305 310 315 320 Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly 325 330 335 Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu 340 345 350 Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala 355 360 365 Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn 370 375 380 Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr 385 390 395 400 Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His 405 410 415 Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg 420 425 430 Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu 435 440 445 Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly 450 455 460 Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg 465 470 475 480 Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys 485 490 495 Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu 500 505 510 His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu 515 520 525 Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp 530 535 540 His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 545 550 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Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly Glu 195 200 205 Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Ala 210 215 220 Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val Gln 225 230 235 240 Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile Lys 245 250 255 Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser Ala 260 265 270 Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala Glu 275 280 285 Lys Ala Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ile Ile Thr Ala Met Asn Gly Gln 290 295 300 Lys Ile Ser Ser Phe Ala Glu Ile Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr Gly 305 310 315 320 Ala Gly Lys Glu Ile Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Asp Gly Lys Ser His 325 330 335 Asp Val Lys Met Lys Leu Gln Ala Asp Asp Ser Ser Gln Leu Ser Ser 340 345 350 Lys Thr Glu Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asp Tyr Asp 355 360 365 Ala Lys Gly Val Lys Gly Ile Glu Ile Thr Lys Ile Gln Pro Asn Ser 370 375 380 Leu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Ile Ile Ile Gly Ile 385 390 395 400 Asn Arg Gln Met Ile Glu Asn Ile Arg Glu Leu Asn Lys Val Leu Glu 405 410 415 Thr Glu Pro Ser Ala Val Ala Leu Asn Ile Leu Arg Gly Asp Ser Asn 420 425 430 Phe Tyr Leu Leu Val Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Pro Ser 435 440 445 Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys Ile 450 455 460 Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr Leu 465 470 475 480 Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Glu Gln 485 490 495 Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp His 500 505 510 Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg His 515 520 525 Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu Ile 530 535 540 Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys Gln 545 550 555 560 Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe Arg 565 570 575 Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu Lys 580 585 590 Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro Trp 595 600 605 Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys Val 610 615 620 Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu Gln 625 630 635 640 Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu Pro 645 650 655 Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr Asp 660 665 670 Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn Tyr 675 680 685 Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val Lys 690 695 700 Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys Glu 705 710 715 720 Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu Leu 725 730 735 Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp Ala 740 745 750 Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Ala Leu Leu 755 760 765 Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr Gly 770 775 780 Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys 785 790 <210> 3 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HID-HIN47 <400> 3 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys 100 105 110 Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys 115 120 125 Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln 130 135 140 Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu 165 170 175 Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met 180 185 190 Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr 195 200 205 Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile 210 215 220 Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr 225 230 235 240 Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala 245 250 255 Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu 260 265 270 Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu 275 280 285 Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val 290 295 300 Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr 305 310 315 320 Asp Ala Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe 325 330 335 Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Ser Thr Leu Pro Ser Phe Val Ser Glu Gln Asn Ser Leu Ala Pro 355 360 365 Met Leu Glu Lys Val Gln Pro Ala Val Val Thr Leu Ser Val Glu Gly 370 375 380 Lys Ala Lys Val Asp Ser Arg Ser Pro Phe Leu Asp Asp Ile Pro Glu 385 390 395 400 Glu Phe Lys Phe Phe Phe Gly Asp Arg Phe Ala Glu Gln Phe Gly Gly 405 410 415 Arg Gly Glu Ser Lys Arg Asn Phe Arg Gly Leu Gly Ser Gly Val Ile 420 425 430 Ile Asn Ala Ser Lys Gly Tyr Val Leu Thr Asn Asn Ala Val Ile Asp 435 440 445 Glu Ala Asp Lys Ile Thr Val Gln Leu Gln Asp Gly Arg Glu Phe Lys 450 455 460 Ala Lys Leu Val Gly Lys Asp Glu Leu Ser Asp Ile Ala Leu Val Gln 465 470 475 480 Leu Glu Lys Pro Ser Asn Leu Thr Glu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Asp 485 490 495 Lys Leu Arg Val Gly Asp Phe Thr Val Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly 500 505 510 Leu Gly Gln Thr Val Thr Ser Gly Ile Val Ser Ala Leu Gly Arg Ser 515 520 525 Thr Gly Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Asn Tyr Ile Gln Thr Asp Ala 530 535 540 Ala Val Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly 545 550 555 560 Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn 565 570 575 Ala Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val 580 585 590 Gln Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile 595 600 605 Lys Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser 610 615 620 Ala Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala 625 630 635 640 Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ile Ile Thr Ala Met Asn Gly 645 650 655 Gln Lys Ile Ser Ser Phe Ala Glu Ile Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr 660 665 670 Gly Ala Gly Lys Glu Ile Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Asp Gly Lys Ser 675 680 685 His Asp Val Lys Met Lys Leu Gln Ala Asp Asp Ser Ser Gln Leu Ser 690 695 700 Ser Lys Thr Glu Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asp Tyr 705 710 715 720 Asp Ala Lys Gly Val Lys Gly Ile Glu Ile Thr Lys Ile Gln Pro Asn 725 730 735 Ser Leu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Ile Ile Ile Gly 740 745 750 Ile Asn Arg Gln Met Ile Glu Asn Ile Arg Glu Leu Asn Lys Val Leu 755 760 765 Glu Thr Glu Pro Ser Ala Val Ala Leu Asn Ile Leu Arg Gly Asp Ser 770 775 780 Asn Phe Tyr Leu Leu Val Gln 785 790 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ccgatgtagc ctagaaattt cctcataggc ataggaaag 39 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tttctaggct acatcggtta agccgtccag aa 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gaccaaatag gggaaacagg ctcaagtgta tcc 33 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtttccccta tttggtctcg aaattttccg tc 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aaaacctagc tccttcctca gatgggaatg ga 32 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggaaggagct aggtttttat gcgtttcagt tcatt 35 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cgaaaggata gtgggtaaac tacaattatg attggatg 38 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tacccactat cctttcggat ctttttcctg gg 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tagagtaccg ggtcagactc cggcacctac ga 32 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tctgacccgg tactctagcc cagagcggaa actatcc 37 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tgctatctag tcaccgagcg gcggtaatgc gg 32 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tcggtgacta gatagcagta ttgataccga tcaattc 37 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ttaggcggga attgcgttcg caattcccag ta 32 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 acgcaattcc cgcctaaccg ccgctcggtg agat 34 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aatgcgggat aggcgttcgc aattcccagt aa 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 aacgcctatc ccgcattacc gccgctcggt ga 32 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gctgaaattt aggcaaaaat tgctacaact ggtgc 35 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tttgcctaaa tttcagcaaa cgaagagatt ttc 33 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 tcgcgcatag attgctacaa ctggtgcagg ca 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tagcaatcta tgcgcgaatt tcagcaaacg aa 32 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ccgatgtagc ctagaaattt cctcataggc ataggaaag 39 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tttctaggct acatcggtta agccgtccag aa 32 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gaccaaatag gggaaacagg ctcaagtgta tcc 33 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gtttccccta tttggtctcg aaattttccg tc 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 aaaacctagc tccttcctca gatgggaatg ga 32 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ggaaggagct aggtttttat gcgtttcagt tcatt 35 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cgaaaggata gtgggtaaac tacaattatg attggatg 38 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 tacccactat cctttcggat ctttttcctg gg 32 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 tagagtaccg ggtcagactc cggcacctac ga 32 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 tctgacccgg tactctagcc cagagcggaa actatcc 37 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 tgctatctag tcaccgagcg gcggtaatgc gg 32 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 tcggtgacta gatagcagta ttgataccga tcaattc 37 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ttaggcggga attgcgttcg caattcccag ta 32 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 acgcaattcc cgcctaaccg ccgctcggtg agat 34 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 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Claims (17)

  1. 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질로서,
    상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 톡신의 무독성 돌연변이체, 세균의 외막 단백질 및 세균 발현 단백질 중 1종 또는 2종 이상으로 형성된 융합 단백질로부터 선택되고, 상기 운반체 단백질에서 적어도 한 부위 상의 아미노산은 비천연 아미노산으로 돌연변이되며, 상기 비천연 아미노산은 아지드기 또는 알키닐 말단기를 함유하는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 톡신의 무독성 돌연변이체 CRM197, B군 수막구균 외막 단백질, 재조합 녹농균 외독소 A, 헤모필루스 인플루엔자 지단백질 HID 및 헤모필루스 인플루엔자 열충격 단백질 HIN47중 1종 또는 2종 이상으로 형성된 융합 단백질로부터 선택되고, 바람직하게는, 상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡신의 무독성 돌연변이체 CRM197, 헤모필루스 인플루엔자 지단백질 HID, 융합 단백질 HIN47-HID 또는 융합 단백질 HID-HIN47로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비천연 아미노산은 페닐알라닌 유도체, 티로신 유도체, 글루타민 유도체, 알라닌 유도체, 시스테인 유도체, 세린 유도체 또는 라이신 유도체인 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비천연 아미노산은
    Figure pct00016
    인 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 HIN47-HID 융합 단백질의 상기 돌연변이 부위는 서열번호 2 중 임의의 부위 상의 하나 이상의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 2에 제시된 서열의 부위 174R, 부위 217I, 부위 223N, 부위 226I, 부위 313R, 부위 315K, 부위 522K, 부위 557D, 부위 653E 또는 부위 684Y로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 HID-HIN47 단백질의 상기 돌연변이 부위는 서열번호 3 중 임의의 부위 상의 하나 이상의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는, 상기 돌연변이 부위는 서열번호 3에 제시된 서열의 부위 78K, 부위 113D, 부위 209E, 부위 240Y, 부위 527R, 부위 570I, 부위 576N, 부위 579I, 부위 666R 또는 부위 668K로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이 전 단백질 아미노산 서열의 N번째 아미노산이 Lys-아지도로 돌연변이되고, 상기 돌연변이 아미노산의 연결 방식은 하기 식으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질:
    Figure pct00017

    상기 식에서,
    N은 돌연변이 부위이고;
    AA는 돌연변이 부위 전후의 아미노산이다.
  8. 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체로서,
    상기 접합체는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질과 알키닐 말단기가 함유되거나 변형된 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 소분자 화합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체.
  9. 제8항에 있어서,
    돌연변이 전 단백질 아미노산 서열의 N번째 아미노산은 하기 구조로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체:
    Figure pct00018
    , 또는,
    Figure pct00019

    상기 구조에서,
    N은 돌연변이 부위이며, AA는 돌연변이 부위 전후의 아미노산이고;
    R2는 당, 핵산, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복실 말단 변형기이다.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 접합체는 당접합체이고, 상기 당접합체는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질과 알키닐 말단기가 함유되거나 변형된 다당류가 접합되어 형성되는 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 당접합체에서 당/운반체 단백질의 비율(w/w)은 0.3 내지 3인 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 다당류의 당 반복 단위는 10 내지 50개인 것을 특징으로 하는, 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체.
  13. 제11항 또는 제12항에 따른 당접합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 당접합체는 피막 다당류의 당접합체이고, 상기 피막 다당류는 폐렴구균의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F 중 1종 또는 2종 이상의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
  15. 다가 폐렴구균 다당류와 2종 이상의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질로 형성되는 것을 특징으로 하는 폐렴 다가 결합 백신.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질, 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 부위 지향적 돌연변이를 갖는 운반체 단백질의 접합체, 또는 제13항 또는 제14항에 따른 면역원성 조성물의, 백신 제조에서의 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 백신은 인플루엔자 백신 또는 폐렴 백신인 것을 특징으로 하는, 용도.
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