JP7366333B2 - 部位特異的突然変異キャリアタンパク質、及びワクチンの製造におけるその使用 - Google Patents

部位特異的突然変異キャリアタンパク質、及びワクチンの製造におけるその使用 Download PDF

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Description

本発明は、バイオ医薬品の分野に関し、具体的には、部位特異的突然変異キャリアタン
パク質、及びワクチン、特に肺炎多価結合ワクチンの製造におけるその使用に関する。
肺炎連鎖球菌による感染は世界中発病率と死亡率を招く要因の一つである。肺炎、発熱
性菌血症及び髄膜炎は侵襲性肺炎連鎖球菌疾患の最もよく見られる所見であり、細菌が呼
吸道内に散布すると中耳感染、副鼻腔炎や再発型気管支炎を招くことがある。
タンパク質担体に連結された多糖を用いて製造された多糖タンパク質コンジュゲートワ
クチンでは、多糖とタンパク質担体との化学結合により、ワクチンに含まれる多糖の細菌
に対する免疫応答をその表面に発現することを誘導し、それによって、疾患を予防するこ
とができ、従って、病原性細菌由来の多糖を用いたワクチンの接種は、宿主の免疫力を増
強する手段として好適である。
多糖自体は免疫原性であるが、標的病原体由来の当該病原体に対する特異的免疫応答を
増強する関連タンパク質抗原、又は主にアジュバント又は一般的な免疫応答刺激剤として
機能する一般的な免疫原性タンパク質であり得るキャリアタンパク質と多糖とのコンジュ
ゲートは、既に免疫原性を改善することに使用されている。
従来の多糖タンパク質結合技術としては、中国特許ＺＬ０２１５９０３２．Ｘは、多糖
タンパク質結合ワクチンの製造方法を開示しており、これは、多糖タンパク質結合ワクチ
ンの製造に現在最もよく使われている技術の１つである。前記技術では、連結剤としてア
ジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を使用して多糖をタンパク質に結合させる。このような
結合方式では、多糖を臭素化シアンで活性化させる必要があり、すなわち、アルカリ条件
下で臭素化シアンを多糖分子の水酸基に作用させて、シアン酸エステルを形成し、その後
、ＡＤＨと反応させ、これにより、シアン酸エステル中の１つの炭素－酸素結合が切断さ
れ、ＡＤＨの一端のアミノ基と付加反応し、エステルヒドラジド（ＡＨ）基が多糖分子に
導入され、多糖－ＡＨ誘導体が形成され、多糖－ＡＨ誘導体は、カルボジイミド（ＥＤＡ
Ｃ）を介してキャリアタンパク質と安定なコンジュゲートを形成する。このような結合方
式は、多糖とキャリアタンパク質との結合の立体障害を減少させ、多糖の抗原エピトープ
を保持しながら、多糖自体の溶解性を回避し、多糖と抗血清の反応による副作用を減少さ
せることできるが、いくつかの欠点が存在する。（１）多糖－ＡＨ誘導体は引き続き臭素
化シアンで活性化された多糖と反応して、多糖自体のポリマーを形成し、この結果、多糖
とタンパク質との結合効率が低下する。（２）ＥＤＡＣはＡＤＨ活性化多糖とキャリアタ
ンパク質との結合を媒介すると同時に、キャリアタンパク質の自己架橋を引き起こしやす
く、それによって、多糖とタンパク質との結合効率を低下させ、そのため、多糖タンパク
質結合ワクチンの免疫原性と抗体の作用持続性には向上する余裕があり、例えば、多糖結
合ワクチンは３回免疫しなければ免疫効果を産生することができない。これらの欠点は多
糖結合ワクチンの更なる発展を制限してしまう。
アジドとアセチレンのＣｌｉｃｋ反応を利用した生体分子系における修飾は、近年研究
が盛んに行われている分野である。Ｎａｔａｌｉｅ Ｗ．Ｎａｉｒｎらは、メチオニン欠
乏菌を用いてインターフェロンβにアジド基を含有する非天然アミノ酸を導入した後、銅
触媒によるＣｌｉｃｋ反応を利用して単一部位のＰＥＧ修飾を行っている（Natalie W.Na
rinetal,Bioconjugate Chem.2012）。
遺伝暗号拡張技術は、近年、迅速に発展し、琥珀終止コドンをセンスコドンとして、対
応する直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を導入することにより、最終的に
設計された非天然アミノ酸をタンパク質に導入し、非天然アミノ酸の性質によりタンパク
質に特殊な機能を付与することである。これまでに、この技術は、数十種類の非天然アミ
ノ酸を生細胞のタンパク質に部位特異的に発現させることに成功しており、かかる非天然
アミノ酸はアルキニル基やアジドなどを含み、生体には本来存在しないこれらの特殊な基
を利用することにより、タンパク質を部位特異的に修飾することができる。従来技術では
、ワクチン結合技術のばらつき、分離精製技術の複雑さなどの問題に直面し、この分野で
は、任意の部位に機能性基を特異的に修飾できる方法が緊急に必要とされている。
ＣＮ１０６９２９４８２Ａは、部位特異的突然変異インフルエンザウイルス、その生ワ
クチン、その製造方法及び使用を記載しており、一方、本発明の修飾キャリアタンパク質
Ｈｉｎ４７－ＨＩＤは、非侵襲的インフルエンザ菌を予防できることが実証されており、
本発明の特定の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸を部位特異的に導入した突
然変異キャリアタンパク質Ｈｉｎ４７－ＨＩＤ及びその部位特異的修飾方法を提供し、こ
の突然変異方法は、タンパク質中の特定部位に導入された非天然アミノ酸Ｌｙｓ－ａｚｉ
ｄｏに固有のアジド基を修飾剤と特異的にＣｌｉｃｋ反応させることで、非天然アミノ酸
を目的のタンパク質に部位特異的に結合させることである。
本発明は、キャリアタンパク質遺伝子の特定部位に琥珀コドンＴＡＧを導入し、直交ア
ミノアシルｔＲＮＡ合成酵素－ｔＲＮＡを用いて架橋性を有する非天然アミノ酸をキャリ
アタンパク質の特定部位に部位特異的に突然変異させた、部位特異的突然変異－部位特異
的修飾免疫原性組成物、その製造方法及びその使用に関する。キャリアタンパク質と多糖
抗原の相互反応において、共有結合が形成され、また、コンジュゲートがビーズのストリ
ングのようになり、このように、キャリアタンパク質と多糖抗原の過剰な架橋を効果的に
回避し、コンジュゲートの粒径分布を著しく均一で制御可能にし、多糖タンパク質結合ワ
クチンの品質を高めるための有効な手段を提供した。
発明者は、従来技術についての思考と研究を行った結果、メタノコッカス古菌のｔＲＮ
Ａ（ｔＲＮＡＰｙｌ）及びピロリジン－ｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ）Ｐｙｌ／ＰｙｌＲ
Ｓ）のタンパク質翻訳システムを利用して、非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的に
組み込むことにより、ＨＩＤ－Ｈｉｎ４７、Ｈｉｎ４７－ＨＩＤやＣＲＭ１９７のような
部位特異的突然変異した目的のペプチド又はタンパク質を得た後、前記部位特異的突然変
異キャリアタンパク質をさらに部位特異的修飾可能な原料とし、該部位特異的突然変異キ
ャリアタンパク質と多糖とを結合させ、さらに単一部位で部位特異的に修飾したキャリア
タンパク質の多糖ワクチンを得るに至った。
これにより、本発明は、部位特異的突然変異キャリアタンパク質を提供し、前記キャリ
アタンパク質は、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素の非毒性突然変異体、細菌外膜
タンパク質及び細菌発現タンパク質のうちの１種又は２種以上で形成される融合タンパク
質から選択され、前記キャリアタンパク質上の少なくとも１つの部位のアミノ酸が、アジ
ド基又はアルキニル末端基を含有する非天然アミノ酸に突然変異されている。前記キャリ
アタンパク質は、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素の非毒性突然変異体ＣＲＭ１９
７（配列番号１）、Ｂ群髄膜炎菌外膜タンパク質、組換え緑膿菌外毒素Ａ、インフルエン
ザ菌リポタンパク質ＨＩＤ、及びインフルエンザ菌熱ショックタンパク質ＨＩＮ４７のう
ちの１種又は２種以上で形成される融合タンパク質から選択される。
好ましくは、前記キャリアタンパク質は、インフルエンザ菌リポタンパク質ＨＩＤ、融
合タンパク質ＨＩＮ４７－ＨＩＤ、又は融合タンパク質ＨＩＤ－ＨＩＮ４７から選択され
る。
前記非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体、チロシン誘導体、グルタミン誘導体
、アラニン誘導体、システイン誘導体、セリン誘導体又はリジン誘導体である。好ましく
は、前記非天然アミノ酸は、アジド基を含有するリジン誘導体である。より好ましくは、
前記非天然アミノ酸は、以下のものである。
Figure 0007366333000001
本発明の一実施形態において、前記キャリアタンパク質はＨＩＮ４７－ＨＩＤ融合タン
パク質であり、前記突然変異部位は、配列番号２のいずれかの部位における１つ又は複数
のアミノ酸であってもよく、
好ましくは、前記突然変異部位は、配列番号２で示される配列の１７４Ｒ位、２１７Ｉ
位、２２３Ｎ位、２２６Ｉ位、３１３Ｒ位、３１５Ｋ位、５２２Ｋ位、５５７Ｄ位、６５
３Ｅ位、６８４Ｙ位、又は活性への影響が小さい他の部位から選択される。
本発明の一実施形態において、前記キャリアタンパク質はＨＩＤ－ＨＩＮ４７タンパク
質であり、前記突然変異部位は、配列番号３のいずれかの部位における１つ又は複数のア
ミノ酸であってもよく、
好ましくは、前記突然変異部位は、配列番号３で示される配列の７８Ｋ位、１１３Ｄ位
、２０９Ｅ位、２４０Ｙ位、５２７Ｒ位、５７０Ｉ位、５７６Ｎ位、５７９Ｉ位、６６６
Ｒ位、６６８Ｋ位、又は活性への影響が小さい他の部位から選択される。
突然変異を行った後、前記部位特異的突然変異タンパク質と突然変異前の目的のタンパ
ク質のアミノ酸配列との相違点としては、突然変異前のタンパク質のアミノ酸配列のＮ位
のアミノ酸がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異されており、前記突然変異アミノ酸は以下の
式で示されるように連結されている。
Figure 0007366333000002
（ここで、前記Ｎは突然変異部位であり、ＡＡは突然変異部位の前後のアミノ酸
Figure 0007366333000003
である。）
本発明はまた、本発明に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質と、アルキニル
末端基が含まれるか又は修飾された分子とを用いて製造された部位特異的突然変異キャリ
アタンパク質コンジュゲートを提供し、前記分子は、糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド
又は小分子化合物を含有するものであるか、又は、糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド又
は小分子化合物が末端アルキニル基で修飾された修飾物である。
本発明に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質は、アルキニル末端基が含まれ
るか又は修飾された分子とＣｌｉｃｋ反応により製造されたものである。前記Ｃｌｉｃｋ
反応は、一価銅を媒介するＣｌｉｃｋ反応であってもよく、シクロオクチン又はその誘導
体を媒介する銅無しＣｌｉｃｋ反応であってもよい。
本発明に記載の糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド又は小分子化合物は、糖、核酸、ア
ミノ酸、ポリペプチド又は小分子化合物の末端アルキニル基の修飾物であってもよく、一
価銅の触媒作用により、部位特異的結合を実現してコンジュゲートを得るか、又は、糖、
核酸、アミノ酸、ポリペプチド、又は小分子化合物が、シクロオクチン又はその誘導体を
修飾基とした修飾物であることにより、部位特異的結合を直接実現するようにしてもよい
。
好ましくは、本発明に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質コンジュゲートに
おいて、突然変異前のタンパク質のアミノ酸配列のＮ位のアミノ酸は以下のような構造に
突然変異されている。
Figure 0007366333000004
又は
Figure 0007366333000005
（ここで、
Ｎは突然変異部位であり、ＡＡは突然変異部位の前後のアミノ酸であり、
Ｒ２は、糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシル末端修飾基である。）
本発明の一実施形態において、前記コンジュゲートは、本発明に記載の部位特異的突然
変異キャリアタンパク質と、アルキニル末端基が含まれるか又は修飾された多糖とをコン
ジュゲートした糖コンジュゲートである。
好ましくは、本発明に記載の部位特異的突然変異タンパク質は、多糖とコンジュゲート
されており、多糖：キャリアタンパク質の比率（ｗ／ｗ）が０．３～３である。
好ましくは、前記多糖の糖反復単位が１０～５０個であり、前記キャリアタンパク質と
前記多糖との間に少なくとも１つの共有結合が直接存在する。
本発明に記載の多糖は、末端アルキニル基の修飾物であってもよく、一価銅の触媒作用
により、部位特異的結合を実現して糖コンジュゲートを得るか、又は、多糖がシクロオク
チン又はその誘導体を修飾基とした修飾物であることにより、目的の多糖タンパク質に対
する部位特異的結合を直接実現する。
本願はまた、本発明に記載の糖コンジュゲートと、薬学的に受容可能な賦形剤、担体又
は希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。
前記多糖は、肺炎球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９
Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、
２２Ｆ、２３Ｆ又は３３Ｆの１つ又は２つ以上の組み合わせの莢膜多糖から選択される。
本発明はまた、多価肺炎球菌多糖と、本発明に記載の特部位特異的突然変異キャリアタ
ンパク質の２種以上とで形成されている肺炎多価結合ワクチンを提供する。
本発明はまた、ワクチンの製造における、前記部位特異的突然変異キャリアタンパク質
、前記部位特異的突然変異キャリアタンパク質コンジュゲート、又は前記免疫原性組成物
の使用を提供する。
好ましくは、前記ワクチンはインフルエンザワクチン又は肺炎ワクチンである。
他の方法と比較して、本発明の利点は、以下のうちの１つ又は複数である。
１、タンパク質の任意の部位に非天然アミノ酸を導入することができ、それによって、
その部位のみを特異的に修飾することができるキャリアタンパク質を製造することができ
る。
２、非天然アミノ酸に特有の活性基を利用することにより、効率的かつ特異的に修飾す
るという目的を達成できる。
３、特定部位の修飾は、特定機能のプロテアーゼ活性を弱め、副作用を減少させ、キャ
リアタンパク質としての役割を果たす
４、修飾条件の最適化により、シクロオクチンを媒介する銅無しＣｌｉｃｋ反応を利用
することで、効率的で、タンパク質に無害で、簡単で容易な修飾反応を実現することがで
きる。
突然変異後のタンパク質Ｈｉｎ４７－ＨＩＤ、ｃｌｉｃｋ化学反応により得られた多糖タンパク質コンジュゲートのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル図を示す。 図２ａは、ｃｌｉｃｋ化学反応により得られた多糖タンパク質コンジュゲートの粒径分布図を示す。図２ｂは、従来のカップリング方法により得られた多糖タンパク質コンジュゲートの粒径分布図を示す。 各カップリング方式により得られた３型コンジュゲートの家ウサギ３回免疫Ｅｌｉｓａ結果を示す。
以下、具体的な実施例を参照して本発明についてさらに説明する。なお、これらの実施
例は、本発明を説明するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例１ 部位特異的突然変異キャリアタンパク質の発現プラスミドの構築
１：突然変異部位の選択
オンラインソフトウェアｐｈｙｒｅ２を用いてＨＩＤ及びＨＩＮ４７の３次元構造をそ
れぞれ予測した。
融合タンパク質ＨＩＮ４７－ＨＩＤ及びＨＩＤ－ＨＩＮ４７においてそれぞれ１０個の
重要なアミノ酸を選択し、これらの重要なアミノ酸部位を置換することにより、多糖を部
位特異的に結合することができるだけでなく、ＨＩＮ４７の残存プロテアーゼ活性をさら
に低下させることが期待でき、これは、最終的な多糖結合産物の安定性の向上に有利であ
る。具体的な突然変異部位の情報は表１～表２に示されており、ここで、アミノ酸位置と
は配列番号２～３に示す配列上の位置である。
表１ ＨＩＮ４７－ＨＩＤ突然変異部位
Figure 0007366333000006
表２ ＨＩＤ－ＨＩＮ４７突然変異部位
Figure 0007366333000007

２：発現プラスミドの取得
ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋが公表したＨＩＤ及びＨＩＮ４７遺伝子配列に基づき、
それぞれ全遺伝子合成を行って遺伝子全長ＤＮＡ断片を取得し、その後、ＧＧＳＧＧＳの
６つのアミノ酸のｌｉｎｋｅｒを用いてＨＩＮ４７とＨＩＤタンパク質をそれぞれＨＩＮ
４７－ｌｉｎｋｅｒ－ＨＩＤとＨＩＤ－ｌｉｎｋｅｒ－ＨＩＮ４７の順でｐＥＴ９ａベク
ターに融合して構築し、ｐＥＴ９ａ－ＨＩＮ４７－ＨＩＤとｐＥＴ９ａ－ＨＩＤ－ＨＩＮ
４７発現プラスミドをそれぞれ取得した。
３：部位特異的突然変異
全式金社製のＦａｓｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ部位特異的突然変異キ
ットを用い、その使用説明書に従って、前述のＥＴ９ａ－ＨＩＮ４７－ＨＩＤとｐＥＴ９
ａ－ＨＩＤ－ＨＩＮ４７発現プラスミドをテンプレートとし、表３－４中の突然変異プラ
イマーペアを用いて、各突然変異を行い、突然変異により得られたプラスミドについて、
シーケンシング検証を行った。シーケンシングの結果、各突然変異部位遺伝子が全てＴＡ
Ｇに突然変異されており、１０個の部位特異的突然変異プラスミドが得られた。
融合タンパク質ｐＥＴ９ａ－ＨＩＮ４７－ＨＩＤの１０個の突然変異クローンは、以下
のように命名された。
pET9a-HIN47-HID-R174、pET9a-HIN47-HID-I217、pET9a-HIN47-HID-N223、pET9a-HIN47-
HID-I226、pET9a-HIN47-HID-R313、pET9a-HIN47-HID-K315、pET9a-HIN47-HID-K522、pET9
a-HIN47-HID-D557、pET9a-HIN47-HID-E653、pET9a-HIN47-HID-Y684。
融合タンパク質ｐＥＴ９ａ－ＨＩＤ－ＨＩＮ４７の１０個の突然変異クローンは、以下
のように命名された。
pET9a-HID-HIN47-K78、pET9a-HID-HIN47-D113、pET9a-HID-HIN47-E209、pET9a-HID-HIN
47-Y240、pET9a-HID-HIN47-R527、pET9a-HID-HIN47-I570、pET9a-HID-HIN47-N576、pET9a
-HID-HIN47-I579、pET9a-HID-HIN47-R666、pET9a-HID-HIN47-K668。
表３ ＨＩＮ４７－ＨＩＤ突然変異プライマーリスト
Figure 0007366333000008
Figure 0007366333000009

表４ ＨＩＤ－ＨＩＮ４７突然変異プライマーリスト
Figure 0007366333000010
Figure 0007366333000011
実施例２ 突然変異キャリアタンパク質の発現及び精製
突然変異タンパク質のＬｙｓ－ａｚｉｄｏ組み込み、発現及び精製
実施例１で得られた発現プラスミドｐＥＴ９ａ－ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－Ｋ５２２をＬＢ
培地にて３７℃で１２～１６時間培養後、菌液のＯＤ値が０．６～１．０になるまで二次
増幅したところ、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏを最終濃度１ｍＭで加え、３７℃で３０分間増幅し
続け、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで加え、アラビノースを最終濃度０．２％で加え、
２４℃で１２時間誘導発現した後、菌体を採取した。
採取した菌体をＮｉ－ＮＴＡ－Ｂｉｎｄ－Ｂｕｆｆｅｒで平衡化して再懸濁し、超音波
破砕し、遠心分離により細胞破片を除去し、Ｎｉ－ＮＴＡ金属キレートアフィニティーク
ロマトグラフィーにかけて、Ｎｉ－ＮＴＡ－Ｗａｓｈ－Ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄し、最
後に、Ｎｉ－ＮＴＡ－Ｅｌｕｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒで溶出し、純度約９０％の予備精製タン
パク質サンプルＨＩＮ４７－ＨＩＤ－Ｋ５２２を得た（図１、ｌｉｎｅ ４参照）。
実施例３ 突然変異体キャリアタンパク質と多糖の銅無し触媒による部位特異的結合
銅無しで触媒されているＣｌｉｃｋ反応では、シクロオクチンの環張力作用により、修
飾物とＤＩＢＯ（シクロオクチン構造を有する多糖）とを結合することで、アジドを含有
する基との銅無し触媒Ｃｌｉｃｋ反応を行った。
Ｃｌｉｃｋ反応系は以下のとおりである：
１μｇ／μＬ ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－－Ｋ５２２タンパク質、分子量２００ＫＤ、４０
０ＫＤのＤＩＢＯ－肺炎３型多糖をそれぞれ２Ｍｍ、４℃で２時間垂直懸濁させた結果、
いずれの分子量（２００ＫＤ、４００ＫＤ）の肺炎３型多糖も、タンパク質Ｆ３－ＨＩＮ
４７－ＨＩＤ－－Ｋ５２２－２００、Ｆ３－ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－－Ｋ５２２－４００に
成功的に修飾した（図１、ｌｉｎｅ１、２参照）。
上記の反応条件により、約９０％のタンパク質を１時間以内に多糖と部位特異的結合さ
せることができ、反応後の再溶解物を脱塩し、さらにイオン交換することにより、純度が
９５％を超える多糖部位特異的結合タンパク質を得た。
実施例４ 銅触媒Ｃｌｉｃｋ反応による多糖結合
反応系は以下のとおりである：
ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－Ｋ５２２タンパク質１μｇ／μＬ
肺炎１型多糖－アルキン２０μｇ／μＬ
Ｃｕ２＋ １ｍＭ
ＢＴＴＥＳ ４００μｍｏｌ
ＰＢＳ ０．０１Ｍ（ｐＨ≒７）
Ｃｕワイヤセグメント（十分）
注：（１,２,３－ｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄはＢＴＴＥＳと略称）
反応条件：４℃で３０分間垂直懸濁させ、反応終了後、ＥＤＴＡを１ｍＭまで加えて反
応を停止し、得られた最終産物として肺炎３型多糖とＨＩＮ４７－ＨＩＤ－Ｋ５２２タン
パク質との部位特異的コンジュゲートＦ３－ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－Ｋ５２２－Ｃｕ（図１
ｌｉｎｅ ３参照）を得て、図１からわかるように、銅触媒Ｃｌｉｃｋ反応により目的
のタンパク質への多糖結合が行われた。
実施例５ 多糖部位特異的結合タンパク質の濾過性の評価
マルバーンレーザー粒子サイズアナライザーＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を用い
てコンジュゲートの粒度分布を分析した結果、多糖部位特異的結合タンパク質から得られ
たコンジュゲート製剤では、粒度分布が均一であり、明らかな凝集物が存在しておらず、
一方、従来の多糖タンパク質結合方法によって得られたコンジュゲートＦ３－ＨＩＮ４７
－ＨＩＤ－－Ｋ５２２－Ｃｕでは、粒度分布が不均一であり、凝集物が存在しており、図
２ａ－２に示すように、従来の多糖タンパク質結合方法は、３型多糖を６０℃の高温で加
水分解した後、過ヨウ素酸ナトリウム０．５ｇ／Ｌの条件下で、活性化反応を行い、最終
濃度２ｇ／Ｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより、得られた活性化多糖を０．１Ｍ
ｐＨ ６．５リン酸緩衝液にてキャリアタンパク質ＨＩＮ４７－ＨＩＤととともに５６時
間反応させた後、水素化ホウ素ナトリウム２ｇ／Ｌを加えて２時間反応させ続け、その後
、生理食塩水による限外濾過を行い、コンジュゲートＦ３－ＨＩＮ４７－ＨＩＤを得た。
実施例６ 多糖部位特異的結合タンパク質コンジュゲートの免疫原性評価
家ウサギモデルにおいて、各カップリング方式により得られたワクチンについて研究を
行った。例３、４、５は、肺炎連鎖球菌由来の３型莢膜多糖とＨＩＮ４７－ＨＩＤ型タン
パク質との多糖タンパク質コンジュゲート、及びリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）アジ
ュバントの、家ウサギの１価ワクチンの免疫応答への影響に関する。これらの効果は、抗
原特異的Ｅｌｉｓａによる血清ＩｇＧ濃度の測定、及びオプソニン食作用アッセイ（ＯＰ
Ａ）による抗体機能の測定により表された。図３は各カップリング方式により得られた３
型コンジュゲートの家ウサギ３回免疫Ｅｌｉｓａ結果を示している。その結果、対照と比
較して、例３、４、５の肺炎連鎖球菌由来の３型莢膜多糖とＨＩＮ４７－ＨＩＤ型タンパ
ク質との多糖タンパク質コンジュゲートは明らかな抗体力価を示した。
０週目、２週目、４週目に、計画されたヒトの臨床投与量（多糖２μｇ）の１／４の量
（多糖０．５μｇ）を用いて、ニュージーランドホワイトラビットを筋肉免疫し、異なる
時点で血清を採取し、Ｅｌｉｓａによる血清特異的ＩｇＧの測定、殺菌能力（ＯＰＡ）に
よる機能活性の評価を行った。
表５ ３型多糖タンパク質コンジュゲートの検出結果
Figure 0007366333000012
表６ ３型多糖タンパク質コンジュゲートの殺菌力（ＯＰＡ）の結果
Figure 0007366333000013

表５は３型多糖タンパク質コンジュゲートの検出結果を示しており、その結果から、部位
特異的結合により得られた３型多糖タンパク質コンジュゲートでは、遊離多糖と遊離タン
パク質のパーセンテージが未突然変異のキャリアタンパク質より明らかに小さかった。表
６は３型多糖タンパク質コンジュゲートの殺菌力（ＯＰＡ）の結果を示しており、部位特
異的結合により得られた３型多糖タンパク質コンジュゲートでは、家ウサギにおいて高い
抗体応答及び特異的殺菌力を明らかに誘導した。
実施例７ 多糖部位特異的結合タンパク質コンジュゲートの安全性検査
実施例３、４で製造された３つの多糖タンパク質コンジュゲートをサンプリングし、サ
ンプルごとに体重１８～２２ｇのマウス５匹と体重２５０～３５０ｇのモルモット２匹を
選び、マウスについて１匹ごとに腹側皮下でサンプルを０．５ｍｌ注射し、モルモットに
ついて１匹ごとに腹側皮下でサンプルを５ｍｌ注射し、７日間観察し、体重の変化を記録
し、その結果、観察期間内にすべてのマウス、モルモットは生存しており、異常反応もな
く、所定時間に達したときに、各マウス、モルモットの体重は注射前より増加した。この
ことから、本発明により製造された部位特異的結合ワクチンには、外因性毒性物質が汚染
されておらず、予期せぬ不安全な要素も存在していなかった。
実施例２～７は、ＨＩＮ４７－ＨＩＤ－－Ｋ５２２を例として、突然変異キャリアタン
パク質の製造、特徴、検出方法及び免疫原性評価などの効果実験を示しており、その他の
ＨＩＮ４７－ｌｉｎｋｅｒ－ＨＩＤ及びＨＩＤ－ｌｉｎｋｅｒ－ＨＩＮ４７の部位特異的
突然変異キャリアタンパク質はすべて上述の方法により製造され、免疫原性と安全性の評
価を行った結果、すべてＨＩＮ４７－ＨＩＤ－－Ｋ５２２に相当するレベルに達し、この
結果、部位特異的結合により得られた３型多糖タンパク質コンジュゲートは、家ウサギに
おいて、より高い抗体応答及び特異的殺菌能力を明らかに誘導した。
本発明は、好ましい実施例を上記のように開示したが、これらの実施例は請求項を限定
するためのものではなく、当業者であれば、本発明の構想を逸脱せず、いくつかの可能な
変更や修正を行うことができるので、本発明の特許範囲は、本発明の請求項に定められた
範囲に準じるべきである。
配列表
SEQUENCE LISTING

<110> CANSINO BIOLOGICS INC.

<120> CARRIER PROTEIN WITH SITE-DIRECTED MUTATION AND USE THEREOF IN
PREPARATION OF VACCINE

<150> CN201910978406.X
<151> 2019-10-15

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> CRM197

<400> 1

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15


Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30


Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45


Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60


Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser
65 70 75 80


Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95


Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110


Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125


Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140


Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160


Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175


Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190


Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205


Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220


Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240


Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255


Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270


Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285


Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300


Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320


Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335


Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350


Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365


Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380


Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400


Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415


Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430


Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445


Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460


Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480


Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495


Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510


His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525


Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540


His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560


<210> 2
<211> 792
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> HIN47-HID

<400> 2

Met Thr Leu Pro Ser Phe Val Ser Glu Gln Asn Ser Leu Ala Pro Met
1 5 10 15


Leu Glu Lys Val Gln Pro Ala Val Val Thr Leu Ser Val Glu Gly Lys
20 25 30


Ala Lys Val Asp Ser Arg Ser Pro Phe Leu Asp Asp Ile Pro Glu Glu
35 40 45


Phe Lys Phe Phe Phe Gly Asp Arg Phe Ala Glu Gln Phe Gly Gly Arg
50 55 60


Gly Glu Ser Lys Arg Asn Phe Arg Gly Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile
65 70 75 80


Asn Ala Ser Lys Gly Tyr Val Leu Thr Asn Asn Ala Val Ile Asp Glu
85 90 95


Ala Asp Lys Ile Thr Val Gln Leu Gln Asp Gly Arg Glu Phe Lys Ala
100 105 110


Lys Leu Val Gly Lys Asp Glu Leu Ser Asp Ile Ala Leu Val Gln Leu
115 120 125


Glu Lys Pro Ser Asn Leu Thr Glu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Asp Lys
130 135 140


Leu Arg Val Gly Asp Phe Thr Val Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu
145 150 155 160


Gly Gln Thr Val Thr Ser Gly Ile Val Ser Ala Leu Gly Arg Ser Thr
165 170 175


Gly Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Asn Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala
180 185 190


Val Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly Glu
195 200 205


Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Ala
210 215 220


Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val Gln
225 230 235 240


Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile Lys
245 250 255


Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser Ala
260 265 270


Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala Glu
275 280 285


Lys Ala Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ile Ile Thr Ala Met Asn Gly Gln
290 295 300


Lys Ile Ser Ser Phe Ala Glu Ile Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr Gly
305 310 315 320


Ala Gly Lys Glu Ile Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Asp Gly Lys Ser His
325 330 335


Asp Val Lys Met Lys Leu Gln Ala Asp Asp Ser Ser Gln Leu Ser Ser
340 345 350


Lys Thr Glu Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asp Tyr Asp
355 360 365


Ala Lys Gly Val Lys Gly Ile Glu Ile Thr Lys Ile Gln Pro Asn Ser
370 375 380


Leu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Ile Ile Ile Gly Ile
385 390 395 400


Asn Arg Gln Met Ile Glu Asn Ile Arg Glu Leu Asn Lys Val Leu Glu
405 410 415


Thr Glu Pro Ser Ala Val Ala Leu Asn Ile Leu Arg Gly Asp Ser Asn
420 425 430


Phe Tyr Leu Leu Val Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Pro Ser
435 440 445


Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp Lys Ile
450 455 460


Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His Thr Leu
465 470 475 480


Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Glu Gln
485 490 495


Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His Asp His
500 505 510


Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His Arg His
515 520 525


Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys Glu Ile
530 535 540


Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly Lys Gln
545 550 555 560


Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His Phe Arg
565 570 575


Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Glu Lys
580 585 590


Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro Trp
595 600 605


Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Lys Val
610 615 620


Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr Leu Gln
625 630 635 640


Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu Leu Pro
645 650 655


Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr Thr Asp
660 665 670


Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val Asn Tyr
675 680 685


Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val Val Lys
690 695 700


Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn Lys Glu
705 710 715 720


Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys Glu Leu
725 730 735


Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val Arg Lys Asp Ala
740 745 750


Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Ala Leu Leu
755 760 765


Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp Thr Gly
770 775 780


Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
785 790


<210> 3
<211> 791
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> HID-HIN47

<400> 3

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
1 5 10 15


Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30


Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45


Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60


Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80


Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95


Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys
100 105 110


Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys
115 120 125


Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln
130 135 140


Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile
145 150 155 160


Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu
165 170 175


Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met
180 185 190


Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr
195 200 205


Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile
210 215 220


Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr
225 230 235 240


Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala
245 250 255


Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu
260 265 270


Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu
275 280 285


Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val
290 295 300


Arg Lys Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr
305 310 315 320


Asp Ala Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe
325 330 335


Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys Gly Gly Ser Gly
340 345 350


Gly Ser Thr Leu Pro Ser Phe Val Ser Glu Gln Asn Ser Leu Ala Pro
355 360 365


Met Leu Glu Lys Val Gln Pro Ala Val Val Thr Leu Ser Val Glu Gly
370 375 380


Lys Ala Lys Val Asp Ser Arg Ser Pro Phe Leu Asp Asp Ile Pro Glu
385 390 395 400


Glu Phe Lys Phe Phe Phe Gly Asp Arg Phe Ala Glu Gln Phe Gly Gly
405 410 415


Arg Gly Glu Ser Lys Arg Asn Phe Arg Gly Leu Gly Ser Gly Val Ile
420 425 430


Ile Asn Ala Ser Lys Gly Tyr Val Leu Thr Asn Asn Ala Val Ile Asp
435 440 445


Glu Ala Asp Lys Ile Thr Val Gln Leu Gln Asp Gly Arg Glu Phe Lys
450 455 460


Ala Lys Leu Val Gly Lys Asp Glu Leu Ser Asp Ile Ala Leu Val Gln
465 470 475 480


Leu Glu Lys Pro Ser Asn Leu Thr Glu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Asp
485 490 495


Lys Leu Arg Val Gly Asp Phe Thr Val Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly
500 505 510


Leu Gly Gln Thr Val Thr Ser Gly Ile Val Ser Ala Leu Gly Arg Ser
515 520 525


Thr Gly Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Asn Tyr Ile Gln Thr Asp Ala
530 535 540


Ala Val Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly
545 550 555 560


Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn
565 570 575


Ala Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val
580 585 590


Gln Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile
595 600 605


Lys Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser
610 615 620


Ala Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala
625 630 635 640


Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ile Ile Thr Ala Met Asn Gly
645 650 655


Gln Lys Ile Ser Ser Phe Ala Glu Ile Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr
660 665 670


Gly Ala Gly Lys Glu Ile Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Asp Gly Lys Ser
675 680 685


His Asp Val Lys Met Lys Leu Gln Ala Asp Asp Ser Ser Gln Leu Ser
690 695 700


Ser Lys Thr Glu Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asp Tyr
705 710 715 720


Asp Ala Lys Gly Val Lys Gly Ile Glu Ile Thr Lys Ile Gln Pro Asn
725 730 735


Ser Leu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Ile Ile Ile Gly
740 745 750


Ile Asn Arg Gln Met Ile Glu Asn Ile Arg Glu Leu Asn Lys Val Leu
755 760 765


Glu Thr Glu Pro Ser Ala Val Ala Leu Asn Ile Leu Arg Gly Asp Ser
770 775 780


Asn Phe Tyr Leu Leu Val Gln
785 790


<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 4
ccgatgtagc ctagaaattt cctcataggc ataggaaag 39


<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 5
tttctaggct acatcggtta agccgtccag aa 32


<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 6
gaccaaatag gggaaacagg ctcaagtgta tcc 33


<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 7
gtttccccta tttggtctcg aaattttccg tc 32


<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 8
aaaacctagc tccttcctca gatgggaatg ga 32


<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 9
ggaaggagct aggtttttat gcgtttcagt tcatt 35


<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 10
cgaaaggata gtgggtaaac tacaattatg attggatg 38


<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 11
tacccactat cctttcggat ctttttcctg gg 32


<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 12
tagagtaccg ggtcagactc cggcacctac ga 32


<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 13
tctgacccgg tactctagcc cagagcggaa actatcc 37


<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 14
tgctatctag tcaccgagcg gcggtaatgc gg 32


<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 15
tcggtgacta gatagcagta ttgataccga tcaattc 37


<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 16
ttaggcggga attgcgttcg caattcccag ta 32


<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 17
acgcaattcc cgcctaaccg ccgctcggtg agat 34


<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 18
aatgcgggat aggcgttcgc aattcccagt aa 32


<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 19
aacgcctatc ccgcattacc gccgctcggt ga 32


<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 20
gctgaaattt aggcaaaaat tgctacaact ggtgc 35


<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 21
tttgcctaaa tttcagcaaa cgaagagatt ttc 33


<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 22
tcgcgcatag attgctacaa ctggtgcagg ca 32


<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 23
tagcaatcta tgcgcgaatt tcagcaaacg aa 32


<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 24
ccgatgtagc ctagaaattt cctcataggc ataggaaag 39


<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 25
tttctaggct acatcggtta agccgtccag aa 32


<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 26
gaccaaatag gggaaacagg ctcaagtgta tcc 33


<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 27
gtttccccta tttggtctcg aaattttccg tc 32


<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 28
aaaacctagc tccttcctca gatgggaatg ga 32


<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 29
ggaaggagct aggtttttat gcgtttcagt tcatt 35


<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 30
cgaaaggata gtgggtaaac tacaattatg attggatg 38


<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 31
tacccactat cctttcggat ctttttcctg gg 32


<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 32
tagagtaccg ggtcagactc cggcacctac ga 32


<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 33
tctgacccgg tactctagcc cagagcggaa actatcc 37


<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 34
tgctatctag tcaccgagcg gcggtaatgc gg 32


<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 35
tcggtgacta gatagcagta ttgataccga tcaattc 37


<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 36
ttaggcggga attgcgttcg caattcccag ta 32


<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 37
acgcaattcc cgcctaaccg ccgctcggtg agat 34


<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 38
aatgcgggat aggcgttcgc aattcccagt aa 32


<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 39
aacgcctatc ccgcattacc gccgctcggt ga 32


<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 40
gctgaaattt aggcaaaaat tgctacaact ggtgc 35


<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 41
tttgcctaaa tttcagcaaa cgaagagatt ttc 33


<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 42
tcgcgcatag attgctacaa ctggtgcagg ca 32


<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Primer

<400> 43
tagcaatcta tgcgcgaatt tcagcaaacg aa 32

Claims (14)

  1. 部位特異的突然変異キャリアタンパク質であって、融合タンパク質ＨＩＮ４７－ＨＩＤ
    又は融合タンパク質ＨＩＤ－ＨＩＮ４７から選択され、前記キャリアタンパク質上の少な
    くとも１つの部位のアミノ酸が、アジド基又はアルキニル末端基を含有する非天然アミノ
    酸に突然変異され、前記融合タンパク質ＨＩＮ４７－ＨＩＤ突然変異部位は、ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ：２の１７４Ｒ位、２１７Ｉ位、２２３Ｎ位、２２６Ｉ位、３１３Ｒ位、３１５
    Ｋ位、５２２Ｋ位、５５７Ｄ位、６５３Ｅ位又は６８４Ｙ位から選択され、前記融合タン
    パク質ＨＩＤ－ＨＩＮ４７突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の７８Ｋ位、１１３
    Ｄ位、２０９Ｅ位、２４０Ｙ位、５２７Ｒ位、５７０Ｉ位、５７６Ｎ位、５７９Ｉ位、６
    ６６Ｒ位又は６６８Ｋ位から選択される、ことを特徴とする部位特異的突然変異キャリア
    タンパク質。
  2. 前記非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体、チロシン誘導体、グルタミン誘導体
    、アラニン誘導体、システイン誘導体、セリン誘導体又はリジン誘導体である、ことを特
    徴とする請求項１に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質。
  3. 前記非天然アミノ酸は
    Figure 0007366333000014
    である、ことを特徴とする請求項１に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質。
  4. 突然変異前のキャリアタンパク質のアミノ酸配列の突然変異部位のアミノ酸がＬｙｓ－
    ａｚｉｄｏに突然変異されており、前記突然変異アミノ酸は以下の式で示されるように連
    結されている、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の部位特異的突然変
    異キャリアタンパク質。
    Figure 0007366333000015
    （ここで、ＡＡは突然変異部位の前後のアミノ酸であり、Ｒ１は
    Figure 0007366333000016
    である。）
  5. 部位特異的突然変異キャリアタンパク質コンジュゲートであって、請求項１～４のいず
    れか１項に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質と、アルキニル末端基が含まれ
    るか又は修飾された糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド又は小分子化合物とを用いて製造
    された、ことを特徴とする部位特異的突然変異キャリアタンパク質コンジュゲート。
  6. 突然変異前のキャリアタンパク質のアミノ酸配列の突然変異部位のアミノ酸は、以下の
    ような構造に突然変異されている、ことを特徴とする請求項５に記載の部位特異的突然変
    異キャリアタンパク質コンジュゲート。
    Figure 0007366333000017
    、又は、
    Figure 0007366333000018
    （ここで、
    ＡＡは突然変異部位の前後のアミノ酸であり、
    Ｒ２は、糖、核酸、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシル末端修飾基である。）
  7. 請求項１～４のいずれか１項に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質と、アル
    キニル末端基が含まれるか又は修飾された多糖とをコンジュゲートした糖コンジュゲート
    である、ことを特徴とする請求項５又は６に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク
    質コンジュゲート。
  8. 前記糖コンジュゲートにおいて、糖：キャリアタンパク質の比率（ｗ／ｗ）が０．３～
    ３である、ことを特徴とする請求項７に記載の部位特異的突然変異キャリアタンパク質コ
    ンジュゲート。
  9. 前記多糖の糖反復単位が１０～５０個である、ことを特徴とする請求項７又は８に記載
    の部位特異的突然変異キャリアタンパク質コンジュゲート。
  10. 請求項７～９のいずれか１項に記載の糖コンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤
    、担体又は希釈剤とを含む、ことを特徴とする免疫原性組成物。
  11. 前記糖コンジュゲートは、肺炎球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、
    ８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１
    ９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ又は３３Ｆから選択される１種又は２種以上の組み合わせの
    莢膜多糖の糖コンジュゲートである、ことを特徴とする請求項１０に記載の免疫原性組成
    物。
  12. 多価肺炎球菌多糖と、請求項１～４のいずれか１項に記載の部位特異的突然変異キャリ
    アタンパク質の２種以上とで形成されている、ことを特徴とする肺炎多価結合ワクチン。
  13. ワクチンの製造における、請求項１～４のいずれか１項に記載の部位特異的突然変異キ
    ャリアタンパク質、請求項５～９のいずれか１項に記載の部位特異的突然変異キャリアタ
    ンパク質コンジュゲート、又は請求項１０～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
    の使用。
  14. 前記ワクチンはインフルエンザワクチン又は肺炎ワクチンである、請求項１３に記載の
    使用。
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