CN1406245B - 去除人血清白蛋白多聚体的方法 - Google Patents

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Abstract

将含有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液与用盐浓度为10～150mM、pH5～9.5的缓冲液平衡的阴离子交换体相接触，并且以此为特征的去除人血清白蛋白的方法。

Description

去除人血清白蛋白多聚体的方法
技术领域
本发明涉及去除人血清白蛋白多聚体的方法。具体指的是在特定的条件下，通过将含有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液与阴离子交换体相接触，去除人血清白蛋白多聚体的方法。
背景技术
人血清白蛋白(以下称为“HSA”)是血浆中的主要成分，由585个氨基酸的单链多肽组成，分子量约66000道尔顿(Minghetti，P.P.etal(1986)Molecular structure of the human albumin gene is revealedby nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4.J.Biol.Chem.261，6747-6757)。已知HSA的主要功能是维持血液的正常渗透压和结合血液中出现的钙离子、脂肪酸、胆红素、色氨酸以及药物等各种物质，并在这些物质的转运中起到了载体的作用。纯化的HSA用于治疗例如：外科手术、出血性休克以及烫伤和肾性综合症等由于白蛋白的损失导致的低白蛋白血症。
最初，根据低温乙醇分级法或者以这种方法为基准的方法，从人血浆中得到HSA组分(HSA组分分级为V)后，进一步利用各种纯化方法制备HSA。并且，近年来，采用不依赖人血浆为原料的方法，应用基因重组技术开发出在酵母和大肠杆菌、枯草杆菌中生产人血清白蛋白的技术。
参考在酵母中(1)Production of Recombinant Human SerumAlbumin from Saccharomyces cerevisiae；Quirk，R.et.al，Biotechnology and Applied Biochemistry 11，273-287(1989)、(2)Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene intheYeast，Saccharomyces cerevisiae；Ken.Okabayashi  et.al，J.Biochemistry，110，103-110(1991)、(3)Yeast Systems for theCommercial Production of Heterologous proteins；Richard G.Buckholz and Martin A.G.Gleeson，Bio/Technology 9，1067-1072(1991)、在大肠杆菌(4)Construction of DNA sequences and their usefor microbial production of proteins，in particular human serum albumin；Lawn，R.M.，European Patent Appl.73，646(1983)、(5)Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E.coli；Latta，L.et.al.Biotechnique 5，1309-1314(1897)、在枯草杆菌(6)Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis；Saunders，C.W.et.al，J.Bacteriol.169，2917-2925(1987)。
人血清白蛋白的纯化方法一般使用蛋白质化学中常规使用的纯化方法，例如：使用盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析方法等。实际上，在纯化人血清白蛋白时，由于其中混有来自生物组织、细胞、血液等的多种夹杂物，所以采用上述方法的复杂组合进行纯化。
进行人血清白蛋白工业生产时，必须在不同于人的体内环境的各种条件下进行处理，因此生成了人血清白蛋白的多聚体。在临床应用人血清白蛋白时，尽管尚未见到报告这种多聚体对人体产生的坏影响，但是怀疑这种多聚体能够表现出新的抗原性。从医药的安全性角度出发，在医药用“人血清白蛋白”检验标准中规定了多聚体混入量的限度，因此在制造上，尽可能降低制剂中的多聚体含量是非常重要的课题。
这种人血清白蛋白多聚体是由2个或者2个以上的单体结合而成的，其等电点和化学性质与单体十分相似，按照常规生产中采取的纯化方法很难分离。因此，采用以前的技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、等电点分级处理、硫酸铵分级处理、乙醇分级处理等数种纯化方法的组合使之除去(特表平11-509525(国际公开WO96/37515)、第2926722号专利(平成11年5月14日注册)。
如果组合使用多种纯化方法，累计相乘各个步骤的回收率，往往导致生产率低下。从工业生产的角度出发，希望能够尽量减少纯化步骤并且有效的除去多聚体，即期待开发出高效回收单体的方法。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种有效的，通过仅实施单阶段工序以除去在人血清白蛋白的制造步骤中生成的人血清白蛋白多聚体的方法。
此外，本发明的另一个目的是提供安全性高的药用人血清白蛋白。
本发明提供将含有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液与用盐浓度为10～150mM、pH5～9.5的缓冲液平衡化的阴离子交换体相接触，并且以此为特征的去除人血清白蛋白的方法。本发明还包括通过采用该方法的制造步骤制造的降低人血清白蛋白多聚体含量的高纯度的人血清白蛋白。下面针对本发明进行详细的阐述。
附图的简单说明
图1所示的是于75mM NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中透析后的试料(处理前)与透析后的试料加到用同缓冲液平衡化的强阴离子交换层析柱上后收集到的直接流出的组分(处理后)，通过凝胶过滤HPLC进行分析时得到的结果。
实施发明的最佳方式
本发明的方法以用适当盐浓度的缓冲液调制含有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液后，将该人血清白蛋白溶液与以同缓冲液平衡化的阴离子交换体相接触，通过阴离子交换体吸附上述的多聚体而将其除去，进而回收高纯度的人血清白蛋白为特征。通过实施这种方法，能够有效的得到基本不合有人血清白蛋白多聚体的高纯度的人血清白蛋白。
作为供给上述阴离子交换体的人血清白蛋白，使用的是通过基因重组技术得到的重组型的人血清白蛋白(以下称之为“rHSA”)或者HSA。
进行血浆来源的HSA制造的时候，能够预测到在制造的各个步骤中生成的多聚体，在任何一个步骤中生产的含有多聚体的水溶液都可以使用。例如：低温乙醇分级分离的组分V的水溶液、将组分V提供用于进一步纯化步骤(层析法或者热处理等)时在随后的各个纯化阶段所产生的含有多聚体的水溶液等。
同样也能够使用rHSA制造时在各个制造步骤中所产生的含有多聚体的水溶液。例如：rHSA产生宿主的培养物、这种培养物用于进一步制造步骤(层析、热处理等)时生成的含有各纯化阶段的多聚体的水溶液等。在这里所说的培养物指的是培养上述宿主的培养液以及按照通常使用的方法将宿主破碎得到的合有破碎的宿主破碎液的物质。
生产rHSA所使用的宿主，没有特殊的限制。例如可以使用：酵母、大肠杆菌、枯草杆菌以及动物细胞等，其中较好的是酵母。例如：使用糖酵母属和毕赤氏酵母属，最好使用啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22株或者它的变异株。
本发明的方法有望用于将含有血浆或者重组宿主来源的夹杂物的人血清白蛋白溶液通过超滤、加热处理、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤以及盐析等处理步骤，进行了一定程度纯化(HSA或者rHSA的纯度在约85％以上)的基础之上。
用于调制上述的白蛋白溶液的缓冲液的种类没有特定的限制，优选使用常规的阴离子交换层析时使用的磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液。缓冲液中缓冲成分的浓度一般根据进行阴离子交换层析的条件设定。即优选5～22mM，尤其优选10～100mM。
缓冲液的pH设定在该缓冲液不含有盐成分的条件下，能够使人血清白蛋白多聚体吸附到阴离子交换体上的范围为佳。即，pH5～9.5范围，优选pH5.5～7.5范围，尤其优选pH6～7范围。
向缓冲液中添加的盐可以使用氯化钠、氯化钾等碱金属的氯化物，优选使用氯化钠。该盐的浓度优选能够吸附多聚体而又不吸附单体的浓度范围，根据所用的缓冲液的种类、浓度以及pH的组合，适当的进行调整，可以在10～150mM的范围内使用，优选25～100mM，尤其优选50～75mM的范围。
溶解在盐浓度为10～150mM、pH5～9.5的缓冲液中的含有人血清白蛋白的多聚体的人血清白蛋白溶液是通过将溶解在任意溶液中的人血清白蛋白溶液在盐浓度为10～150mM、pH5～9.5的缓冲液中透析置换的方法、凝胶过滤法、将浓缩后的人血清白蛋白以前述缓冲液反复进行稀释的置换方法得到的。
只要在该白蛋白的溶解浓度范围内，不特殊限定人血清白蛋白溶液中的人血清白蛋白的浓度，优选1～30％，尤其优选5～25％.
不特殊限定阴离子交换体的基体载体，优选不对人血清白蛋白非特异性吸附的载体。此外，阴离子交换基团既可以使用强的阴离子交换基团也可以使用弱的阴离子交换基团。优选使用强阴离子交换基团。所说的具有强阴离子交换基团的强阴离子交换体如例所示有：Q-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia-Biotech公司制)、Cellufine Q(Millipore公司制)，不过没有特殊限定。
作为使用阴离子交换体去除白蛋白多聚体的方法，是一种采用通过将含有白蛋白多聚体的白蛋白溶液加到层析柱上，使阴离子交换体选择性的吸附白蛋白多聚体，回收不含有多聚体的直接流通的组分的方法。例如：采用分批式方法将该白蛋白溶液与阴离子交换体相接触，使多聚体被阴离子交换体选择性的吸附后，将该溶液自然放置或者离心分离阴离子交换体，回收所得到的上清的方法。其他方法也可以。例如：进行柱层析时，柱子的尺寸、流速等的层析条件根据试验材料的浓度、体积进行适当的调整。例如：针对10L的10％的人血清白蛋白，采用25L容积的阴离子交换体、柱尺寸(700cm2x 35cm)、设定流速为1200ml/分钟。
人血清白蛋白多聚体的去除程度可以采用将回收液的一部分经凝胶高效液相层析(HPLC)分析的方法进行检测。例如：使用TSKgelG3000SW(Tosoh公司制)的柱子，以0.1MKH2PO4/0.3M NaCl缓冲液进行洗脱，于280nm进行吸光度测定。
实施例
调制例1：制备含有多聚体的人血清白蛋白溶液
根据特表平11-509525所述的方法，用酵母(Saccharomycescerevisiae)生产rHSA。将含有rHSA的培养液用纯水进行2倍稀释后，用醋酸水溶液调节pH为4.5。用含有50mM氯化钠的50mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)加样到平衡化的STREAMLINE SP柱子(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)(柱径60cm x 16cm)上。然后，用和平衡柱子时所用的缓冲液相同的缓冲液进行洗涤，之后，用含有300mM氯化钠的50mM的醋酸钠缓冲液(pH9.0)进行洗脱，得到含有rHSA的组分。将该STREAMLINE SP柱子的洗脱HSA组分于硼酸盐中调节pH9.0，放置5小时，将人血清白蛋白的多聚体的一部分单体化。
实施例1：继透析之后的强阴离子交换层析
将根据调制例的方法制备的人血清白蛋白多聚体含量为6.1％(根据凝胶过滤HPLC分析得到的定量值)的人血清白蛋白溶液在分别含有50mM、75mM或100mM的氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，于室温透析8小时后，将该人血清白蛋白溶液加到预先用同样的缓冲液平衡的Q-Sepharose FF柱上(直径2.5cm x 10cm)，以同一种缓冲液(500ml、洗脱速度12ml/分钟)进行洗脱，将流出的组分全部回收。
试验例1：凝胶过滤HPLC分析
将实施例1中流出的组分0.02ml加到以含有0.3M NaCl的0.1MKH2PO4缓冲液平衡的TSKgel G3000SW(Tosoh公司制)的柱子(直径0.75cmx30cm)，在280nm检测波长进行凝胶过滤HPLC分析。图1以及表1所示的是实施例1的分析结果。
表1
  试料   rHSA回收率(％)   单体含量(％)   多聚体含量(％)
  处理前   93.9   6.1
  50mM NaCl   98.3   100.0   0.0
  75mM NaCl   97.2   100.0   0.0
  100mM NaCl   98.5   98.1   1.9
表1所示的是将人血清白蛋白溶液在含有50～75mM氯化钠的磷酸缓冲液中进行透析后，将该溶液通过用同种缓冲液平衡化的强阴离子交换柱，使强阴离子交换体选择性的吸附多聚体，以高回收率得到降低了多聚体浓度的人血清白蛋白。
产业上应用的可能性
可以根据本发明，用混有人血清白蛋白多聚体的人血清白蛋白溶液调制成选定的缓冲液成分，将此溶液与用同种缓冲液平衡的阴离子交换体进行接触，进而有效的除去这种多聚体，以高收率回收单体。
此外，根据本发明的方法，能够提供基本不含有作为可能造成人体用药时引发过敏反应等的副作用的原因的人血清白蛋白多聚体的高纯度的人血清白蛋白。

Claims (3)

1.一种纯化来自酵母的重组人血清白蛋白的方法，其包括以下步骤：(1)用盐浓度为50～100mM，pH值为6～7的缓冲液透析重组人血清白蛋白，其中所述盐是碱金属氯化物，然后(2)将透析过的重组人血清白蛋白溶液加到用相同缓冲液平衡后的阴离子交换柱上，从而从白蛋白多聚体分离白蛋白单体。
2.权利要求1的方法，其中缓冲液所含的盐是选自NaCl和KCl的碱金属氯化物。
3.权利要求1的方法，其中缓冲液所含的盐是NaCl。
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