CN1313493C - 包括加热处理步骤的人血清白蛋白的制造方法 - Google Patents

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Abstract

以将含有夹杂物的人血清白蛋白溶液在该夹杂物的等电点附近的pH进行包括加热处理步骤为特征的人血清白蛋白的制造方法。

Description

包括加热处理步骤的人血清白蛋白的制造方法
技术领域
本发明是关于人血清白蛋白的制造方法。具体指的是关于在由基因重组技术得到的重组型的人血清白蛋白(以下称之为“rHSA”)的制造步骤中，包括在来自宿主的夹杂物(主要是蛋白质)的等电点附近，进行加热处理步骤的rHSA的制造方法。
背景技术
人血清白蛋白(以下称为“HSA”)是血浆中的主要成分，由585个氨基酸的单链多肽组成，分子量约66000Dr(Minghetti，P.P.et al(1986)Molecular structure of the human albumin gene isrevealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4.J.Biol.Chem.261，6747-6757)。已知HSA的主要功能是维持血液的正常渗透压和结合血液中出现的钙离子、脂肪酸、胆红素、色氨酸以及药物等各种物质，并在这些物质的转运中起到了载体的作用。纯化的HSA用于治疗例如：外科手术、出血性休克以及烫伤和肾性综合症等由于白蛋白的损失导致的低白蛋白血症。
最初，根据低温乙醇分级法或者以这种方法为基准的方法，从人血浆得到HSA组分(HSA组分分级为V)后，进一步利用各种纯化方法进行HSA的制备。并且，近年来，作为不依赖人血浆为原料的方法，应用基因重组技术开发了在酵母和大肠杆菌、枯草杆菌中生产人血清白蛋白的技术。
参考在酵母中(1)Production of Recombinant Human SerumAlbumin from Saccharomyces cerevisiae；Quirk，R.et.al，Biotechnology and Applied Biochemistry 11，273-287(1989)、(2)Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in theYeast，Saccharomyces cerevisiae；Ken.Okabayashi et.al，J.Biochemistry，110，103-110(1991)、(3)Yeast Systems for theCommercial Production of Heterologous proteins；Richard G.Buckholz and Martin A.G.Gleeson，Bio/Technology 9，1067-1072(1991)、在大肠杆菌(4)Construction of DNA sequences and theiruse for microbial production of proteins，in particular humanserum albumin；Lawn，R.M.，European Patent Appl.73，646(1983)、(5)Synthesis and Purification of mature humanserum albumin from E.coli；Latta，L.et.al.Biotechnique5，1309-1314(1897)、在枯草杆菌(6)Secretion of human serumalbumin from Bacillus subtilis；Saunders，C.W.et.al，J.Bacteriol.169，2917-2925(1987)。
人血清白蛋白的纯化方法一般使用蛋白质化学中常规使用的纯化方法，例如：使用盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析方法等。实际上，在纯化人血清白蛋白时，由于其中混有来自生物组织、细胞、血液等的多种夹杂物，所以采用上述方法的复杂组合进行纯化。例如：特开平5-317079中记载了将产生人血清白蛋白的重组酵母的培养上清通过超滤、加热处理、酸处理，再次超滤后供给阳离子交换体、疏水性层析、阴离子交换体、盐析的各种处理构成的这种人血清白蛋白的制造方法。
该制造方法采取在还原剂存在的情况下，进行加热处理抑制着色。另外，有几份报告报道了包括加热处理步骤的人血清白蛋白的制造方法。确认了基于加热处理的种种效果。
例如：特公平6-71434以及特开平8-116985中记载了，在乙酰基色氨酸或有机羧酸存在的情况下，将通过基因操作制备的人血清白蛋白的培养上清于50℃～70℃加热1～5小时使蛋白水解酶失活的报道。
此外，在特开平7-126182中还记载了将重组人白蛋白制剂通过在50～70℃加热30分钟以上使污染的微生物失活的报道。
发明内容
不过，在上述组合有加热步骤的重组白蛋白制造步骤中，没有任何一项报道了去除污染蛋白质的方法。因此，本发明的目的是提供有效的去除人血清白蛋白中存在的夹杂物的方法。
此外，本发明的另外目的是提供安全性高的作为药品的人血清白蛋白。
本发明者等人就以上目的进行了刻苦研究，最终将生产重组人血清白蛋白酵母的培养物进行稀释，通过阳离子交换、碱性处理将白蛋白多聚体单体化，并且，进行超滤后，将得到的含rHSA溶液在其宿主来源污染蛋白质的等电点附近的pH进行加热处理，发现能够有效的去除宿主来源的污染蛋白质，本发明是基于此发现完成的。
本发明提供的是以包括将含有夹杂物的人血清白蛋白溶液在这种夹杂物等电点附近的pH进行加热处理步骤为特征的人血清白蛋白的制造方法。本发明还包括提供根据这种方法得到的不含有污染蛋白质的高纯度的rHSA。下面，就本发明进行详细说明。
附图的简单说明
图1所示的是凝胶过滤HPLC分析结果的谱图。
实施本发明的最佳方式
本发明的方法是以在人血清白蛋白的制造步骤中，将混有宿主来源的污染蛋白质的人血清白蛋白溶液在宿主来源的污染蛋白质的等电点附近的pH进行加热处理为特征的方法。通过实施这种方法，能够容易的去除来自酵母的夹杂物，制造高纯度的人血清白蛋白。
作为供给本发明加热处理的对象，如例所示：混有通过基因重组技术得到的rHSA产生宿主来源的污染蛋白质的rHSA溶液。所用的宿主没有特殊的限制，例如使用：酵母、大肠杆菌、枯草杆菌以及动物细胞等，优选酵母，例如使用糖酵母属和毕赤氏酵母属，最好使用啤酒糖酵母AH22株或者它的变异株。本发明的方法，不限于用于产生rHSA的重组体宿主，对于含有血浆来源的蛋白夹杂物的情况也同样适用。
本发明的加热处理能够用于rHSA(或者血浆来源的人血清白蛋白)制造步骤的任何阶段。例如：本发明的方法有望用于生产人血清白蛋白的重组酵母的培养液上清或者酵母的破碎液、将上述上清或者破碎液进行适当的前处理后的含有rHSA溶液、以及经离子交换体、吸附层析、凝胶过滤、盐析等处理的进一步纯化步骤。本发明的方法优选用于将rHSA产生酵母的培养上清用纯水稀释2～3倍后，阳离子交换体、碱性处理以及超滤后。
所说的阳离子交换体处理按照常规的方法进行。所用的阳离子交换体如例所示有：磺基琼脂糖、磺基纤维素、磺丙基琼脂糖、磺丙基右旋糖酐、磺丙基聚乙烯、羧甲基琼脂糖、羧甲基右旋糖酐以及羧甲基纤维素。其中任何一种都可以用作载体。例如：可以采用如下方法，向用含有50mM的氯化钠的50mM醋酸缓冲液(pH4.5)平衡的阳离子交换柱上添加调整至同一pH的人血清白蛋白溶液，洗涤后，用含有300mM氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH9.0)进行洗脱，得到HAS组分。
之后，开始将培养或者制造步骤中生成的人血清白蛋白的多聚体进行达到单体化的碱性处理。多聚体进行单体化时，采用pH8～11，优选采用pH8.5～9.5范围的碱性水溶液。
进行碱性处理的温度，不限定为室温，只要是HSA以及rHSA不发生变性的温度即可。例如：可以采用0～65℃的范围进行处理，优选在室温(25℃)下放置的方法。
人血清白蛋白的多聚体进行单体化，将含有多聚体的水溶液和碱性溶液混合后，放置15分钟以上。优选放置3个小时以上，放置时间上限没有特殊限定。
用于使碱性处理液的pH碱性化的化学物质没有特殊的限定。例如：碱性有机化合物、碱性无机化合物，具体指的是：氨、氨盐、碱性金属的氢氧化物(例如：氢氧化钠、氢氧化钾)、硼酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、三羟氨基甲烷以及由上述2种以上的混合物组成的组中选用的物质。
所加入的化学物质，在使人血清白蛋白不能够发生变性的范围内使用。
进行碱性处理时，向碱性处理液中添加具有SH基化合物，用来抑制HSA分子内以及/或者HSA分子间、进一步HSA和夹杂物(主要认为是蛋白质)之间的错误交联，进而有效的实现单体化。
在这一处理中所用的含SH基化合物，只要是含有SH基官能团的化合物即可，没有特殊的限制。较好的是含有SH基的低分子量的化合物。具体指的是半胱氨酸、巯乙胺、胱胺和蛋氨酸等。优选采用半胱氨酸。
含有SH基化合物的添加量，针对1～100mg/mL的rHSA浓度，添加SH基化合物0.1～50mM为较好，0.2～15mM更好，0.5～5mM最好。
然后，用超滤膜(分级分子量1万)浓缩含有HSA溶液，调整pH到夹杂物的等电点附近，进行加热处理。
优选在50℃～70℃，尤其优选55℃～60℃，最优选60℃进行加热处理。加热时间优选30分钟～5小时，尤其优选1小时。
加热处理时的pH优选在夹杂物的等电点附近。例如：当用啤酒糖酵母AH22株或其变异株作为人血清白蛋白产生宿主时，优选pH4～7，尤其优选pH5～6，最优选pH5.5。
此外，加热处理时的人血清白蛋白浓度，只要是能够溶解这种人血清白蛋白的浓度即可，没有特殊的限制，优选10～250mg/ml，尤其优选80～120mg/ml。
加热处理步骤后的人血清白蛋白的纯度可以通过凝胶过滤HPLC分析进行测定。所用的柱子，例如可以使用TSKgel G300 SW(Tosoh公司制备)柱子，用0.1M KH2PO4/0.3M NaCl缓冲液洗脱，在280nm测定吸光度，用通过相同的方法得到的未加热处理的人血清白蛋白溶液作为对照。
此外，用和本发明同样的方法处理人血清白蛋白非产生酵母培养液，将粗提物免疫兔子，用得到的抗血清，通过酶免疫测定法(EIA)测定纯化的rHSA溶液中存在的酵母由来成分。
实施例
调制例1：制备含有多聚体的人血清白蛋白溶液
根据特表平11-509525所述的方法，用酵母(Saccharomycescerevisiae)生产rHSA。将含有rHSA的培养液用纯水进行2倍稀释后，用醋酸水溶液调节pH为4.5。用含有50mM氯化钠的50mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)加样到平衡化的STREAMLINE SP柱子(AmershamPharmacia Biotech公司制造)(柱径60cm×16cm)上。然后，用和平衡柱子时所用的缓冲液相同的缓冲液进行洗涤，之后，用含有300mM氯化钠的50mM的磷酸钠缓冲液(pH9.0)进行洗脱，得到含有rHSA的组分。
调制例2：含有半胱氨酸白蛋白溶液的碱性处理
向得到的含有rHSA组分(10ml)中添加1mM半胱氨酸，添加5％(W/V)四硼酸二钾溶液(15ml)至终浓度3％(pH约9.0)，于室温放置5小时。之后，向该溶液中添加醋酸水溶液，调节至pH7.0，终止碱性处理。
实施例：加热处理
之后，用分级分子量1万的超滤膜(Zartrius公司制)将rHSA水溶液浓缩至rHSA浓度为约100mg/ml，同时以含有5mM辛酸钠的50mM的磷酸缓冲液(pH5.5)进行交换。将此rHSA溶液在60℃加热处理1小时。接着，冷却到室温，通过离心除去生成的沉淀，并回收上清。
试验例1：凝胶过滤HPLC分析
将前述上清0.2ml加到预先用0.1M KH2PO4/0.3M NaCl缓冲液平衡好的TSKgel G300 SW(Tosoh公司制备)柱子(直径0.75cm×30cm)上。用相同的缓冲液洗脱，将洗脱液在280nm波长处进行测定。以根据同样的方法得到非加热处理的人血清白蛋白溶液作为对照。其结果如图1所示。
试验例2：酵母由来成分的分析
用和本发明同样的方法处理人血清白蛋白非产生酵母培养液，将粗提物免疫兔子，用得到的抗血清，按照常规方法进行ELISA测定体系的构建，测定本发明得到HSA溶液中存在的酵母由来成分。其结果如表1所示。
表1
  试料   每1g rHSA的蛋白质质量(μg)   清除率
  加热处理前   1140
  加热处理后   194   5.9
产业上利用的可能性
根据本发明，通过将混有来自宿主的污染蛋白质的含有人血清白蛋白溶液在这种夹杂物的等电点附近pH进行加热处理，能够简单并且有效的除去这种污染蛋白质。
此外，根据本发明，能够提供降低在人体用药是导致过敏反应等的副作用的可能的原因的来自宿主物质的含量的、高纯度的人血清白蛋白。通过将本发明与其他的纯化方法相组合，能够制造纯度更高的人血清白蛋白。

Claims (4)

1.重组人血清白蛋白的制造方法，其特征在于包括将含有夹杂物的重组人血清白蛋白溶液在夹杂物的等电点附近的pH4.0～6.5，温度为50～70℃的条件下进行加热处理以去除来自酵母细胞的夹杂物的步骤，所述夹杂物是来源于酵母细胞的蛋白。
2.权利要求1记载的方法，其中加热处理进行0.5～5小时。
3.权利要求2记载的方法，其中在pH5.0～6.0，温度为55～60℃的条件下进行加热处理。
4.权利要求2记载的方法，其中在pH5.5～6.0，温度为55～60℃的条件下进行加热处理，时间为1小时。
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