WO2002034787A1 - Procede d"elaboration d"albumine de serum d"origine humaine comportant une etape de chauffage - Google Patents

Procede d"elaboration d"albumine de serum d"origine humaine comportant une etape de chauffage Download PDF

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WO2002034787A1
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serum albumin
human serum
heat treatment
yeast
solution
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Toshinobu Nouchi
Hiroshi Mizokami
Yoshitaka Tajima
Yoshinobu Miyatsu
Masahiro Sakaguchi
Kazunari Yagi
Original Assignee
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing human serum albumin. More specifically, in the process of producing recombinant human serum albumin (hereinafter sometimes referred to as rHSA) obtained by genetic recombination, heating is performed near the isoelectric point of host-derived contaminants (mainly proteins).
  • rHSA recombinant human serum albumin
  • the present invention relates to a method of producing HSA including a step of treating.
  • HSA Human serum albumin
  • HSA Human serum albumin
  • the purified HSA is used, for example, for the treatment of hypoalbuminemia due to albumin loss such as surgery, hemorrhagic shock or burns or nephrotic syndrome.
  • HSA has been obtained from human plasma by low-temperature ethanol fractionation of corn or an HSA fraction (HSA is fractionated into fraction V) according to the method, and then various purification methods are used. It is manufactured.
  • human serum albumin has been applied to yeast, Escherichia coli, and Bacillus subtilis by applying genetic recombination technology. Techniques for producing min have been developed.
  • Serum Albumin Gene in the Yeast Saccharomyces cerevisiae; Ken.
  • purification methods usually used in protein diagnosing for example, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange chromatography method , Gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like can be used.
  • protein diagnosing for example, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange chromatography method , Gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like can be used.
  • the culture supernatant of the recombinant yeast producing human serum albumin was subjected to ultrafiltration, heat treatment, acid treatment, ultrafiltration again, and then a cation exchanger, 3 ⁇ 47J ⁇
  • a method for producing the human serum albumin which comprises subjecting it to each of the following treatments: kutomatto, anion exchanger, and salt prayer.
  • This manufacturing method is intended to suppress coloring by performing a heat treatment in the presence of a reducing agent.
  • Several other methods for producing human serum albumin including a heat treatment step have been reported, and various effects based on the heat treatment have been recognized. For example, Japanese Patent Publication No. 6-711434 and Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • 8-116985 disclose the culture supernatant of human serum albumin prepared by genetic manipulation, using acetyltributophan or an organic carboxylic acid. It is described that heating at 50 ° C. to 70 ° C. for 1 to 5 hours in the presence of is inactivating the protease.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-126182 describes that contaminating microorganisms are inactivated by heating a recombinant human albumin preparation at 50 to 70 ° C. for 30 minutes or more.
  • an object of the present invention is to provide a method for effectively removing contaminants present in human serum albumin.
  • Another object of the present invention is to provide human serum albumin which is highly safe as a pharmaceutical.
  • the present inventors have made intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, have diluted the culture of human serum albumin-producing recombinant yeast, cation-exchanged, monomerized albumin multimer by alkali treatment, and After filtration, the resulting rHSA-containing solution was subjected to a heat treatment at a pH near the isoelectric point of the host-derived protein, thereby finding that the host-derived contaminating protein was effectively removed.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a method for producing human serum albumin, comprising a step of heat-treating a human serum albumin solution containing impurities at a pH near the isoelectric point of the impurities. It provides the law.
  • the present invention also includes high-purity rHSA containing no contaminating proteins obtained by the method.
  • the present invention will be described in detail.
  • FIG. 1 is a drawing showing analysis results of gel filtration HPLC. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the method of the present invention is characterized in that, in the process of producing human serum albumin, a human serum albumin solution containing host-derived contaminating proteins is heated at a pH near the isoelectric point of host-derived contaminating proteins. is there.
  • yeast-derived contaminants can be easily removed, and high-purity human serum albumin can be produced.
  • An object to be subjected to the heat treatment of the present invention includes an rHSA-containing solution containing contaminant proteins derived from an rHSA-producing host obtained by a genetic recombination technique.
  • Such hosts are not particularly limited, and include yeast, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and animal cells.
  • yeast for example, Saccharomyces or Pichia is used, and more preferably, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain or a mutant thereof is used.
  • the method of the present invention can be applied not only to rHSA-producing recombinant hosts but also to cases where protein components derived from plasma are contained as impurities.
  • the heat treatment of the present invention can be used at any stage of the rHSA (or plasma-derived human serum albumin) production process.
  • the method of the present invention may be carried out using a culture supernatant of a recombinant yeast producing human serum albumin or a crushed yeast solution, a rHSA-containing solution appropriately pretreated with these, or an ion exchanger, adsorption chromatography, or gel filtration. It is desirable to use it at the stage where purification has progressed through processing such as salt prayer.
  • the culture supernatant of rHSA-producing yeast was diluted 2- to 3-fold with purified water. Later applied after cation exchanger, alkali treatment and ultrafiltration.
  • the cation exchanger treatment is performed according to a usual method.
  • the cation exchanger include sulfoagarose, sulfocell mouth, sulfopropyl-agarose, sulfopropyl-dextran, sulfopropyl-polyvinyl, carboxymethyl-agarose, carboxymethyl-dextran, and carboxymethyl-cellulose.
  • any carrier may be used.
  • a human serum albumin solution adjusted to the same pH is added to a cation exchange column equilibrated with 5 (M-acid buffer (PH4.5)) containing sodium chloride, washed, and washed with 300 mM sodium chloride. Elution with 50m phosphate buffer (pH 9.0) containing danidium to obtain HSA fraction ⁇
  • an alkali treatment is performed to monomerize the multimer of human serum albumin generated in the culture or production process.
  • an aqueous solution of an alkaline solution having a pH of from 8 to 11, preferably from pH 8.5 to 9.5 is used.
  • the temperature for the alkali treatment is not necessarily room temperature, and the treatment can be performed at a temperature at which HSA and rHSA are not denatured, for example, in the range of 0 to 65 ° C.
  • the method of leaving at room temperature (about 25 ° C) is adopted.
  • Monomerization of a multimer of human serum albumin is performed by mixing an aqueous solution containing the multimer and an alkaline solution, and then allowing the mixture to stand for at least 15 minutes. Preferably, it is 3 hours or more, and the upper limit is not particularly limited.
  • the chemical substance used to make the pH of the processing solution of the fermentation viscous is not particularly limited.
  • alkaline organic compounds, alkaline inorganic compounds, specifically, ammonia, ammonium salts, basic metal hydroxides (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide), borates, phosphates, acetates examples thereof include substances selected from the group consisting of oxalate, citrate, trishydroxyamino methane, and a mixture of two or more of these.
  • Such chemicals are used at concentrations that do not denature human serum albumin.
  • the SH group-containing compound used in the treatment is not particularly limited as long as it is a compound containing a functional group SH group, but a low molecular compound having an SH group is preferable.
  • Specific examples include cysteine, cysteamine, cisamine, methionine, and the like.
  • cysteine is used.
  • the amount of the SH group-containing compound to be added is 0.1 to 50 mM, preferably 0.2 to 15 mM, more preferably 0.5 to 5 mM, with respect to the rHSA concentration of 1 to 100 nig / ml.
  • the pH is adjusted to near the isoelectric point of the contaminants, and heat treatment is performed.
  • the heat treatment is preferably performed at 50 ° C to 70 ° C, more preferably at 55 ° C; to 60 ° C, most preferably at 60 ° C.
  • the heating time is preferably 30 minutes to 5 hours, more preferably 1 hour.
  • the pH during the heat treatment is preferably around the isoelectric point of the contaminants.
  • the pH is preferably 4 to 7, and more preferably Is pH 5-6, most preferably pH 5.5 ⁇
  • the concentration of human serum albumin during the heat treatment is not particularly limited as long as the human serum albumin can be dissolved, but is preferably 10 to 250 mg / ml, more preferably 80 to 20 mg / ml. It is.
  • the purity of human serum albumin after the heat treatment step can be measured by gel filtration HPLC analysis.
  • For the column for example, use TSKgel G300SW (manufactured by Tosoichi). Used, and developed with 0.1MK3 ⁇ 4P0 4 /0.3MNaCl buffer, measuring the absorbance of 2 8 0 nm.
  • a non-heat-treated human serum albumin solution obtained by the same method is used.
  • yeast According to the method described in Tokuhei 1 1—5 0 9 5 25, yeast (
  • Saccharomyces cerevisiae produced rHSA.
  • the culture solution containing rHSA was diluted with purified water to about twice the volume, and then adjusted to pH 4.5 with an acetic acid aqueous solution. It was applied to a streamline SP column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) (diameter: 60 cm ⁇ 16 cm) equilibrated with a 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) containing 50 mM salted sodium. Next, the column was washed with the same buffer as that used for equilibration of the column. Next, 50 phosphate buffer (PH9.0) containing 300 mM sodium chloride was sent to the column, and rHSA was transferred. The containing fraction was obtained.
  • Preparation Example 2 Alcamine treatment of cysteine-containing albumin solution
  • the rHSA aqueous solution was concentrated at an rHSA concentration of about 100 mg / m using an ultrafiltration membrane (manufactured by Sartorius) having a molecular weight cut-off of 10,000, and a 50 mM phosphate buffer containing 5 mM sodium caprylate.
  • the solution was changed to pH 5.5.
  • the rHSA solution was heated at 60 for 1 hour.
  • the mixture was cooled to room temperature, the generated precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was recovered.
  • Experimental example 1 Gel filtration HPLC analysis
  • a human serum albumin non-producing yeast culture was roughly purified in the same manner as in the present invention, and immunized to rabbits.
  • an ELISA measurement system was constructed according to a standard method, and the HS obtained in the present invention was obtained. Yeast-derived components present in the A-containing solution were measured. The results are shown in Table 1.
  • table 1 A human serum albumin non-producing yeast culture was roughly purified in the same manner as in the present invention, and immunized to rabbits.
  • an ELISA measurement system was constructed according to a standard method, and the HS obtained in the present invention was obtained.
  • Yeast-derived components present in the A-containing solution were measured. The results are shown in Table 1.
  • table 1 A human serum albumin non-producing yeast culture was roughly purified in the same manner as in the present invention, and immunized to rabbits.
  • an ELISA measurement system was constructed according to a standard method, and the HS obtained in the present invention was obtained.
  • a human serum albumin-containing solution containing host-derived contaminant proteins is subjected to a heat treatment at a pH near the isoelectric point of the contaminants, whereby the contaminant proteins can be easily and effectively removed. Can be removed.
  • high-purity human serum albumin having a reduced content of host-derived substances that cause side effects such as allergy when administered to humans.

Description

明細書 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 技術分野
本発明は、 ヒト血清アルブミンの製造方法に関する。 より詳細には、 遺伝子組 換え技術により得られる組換え型ヒト血清アルブミン （以下、 r H S Aと称する こともある） の製造工程において、 宿主由来の夾雑物 （主として蛋白質） の等電 点近傍で加熱処理する工程を含む r H S Aの製造方法に関する。 背景技術
ヒト血清アルブミン （以下、 H S Aと称することもある） は、 血漿中の主要な 蛋白質成分で、 585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、 約 66，000ダルト ンの分子量を有する（Minghetti, P. P. et al. (1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11 - 22 of chromosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。 H S Aは、 主に血液の正常 な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、 脂肪酸、 ピリルビン、 トリプ トフアン、 薬物など様々なものと結合し、 これらを運搬するキャリアーとしての 役割を果たすことが知られている。 純ィ匕した H S Aは、 例えば、 外科手術、 出血 性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アル ブミン血症の治療に使用される。
従来、 H S Aは、 ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法 に準じて、 H S A画分 （H S Aは画分 Vに分画される） を得た後、 更に、 種々の 精製方法を駆使して製造されている。 また近年、 原料をヒト血漿に依存しない方 法として、 遺伝子組換え技術を応用して酵母や大腸菌、 枯草菌にヒト血清アルブ ミンを生産させる技術が開発されている。
酵母については、 ( 1 ) Production of Recombinant Human Serum Albumin from
Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied
Biochemistry 11， 273-287( 1989)、 (2) Secretory Expression of the Human
Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken.
Okabayashi et. al, J. Biochemistry, 110, 103-110(1991 )、 (3) Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G.
Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9， 1067-1072( 1991)、 大 腸菌については (4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin;
Lawn, R. M.， European Patent Appl. 73, 646 ( 1983)、 (5) Synthesis and
Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al . Biotechnique 5， 1309-1314 (1897)、 枯草菌については (6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtil is; Saunders, C. W. et. al, J.
Bacteriol . 169, 2917-2925 ( 1987)参照。
ヒト血清アルブミンの精製方法としては、 一般に、 蛋白質ィ匕学において通常使 用される精製方法、 例えば、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 ゲル濾過クロマトグラフィー法、 ァフィニテ ィークロマトグラフィー法等を用いることができる。 実際には、 生体組織、 細胞
、 血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、 ヒト血清アルブミンの精 製は、 上記方法の複雑な組み合わせにより行われている。例えば、 特開平 5— 3
1 7 0 7 9には、 ヒト血清アルブミンを産生する組換え酵母の培養上清を、 限外 濾過し、 加熱処理、 酸処理し、 再び限外濾過した後、 陽イオン交換体、 ¾7J<性ク 口マト、 陰イオン交換体、 塩祈の各処理に供することからなる、 該ヒト血清アル ブミンの製造方法が記載されている。 この製造方法は、 還元剤の存在下で加熱処理することにより、 着色を抑制しよ うとするものである。 他にも加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 が幾つか報告されており、 加熱処理に基づく種々の効果が認められている。 例えば、 特公平 6— 7 1 4 3 4及び特開平 8— 1 1 6 9 8 5には、 遺伝子操作 により調製されたヒト血清アルブミンの培養上清を、 ァセチルトリブトファン又 は有機カルボン酸の存在下で、 50°C〜70°C、 1〜5時間加熱することにより、 プ 口テァ一ゼが不活化されることが記載されている。
また、 特開平 7— 1 2 6 1 8 2には、 組換えヒトアルブミン製剤を、 50〜70°C 、 30分間以上加熱することによって夾雑微生物が不活化されることが記載されて いる。
発明の開示
しかしながら、 上記の組換えアルブミンの製造工程に組み入れられた加熱処理 は、 いずれも夾雑蛋白質の除去方法を開示するものではない。 したがって、 本発 明の目的は、 ヒト血清アルブミン中に存在する夾雑物を効果的に除去する方法を 提供することにある。
また、 本発明の他の目的は、 医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを 提供することにある。
本発明者らは、 上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、 ヒト血清アルブミン 産生組換え酵母の培養物を希釈、 陽イオン交換、 アルカリ処理によるアルブミン 多量体の単量体化、 及び限外濾過処理を行った後、 得られた r H S A含有溶液を 宿主由来蛋白質の等電点近傍の pHで加熱処理することによって、 該宿主由来の夾 雑蛋白質が効果的に除去されることを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、 該夾雑物の等電点近 傍の pHで加熱処理する工程を含むことを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方 法を提供するものである。 本発明はまた、 該方法により得られた夾雑蛋白質を含 有しない高純度 r H S Aを包含する。 以下、 本発明について詳述する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ゲル濾過 H P L Cの分析結果を示す図面である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、 ヒト血清アルプミンの製造工程において、 宿主由来の夾雑蛋 白質が混在するヒト血清アルブミン溶液を宿主由来夾雑蛋白質の等電点近傍の pH で加熱処理することを特徴とするものである。 この方法を実施することにより、 例.えば、 酵母由来の夾雑物を容易に除去することができ、 高純度のヒト血清アル ブミンの製造が可能となる。
本発明の加熱処理に供される対象として、 遺伝子組換え技術によって得られた r H S A産生宿主由来の夾雑蛋白質が混在する r H S A含有溶液が挙げられる。 斯かる宿主には特に制限はなく、 酵母、 大腸菌、 枯草菌及び動物細胞などが挙げ られる。 好ましくは、 酵母、 例えば、 サヅカロミセス属、 ピキア属が使用される が、 更に好ましくは、 サヅカロミセスセレピシェ AH22株又はその変異株が用い られる。 本発明の方法は、 r H S A産生性の組換え体宿主に限らず、 血漿由来の 蛋白成分が夾雑物として含まれている場合にも適用することが出来る。
本発明の加熱処理は、 r H S A (又は血漿由来のヒト血清アルブミン）製造ェ 程の任意の段階で使用することが出来る。例えば、 本発明の方法は、 ヒト血清ァ ルプミンを生産する組換え酵母の培養上清若しくは酵母の破砕液、 これらを適当 に前処理した r H S A含有溶液、 又はイオン交換体、 吸着クロマト、 ゲル濾過、 塩祈などの処理を経て精製が進んだ段階で使用することが望ましい。好ましくは 、 本発明の方法は、 r H S A産生酵母の培養上清を精製水で 2〜3倍に希釈した 後、 陽イオン交換体、 アルカリ処理及び限外濾過後に適用される。
該陽イオン交換体処理は、 通常の方法に準じて行われる。 陽イオン交換体とし ては、 スルホーアガロース、 スルホ—セル口一ス、 スルホプロピル一ァガロース 、 スルホプロピル一デキストラン、 スルホプロピル一ポリビニル、 カルボキシメ チルーァガロース、 カルボキシメチル一デキストラン、 カルボキシメチル—セル ロースなどが挙げられるが、 いずれの担体を使用しても良い。 例えば、 50 . 化ナトリゥムを含む 5(M»酸緩衝液 (PH4.5)で平衡ィ匕した陽イオン交換カラムに 、 同 pHに調整したヒト血清アルブミン溶液を添加し、 洗浄後、 300mM塩ィ匕ナトリ ゥムを含む 50m リン酸緩衝液 (pH9.0)で溶出し H S A画分を得る方法が取られる ο
次いで、 培養又は製造工程で生じたヒト血清アルブミンの多量体を単量体化す るためにアルカリ処理が行われる。 多量体の単量体化には、 pH 8〜l 1、 好まし くは、 pH8.5〜9.5の範囲のアル力リ水溶液が使用される。
アルカリ処理を行う際の温度は、 必ずしも室温である必要はなく、 H S A及び r H S Aを変性しない温度、 例えば、 0〜65°Cの範囲で処理することができる。 好ましくは、 室温 （約 25°C) で放置する方法が取られる。
ヒト血清アルブミンの多量体の単量体化は、 多量体を含有する水溶液とアル力 リ性溶液を混合した後、 15分以上放置することにより行われる。 好ましくは、 3 時間以上であり、 上限は特に限定されない。
アル力リ処理液の pHをアル力リ性にするのに使用される化学物質は、 特に限定 されない。 例えば、 アルカリ性有機化合物、 アルカリ性無機化合物、 具体的には 、 アンモニア、 アンモニゥム塩、 塩基性金属水酸化物 （例えば、 水酸化ナトリウ ム、 水酸化カリウム） 、 ホウ酸塩、 リン酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 クェン酸塩、 ト リスヒドロキシァミノメタン及びこれらの 2種以上の混合物からなる群より選ば れる物質が挙げられる。 かかる化学物質は、 ヒト血清アルブミンを変性させない濃度で使用される。 アルカリ処理において、 そのアルカリ処理液中に S H基を有する化合物を添カロ すると、 H S A分子内及び/又は H S A分子間、 さらには H S Aと夾雑物 （主と して、 蛋白質と考えられる） とのミスホールディングが抑制され、 より効果的に 単量体化が達成される。
当該処理に用いる S H基含有化合物としては、 官能基 S H基を含む化合物で あるならば特に限定されないが、 S H基を有する低分子化合物が好ましい。 具体 的には、 システィン、 システアミン、 シス夕ミン、 メチォニンなどが挙げられる が、 好ましくは、 システィンが用いられる。
S H基含有化合物の添加量は、 1〜； 100 nig/mlの r H S A濃度に対し、 0.1〜50 mM、 好ましくは 0.2~15mM、 更に好ましくは 0.5〜5 mMである。
次いで、 限外濾過膜 （分画分子量 1万） を用いて H S A含有溶液を濃縮した後 、 pHを夾雑物の等電点近傍に調整し、 加熱処理が行われる。
加熱処理は、 好ましくは 50°C〜70°C、 更に好ましくは 55°C；〜 60°C、 最も好まし くは 60°Cで行われる。 加熱時間は、 好ましくは 30分間〜 5時間、 更に好ましくは 1時間である。
加熱処理する際の pHは、 夾雑物の等電点付近が好ましく、 例えば、 酵母サッカ 口ミセスセレビジェ AH22株又はその変異株をヒト血清アルブミン産生宿主とした 場合、 好ましくは pH4〜7、 更に好ましくは pH5〜6、 最も好ましくは pH5.5である ο
また、 加熱処理する際のヒト血清アルブミン濃度は、 該ヒト血清アルブミンが 溶解する濃度であれば特に制限はないが、 好ましくは、 10〜250mg/ml、 更に好ま しくは、 80〜； I20mg/mlである。
加熱処理工程後のヒト血清アルブミンの純度は、 ゲル濾過 H P L C分析により 測定することができる。 カラムには、 例えば、 TSKgel G300SW (東ソ一社製） を 用い、 0.1MK¾P04/0.3MNaCl緩衝液で展開し、 2 8 0 nmの吸光度を測定する。 コントロールとして、 同様の方法により得た非加熱処理のヒト血清アルプミン溶 液を用いる。
また、 ヒト血清アルブミン非産生酵母の培養液を本法と同様の方法で粗精製 したものをゥサギに免疫し、 得られた抗血清を用いて精製 r H S A中に存在する 酵母由来成分を、 酵素免疫測定法 （E I A法） により測定することもできる。 実施例
調製例 1 ：多量体を含有するヒ卜血清アルブミン溶液の調製
特表平 1 1— 5 0 9 5 2 5に述べられている方法に従って、 酵母 （
Saccharomyces cerevisiae) により r H S Aを生産させた。 この r H S Aを含む 培養液を精製水で約 2倍容量になるように希釈後、 酢酸水溶液を用いて pH4.5に 調整した。 50 mM塩ィ匕ナトリゥムを含む 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH4.5)で平 衡化したストリ一ムライン S Pカラム （アマシャム■フアルマシア ·バイオテク 社製） （径 60cmx l6cm)に適用した。 次に、 カラムの平衡ィ匕に用いた緩衝液と同 じ緩衝液で洗浄し、 次に、 300 mM塩ィ匕ナトリゥムを含む 50 リン酸緩衝液 (PH9.0)を送液して r H S A含有画分を得た。 調製例 2 ：システィン含有アルプミン溶液のアル力リ処理
得られた r H S A含有画分 （10ml) に 1 mMシスティンを添加し、 5 % (W/V) 四ホウ酸二カリウム液 （15ml) を終濃度 3 % (pH約 9.0) となるように添カロし、 室温で 5時間放置した。 次いで、 該溶液に酢酸水溶液を加え、 pH7.0に調整しァ ルカリ処理を終了した。 実施例 1 ：加熱処理
続いて、 該 r H S A水溶液を、 分画分子量 1万の限外濾過膜（ザルトリウス 社製） を用いて rHSA濃度約 100mg/mほで濃縮すると共に、 5mMカプリル酸ナ トリウムを含む 50mMリン酸緩衝液 (pH5.5) に交換した。 該 rHSA溶液を、 60 で、 1時間加熱処理した。 続いて、 室温まで冷却し、 生じた沈殿を遠心除去し、 上清を回収した。 実験例 1 ：ゲル濾過 H P L C分析
前記上清 0.2mlを、 0.1MKH2P04/0.3應 aCl緩衝液で平衡ィ匕した TSKgel G300SW ( 東ソ一社製） カラム （径 0.75cmx30cm) にかけ、 同緩衝液で溶出し、 溶出液 を、 波長 280 nmで測定した。 コントロールとして、 同様の方法により得た非 加熱処理のヒト血清アルプミン溶液を用いた。 その分析結果を図 1に示す。 実験例 2 ：酵母由来成分の分析
ヒト血清アルプミン非産生酵母培養液を本発明と同様の方法で粗精製したもの を、 ゥサギに免疫し、 得られた抗血清を用いて ELISA測定系を定法に従って構築 し、 本発明で得た HS A含有溶液中に存在する酵母由来成分を測定した。 その結 果を表 1に示す。 表 1
試料 rHSAl g当りの クリアランス
蛋白質量 {j g)
加熱処理前 1 140
加熱処理後 194 5. 9 産業上の利用可能性
本発明によれば、 宿主由来の夾雑蛋白質が混在するヒト血清アルブミン含有溶 液を、 該夾雑物の等電点近傍の pHで加熱処理をすることによって、 該夾雑蛋白質 を簡単に、 且つ効果的に除去することができる。
また、 本発明によれば、 ヒトに投与された場合アレルギーなどの副作用の原 因となる宿主由来物質の含有量が低減された高純度のヒト血清アルブミンが提供 される。 本発明を他の精製方法と組み合わせて利用することによって、 更に高純 度のヒト血清アルプミンを製造することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1. 夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、 該夾雑物の等電点近傍の pHで 加熱処理する工程を含むことを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。
2. 加熱処理が、 50〜70°Cで行われる請求項 1に記載の方法。
3. 加熱処理が、 55~60°Cで行われる請求項 2に記載の方法。
4. 加熱処理が、 0.5〜5時間行われる請求項 1ないし 3のいずれか 1項記載の方 法。
5. 加熱処理が、 1時間行われる請求項 4記載の方法。
6. 加熱処理が、 pH4〜7で行われる請求項 1ないし 5のいずれか 1項記載の方法
7. 加熱処理が、 pH5.0〜6.5で行われる請求項 6記載の方法。
8. 加熱処理が、 pH5.5〜6.0で行われる請求項 7記載の方法。
9. 夾雑物が、 酵母由来の蛋白質である請求項 1ないし 8のいずれか 1項記載の 方法。
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