RU2031125C1 - Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека - Google Patents
Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2031125C1 RU2031125C1 SU4717846A RU2031125C1 RU 2031125 C1 RU2031125 C1 RU 2031125C1 SU 4717846 A SU4717846 A SU 4717846A RU 2031125 C1 RU2031125 C1 RU 2031125C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interleukin
- human recombinant
- strain
- purification
- chromatography
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения очищенного препарата рекомбинантного интерлейкина-2. Целью изобретения является повышение активности и обеспечение высокой степени очистки целевого продукта. Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека, секретируемого дрожжами saccharomyces cerevisiae из культуральной среды штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) (ВКПМ У -1038), состоит из следующих основных этапов: выращивания клеток штамма GRF 18-pJOB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата; концентрирования интерлейкина-2 с помощью СМ-сефадекса или СМ-целлюлозы; очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой, лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека имеет удельную биологическую активность 10-30 млн.ед/мг. Электрофоретическая чистота свыше 90% и удельная биологическая активность в тесте на индукцию пролиферации клеток линии CTLL-2 10-30 млн. международных ед/мг белка. 2 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения очищенного препарата рекомбинантного интерлейкина-2 человека из культуральной среды штамма дрожжей S.cerevision ВКПМ-У-1038, секретирующего интерлейкин-2 в культуральную среду.
Цель изобретения - повышение активности и обеспечение высокой степени очистки целевого продукта.
Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 из культуральной среды штамма Saccharomyces cerevisial ВКПМ У-1038 (GRF 18-pJDB(ALPHOIL) состоит из следующих основных этапов:
- выращивания клеток штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата;
- отделения клеток дрожжей центрифугированием от культуральной жидкости;
- сорбции интерлейкина-2 на СМ-сефадекс или СМ-целлюлозе, отделения сорбента седиментацией и последующей элюции интерлейкина-2 высокосолевым буфером;
- очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой (Octyl = Si 300 Polyol фирмы "Serva" или аналогичной) и лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола.
- выращивания клеток штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата;
- отделения клеток дрожжей центрифугированием от культуральной жидкости;
- сорбции интерлейкина-2 на СМ-сефадекс или СМ-целлюлозе, отделения сорбента седиментацией и последующей элюции интерлейкина-2 высокосолевым буфером;
- очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой (Octyl = Si 300 Polyol фирмы "Serva" или аналогичной) и лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола.
Получаемый по этому методу интерлейкин-2 человека характеризуется электрофоретической чистотой свыше 90% и имеет удельную биологическую активность в тесте на индукцию пролиферации клеток линии CTLL-2 10-30 млн. международных ед/мг белка.
П р и м е р. Штамм дрожжей S.cerevisial GRF 18-pJDB (ALPHOIL) (депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ У-1038) выращивают в 2 л минеральной среды SC, состав которой: 0,67% Jeast Nitrogen Base фирмы "Difco", 2% глюкозы. Кроме основных компонентов, среда должна содержать L-гистидин в концентрации 50 мг/мл. Выращивание продолжают в течение 48 ч при температуре 30оС в качалке со скоростью 170-190 об/мин. Далее клетки отделяют от среды центрифугированием, промывают один раз стерильной водой и переносят в 4 л свежей минеральной среды, аналогичной среде SC, также содержащей гистидин, но имеющей пониженное содержание неорганического фосфата (вместо 1500 ед/л однозамещенного фосфата калия у среды SС - 30 мг/л однозамещенного фосфата калия и 1500 мг хлористого калия). Дрожжевые клетки культивируют в этой среде в указанных условиях в течение 24-48 ч. За это время культура достигает оптической плотности 5-8 при 600 нм.
Культуральную среду отделяют от клеток центрифугированием, затем, в случае необходимости, доводят рН среды до 4,8 добавлением разбавленной натриевой щелочи и вносят в среду 150 мл суспензии СМ-сефадекса С-25 (фирмы "Фармация", Швеция) или СМ-целлюлозы (Servacel СМ 23, "Реанал", Венгрия). Суспензию медленно перемешивают с помощью механической мешалки в течение 3 ч при 4оС. Далее смолу отделяют декантацией, промывают 3 раза 0,5-литровыми порциями 30 мМ натрий-цитратного буфера, рН 4,8 и суспендируют в 0,4 л 1,5 М натрий-цитратного буфера рН 4,8. Суспензию осторожно перемешивают 8 ч при 4оС, после чего смолу промывают один раз 200 мл того же буфера. Элюаты объединяют, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин и наносят на колонку с обращенно-фазным носителем.
Хроматографию проводят на колонке 22х250 мм со смолой в обращенной фазе Ostyl = Si 300 Polyol, средний размер зерна 10 мкм ("Серва", ФРГ). Для проведения хроматографии необходим жидкостной хроматограф, например "Altex" ("Бекман", Австрия) или аналогичный прибор с двумя жидкостными насосами высокого давления и возможностью программирования линейного градиента. Смолу уравновешивают 0,1% трифторуксусной кислотой и после нанесения со скоростью 10 мл/мин препарата интерлейкина-2 с предыдущей стадии и промывки в течение 5 мин с той же скоростью 0,1% трифторуксусной кислотой проводят элюцию с помощью следующей программы, состоящей из серии линейных градиентов двух растворов: элюент А-0,1% трифторуксусная кислота, элюент В-0,1% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле: 0 - 5 мин 0 - 30% В 5 - 10 мин 30 - 40% В 10 - 40 мин 40-60% В 40-45 мин 60-80% В
Элюция проводится со скоростью 10 мл/мин, причем элюат собирается фракциями по 15-18 мл. В ходе хроматографии непрерывно регистрируется оптическая плотность элюата при 280 нм. Как правило, пик интерлейкина-2 легко обнаруживается в конце хроматограммы (фиг.1), в области градиента, соответствующей примерно 55% концентрации ацетонитрила. Из фракций в той области, где предполагается элюция интерлейкина-2, отбирают аликвоты по 100 мкл, высушивают их в вакууме, растворяют в 0,125М трис-гидрохлоридном буфере, рН 6,8, содержащем 1% додецилсульфата натрия и 1% меркаптоэтанола, и прогревают 2 мин при 100оС. Подготовленные таким образом пробы анализируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер - 0,2М глицин, оттитрованный трис-основанием до рН 8,3, буфер для геля 0,375М трис-гидрохлорид, рН 8,9, оба буфера содержат 0,1% додецилсульфат натрия). Электрофорез ведут в пластинах геля 100х150х1,5 мм при мощности 25 Вт в течение 3 ч. Гели окрашивают 0,025% раствором кумасси R-250 в 25% изопропаноле и 7% уксусной кислоте при нагревании до 80оС в течение 30 мин. Отмывку проводят 7% уксусной кислотой при нагревании до 80оС в течение нескольких часов при периодической смене раствора. Результаты электрофоретического анализа позволяют точно определить границы пика интерлейкина-2.
Элюция проводится со скоростью 10 мл/мин, причем элюат собирается фракциями по 15-18 мл. В ходе хроматографии непрерывно регистрируется оптическая плотность элюата при 280 нм. Как правило, пик интерлейкина-2 легко обнаруживается в конце хроматограммы (фиг.1), в области градиента, соответствующей примерно 55% концентрации ацетонитрила. Из фракций в той области, где предполагается элюция интерлейкина-2, отбирают аликвоты по 100 мкл, высушивают их в вакууме, растворяют в 0,125М трис-гидрохлоридном буфере, рН 6,8, содержащем 1% додецилсульфата натрия и 1% меркаптоэтанола, и прогревают 2 мин при 100оС. Подготовленные таким образом пробы анализируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер - 0,2М глицин, оттитрованный трис-основанием до рН 8,3, буфер для геля 0,375М трис-гидрохлорид, рН 8,9, оба буфера содержат 0,1% додецилсульфат натрия). Электрофорез ведут в пластинах геля 100х150х1,5 мм при мощности 25 Вт в течение 3 ч. Гели окрашивают 0,025% раствором кумасси R-250 в 25% изопропаноле и 7% уксусной кислоте при нагревании до 80оС в течение 30 мин. Отмывку проводят 7% уксусной кислотой при нагревании до 80оС в течение нескольких часов при периодической смене раствора. Результаты электрофоретического анализа позволяют точно определить границы пика интерлейкина-2.
Фракции, содержащие интерлейкин-2, объединяют, добавляют маннитол до концентрации 5 мг/мл, разливают аликвотами по 5-10 мл и лиофильно высушивают.
Каждая из приготовленных таким образом аликвот препарата интерлейкина-2 человека может быть растворена в 0,5-1 мл воды, без добавления додецилсульфата натрия или других денатурирующих агентов.
Чистоту препарата и концентрацию интерлейкина-2 проверяют, проводя электрофорез одной из порций препарата. Условия электрофореза указаны. Помимо образцов интерлейкина-2 на тот же гель наносят заведомо известные количества бычьего сывороточного альбумина (1, 2, 4 мкг). После прокрашивания и отмывки проводят сканирование геля на спектрофотометре DU8 ("Бекман", Австрия) при длине волны 600 нм. Сравнивая площади пиков альбумина и интерлейкина-2, определяют количество интерлейкина-2 в образце. Как видно из фиг. 2, препарат интерлейкина-2, полученный по предлагаемому методу, имеет высокую чистоту.
Общий выход очищенного интерлейкина-2 составляет 2-4 мг (из 4 л исходной дрожжевой культуры).
Биологическая активность рекомбинантного интерлейкина-2, очищенного по предлагаемой схеме, соответствует биологической активности нерекомбинантного интерлейкина-2 человека, очищаемого из культуры человеческих клеток, и составляет 10-30 млн. инт.ед./мг белка.
Способ поясняется фиг.1 и 2. На фиг.1 представлен профиль элюции препарата интерлейкина-2 с колонки Ostyl = Si 300 Polyol, стрелкой показано положение пика интерлейкина-2; на фиг.2 - результат сканирования электрофоретограммы очищенного препарата интерлейкина-2, синтезированного и секретированного и секретированного дрожжами Caccharomyces cerevisiae.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, предусматривающий культивирование штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1038 на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата и отделение культуральной жидкости от биомассы центрифугированием, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и обеспечения высокой степени очистки целевого продукта, сорбируют интерлейкин-2 из культуральной жидкости на СМ-сефадекс или СМ-целлюлозу, отделяют сорбент седиментацией, элюируют интерлейкин-2 высокосолевым буфером, элюат подвергают хроматографии на смоле с обращенной фазой и фракции, содержащие интерлейкин-2, лиофильно высушивают в присутствии маннитола.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4717846 RU2031125C1 (ru) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4717846 RU2031125C1 (ru) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2031125C1 true RU2031125C1 (ru) | 1995-03-20 |
Family
ID=21460333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4717846 RU2031125C1 (ru) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2031125C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2565553C2 (ru) * | 2013-04-09 | 2015-10-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Стратегия" | Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат |
-
1989
- 1989-07-13 RU SU4717846 patent/RU2031125C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Авторское свидетельство СССР N 1830945, кл. C 12N 15/00, 1988. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2565553C2 (ru) * | 2013-04-09 | 2015-10-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Стратегия" | Способ получения препарата интерлейкина-2, препарат интерлейкина-2 и фармацевтический иммуномодулирующий препарат |
| EA027601B1 (ru) * | 2013-04-09 | 2017-08-31 | Общество с ограниченной ответственностью "Стратегия" | Способ получения препарата интерлейкина-2 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1312031C (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| Erlanson et al. | Purification and characterization of two proteins with co-lipase activity from porcine pancreas | |
| US6399333B1 (en) | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins | |
| Khazaeli et al. | Cadmium-binding component in Escherichia coli during accommodation to low levels of this ion | |
| US4485017A (en) | Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography | |
| CA2469815A1 (en) | Methods for purifying protein | |
| CN1031943C (zh) | 蛋白质纯化方法 | |
| Gordon et al. | [29] Isolation of bacterial chain elongation factors | |
| US5484887A (en) | Homogeneous interleukin 1 | |
| US4751078A (en) | Process for the purification of gamma interferon | |
| Herbert et al. | Crystal Protein of Bacillus thuringiensis var. tolworthi: subunit structure and toxicity to Pieris brassicae | |
| US4990447A (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| Addeo et al. | Fractionation of whole casein on hydroxyapatite. Application to a study of buffalo κ-casein | |
| RU2031125C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека | |
| Reinwald et al. | Purification of the variant antigens of Trypanosoma congolense. A new approach to the isolation of glycoproteins | |
| Novak-Hofer et al. | Two-dimensional separation of chloroplast membrane proteins by isoelectri focusing and electrophoresis in sodium dodecyl sulphate | |
| Roberts et al. | The preparation and purification of individual human pepsins by using diethylaminoethyl-cellulose | |
| Balekjian et al. | Histones isolated from human parotid fluid | |
| Petrides et al. | Rapid isolation of the 7S‐nerve growth factor complex and its subunits from murine submaxillary glands and saliva | |
| KR940010024B1 (ko) | α-인터페론의 제조 및 정제 방법 | |
| Lehman et al. | A novel process for the large-scale purification of recombinant tick anticoagulant peptide using perfusion chromatography | |
| Low | The use of the FplcR system in method development and process monitoring for industrial protein chromatography | |
| Lundblad | Isolation of fucose-rich glycopeptides from normal urine | |
| KR930007430B1 (ko) | 크로마토그래피 단계에 의한 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 정제방법 | |
| Gustafsson et al. | Monitoring of protein product formation during fermentation with fast protein liquid chromatography |