CN1452658A - 由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法 - Google Patents

由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1452658A
CN1452658A CN00819549.8A CN00819549A CN1452658A CN 1452658 A CN1452658 A CN 1452658A CN 00819549 A CN00819549 A CN 00819549A CN 1452658 A CN1452658 A CN 1452658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
interferon
alpha
pichia pastoris
clone
pastoris phaff
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00819549.8A
Other languages
English (en)
Inventor
K·V·苏德希尔
C·R·约古拉马
A·V·斯里拉姆
K·S·N·普拉萨德
K·V·拉马纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shantha Biotechnics Pvt Ltd
Original Assignee
Shantha Biotechnics Pvt Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shantha Biotechnics Pvt Ltd filed Critical Shantha Biotechnics Pvt Ltd
Publication of CN1452658A publication Critical patent/CN1452658A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种用于由遗传工程酵母巴斯德毕赤酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，该方法包括用一种酶消化具有一个启动子，并且在缺乏融合基因的情况下与人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒；通过同源重组用所述线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆；在所述巴斯德毕赤酵母克隆中筛选干扰素α的高水平表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆；生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；并从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。

Description

由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法
                     优先权要求
本申请要求申请日为1999年3月19日的印度专利申请号826/MAS/98的优先权。
                     引用的参考文献
对所引用的参考文献的完整的引用，可以从权利要求书前面的参考文献部分查阅到。
                       发明领域
本发明涉及一种用于由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法。更具体地讲，本发明涉及在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α基因，以及用于纯化所述蛋白的方法。
                     相关技术说明
干扰素——身体针对病毒最迅速地产生的防御物质，是一种在体细胞接触到病毒、细菌、和不同类型的大分子时，由体细胞所分泌的一种蛋白。然后由所分泌的干扰素刺激周围的细胞，以便产生其他蛋白，这些蛋白又能够调节病毒的增殖、免疫反应、细胞生长和其他细胞功能。有三种类型的人干扰素：
(i)干扰素α，它是由白细胞分泌的；
(ii)干扰素β，它是由成纤维细胞分泌的；
(iii)干扰素γ，它是由淋巴细胞分泌的。
干扰素α和β被称为I型干扰素，而干扰素γ被称为II型干扰素。人干扰素α蛋白通常包括165或166个氨基酸，并且通过SDS-PAGE测定其分子量为17000-20000道尔顿。
业已将干扰素α用于治疗各种病毒和与癌症相关的疾病，例如，用于治疗乙型、丙型和丁型肝炎病毒感染和癌症疾病，如多毛细胞白血病、与AIDS相关的Kaposi’s肉瘤、慢性骨髓白血病、以及肾细胞癌。
人白细胞干扰素α是用生长在组织培养物中的人细胞系生产的或者是通过从血液供体中收集的人白细胞生产的。Horowitz等，1982，美国专利4680261，5503828，5391713，4732683，4696899，5789551和欧洲专利EP0945463。这些方法工作量大，烦琐，并且费时间。所采用的培养基成本高昂，而所获得的纯化材料的产量很低。还存在用于制备白细胞的血液受一种尚未鉴定的感染剂污染的危险。
随着重组DNA技术的出现，业已可以将人干扰素α基因克隆在微生物中，并且由这些微生物生产足够数量的人干扰素α。Stahelin等，1981，Ho等，1989，Yang等，1992，Tarnowski等，1986，Thatcher等，1986，Tiute等，1982，美国专利5710027，5661009，4765903，5196323，4315852，4845032，4530901和欧洲专利EP0032134和EP0679718披露了利用重组大肠杆菌和酿酒酵母生产人干扰素α的方法。尽管在大肠杆菌中表达并纯化人干扰素α，克服了与由天然来源生产这种干扰素相关的问题和潜在危险，但这种方法有它本身的缺陷。在某些场合下，所表达的蛋白不能进行正确的加工。纯化的蛋白应当不含细菌内毒素。为了除去所述内毒素，需要额外的纯化步骤。因此，所采用的方法包括多个层析步骤，因此是费时间的。这些方法难于放大，而放大是大规模生产的先决条件。在酵母属中表达的重组人干扰素α的产量很低。因此，存在对在合适的宿主中表达人干扰素α的方法以及简单、有效而又容易放大的纯化方法的需求。
甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母，正日益成为流行的蛋白表达系统。毕赤酵母属具有以下优点：首先，细胞内蛋白的产量极高；其次，容易发酵到高细胞密度；第三，遗传学稳定性以及不损失产量的放大；第四，无内毒素污染。因此，通过在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α，可以克服与大肠杆菌表达和纯化重组干扰素相关的缺陷。因此，本发明的目的是在巴斯德毕赤酵母中克隆并表达人干扰素α基因。本发明的另一个目的是开发一种有效的纯化方法，该方法很容易放大，以便纯化在巴斯德毕赤酵母中表达的重组人干扰素α。
                     附图的简要说明
图1是干扰素克隆形成的说明性示意图。
图2是表示干扰素α的下游加工和纯化的第一种优选实施方案的流程图。
图3是表示干扰素α的下游加工和纯化的第二种优选实施方案的流程图。
                       详细说明
本发明提供了一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法。该方法具有以下步骤。用一种酶(优选NotI)消化一种具有一个启动子，并且在缺乏融合区的情况下与一种人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒。通过同源重组用线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆。筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆的高水平干扰素α表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆。生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆。从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。
所述质粒优选是通过将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2上而构建的。其他启动子，如GAP、MOX、FMD、ADH、LAC4、XPR2、LEU2、GAM1、PGK1、GAL7、GADPH、CYC1和CUP1是已知的，并且能同样成功地使用。用含有所述克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌。然后筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆。pHIL-D2质粒可以从Invitrogen公司(Carlsbad，加州，美国)购买，并且在其产品目录中进行了说明。于2000年2月3日，将能表达人干扰素α的转化过的巴斯德毕赤酵母克隆保存在美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，所获得的保藏号为PTA-1276。
优选采用以下步骤，由遗传工程酵母生产人干扰素α：
1.将人干扰素α基因克隆到质粒pHIL-D2中；
2.用含有人干扰素基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；
3.筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆；
4.用NotI酶消化大肠杆菌中的质粒pHIL-D2，以便得到pHIL-D2的NotI片段。
5.通过同源重组用具有干扰素α基因的pHIL-D2的NotI片段转化巴斯德毕赤酵母细胞；
6.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆，寻找干扰素α的表达，并验证来自高产干扰素克隆的干扰素α基因的核苷酸序列；
7.在本文所披露的优化条件下，在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
8.按本文所披露的方法，用一种缓冲液洗涤从所述发酵罐中获得的巴斯德毕赤酵母细胞；
9.按本文所披露的方法，在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解所述巴斯德毕赤酵母细胞；
10.按本文所披露的方法，添加蛋白增溶剂至最终浓度为4-8M，并在4-7℃下，以200-300rpm的速度搅拌2-10小时，进行或不进行离心；
11.按本文所披露的方法，用缓冲液将以上步骤的提取物稀释10-30倍，然后通过离心或过滤澄清，对该提取物进行浓缩或不进行浓缩；
12.按本文所披露的方法，用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后离心或过滤；
13.将上述提取物吸附在“SP-SEPHAROSE”的阳离子交换柱(Pharmacia Fine Chemicals，New Market，新泽西，美国)上，并用碱金属氯化物洗脱含有人干扰素α的蛋白；
14.按本文所披露的方法，将上述含有人干扰素α的洗脱样品的pH调整到中性pH，并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上，并在低于4.0的pH下洗脱干扰素α；和
15.对所述洗脱的干扰素α进行渗滤，然后再进行消毒过滤。
用于在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母的优选条件为：pH5.0，28-30℃，以500-1500rpm的速度旋转培养2天，并且用甲醇诱导48小时。
用于洗涤从所述发酵罐中获得的巴斯德毕赤酵母细胞的优选缓冲液是25-100mM的磷酸钠缓冲液，pH6.5-8，含有1-5mM乙二胺四乙酸(EDTA)。
在用玻璃珠研磨机裂解期间，所使用的优选蛋白酶抑制剂是0.5-2.0mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
所使用的优选蛋白增溶剂是浓度为4-8M的盐酸胍或尿素。
用于将所述提取物稀释10-30倍的优选的缓冲液是25-100mM Tris-HCl，0-1M的尿素，pH6.5-8.0。
澄清优选是通过离心或过滤进行的，而浓缩优选是通过超滤进行的。
用柠檬酸缓冲液(25-100mM，pH4-5)稀释浓缩样品，然后离心并过滤。
澄清是通过离心或过滤进行的，并且不进行浓缩，用柠檬酸缓冲液(1-2M，pH2-5)调整提取物的pH。
用于将提取物pH的调整到pH3-5的缓冲液优选是柠檬酸，根据提取物的体积，可以是pH2-5的25-100mM的柠檬酸或1-2M的柠檬酸。
用于洗脱含有人干扰素α的蛋白的碱金属氯化物优选是氯化钠。
所述使用的优选基质是可以作为通过伯胺连接配体的亲和支持物的基质。最优选的基质是可以从BIO-RAD(Hercules，加州，美国)获得的“AFFI-GEL-10”。干扰素α优选在pH2-4的条件下洗脱。
下面将结合以下流程图和实施例说明本发明：
                        实施例1
参见图1，它表示用于将人干扰素α基因克隆到巴斯德毕赤酵母中的步骤，扩增所述人干扰素α基因(优选通过PCR扩增)，并用EcoRI消化。通过用EcoRI消化，使具有AOX1启动子的pHIL-D2质粒线性化。将干扰素α)基因连接到消化过的pHIL-D2上。用pHIL-D2-IFN质粒转化大肠杆菌细胞。筛选大肠杆菌转化体，寻找其中的IFNα基因相对pHIL-D2质粒中的AOX1启动子成正确方向的重组体。用NotI消化过的pHIL-D2-IFN质粒转化巴斯德毕赤酵母。这会导致IFN基因通过同源重组整合到酵母基因组中。根据其在基本培养基上生长的能力筛选重组体。筛选能在细胞内表达人干扰素α的重组体。在培养罐中，在最低培养基里生长能表达人干扰素α的巴斯德毕赤酵母克隆2天，条件为pH5.0，28-30℃，500-1200rpm，并且用甲醇诱导48小时。
参见图2，它表示用于对从发酵罐方向获得的人干扰素α进行下游加工和纯化的第一种优选方法的步骤，收获发酵罐培养物，并且用裂解缓冲液洗涤细胞，裂解缓冲液为25mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，20mMEDTA。在有1mM PMSF的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解洗涤过的细胞，为了裂解细胞提取物，以7M的最终浓度添加固体盐酸胍，并以200-300rpm的速度搅拌4-6小时，进行或不进行离心。用含有1-10微摩尔PMSF的25mM Tris-HCl，pH7.5将上述步骤的提取物稀释20倍，并通过离心或过滤澄清。通过超滤将澄清的提取物浓缩10倍。用pH4.0的含有1微摩尔PMSF的50mM柠檬酸缓冲液再次将所述浓缩10倍的提取物稀释10倍。通过离心或过滤将柠檬酸稀释过的提取物澄清，并通过超滤浓缩10倍。在SP-sepharose上对上述浓缩提取物进行阳离子交换层析，并且用氯化钠梯度洗脱。
将上述洗脱的IFN级份的pH调整到7.0，并将该级份加样到装有与AFFI-Gel-10基质(BIO-RAD，Hercules，加州，美国)结合的单克隆抗体的免疫亲和柱上。用0.2M乙酸和0.15M氯化钠洗脱纯的干扰素。对洗脱的干扰素进行渗滤和消毒过滤。
                       实施例2
以与例1相同的方法扩增并克隆人干扰素α基因。
参见图3，它表示用于对从发酵罐方向获得的人干扰素α进行下游加工和纯化的第二种优选方法的步骤，收获发酵罐培养物，并且用裂解缓冲液洗涤，裂解缓冲液为25mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，2mM EDTA。在有1mM PMSF的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解洗涤过的细胞。为了裂解细胞提取物，以7M的最终浓度添加固体盐酸胍，并以200-300rpm的速度搅拌4-6小时，进行或不进行离心。用含有1-10微摩尔PMSF的25mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液将上述步骤的提取物稀释20倍，并通过离心或过滤澄清。用pH2-4的1-2M柠檬酸将上述澄清的提取物的pH降低到4。在SP-sepharose上对上述pH调整过的提取物进行阳离子交换层析，并且用氯化钠梯度洗脱。
将上述含有IFN的洗脱级份的pH调整到7.0，并加样到装有与AFFI-Gel-10基质结合的单克隆抗体的免疫亲和柱上。用0.2M乙酸，0.15M氯化钠洗脱纯的干扰素。对洗脱的干扰素进行渗滤和消毒过滤。
表1提供了纯化的重组干扰素α的比活性和产量。干扰素α的生物学活性是通过病毒致细胞病变效应减弱实验测定的。该实验中使用了Madin Darby牛肾(MDBK)细胞和水疱性口炎病毒(VSV)。该实验用从英国国家生物学标准和对照研究所获得的国际参考标准进行校正。提供了三批纯化干扰素α的数据。
                          表1
                  干扰素α比活性和产率
    系列号     批次   平均比活性   总单位/升
    1     0399  4.4×108IU/mg   600×108IU
    2     0499  4.66×108IU/mg   620×108IU
    3     0599  5.2×108IU/mg   560×108IU
以上利用遗传工程酵母生产干扰素α的方法与同样使用了重组DNA技术的现有方法相比具有若干优点。首先巴斯德毕赤酵母能够生长到非常高的细胞密度，并且，干扰素基因可以用强的乙醇氧化酶启动子进行表达，从而可以获得高产量的重组干扰素α。另外，甲醇是一种廉价的诱导物。其次，由于所述干扰素基因通过同源重组稳定整合到酵母基因组中，因此，没有必要使用抗生素来维持该质粒。第三，所采用的纯化方法简单、有效，并且能得到高回收量的表达蛋白。第四，该方法可以方便地加以放大，以便大规模纯化干扰素α。最后，因为酵母是真核生物，它能提供更适合真核干扰素蛋白折叠的环境。也许正是由于这种原因，发现通过上述方法生产的干扰素所提供的比活性，高于以前报导的有关从大肠杆菌中纯化的干扰素的比活性。
因此，本发明用于由遗传工程酵母巴斯德毕赤酵母生产人干扰素α的方法简单、有效，并且容易放大进行大规模生产。纯化干扰素α的产量和比活性，高于报导的在其他系统中的产量和比活性。
应当理解的是，本发明并不局限于本文所说明和披露的各部分的特定结构和排列顺序，而且包括可以从以下权利要求书范围中得出的它的改进形式。
参考文献专利文献EP 4530901            1985年7月            WeissmannEP 0043980            1982年1月            Goeddel，et al.US 4680261            1987年7月            Nobuhara，et al.US 5503828            1996年4月            Testa，et al.US 5391713            1995年2月            Borg，et al.US 4732683            1988年3月            Georgiades，et al.US 4696899            1987年9月            Toth，et al.US 5789551            1998年8月            PestkaEP 0945463            1999年9月            Attalla，et al.US 5710027            1998年1月            Hauptmann，et al.US 5661009            1997年8月            StabinslyEP 0032134            1981年7月            WeissmannUS 105629             1988年8月            D′Andrea，et al.US 5196323            1993年3月            Bodo Gerhard，et al.US 4315852            1982年2月            Leibowitz，et al.EP 0679718            1995年11月           Ettlin，et al.US 4845032            1989年7月            Obermejer
其他文献Staehelin，T.，et al.，1981，Purification of recombinant human leukocyte interferon withmonoclonal antibodies，Methods in Enzymology，Vol.78，505-512.Ho，L.J.，et al.，1989，Production of human leukocyte interferon in E.coli by controi ofgrowth rate in fed-batch fermentation，Biotechnology Letters，Vol.11，695-698.Yang，X.M.，et al.，1992，Production of recombinant human interferon alpha by E.coliusing a computer controlled cultivation process，Journal of Biotechnology，Vol.23，291-301.Gwynne.D.I.，et al.1987，Genetically engineered secretion of active human interferonand a bacterial endoglucanase from Aspergillus nidulans，Biotechnology，Vol.5，713-719.Tiute，M.F.，et al.，1982，Regulated high efficiency expression of human interferon alphain Saccharomyces cerevisiae，The EMBO Journal，Vol.1，603-608.Horowitz，B.，1986，Large scale production and recovery of human leukocyte interferonfrom peripheral blood leukocytes，Methods in Enzymology，Vol.119，39-47.Tamowski，J.S.，et al.，1986，Large scale purifieafion of recombinant human leukocyteinterferon，Methods in Enzymology，Vol.199，153-165.Thatcher，D.R.，et al.，1986，Purification ofrecombinant human IFN-α2，Methods inEnzymology，Vol.119，166-177.Sudbert，P.E.，1996，The expression of recombinant proteins in yeasts，Current Opinionin Biotechnology，Vol.7，517-524Romanos，M.，1998，Advances in the use of Pichia pastoris for high level geneexptessio，Current Opinion in Biotechnology，Vol.6，527-533.

Claims (22)

1.一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，该方法包括：
a.用一种酶消化一种具有一个启动子，并且在缺乏融合区的情况下与一种人干扰素α基因可操作地连接的质粒，以便产生一种线性化的质粒；
b.通过同源重组用线性化的质粒转化巴斯德毕赤酵母细胞，以便形成巴斯德毕赤酵母克隆；
c.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆的高水平干扰素α表达，以便寻找高产干扰素的巴斯德毕赤酵母克隆；
d.生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；和
e.从所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中纯化具有生理学活性的人干扰素α蛋白。
2.如权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，所述质粒是通过以下步骤构建的：将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2上；用含有所述克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；并筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆。
3.如权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，所述消化包括用NotI酶消化。
4.如权利要求1的方法，其中，在步骤(d)中，所述生长包括在pH5.0，28-30℃的条件下，在发酵罐中生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆，以500-1500rpm的速度旋转培养2天；并且包括用甲醇诱导所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆48小时。
5.如权利要求1的方法，其中，在步骤(e)中，所述纯化包括：
i.用一种缓冲液洗涤所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
ii.裂解所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
iii.添加蛋白增溶剂至所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中，以便形成一种提取物；
iv.用一种缓冲液稀释提取物，然后澄清稀释过的提取物；
v.用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后对该提取物进行离心或过滤；
vi.将上述提取物吸附在阳离子交换柱上，并洗脱具有生理学活性的人干扰素α的蛋白；
vii.将上述具有生理学活性的人干扰素α蛋白的pH调整到中性pH；并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上；并在低于4.0的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白；和
viii.渗滤；然后
ix.对所述洗脱的具有生理学活性的干扰素α蛋白进行消毒过滤。
6.如权利要求5的方法，其中，在步骤(ii)中，所述裂解包括在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，在玻璃珠研磨机中用玻璃珠裂解。
7.如权利要求6的方法，其中，在步骤(ii)中，所述蛋白酶抑制剂包括0.5-2.0mM的苯甲基磺酰氟。
8.如权利要求5的方法，其中，在步骤(i)中，所述缓冲液包括25-100mM的磷酸钠缓冲液，pH6.5-8.0。
9.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iii)中，所述添加包括添加蛋白增溶剂至最终浓度为4-8M，并在4-7℃下，以200-300rpm的速度搅拌2-10小时。
10.如权利要求9的方法，其中，在步骤(iii)中，所述蛋白增溶剂包括浓度为4-8M的盐酸胍或尿素。
11.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iv)中，所述稀释包括稀释10-30倍；缓冲液包括25-100mM Tris-HCl，0-1M的尿素，pH6.5-8.0；而所述澄清包括离心或过滤。
12.如权利要求11的方法，其中，还包括通过超滤浓缩所述提取物。
13.如权利要求5的方法，其中，在步骤(iv)中，所述澄清包括离心或过滤。
14.如权利要求5的方法，其中，在步骤(v)中，所述用一种缓冲液调整提取物的pH包括用pH2-5的25-100mM的柠檬酸缓冲液或1-2M的柠檬酸缓冲液。
15.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vi)中，所述吸附包括将提取物吸附在阳离子交换柱上。
16.如权利要求15的方法，其中，还包括用25-100mM，pH4-5柠檬酸缓冲液稀释所述浓缩的提取物；然后进行离心或过滤。
17.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vi)中，所述洗脱包括用碱金属氯化物洗脱。
18.如权利要求17的方法，其中，在步骤(vi)中，所述洗脱包括用氯化钠洗脱。
19.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vii)中，所述吸附包括将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上，所述基质是可以通过伯胺连接配体的亲和支持物。
20.如权利要求5的方法，其中，在步骤(vii)中，所述洗脱包括在2-4的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白。
21.一种用于由遗传工程酵母生产具有生理学活性的人干扰素α的方法，包括：
a.在缺乏融合区的情况下，将人干扰素α基因克隆到含有AOX1启动子的质粒pHIL-D2中；
b.用含有克隆的人干扰素α基因的质粒pHIL-D2转化大肠杆菌；
c.筛选转化过的大肠杆菌，寻找具有相对质粒pHIL-D2中的AOX1启动子为正确方向的干扰素α基因的重组克隆；
d.用一种酶消化质粒pHIL-D2，以便产生pHIL-D2的片段。
e.通过同源重组用具有干扰素α基因的pHIL-D2的片段转化巴斯德毕赤酵母细胞，以形成巴斯德毕赤酵母克隆；
f.筛选所述巴斯德毕赤酵母克隆，寻找高表达干扰素α的高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
g.生长所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
h.用一种缓冲液洗涤所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母细胞；
i.裂解所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆；
j.添加蛋白增溶剂至所述高产干扰素巴斯德毕赤酵母克隆中，以便形成一种提取物；
k.用一种缓冲液稀释提取物，然后澄清稀释过的提取物；
l.用一种缓冲液将上述提取物的pH调整到pH3-5，然后对该提取物进行离心或过滤；
m.将上述提取物吸附在阳离子交换柱上，并洗脱含有具有生理学活性的人干扰素α的蛋白的混合物；
n.将上述具有生理学活性的人干扰素α蛋白的pH调整到中性pH；并将它吸附在含有与一种基质结合的抗人干扰素α的单克隆抗体的免疫亲和柱上；并在低于4.0的pH下洗脱纯的具有生理学活性的干扰素α蛋白；和
o.渗滤；然后对所述洗脱的具有生理学活性的干扰素α蛋白进行消毒过滤。
22.一种用权利要求1的方法制备的重组人干扰素。
CN00819549.8A 2000-03-16 2000-03-16 由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法 Pending CN1452658A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2000/000339 WO2001068827A1 (en) 2000-03-16 2000-03-16 A process for the production of human interferon alpha from genetically engineered yeast

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1452658A true CN1452658A (zh) 2003-10-29

Family

ID=11003897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00819549.8A Pending CN1452658A (zh) 2000-03-16 2000-03-16 由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1272624A4 (zh)
JP (1) JP2003526365A (zh)
CN (1) CN1452658A (zh)
AU (1) AU2000231863A1 (zh)
CA (1) CA2402562A1 (zh)
WO (1) WO2001068827A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002356422A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-25 Cadila Healthcare Limited Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
WO2005074650A2 (en) 2004-02-02 2005-08-18 Ambrx, Inc. Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
CU24158B1 (es) * 2012-09-18 2016-03-30 Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología Método de obtención de 1-kestosa

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
JPH06209763A (ja) * 1993-01-13 1994-08-02 Green Cross Corp:The 変異株

Also Published As

Publication number Publication date
AU2000231863A1 (en) 2001-09-24
EP1272624A4 (en) 2004-06-16
EP1272624A1 (en) 2003-01-08
WO2001068827A1 (en) 2001-09-20
JP2003526365A (ja) 2003-09-09
CA2402562A1 (en) 2001-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0885955B1 (en) Thermostable purified endoglucanases from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus
CN1032315C (zh) 在酵母中生产乙型肝炎病毒蛋白质的方法
EP0796269A1 (en) Filtration
CN101195809A (zh) α-1,6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法
US6005075A (en) Method for producing alpha-interferon
CN1452658A (zh) 由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法
CN101450961A (zh) 人工合成的猪干扰素基因及制备猪干扰素的方法
CN1124502A (zh) 哺乳动物细胞系和获得糖蛋白的方法
CN116555320A (zh) 一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌及其构建方法和应用
CN1105727C (zh) 重组人血清白蛋白的生产方法
CN1242059C (zh) rDSPAα I 的产生方法
CN1916024A (zh) 高比活人α－2b干扰素突变体序列、酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法
CN1163608C (zh) 原核分泌型表达载体及用途
CN102786589A (zh) 重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株
CN102220345B (zh) 重组犬α干扰素的优化基因、菌种及高效表达
CN1088107C (zh) 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子制备方法及其表达载体和工程菌
CN1793324A (zh) 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法
CN101831452B (zh) 通过重组瑞氏木霉以诱导型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
CN117304344B (zh) 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用
CN1268751C (zh) 表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的酵母重组株及rhGM－CSF的纯化方法
KR100241266B1 (ko) 재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는 방법
Mohanty et al. Heterologous Gene Expression in Pichia pastoris: Success Stories and Commercial Ventures
CN1468953A (zh) 人γ-干扰素在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化
CN1182240C (zh) 纤溶酶原的酵母表达系统及其纯化工艺
EP0227833B1 (en) Process for preparing hetero-protein

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication