CN1692942A - 猪白细胞介素－4基因抗病制剂的制备和使用技术 - Google Patents

Abstract

该发明所属技术领域：1.生物技术，2.分子免疫学。本发明克隆了藏猪白细胞介素－4基因，并构建了其真核表达质粒(VTPIL－4)，以分子量为150000、脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备了壳聚糖纳米颗粒，提供了利用壳聚糖纳米颗粒对质粒VTPIL－4进行分子包装以制备抗感染DNA制剂的方法，公开了该纳米颗粒DNA制剂作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL－4质粒，将此制备DNA纳米颗粒制剂以肌肉注射方式单独或协同疫苗免疫实验动物，增强实验动物的特异和非特异性细胞和体液免疫机能，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL－4质粒作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。

Description

猪白细胞介素-4基因抗病制剂的制备和使用技术

技术领域

1.生物技术  2.分子免疫学

具体涉及壳聚糖纳米颗粒包装藏猪白细胞介素-4基因抗感染DNA制剂的制备及应用技术。

背景技术

防治畜禽疾病感染的传统方法是药物治疗和疫苗免疫。由于长期使用化学药物和抗生菌来治疗疾病，药物的“选择压力”，导致病原抗性品系的出现、传播及扩散，产生了众多药源性疾病和细菌对抗生素的耐药性问题，使药物疗效降低乃至失败。而且大量使用药物也造成体内蓄积，畜产品质量降低，人食用后也损害健康。目前由于过度依赖抗生素控制感染性疾病，导致病菌耐药性问题。近十多年来细菌对抗生素的耐多药、全耐药现象蔓延加剧，造成许多感染性疾病难以控制，严重威胁着畜牧业的健康发展及人类食品安全。目前迫切需要开拓全新的抗感染技术及药物，有效增强动物免疫抗感染能力，克服滥用抗生素的危害。

全新的“第三代免疫增强剂”为解决这一问题带来了新的希望。免疫增强剂能提高机体特异和非特异的免疫防御能力，增强机体识别、杀灭和清除病原及异已物质的能力，并且在机体免疫功能低下或处于抑制状态时，重建免疫功能，提升免疫水平，从而保证机体健康。第三代免疫增强剂是经历了第一代外源性化学药物分子和植物源分子的免疫增强剂，以及“细胞因子”类物质的第二代免疫增强剂，发展起来的一类新型免疫增强剂。第三代免疫增强剂利用现代生物工程技术，将免疫调节效应很强的细胞因子基因克隆入高效真核表达载体，构建重组真核质粒，将其有效转染导入机体细胞，使之持久稳定表达出所需的细胞因子，增强其浓度，从而能够特异高效而持久地增强机体免疫防御能力，达到经济防治目前难以控制的病毒，细菌性传染病和寄生虫病的目的；并且预防条件性病原造成难以控制的复杂感染和疾病。近年来，人们对于用细胞因子表达性质粒直接转染动物方面进行了研究，取得了许多结果。其特点是这些细胞因子可以在动物体内表达，达到免疫刺激增强作用，并且有容易生产，易纯化，易保存，作用持久，理化性质稳定等特点。所以，构建高效重组细胞因子表达质粒作为新型抗感染制剂是一个有经济价值和社会效益的方法。必将首先在动物医学及保健方面获得广泛应用，有力推动各类动物传染性疾病的预防和治疗，保障畜牧业的顺利发展和人类健康及食品卫生安全。

白细胞介素4(IL-4)是由CD4⁺T细胞亚群、B细胞、肥大细胞等分泌的多效性细胞因子，概括起来，主要在下述几个方面发挥重要作用：(1)调节B细胞的生长分化及其对抗原刺激的应答，包括增殖和分泌抗体，参与Ig类别转换(IgE生成)；(2)促进B细胞表达CD和MHCII类分子；(3)刺激T细胞生长分化和杀伤性T细胞的生成；(4)是巨噬细胞(Mφ)和肥大细胞的激活因子；(5)是Mφ的趋化因子；(6)抑制Mφ分泌IL-6，IL-1，TNF，促进IL-1ra的产生；(7)与细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)有关；(8)免疫佐剂作用；(9)能诱导造血细胞的分化和维持其生存。IL-4又名B细胞生长因子(B cell growth factor，BCGF)、B细胞化因子γ(B cell differentiating factorγ，BCDFγ)、B细胞刺激因子1(B cell stimulating factor-1，BSF-1)、T细胞生长因子II(T cell growth factor II，TCGF-II)和肥大细胞生长因子II(mast cell growthfactor II，MCGF-II)。

IL-4可以作用于T细胞、B、细胞胸腺细胞、肥大细胞、巨噬细胞等多种靶细胞，激活的B细胞产生的抗体主要是IgG1和IgE，是机体液免疫的重要调节因子。IL-4作为体液免疫的重要调节因子，其表达型质粒作为分子免疫增强剂的研究也取得了一些进展。将IL-4插入到RSV-LTR表达载体，以DNA免疫的形式与钥孔蓝蛋白(KLH)注射小鼠，结果注射IL-4表达载体的小鼠应答明显高地对照组，且IL-4有选择性地刺激IgG1的作用。IL-4与HIV-1DNA共同免疫小鼠，使得DCS(郎罕氏细胞)具有强的Th2型免疫应答反应。将IL-4基因与抗AID的编码猿猴免疫缺陷病毒(SIV)Gag蛋白的基因共注射时能促进更强的Th2型反应。Lee(1999)用IL-4表达型质粒DNA疫苗共同免疫小鼠，测得其抗体反应水平明显提高。在针对免疫缺陷的糖尿病、关节炎等疾病的基因治疗中，IL-4作为分子免疫佐剂显示了一定的作用。在糖尿病患者体内，IL-4分泌异常，对小鼠共注射编码IL-4基因和IL-10基因的质粒能抑制糖尿病的恶化，降低小鼠体内葡萄糖的浓度。Chang等比较了IL-4和γ干扰素受体基因在糖尿病治疗中的作用，结果表明共注射编码IL-4/IgG1的质粒比共注射编码γ-IFN受体/IgG的质粒更有效，而且具有剂量低、无免疫原性等优点。Wolfe还将IL-4表达型质粒通过口服途径给药于患糖尿病的动物，能增加免疫治疗的安全性(Wolfe T，2002)。将编码鼠IL-4基因的腺病毒注射小鼠脚踝，可减缓关节炎症状，有望成为基因治疗关节炎的新手段。吴丹(1999)将猪IL-4与猪囊尾蚴保护性抗原cC1进行融合，以融合蛋白形式在体内表达，可以增加抗原的免疫原性，通过IL-4的作用还可以促进抗原提呈和抗体应答，增强机体的保护性免疫效应。

在DNA免疫的载体中，将编码抗原的基因与细胞因子基因共表达，不仅能增强体液免疫和细胞免疫，还能诱导直接的Th1型和Th2型反应。Hornef等将IL-2、IL-4及γ-IFN基因分别与编码结肠耶氏菌素60KD热休克蛋白的基因构建于同一载体共免疫小鼠，能使小鼠抵御结肠耶氏菌的攻击，并且克服了常规佐剂的副作用，提高了机体免疫力。Park等构建了IL-4基因和编码呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的融合载体免疫小鼠，与对照组相比，IL-4基因增强了特异性抗RSV-F的抗体表达。

IL-4基因在肿瘤治疗方面也显示了广阔的前景。Kimura等尝试利用细胞因子的基因(如IL-2，IL-4)来治疗胰腺癌，在以小鼠为动物模型阶段取得了一些结果。将IL-4基因克隆到逆转录病毒载体上转染C6神经胶质瘤细胞，降低了肿瘤原性，肿瘤细胞的生长被有效的抑制。Broberg等将Th2型细胞因子IL-4与单纯性疱疹病毒载体重组后注射患脑脊髓炎小鼠，消除了脑脊髓炎症状，防止脊髓受到巨噬细胞渗透，预防了脱髓鞘。Kim等分别将编码人免疫缺陷病毒EnV、Rev和猴免疫缺陷病毒Gag及Pol蛋白的基因与IL-4基因共注射恒河猴，实验结果表明IL-4能明显增强恒河猴特异性抗原的免疫应答。Poliani等把IL-4基因插入单纯疱疹病毒载体中，治疗恒河猴急性脑脊髓炎取得了一些效果。

由于IL-4在机体体液免疫应答和造血调控中发挥重要作用，而且随着对IL-4作用机制的进一步认识，IL-4可能会显示出更多的研究和应用价值。

藏猪主要繁衍、栖息在西藏高原，是我国特有的珍稀物种，是经高寒地区牧民长期驯养而形成的一种能适应高寒气候、耐粗性、抗逆性强的独特地方猪种；其肉质鲜美，具有较高的经济价值。目前国内外均未见有关藏猪白细胞介素-4(IL-4)基因及其应用的研究报道，因此藏猪IL-4基因抗感染DNA制剂的制备及应用技术具有广阔的应用前景，可望发展成新型抗感染分子制剂用于提高猪抗传染性疾病的免疫应答能力，防治动物疾病的感染。

因免疫途径和免疫方式不同，所涉及的抗原呈递细胞、抗原呈递方式均有不同，故可产生不同类型、不同强度的免疫应答。由于肌肉注射主要通过Th1细胞激活方式诱导免疫应答，效率较低，需要注射的DNA剂量较大。为了进一步提高实验动物对质粒DNA的免疫应答水平，必须采用有效的免疫投递系统来增强免疫效果。壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现：基于

壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。

由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，因此利用壳聚糖纳米颗粒包装藏猪白细胞介素-4基因作为抗感染DNA制剂的制备及应用技术，在科研，动物保健，和产业化方面具有潜在的巨大价值。

本发明首次将克隆的藏猪白细胞介素-4基因构建入真核表达载体，以壳聚糖纳米颗粒分子对藏猪白细胞介素-4基因真核表达质粒进行分子包装，并将其应用于增强动物免疫应答和免疫保护力，发现对动物免疫机能和免疫保护效应有显著的增强作用，可用作高效安全和效应持久的新型动物免疫增强剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题具体包括藏猪白细胞介素-4基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-4基因真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。主要包括下列步骤：

1、藏猪白细胞介素-4基因的克隆

应用淋巴细胞分离技术，分离了藏猪外周血液淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养36h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT-PCR扩增出藏猪淋巴细胞白细胞介素-4基因的cDNA，克隆到pMD18-T载体上，并进行了序列分析；将得到的序列在GenBank和EMBL数据库中进行了同源比较，证实本实验克隆到了藏猪白细胞介素-4的cDNA。

2、藏猪白细胞介素-4基因的真核表达与活性检测

将藏猪白细胞介素-4基因克隆到真核分泌型表达载体VR1020上，命名为VTPIL-4；重组质粒转染Cos7细胞株后，RT-PCR结果显示转染细胞24小时总RNA中已含有目的cDNA片段对应的mRNA；猪淋巴母细胞增殖实验证明VTFIL-4在转染Cos7细胞株后，能够表达出有生物活性的猪PIL-4蛋白质，对猪淋巴细胞具有增殖作用；此结果表明已成功构建了能正确表达藏猪IL-4的真核表达质粒，其表达产物具有正常的生物学活性，为研究其体内基因转移表达的免疫调节作用奠定了坚实基础。

3、纳米颗粒的制备

以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；将VTPIL-4质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是VTPIL-4质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。

4、纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定

取少量VTPIL-4质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米颗粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。

5、藏猪白细胞介素-4基因抗病制剂的应用

昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。其中4组为非特异性免疫组，4组为疫苗免疫组。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠。

注射裸质粒免疫组每只小鼠接种相应质粒30pmol；注射壳聚糖包装质粒的免疫组每只小鼠接种相应包装的质粒6pmol。大肠杆菌、沙门氏菌和支原体疫苗特异性小鼠分组见表2，疫苗免疫组每只小鼠均按猪免疫剂量1/50接种以及相应裸质粒30pmol或壳聚糖纳米颗粒包装的相应质粒6pmol。非特异免疫小鼠分组除不注射疫苗外，其它均以特异疫苗免疫组相同。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×10⁹/ml)。

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，检测了壳聚糖包装VTPIL-4质粒及未包装VTPIL-4质粒对小鼠的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对常规疫苗在不同形式的VTPIL-4质粒分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析。在小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察发病情况；49天时对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况，检测免疫保护效应。

结果发现：以VTPIL-4质粒壳聚糖纳米颗粒作为免疫增强剂时，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平比对照组显著升高；同时，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加；与常规疫苗联合使用，同样可以显著提高实验动物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平，免疫细胞数量；对疫苗的特异性免疫应答也显著加强。壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒后，虽然DNA用量仅为未包装组的1/5，但免疫组体液免疫和细胞免疫应答水平也显著提高，与对照组差异显著(P＜0.05)。其原因可能是壳聚糖纳米颗粒包裹质粒后，有效地防止了DNA被体内其它组织蛋白的吸附和体液核酸酶的降解，同时又促进质粒进入细胞，使质粒DNA缓慢释放，将目的基因DNA转运到靶细胞中，发挥基因转录表达，分泌更多的细胞因子，增强对免疫应答的上调效应，提高体液和细胞免疫水平。

这些结果表明：VTPIL-4质粒能显著提高小鼠的免疫应答水平，以壳聚糖纳米颗粒作为免疫投递系统，具有减少质粒用量、降低成本、增强体液免疫和细胞免疫的优点。结果提示壳聚糖纳米颗粒包裹VTPIL-4质粒可提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，可望作为有效的新型抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。

附图说明

表1非特异性免疫小鼠分组(CNP：壳聚糖纳米颗粒)

表2疫苗免疫小鼠分组(CNP：壳聚糖纳米颗粒)

表3VTPIL-4重组质粒真核表达产物对猪淋巴细胞增殖刺激活性检测结果(0D₅₇₀)

图1TPIL-4RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

    1：PIL-4cDNA    M：DL2,000

图2pMDT18-IL4BamHI酶切电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

    S：pMDT18-IL4/BamHI    M：DL2,000

图3重组VTPIL-4质粒的菌落PCR筛选

    1：阴性菌落  2、3：阳性菌落  M：DL2,000

图4VTPIL-4 BamHI酶切电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

    1：VR1020质粒  2：VTPIL-4/BamHI  3：VR1020/BamHI  M：DL2,000

图5PIL-4在VR1020插入方向酶切电泳图谱(1.2％琼脂糖凝胶)

1：pVTPIL-4/BglII和PmacI双酶切正向重组子    2：pVTPIL-4/BamHI

3：pVTPIL-4/BglII和PmacI双酶切反向重组子    M：φ174

图6真核表达RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

1：VR1020  2：24h  3：48h 4：72h  M：DL2,000

图7VTPIL-4质粒壳聚糖纳米颗粒透射电镜图(放大倍数：50000)

图8壳聚糖纳米颗粒粒径分布

图9非特异性免疫组小鼠血清中IgG含量

图10非特异性免疫组小鼠血清中IgA含量

图11非特异性免疫组小鼠血清中IgM含量

图12非特异性免疫组小鼠血清中IL-2含量

图13非特异性免疫组小鼠血清中IL-4含量

图14非特异性免疫组小鼠血清中IL-6含量

图15非特异性免疫组小鼠白细胞数量变化

图16非特异性免疫组小鼠单核细胞数量变化

图17非特异性免疫组小鼠淋巴细胞数量变化

图18非特异性免疫组小鼠中性粒细胞数量变化

图19疫苗免疫组小鼠血清中IgG含量

图20疫苗免疫组小鼠血清中IgA含量

图21疫苗免疫组小鼠血清中IgM含量

图22疫苗免疫组小鼠血清中沙门氏菌特异性抗体含量

图23疫苗免疫组小鼠血清中支原体特异性抗体含量

图24疫苗免疫组小鼠血清中大肠杆菌特异性抗体含量

图25疫苗免疫组小鼠血清中IL-2含量

图26疫苗免疫组小鼠血清中IL-4含量

图27疫苗免疫组小鼠血清中IL-6含量

图28疫苗免疫组小鼠白细胞数量变化

图29疫苗免疫组小鼠单核细胞数量变化

图30疫苗免疫组小鼠淋巴细胞数量变化

图31疫苗免疫组小鼠中性粒细胞数量变化

具体实施方式

1、藏猪IL-4基因(TPIL-4基因)的克隆

从健康藏猪耳静脉无菌采血10mL，分离藏猪外周血淋巴细胞，加入10ug/ml Con A刺激，在CO₂培养箱中37℃培养72h，分时段(24、48、70h)提取藏猪总RNA，设计一对藏猪IL-4基因cDNA扩增引物。引物序列如下：

引物1：CGG GAT CCC TAT TCA TGG GTC TCA CCT C

引物2：CGG GAT CCT CAG CTT CAA CAC TTT

以总RNA为模板，在50μl反应体系中加10×RT-PCR反应缓冲液5μl，25mM MgCl₂ 10μl，10mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)1μl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，引物1和引物2各20uM，总RNA1-2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：50℃，30min；94℃，2min，然后进行30个PCR循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s)后继续在72℃延伸10min，4℃保存。

回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA，确定重组质粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一样后(附图1、2)，进行序列测定。序列测定结果采用DNAtools 5.1进行分析(基因序列表见说明书13页)。

用M13通用引物对含有目的基因片断的pMTPIL-4质粒进行正反向测序，通过重叠序列的拼接，得到了完整的TPIL-4基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1对其编码氨基酸进行了分析，cDNA长度为423个碱基，开放阅读框为402个碱基，编码134个氨基酸，分子量为15.0kD。

2、藏猪IL-4基因真核表达质粒的构建及表达活性检测

将pMTPIL-4质粒用BamHI酶切后，将TPIL-4片段与BamHI酶切、脱磷酸化的VR1020质粒DNA在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化子经菌落PCR鉴定，得到含有目的PIL-4片段的重组质粒的菌落，菌落PCR图见附图3。

得到含TPIL-4的重组质粒后，利用BamHI酶切可见413bp片段，根据VR1020质粒没有PmacI位点，有BagII位点，而PIL-4片段上没有BagII位点，有PmacI位点，因此，用PmacI和BagII双酶切重组质粒DNA，通过观察其酶切片段的大小来判定TPIL-4片段的插入方向，筛选出正确方向插入的重组表达质粒，命名为VTPIL-4，其BamHI酶切及PmacI和BagII双酶切电泳图谱见附图4、5。

使用Life Technology公司Lipofect AMINE^TM Reagent进行Cos7细胞的转染，参照试剂说明书进行。培养48小时，检测基因表达产物活性。以RT-PCR检测基因在真核细胞中表达，结果显示：只有VTPIL-4转染的Cos7细胞总RNA出现PIL-6的特征带，Cos7细胞、VR1020转染的Cos7细胞总RNA不出现TPIL-4的特征带。表明VTPIL-4重组质粒在Cos7细胞中能表达基因的片段相应的mRNA。RT-PCR结果见图6。

制备猪淋巴母细胞，MTT比色法检测TPIL-4生物学活性，分别使用转染后24小时、48小时和72小时细胞培养液上清进行分析，结果见附图表3。此结果表明：VTPIL-4转染后24小时、48小时和72小时的细胞培养液上清中表达了具有生物学活性的PIL-4，对猪淋巴细胞具有增殖刺激作用。

3、纳米颗粒的制备

以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)：将质粒DNA溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。

4、纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定

取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米颗粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。

透射电镜观察结果表明：壳聚糖纳米颗粒多呈球形(见说明书附图图7)。纳米颗粒度分析仪测定结果为：平均粒径为45nm；多分散度为0.190(见说明书附图图8)；zeta电位为+25.6mV，说明纳米颗粒表面带有正电荷。

5、实验动物的免疫

昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。其中4组为非特异性免疫组，4组为疫苗免疫组。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠。

注射裸质粒免疫组每只小鼠接种相应质粒30pmol；注射壳聚糖包装质粒的免疫组每只小鼠接种相应包装的质粒6pmol。大肠杆菌、沙门氏菌和支原体疫苗特异性小鼠分组见表2，疫苗免疫组每只小鼠均按猪免疫剂量1/50接种以及相应裸质粒30pmol或壳聚糖纳米颗粒包装的相应质粒6pmol。非特异免疫小鼠分组除不注射疫苗外，其它均以特异疫苗免疫组相同。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×10⁹/ml)。动物免疫分组见说明书附图表1，表2。表1为非特异性免疫分组情况，表2为疫苗免疫分组情况。

6、壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒对小鼠非特异性免疫应答的影响

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。

(1)IgG、IgA及IgM的测定含量

实验鼠血清分别作10⁵(IgG)和10⁴(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。

结果见说明书附图9、图10、图11。从图可见，小鼠在注射VTPIL-4质粒后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高；壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒后，虽然DNA用量仅为未包装组的1/5，但免疫组血清中的IgG、IgA、IgM含量仍显著提高，与对照组差异显著(P＜0.05)。第6周大肠杆菌攻毒后，免疫组小鼠IgG、IgA、IgM较对照组血清中IgG、IgA、IgM含量有显著增加。

(2)细胞因子的检测

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。

结果见说明书附图12、图13、图14。由图可知，VTPIL-4质粒免疫组小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均较对照组明显升高(P＜0.05)，壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒组与未包裹组相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差异不显著(P＞0.05)，但包装组质粒用量比未包装减少了4/5，节约了质粒用量。

(3)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。

结果见说明书附图15、16、17、18。免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化是考察小鼠细胞免疫应答的一个重要指标。从图可见：VTPIL-4质粒免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白细胞、单核细胞、淋巴细胞数量较对照组都有显著增加，中性粒细胞在攻毒前也较对照组明显升高，但攻毒后中性粒细胞数量则较对照组低；用壳聚糖纳米微粒包装质粒后免疫小鼠，发现在使用DNA量上减少5倍的情况下，可以同样达到的提高免疫细胞数量的效果。

7、壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒对疫苗特异性免疫应答的调节

(1)IgG、IgA及IgM的测定含重

实验鼠血清分别作10⁵(IgG)和10⁴(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中1gG、1gM和IgA含量。

结果见说明书附图19、20、21。图19、20、21显示了VTPIL-4质粒与支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的变化情况。结果表明：在同时免疫了VTPIL-4质粒后，实验动物的IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著提高。其中壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒后，再与支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合注射小鼠，结果显示这种免疫方法虽然在DNA的使用量上只有未包装组的1/5，但是可以协同疫苗免疫，其IgG、IgA、IgM含量较对照组明显增加(P＜0.05)，与未包装免疫鼠差异不显著(P＞0.05)。

(2)特异性抗体的测定

制备支原体抗原、沙门氏菌抗原、大肠杆菌抗原包被Costar酶标板，实验鼠血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法测定小鼠血清中支原体特异性抗体、伤寒特异性抗体、大肠杆菌特异性抗体含量。

结果见说明书附图22、23、24。图22、23、24显示了支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗与相应质粒联合免疫动物后实验动物特异性抗体变化情况。结果显示：动物在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生；在同时免疫VTPIL-4质粒后，实验小鼠的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。用壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒后与疫苗联合注射免疫小鼠，在核酸用量仅为未包装组1/5的情况下，VTPIL-4质粒对提高实验动物对疫苗特异性免疫应答效果同样显著。

(3)细胞因子的检测

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。

结果见说明书附图25、26、27。图结果显示：VTPIL-4质粒与支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高。壳聚糖纳米颗粒包裹VTPIL-4质粒组与未包装组相比较，包装的DNA只有未包裹组1/5的用量，但是对免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差异不显著(P＞0.05)。(4)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。

结果见说明书附图28、29、30、31。用支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合VTPIL-4质粒免疫小鼠，小鼠外周血免疫细胞数量的变化情况结果同样发现肌肉注射VTPIL-4质粒对实验小鼠外周血免疫细胞有较好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒细胞数量较对照组低。用壳聚糖纳米颗粒包装VTPIL-4质粒，不仅可以将DNA用量减少至未包装剂量的1/5，还有效增加了小鼠外周血免疫细胞数量。

8、攻毒小鼠器官病变的检测

小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88和K99口服攻毒实验小鼠，观察小鼠的生长情况；49天时用常规方法对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。

攻毒3周后剖解实验小鼠发现，VTPIL-4质粒接种小鼠均健康存活，肝、脾、十二指肠、等消化道和呼吸道组织器官未出现明显病变，而对照小鼠均发病，精神萎靡，被毛耸立，粪便稀软，带棕褐色：解剖观察发现，对照组小鼠均出现以胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。

9、数据分析

上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。

藏猪白细胞介素-4基因序列

<110>四川大学

<120>猪白细胞介素-4基因抗病制剂的制备和使用技术

<160>1

<210>1

<211>423

<212>DNA

<213>藏猪(Sus scrof，Tibet)

<220>

<400>1

agagctctat tcatgggtgt cacctcccaa ctgatcccaa ccctggtctg cttactggca 60

tgtaccagca acttcgtcca cggacacaag tgcgacatca ccttacaaga gatcatcaaa 120

accttgaaca ttctctcagc gagagagaac tcgtgcatgg agctgcccgt gacggacgtc 180

tttgctgccc cagagaacac gacggagaag gaaaccttct gccgggcctc gactgtgctt 240

cggcacatct acagacacca cacgtgcatg aagagcctcc tgagcggact tgacaggaac 300

ctgagcagca tggcaaacat gacctgttct gtgcatgaag ccaagaagag cactttgaaa 360

gacttcttgg aaaggctaaa gacgattatg aaggagaaat actcaaagtg ttgaatctct 420

aga                                                               423

      表1非特异性免疫小鼠分组

组别	免疫程序
		B1	裸VTPIL-4肌注接种小鼠
B2	CNP包裹VTPIL-4肌注接种小鼠
		C1	裸VR1020肌注接种小鼠
C2	CNP包裹VR1020肌注接种小鼠

注：CNP：壳聚糖纳米颗粒

        表2疫苗免疫小鼠分组

组别	免疫程序
		YB1	裸VTPIL-4肌注接种小鼠+疫苗
YB2	CNP包裹VTPIL-4肌注接种小鼠+疫苗
		YC1	裸VR1020肌注接种小鼠+疫苗
YC2	CNP包裹VR1020肌注接种小鼠+疫苗

注：CNP：壳聚糖纳米颗粒

      表3VTPIL-4重组质粒真核表达产物对猪淋巴细胞

            增殖刺激活性检测结果OD₅₇₀

转染时间	VR1020对照样品	VTPIL-4转染样品
			24h	0.199	1.570
48h	0.204	1.776
			72h	0.156	2.019

Claims (4)

1、猪白细胞介素-4基因抗病制剂的制备和使用技术，其特点包括藏猪白细胞介素-4基因的克隆及其真核表达质粒(VTPIL-4)的构建，壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-4基因真核表达质粒进行分子包装制备DNA纳米颗粒制剂，并将此DNA制剂应用于增强猪机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。

2、根据权利要求1所述的藏猪白细胞介素-4基因抗病制剂的制备，其特征在于所述的DNA制剂的基质是以分泌型质粒VR1020为载体构建的藏猪白细胞介素-4基因真核表达质粒VTPIL-4。

3、根据权利要求1所述的藏猪白细胞介素-4基因抗病制剂的制备，其特征在于所述的DNA制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒分子。

4、使用权利要求1要求的壳聚糖包装藏猪白细胞介素-4基因真核表达质粒VTPIL-4纳米颗粒作为猪用新型抗感染分子免疫调节剂的应用技术，其特征在于以下几方面：

(1)以小鼠为实验动物，将制备的壳聚糖VTPIL-4质粒纳米颗粒以肌肉注射的投递方式免疫小鼠，检测了壳聚糖包装VTPIL-4质粒及未包装VTPIL-4质粒对小鼠的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对常规疫苗在不同形式的VTPIL-4质粒分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析；

(2)以制备的壳聚糖VTPIL-4质粒纳米颗粒单独免疫实验动物，结果表明壳聚糖VTPIL-4质粒纳米颗粒能有效提高实验动物细胞和体液免疫水平，增强其非特异性免疫力；

(3)以制备的壳聚糖VTPIL-4质粒纳米颗粒联合疫苗(支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗)共免疫实验动物，结果表明壳聚糖VTPIL-4质粒纳米颗粒可显著增强实验动物对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应。

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