KR20140107616A - 사람 아르기나제 및 페길화된 사람 아르기나제 및 그의 적용 - Google Patents

사람 아르기나제 및 페길화된 사람 아르기나제 및 그의 적용 Download PDF

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KR20140107616A
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Abstract

본 발명은 부위-지향성 변이 아르기나제 및 그의 제조 방법, 및 아르기나제-관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 부위-지향성 변이 아르기나제의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 페길화된 아르기나제 및 그의 제조 방법, 및 아르기나제-관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 페길화된 아르기나제의 용도를 제공한다.

Description

사람 아르기나제 및 페길화된 사람 아르기나제 및 그의 적용{Human arginase and pegylated human arginase and application thereof}
본 출원은, 2011년 12월 27일에 발명의 명칭 “Human arginase and pegylated human arginase and the use thereof”로 출원된 중국 특허 출원 제201110445965.8호, 및 2012년 3월 16일에 발명의 명칭 “Human arginase and pegylated human arginase and the use thereof”로 출원된 중국 특허 출원 제201210069626.9호로부터 우선권을 주장하고, 이들은 그 전체로서 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 명세서와 함께 제출되는 서열 목록의 출력물(hard copy) 및 상응하는 컴퓨터 판독가능 형태가 그 전체로서 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
기술 분야
본 발명은 아르기나제, 그의 제조 방법 및 아르기나제-관련 질환의 치료에서 그의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 부위-지향성 변이 아르기나제(site-directed mutated arginase), 그의 제조 방법 및 아르기나제-관련 질환의 치료에서 그의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 페길화된 아르기나제, 그의 제조 방법 및 그의 용도를 제공한다.
아르기닌은 사람을 포함한 포유동물에서 중요한 아미노산으로, 세포 증식 및 성장을 포함한 여러 생리적 과정과 관련된다. 예를 들면, 아르기닌은 잠재적인 신호 분자인 일산화질소(nitric oxide: NO)의 합성을 위한 직접적인(immediate) 전구체이다. NO는 신경전달물질, 근육 이완제(muscle relaxant) 또는 혈관확장제(vasodilator)로 기능한다. NO의 생합성은 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)에 의해 촉매되는 Ca++ 및 NADPH-의존성 반응을 수반한다. 아르기닌의 또다른 기능은 폴리아민, 스페르미딘(spermidine) 또는 스페르민(spermine)에 대한 전구체로 및 상이한 생리적 과정에 참여하는 것이다.
연구는, 아르기닌이 8μM 미만인 경우, 암세포가 비가역적 사망을 겪는다는 것을 보여주었다 (Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30, 50). 세포 성장에 대한 효과를 연구함으로써, 아르기닌의 제거에 의해, 세포 주기 G0 기(phase)에 있는 정상 세포가 휴지 상태(resting state)로 들어가고 유의한 손상 없이 수 주 동안 생존 상태를 유지하고; 아르기닌의 농도가 정상 수준으로 돌아올 경우, 세포는 정상 세포 주기로 돌아온다는 것이 밝혀졌다. 그러나 특성 종양 세포는, 아르기닌의 결핍시 세포 주기 G1 기의 'R' 지점으로부터 S 기로 진행하고, 곧 세포사멸(apoptosis)을 겪을 것이다. 아르기닌 결핍의 결과인 종양 세포의 사멸은 비가역적이다. 그러므로, 과학자들은 체내에서 아르기닌의 수준을 조절함으로써, 특히 간암 및 흑색종과 같은 영양 요구성 종양(auxotrophic tumor)에 대해, 암을 치료하는 것을 고려하기 시작하였다. 현재 이 접근법은, 유방암, 소세포 폐암(small cell lung cancer), 전립선암, 림프종 및 백혈병을 포함한 여러 종양의 억제를 연구하는데 이용된다.
아르기나제는 L-아르기닌의 오르니틴 및 요소로의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 일반적으로, 아르기나제는 요소-생성 동물 (포유동물, 판새류(elasmobranchs), 양서류(amphibians), 및 거북이)의 간, 신장 및 고환에서 요소 회로의 효소 중 하나로 발현된다. 아르기나제는 포유동물에서 요소 순환 경로 중 최종 단계를 촉매하여, 아르기닌을 오르니틴 및 요소로 전환시킨다. 사람을 포함한 대부분의 포유동물에서, 아르기나제의 패밀리는 아르기나제 I 및 아르기나제 II를 포함한다. 아르기나제 I은 주로 간 세포에서 발현되고, 아르기나제 II는 주로 신장 및 적혈구에서 발현된다.
아르기나제를 생산하는 두 가지 방법이 존재한다; 그 중 하나는 아르기나제 생성 유기체로부터 아르기나제를 분리하는 것이고, 나머지 하나는 재조합 유전공학 기법을 통하는 것이다. 후자는 이점을 갖는다. 예를 들면, 대량의 아르기나제가 E.coli로부터 생산될 수 있다는 것이 실험에서 확인되었다. 그러나, 재조합 유전공학 기법을 통해 아르기나제를 생산하는데 있어서, 인 비보에서의 낮은 효소 활성 또는 부족한 안정성 및 짧은 반감기와 같이, 임상에서의 그의 적용을 제한하는, 기술적인 문제가 존재할 수 있다.
US7951366B2는, 아르기나제의 표면 상에 있는 아민 기 또는 N-말단에 분자량 5,000 (MW 5,000)의 폴리에틸렌 글리콜과 공유결합에 의해 접합됨으로써 변형된, his-tag를 갖는 재조합 사람 아르기나제 I을 이용한 아르기닌 결핍에 의한 사람 악성 종양의 치료를 위한 약제학적 조성물 및 방법을 개시한다. 변형된 사람 아르기나제는 사람 혈청에서 3일의 반감기를 갖는 증가된 안정성을 가졌다.
US20100247508A1은, 168 및 303번 시스테인이 세린으로 치환되고 아르기나제가 분자량이 20 KDa의 폴리에틸렌 글리콜에 의해 페길화된(pegylated), his-tag을 갖는 변형된 사람 아르기나제를 개시한다. US7951366B2에 개시된 재조합 사람 아르기나제 I과 마찬가지로, 부가적인 펩티드 단편인 His-tag이 아르기나제의 아미노산 서열에 포함된다. 대부분의 국가에서 의약품 규제 기관(drug regulatory agency)은 이들 펩티드 단편의 사용을 권장하지 않는다. 예를 들면, 중국 국가식품약품관리국(China State Food and Drug Administration)은 "Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use"에서, 생산 공정을 단순화하기 위한 목적으로 도입된 His-tag과 같은 부가적인 펩티드 단편이 가능한 한 최종 생성물로부터 제거되어야 한다고 명시한다.
WO 2011/008495A2는, 세 개의 시스테인을 보유하고 N-말단의 3번째 아미노산 잔기를 치환함으로써 다른 시스테인 잔기가 도입된 후, 분자량 20 KDa의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드에 의해 페길화된, 부위-지향성 변형 아르기나제를 개시한다. 이 사람 아르기나제는 원래의 세 개의 시스테인 잔기를 여전히 포함하므로, 그의 페길화 산물은 불균질(heterogeneous)하고 수율이 낮은 경향이 있어, 정제에서도 곤란을 가중시킨다.
본 기술 분야는, 아르기닌 관련 질환 또는 장애의 치료를 위하여, 보다 우수한 아르기나제 또는 그의 유도체에 대한 요구를 갖는다.
발명의 요약
본 발명은 단리되고 실질적으로 순수한 아르기나제를 제공한다. 아르기나제는 포유동물의 요소의 합성에 있어서 요소 순환 경로 중 최종 단계에서, 아르기닌을 오르니틴 및 요소로 전환시키는 효소이다. 사람을 포함한 대부분의 포유동물에서, 아르기나제의 패밀리는 아르기나제 I 및 아르기나제 Ⅱ를 포함한다. 여러 기원의 아르기나제 I에 대한 연구는, 상이한 기원의 아르기나제 I이 그의 서열이 상이할 수 있기는 하지만, 다수의 보존 영역(conserved region) 및 활성 부위를 갖는다는 것을 보여주었다. Haraguchi, Y., etc., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. 84, 412-415에 의해 보고된 바와 같이, 야생형 사람 아르기나제 I은, 45, 168 및 303번 아미노산 위치에 세 개의 시스테인을 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 야생형 사람 아르기나제 I은 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
본 발명에서, 용어 "단리된(isolated)"은 인공적인(non-natural) 형태를 지칭한다. 용어 "실질적으로 순수한(substantial pure)"은 생성물이 생산 또는 단백질 변형에서 유래한 기타 구성성분을 포함할 수 있으나, 그와 같은 기타 구성성분은 실질적으로 존재하지 않거나 단지 적은 비율로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에서, 아미노산 부위의 위치에 관한 기재는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 사용된다. 예를 들면, 문구 "서열번호 x의 서열 중 45번 위치의(in position 45 of the sequence of SEQ ID NO.x)" 또는 "서열번호 x의 서열 중 45번 위치의 Cys (시스테인)(Cys (cysteine) in position 45 of the sequence of SEQ ID NO.x)" 또는 "Cys45"는 아미노산 서열 중 45번째 아미노산 잔기 또는 45번 위치의 시스테인을 지칭한다.
일 양태에서, 본 발명은
(1) 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 하나, 두 개 또는 세 개가 돌연변이된, 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는
(2) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위가 (1)에 정의된 아미노산 서열에 도입된, 아미노산 서열을 포함하는 사람 아르기나제 I이고, 아르기나제 활성을 갖는 변이 아르기나제(mutant arginase)를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 시스테인은 무극성 아미노산으로 독립적으로 돌연변이된다. 그의 측쇄의 특성에 따라, 아미노산은 극성 또는 무극성 아미노산으로 분류될 수 있다. 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린과 같이, 전하를 띠지 않거나 약한 극성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산은 무극성 아미노산으로 불린다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 시스테인은 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이된다. 바람직하게는, 시스테인은 독립적으로 알라닌으로 돌연변이된다. 본 발명은 예상치 못하게, 비-이온성 극성 아미노산인 시스테인이 무극성 아미노산 (예를 들면, 알라닌)으로 돌연변이될 경우, 사람 아르기나제 I의 효소 활성이 유의하게 증가한다는 것을 밝혔다. 가능한 원인 중 하나는 변이 아르기나제와 기질 사이의 결합이 향상된다는 것이다.
일 앙태에서, 본 발명의 아르기나제에서 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 하나가 돌연변이된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된다. 바람직하게는, 상기 시스테인은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고; 보다 바람직하게는, 이 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 두 개가 돌연변이된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 45 및 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된다. 바람직하게는, 이 시스테인은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고; 보다 바람직하게는, 이 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 168 및 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된다. 바람직하게는, 상기 시스테인은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고; 보다 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45 및 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된다. 바람직하게는, 상기 시스테인은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고; 보다 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다.
일 양태에서, 본 발명의 아르기나제에서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된다. 바람직하게는, 상기 시스테인은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고; 보다 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다.
본 발명의 아르기나제는 야생형 아르기나제보다 더 높은 효소 활성을 갖는다. 본 발명의 아르기나제는 통상적으로 약 500 U/mg 이상의 비활성(specific activity)을 갖는다; 바람직하게는, 이 활성은 약 700 U/mg 이상이고; 보다 바람직하게는, 이 활성은 약 800 U/mg 이상이다. 본 발명의 아르기나제는 통상적으로 야생형 아르기나제보다 더 높은 효소 활성을 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 아르기나제는, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치의 아미노산 잔기 시스테인에 대한 하나 이상의 코돈이 치환된, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 아미노산은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 전사 RNA에서 세 개의 뉴클레오티드로 이루어진 코돈(three-nucleotide codon)은 하나의 아미노산을 지정한다. 본 발명의 일 양태에서, 뉴클레오티드 치환은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린을 코딩하는 코돈에 의해 치환된 코돈 TGT이다. 바람직하게는, 코돈 TGT는 알라닌을 코딩하는 코돈에 의해 치환된다.
본 발명의 일 양태에서, 알라닌을 코딩하는 코돈은 GCT, GCC, GCA, GCG이고, 바람직하게는 GCT이다.
일 양태에서, 본 발명은, 단백질을 발현할 수 있는 숙주에서 아르기나제 또는 변이 아르기나제의 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 상기 언급된 아르기나제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 아르기나제를 위한 제조 방법은 통상적으로 하기 주요 단계를 포함한다. PCR 또는 합성 방법에 의해 원하는 유전자 또는 뉴클레오티드 단편을 얻는다. 원하는 유전자를 갖는 DNA 단편을, 플라스미드, 파지 또는 바이러스와 같이, 독립적으로 복제될 수 있고 선별 마커를 갖는 벡터와 연결시켜, 재조합 DNA 분자를 형성한다. DNA 단편의 벡터로의 라이게이션(ligation)은 주로 호모폴리머 테일(homopolymer tail), 점착성 말단, 평활 말단 또는 인공 링커를 통해 이루어진다. 재조합 DNA는 증식되고 발현되기 위하여 숙주 세포 내로 도입되어야 한다. 벡터의 상이한 특성에 따라, 형질감염, 형질전환, 형질전이를 수행하여, 재조합 DNA 분자를 숙주 세포 내로 도입하고 증식시킨다. 적합한 유전공학 숙주는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 대장균, 효모, 곤충 세포 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 단리되고 실질적으로 순수한 페길화된 아르기나제를 제공한다. 상기 페길화된 아르기나제에서 아르기나제는 앞서 정의된 바와 같다. 일 양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 본 발명의 상기 아르기나제의 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 하나, 두 개 또는 세 개가 돌연변이되고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 무극성 아미노산으로 돌연변이되며, 보다 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이되고, 보다 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된다. 본 발명의 페길화된 아르기나제는 상기 아르기나제의 페길화에 의해 수득된다. 상기 페길화된 아르기나제에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 이 아르기나제의 아미노산 잔기와 공유적으로 결합된다. 본 발명에서, 각 아르기나제는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 결합되어 페길화된 아르기나제를 형성한다.
일 양태에서, 본 발명은
(1) 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 하나, 두 개 또는 세 개가 돌연변이된, 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는
(2) 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위가 (1)에 정의된 아미노산 서열에 도입된, 아미노산 서열을 포함하는 사람 아르기나제 I이고, 아르기나제 활성을 갖는 페길화된 아르기나제를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 페길화된 아르기나제에서 시스테인은 독립적으로 무극성 아미노산으로 돌연변이된다. 20개의 아미노산의 구조는 그의 측쇄의 차이로 인해 상이하다. 전하를 띠지 않거나 약하게 극성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산은, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린과 같은, 무극성 아미노산에 속한다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제 I은, C 또는 N 말단에 부가되는 His-tag 서열과 같이, 정제에 사용하기 위한 태그(tag) 서열을 포함하지 않는다. His-tag 융합 단백질은 단백질 발현의 가장 일반적인 수단이고, 정제가 용이하고 단백질의 활성에 유의한 영향을 미치지 않는는 장점을 갖는다. 가용성 형태 또는 응집체(inclusion body)인 단백질 발현 산물은 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있었다. 반면에, 잠재적인 면역원성 특성으로 인해, 중국 국가식품약품관리국은 "Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use"에서, 생산 공정을 단순화하기 위한 목적으로 도입된 His-tag과 같은 부가적인 펩티드 단편은 가능한 한 최종 생성물로부터 제거되어야 한다고 명시한다.
본 발명에서, 아르기나제의 페길화는 화학적 변형에 의해 달성될 수 있고, 상기 화학적 변형은 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 (페길화 시약으로도 지칭되는) 커플링제(coupling agent)를 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 분자를 아르기나제와 공유결합에 의해 접합시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 일반적인 폴리에틸렌 글리콜 분자는 그의 각 말단에 히드록실기를 갖는다. 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)은 메톡시기에 의해 하나의 말단이 차단된 폴리에틸렌 글리콜이다. 펩티드 또는 단백질의 변형에 사용되는 가장 일반적으로 연구된 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)의 유도체이다. 이 변형은 주로 아미노기, 카르복실기 또는 티올기에 대한 변형을 포함한다. 일반적인 페길화 방법 중 하나는 폴리에틸렌 글리콜 또는 페길화 시약, 예를 들면, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 부티레이트 (mPEG-SBA), mPEG-숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA), mPEG-숙시니미딜 숙시네이트 (mPEG-SS), mPEG-숙시니미딜 카보네이트 (mPEG-SC)，mPEG-숙시니미딜 글루타레이트 (mPEG-SG)，mPEG-N-히드록시-숙시니미드 (mPEG-NHS), mPEG-트레실레이트 및 mPEG-알데히드를 단백질의 표면 라이신의 ε-NH2 또는 N-말단 α-NH2와 공유적으로 결합시키는 것이다. 티올기의 높은 친핵성으로 인해, 또다른 일반적인 페길화 방법은, 펩티드 또는 단백질의 티올기를 변형시키기 위하여, 단백질의 티올기와 특이적으로 접합할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 또는 페길화 시약, 예를 들면, mPEG-말레이미드, mPEG-오르토-피리딜-디설파이드, mPEG-비닐설폰 및 mPEG-요오도아세트아미드의 선택적 사용이다. 사람 아르기나제는 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치에 세 개의 시스테인 잔기를 갖고, 이는 티올기를 지향하는 PEG 분자와의 공유결합에 의한 접합에 의해 부위-지향성으로 변형(site-directed modified)될 수 있다.
본 발명의 아르기나제 I의 아미노산 서열은 아미노기 페길화를 위한 잠재적 부위로 24개의 라이신 및 N-말단 아미노기를 포함한다; 각각은 이 단백질의 3-차원 구조에서의 상이한 위치로 인해, 상이한 정도의 페길화를 갖는다. PyMOL 또는 Swiss-PdbViewer에 의한 아르기나제의 3-차원 구조 분석에 따르면, 24개의 ε-아미노기 중 12개는, 입체 장해(steric hindrance) 또는 주변 작용기에 의해 형성되는 수소 결합으로 인해 페길화되기 어렵다. K4, K33, K41, K75, K89, K150, K155, K191, K224, K284, K313, 및 K322의 ε-아미노기는 아미노기를 표적화하는 PEG 시약에 의한 반응에 대해 접근가능하고, K191，K224，K89，K284의 ε-아미노기는 페길화에 있어서 가장 용이하게 접근가능한 부위이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA), mPEG-숙시니미딜 부티레이트 (mPEG-SBA), mPEG-숙시니미딜 숙시네이트 (mPEG-SS), mPEG-숙시니미딜 카보네이트 (mPEG-SC)，mPEG-숙시니미딜 글루타레이트 (mPEG-SG)，mPEG-N-히드록실-숙시니미드 (mPEG-NHS), mPEG-트레실레이트 및 mPEG-알데히드로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트이고; 바람직하게는, 상기 페길화 시약은 평균 분자량 5K를 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000이다.
PEG의 분자량 선택은 생물-활성 및 약동학 특성을 종합적으로 고려해야 한다. 연구는, 체내에서 변형된 단백질 약물의 작용 시간이 접합된 PEG의 수 및 분자량과 상관된다는 것을 보여주었다. 너무 큰 PEG 분자에 의해 변형된 단백질은 그 활성 중 일부를 상실할 수 있다. 본 발명에 이용되는 PEG는 5K 내지 40K의 분자량을 갖고, 선형 또는 분지형이다. 본 발명에서 이용되는 PEG는 당해 기술 분야에서 이용되는 PEG 유도체일 수 있다. 본 발명에서 이용되는 PEG는 특정의 구체적인 종류(type)에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아르기나제의 각 분자와 접합된 PEG 분자의 총 분자량은 약 20 내지 70K이고; 바람직하게는, 이 총 분자량은 약 30 내지 60K이다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화에서 이용되는 각 PEG 분자는 약 2 내지 40K의 평균 분자량을 갖고; 바람직하게는, 평균 분자량은 약 5 내지 20K이고; 보다 바람직하게는, 평균 분자량은 약 5K이다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화에서 이용되는 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고; 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자와 접합되며; 바람직하게는, 각 아르기나제 분자는 6 내지 12개의 PEG 분자와 접합된다.
아르기나제의 각 분자와 접합된 PEG 분자의 수는, 단백질/PEG 시약의 비율, 반응 시간, 및 온도와 같은, 페길화 반응에 영향을 미치는 파라미터를 조정함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자와, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합되도록 조절될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 페길화된 아르기나제는 아민 반응성 PEG 시약을 아르기나제의 표면 상에 있는 라이신의 ε-아미노기, 예를 들면, K191，K224，K89, K284의 아미노기, 또는 N-말단의 ε-아미노기와 공유결합에 의해 접합시킴으로써, 또는 K4, K33, K41, K75, K150, K155, K313, 및 K322의 부위에서 추가로 페길화시킴으로써 형성된다. 아르기나제의 각 분자와 접합된 PEG 분자의 수는 단백질/PEG 시약의 비율, 반응 시간 또는 온도와 같은, 페길화 반응에 영향을 미치는 파라미터를 조정함으로써 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 바람직하게는 6 내지 12개의 분자로 조절될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치의 세 개의 시스테인 중 하나 (예를 들면, 시스테인 45번, 시스테인 168번 또는 시스테인 303번)가 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이될 수 있고; 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되며, 상기 페길화된 아르기나제의 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고; 상기 페길화된 아르기나제의 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000을 이용하여 수행된다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 168 및 303번 위치의 시스테인은 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 독립적으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되며, 상기 페길화된 아르기나제의 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 상기 페길화된 아르기나제의 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000을 이용하여 수행된다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45 및 303번 위치의 시스테인은 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 독립적으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되며, 페길화된 아르기나제의 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 페길화된 아르기나제의 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000을 이용하여 수행된다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45 및 168번 위치의 시스테인은 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 독립적으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되며, 상기 페길화된 아르기나제의 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 상기 페길화된 아르기나제의 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000을 이용하여 수행된다.
본 발명의 일 양태에서, 페길화된 아르기나제의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치의 시스테인은 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 독립적으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되며, 상기 페길화된 아르기나제의 각 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 상기 페길화된 아르기나제의 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자, 및 바람직하게는 6 내지 12개의 분자와 접합된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 페길화는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000을 이용하여 수행된다.
본 발명의 페길화된 아르기나제는 실질적으로 균질하다(homogeneous). 실질적으로 균질하다는 것은, 생성물이 실질적으로 페길화된 아르기나제를 포함하나, 소량의 미반응 (즉, 페길화되지 않은) 단백질 또는 폴리머성 페길화된 아르기나제를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명은 90%를 초과하는, 바람직하게는 95%를 초과하는, 보다 바람직하게는 98%를 초과하는 순도를 갖는 페길화된 아르기나제를 제공한다. 본 발명에서, 용어 "페길화된 아르기나제의 순도(purity of pegylated arginase)"는 전체 아르기나제 (PEG와 공유적으로 결합된 아르기나제, PEG와 공유적으로 결합되지 않은 아르기나제 및 폴리머성 페길화된 아르기나제) 중 페길화된 아르기나제 (즉, PEG와 공유적으로 결합된 아르기나제)의 퍼센트를 의미한다. 통상적으로, 생성물은 PEG와 공유적으로 결합되지 않은 아르기나제 및 폴리머성 형태의 아르기나제를 포함하므로 추가의 정제를 필요로 한다. 양이온 교환 크로마토그래피 및 접선 유동 여과(Tangenital Flow Filtration)를 포함한 일반적으로 이용되는 정제 기법의 수단이 당해 분야에 알려져 있다.
본 발명의 페길화된 아르기나제는, 혈액 또는 혈청에서, 0.5일 이상의 반감기를 갖고; 바람직하게는, 상기 아르기나제는 2.5일 이상의 반감기를 갖고; 보다 바람직하게는, 상기 아르기나제는 3.5일 이상의 반감기를 갖는다. 아르기나제의 반감기는 당해 분야에서 알려져 있고 일반적으로 이용되는 방법에 의해 측정될 수 있다. 혈액 또는 혈청에서 아르기나제의 반감기에 대하여 측정된 데이터와 사용된 동물 모델 간에는 특정한 관계가 존재한다. 통상적으로, 보다 높은 대사 속도를 갖는 동물 (예를 들면, 랫트)에서 얻어진 반감기 데이터는 보다 낮은 대사 속도를 갖는 동물 (예를 들면, 사람)에서 얻어진 것보다 더 짧다.
본 발명은 페길화된 아르기나제를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 페길화는 PEG 분자와 아르기나제의 아미노산 잔기의 접합에 의해 달성된다. 본 발명의 페길화된 아르기나제에서, 각 아르기나제 분자는 PEG 분자와 결합되어 페길화된 아르기나제를 형성한다.
본 발명에서, 부위-지향성 페길화는 아르기나제 상의 작용기를 PEG 시약과 공유결합에 의해 접합시킴으로써 수행되는 화학적 변형에 의해 달성된다. 상기 화학적 변형은 특이적일 수 있고, 즉, PEG 분자는 특정 작용기와 결합하는 시약을 이용하여 아르기나제의 특정 아미노산 잔기와만 결합한다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 아르기나제 또는 페길화된 아르기나제, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물의 아르기나제-관련 질환을 치료하는데 있어서의 적용/용도를 제공한다. 당해 분야에서 알려진 상기 아르기나제 관련 질환은 포유동물의 체내에서 아르기닌 수준과 관련된 상태/질환/장애를 포함한다. 그와 같은 상태/질환/장애는 아르기닌혈증을 포함한다. 아르기나제 결핍에 의해, 개체의 체내에서 아르기닌은 요소로 분해되어 오르니틴 대사 회로에 참여할 수 없어서, 혈중 아르기닌 수준은 정상 혈액 수치보다 7 내지 10배 더 높을 수 있고, 동시에 뇌척수액 및 소변 중 아르기닌 수준과 크레아티닌의 요소 분비가 또한 증가된다. 또한, 상기 상태/질환/장애는 아르기닌-의존성 과다형성 또는 종양을 포함한다. 세포 성장에 대한 효과를 연구함으로써, 아르기닌의 제거에 의해, 세포 주기 G0 기에 있는 정상 세포가 휴지 상태로 들어가고 유의한 손상 없이 수 주 동안 생존 상태를 유지하고; 아르기닌의 농도가 정상 수준으로 돌아올 경우, 세포가 정상 세포 주기로 돌아온다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 증식 중의 세포 또는 종양은, 아르기닌의 결핍시 세포 주기 G1 기의 'R' 지점을 지나 S 기로 진행하고, 곧 세포사멸을 겪는다. 아르기닌 결핍의 결과인 과다형성 세포 또는 종양 세포의 세포사멸은 비가역적이다. 그러므로, 과학자들은 체내에서 아르기닌의 수준을 조절함으로써 과다형성 또는 종양을 치료하는 것을 고려하기 시작하였다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 약제학적 조성물의 활성 성분이 전술된 아르기나제 또는 페길화된 아르기나제인, 약제학적 조성물을 제공한다. 이 약제학적 조성물의 제형은 고체, 용액, 에멀젼, 분산액, 마이셀, 리포좀의 형태일 수 있고, 이 제형은 활성 성분으로 본 발명의 사람 아르기나제 또는 페길화된 아르기나제 중 하나 이상을 포함하며, 비경구 적용에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 증점제, 착색제 및 향료가 포함될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 단리되고 실질적으로 순수한 사람 아르기나제 또는 페길화된 아르기나제는, 상태 또는 질환에 대해 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 활성 성분으로 포함된다. 약제학적 조성물은, 정제(tablet), 알약(pill), 로젠지(lozenge), 수화(hydration) 또는 오일 기반 현탁액, 분산된 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽과 같이, 경구 투여에 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 당해 분야에 알려진 기법에 따라 캡슐화되어 위장관에서의 분해 및 흡수를 늦춤으로써, 보다 장시간 동안 지속되는 효과를 제공할 수 있다. 또한, 이 제형은 멸균된 주사가능 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 고체, 액체, 현탁액, 마이셀 또는 리포좀 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명의 일 앙태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여 또는 주사가능한 형태로 제제화된다.
도 1은 야생형 아르기나제 I의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2는 환원성 조건하에서 사람 아르기나제 I의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 3은 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의한 사람 아르기나제의 발현을 나타낸다.
도 4는 환원성 및 비-환원성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 야생형 및 변이 아르기나제 I의 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 환원성 및 비-환원성 조건하에서 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303 및 rhArgI-A45/303)의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 6은 환원성 및 비-환원성 조건하에서 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 6a는 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 비-환원성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 6b는 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 환원성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 7은 페길화된 사람 아르기나제 I의 비-환원성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 8은 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다.
도 8a는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: A168/303-Y40K.
도 8b는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: A45/303-Y40K.
도 8c는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: RP-V-J5K.
도 8d는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: RP-M2-J5K.
도 8e는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: RP-M3-J5K.
도 8f는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: RP-M4-J5K.
도 8g는 페길화된 아르기나제 I의 질량 분석을 나타낸다: RP-M7-J5K.
도 9는 페길화된 아르기나제의 질량 분석의 통합된(consolidated) 도면을 나타낸다.
본 발명은 하기 기술된 구체예를 이용하여 더 설명될 것이다. 이들 구체예가 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하나, 이들은 단지 설명적인 예시로서 주어진다는 것이 이해되어야 한다. 전술된 설명 및 구체예를 참고하여, 통상의 기술자는, 본 발명의 필수적인 특징을 결정할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 기타의 용도 및 조건으로 개조하는 여러 방식으로 본 발명을 변화 및 변형시킬 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 표시되고 기술된 것 이외의, 전술한 것에 따른, 본 발명에 대해 이루어진 변화/변형은 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 또한 이들 변형은 첨부된 청구항의 범위 중 일부를 형성하는 것으로 의도된다.
실시예 1: His-tag이 없는 재조합 사람 아르기나제 I 플라스미드 pET30a (+)-라기나제(rharginase)-V의 발현 및 구성.
사람 아르기나제 I 유전자 서열은 1987년에 공개되었다 (Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412-415). 사람 간 5' 스트레치 플러스(human liver 5' stretch plus) cDNA 라이브러리 (clontech)를 주형으로 이용하고 전술된 아르기나제 I 서열에 따라 설계된 프라이머 ARG-V (+) 및 ARG-V (-)을 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 사람 아르기나제 유전자를 증폭하였다. 프라이머 ARG-V (+)는 Nde I 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하고, ARG-V (-) 프라이머는 XhoI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 분자 생물학의 일반적인 실험 기법을 이용하여, 사람 아르기나제 I PCR 산물을 수득하고 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 상기 증폭된 사람 아르기나제 I PCR 산물 및 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 pET30a (+)를 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 XhoI (Promega)에 의해 개별적으로 37℃에서 1.5시간 동안 절단하였다(digested). 절단된 단편을 16℃에서 T4 DNA 라이게이즈에 의해 밤새 라이게이션하고, 결과로 얻은 라이게이션된 재조합 플라스미드를 DH5α E. coli 컴피턴트(competent) 세포로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 카나마이신 (30 ㎍/ml)을 함유한 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하고 배양함으로써 선발하였다. 제한 엔도뉴클레아제 절단 분석(digest assay)에 의해 올바른 인서트(insert)를 함유한 플라스미드를 확인하였다. 이하에서 pET30a (+)-라기나제-V로 지칭되는, 올바른 재조합 사람 아르기나제 I 발현 플라스미드를 시퀀싱에 의해 분석하여 사람 아르기나제 I 유전자의 올바른 서열 및 삽입을 확인하였다. 인서트 크기는 969 염기쌍(bp) 길이이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이것은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
Figure pct00001

실시예 2: His-tag이 없는 재조합 사람 아르기나제 I 플라스미드 DNA pET30a (+)-라기나제-V의 발현 및 표적 단백질의 정제.
100 ㎕의 컴피턴트 BL21(DE3) 세포를 얼음 상에서 해동시켰다. 1 ㎕의 pET30a (+)-V 재조합 플라스미드를 컴피턴트 세포에 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 혼합물을 42℃ 수조에서 90초 동안 열 충격 처리한 후 얼음 상에서 2분 동안 더 인큐베이션 하였다. 500 ㎕의 LB 액체배지(broth)를 형질전환 세포에 첨가하고 37℃, 150 rpm으로 1시간 동안 진탕-배양하였다. 인큐베이션 후, 200 ㎕의 형질전환 세포 현탁액을 카나마이신 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하고 도포한 후, 뒤집은 채로(upside-down) 37℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 단일 콜로니를 선택하고 25 ml의 LB 액체배지로 옮기고, 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600 nm)가 0.6-0.8에 도달할 때까지 37℃, 150 rpm에서 진탕-배양하였다. 최종 농도 0.2 mM의 IPTG를 배양액에 첨가하여 표적 단백질의 발현을 3시간 동안 유도하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 이용하여 선택된 클론의 표적 단백질 발현을 분석하였다. 보다 높은 단백질 발현을 갖는 클론을 조작된(engineered) 박테리아로 글리세롤 스톡으로 저장하였다.
조작된 박테리아 세포를 15L 발효기 중에서 유가배양하였다. OD600 nm가 12-13에 도달한 경우, 최종 농도 0.2 mM의 IPTG를 배양액에 첨가하여 표적 단백질의 발현을 3-4시간 동안 유도하였다. 유도된 박테리아 세포를 수집하고 파쇄하였다. 후속의 표적 단백질 분리 및 정제를 위해 세포 파쇄물을 원심분리하고 상층액을 수집하였다.
CM 양이온 액체 크로마토그래피를 이용하여 표적 단백질 정제를 수행하였다. 시료 로딩 전 Tris-HCl을 이용하여 컬럼을 평형화시켰다. 박테리아 세포의 파쇄물 상층액을 컬럼에 로딩한 후, 3 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 세척함으로써 약하게 결합되거나(associated) 또는 비-특이적으로 결합된 불순물을 제거하였다. UV280 nm의 판독이 안정화되었을 때, Tris-HCl 및 NaCl을 함유한 용리 완충액을 이용하여 표적 단백질을 용리시켰다. 컬럼으로부터 용리된 단백질 피크를 수집하고 SDS-PAGE 및 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석하였다.
실험 결과를 도 2 및 3에 도시하였다.
도 2는 사람 아르기나제 I 발현 수준의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각 레인의 시료는 하기와 같다:
1. 단백질 분자량 표준 시료(standard); 2. 박테리아 파쇄물 상층액; 3. 정제된 His-tag이 없는 사람 아르기나제 I; 4. CM 양이온 교환 컬럼 통과액(flow through).
도 3은 정제된 사람 아르기나제 I의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 전술된 크로마토그래피 과정을 통해 수득된 아르기나제의 순도는 90%를 초과한다.
실시예 3: 사람 아르기나제 I (rhArgI)의 부위-지향성 돌연변이 유발.
QuickChange 부위-지향성 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)를 이용하여 사람 아르기나제 I의 아미노산 서열 중 45, 168 및 303번 위치에 부위-지향성 돌연변이를 도입하였다. 야생형 사람 아르기나제를 포함하는 재조합 플라스미드 pET30a-라기나제 I-V를 주형으로 이용하였다. 45, 168 및 303번 위치에서 시스테인을 코딩하는 코돈 (TGT)을 알라닌을 코딩하는 코돈 (GCT)으로 독립적으로 돌연변이시켜, 하나의, 두 개의 또는 세 개의 부위에 돌연변이를 생성하였다. 사람 아르기나제 I 중 45, 168, 및 303번 위치에서 대체 코돈 GCT를 도입하기 위해 의도된 프라이머는 하기에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00002
돌연변이 유발 키트에 제공된 지시사항에 따라 PCR을 수행하였다. 돌연변이되지 않은 모(parental) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제 DpnI으로 절단하였다. 그 후 변이된 플라스미드를 컴피턴트 세포로 형질전환하고 시퀀싱에 의해 확인하였다. 시스테인을 코딩하는 코돈 (TGT)의 알라닌을 코딩하는 코돈 (GCT)으로의 돌연변이를 포함하는 변이 아르기나제 플라스미드에 의해 형질전환된 클론을 선발하고 LB 액체배지 배양물에서 확장시켰다. 표적 변이 플라스미드를 Wizard Plus 미니 프랩(mini prep) 키트를 이용하여 단리하였다.
아미노산 위치 303, 168 또는 45번에서 하나의 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이를 갖는 변이 사람 아르기나제 I을 각각 rhArgI-A303, rhArgI-A168 또는 rhArgI-A45로 표시하였다. 아미노산 위치 168 및 303번에서, 아미노산 위치 45 및 303번에서 및 아미노산 위치 45 및 168번에서, 두 개의 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이를 갖는 변이 사람 아르기나제 I를 각각 rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303 및 rhArgI-A45/168로 표시하였다. 아미노산 위치 45, 168 및 303번에서 세 개의 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이를 갖는 변이 사람 아르기나제 I을 rhArgI-A45/168/303로 표시하였다. 전술된 아르기나제 변이 인서트를 포함하는 플라스미드를 pET30a(+)-rhArgI-A303, pET30a(+)-rhArgI-A168, pET30a(+)-rhArgI-A45, pET30a(+)-rhArgI-A168/303, pET30a(+)-rhArgI-A45/303, pET30a(+)-rhArgI-A45/168 또는 pET30a(+)-rhArgI-A45/168/303으로 표시하였다.
100 ㎕의 컴피턴트 BL21(DE3) 세포를 얼음 상에서 해동시켰다. 1 ㎕의 변이 구조물(construct)을 BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 혼합물을 42℃에서 90초 동안 열 충격 처리한 후, 얼음 상에서 2분 동안 더 인큐베이션 하였다. 500 ㎕의 LB 액체배지를 형질전환 세포에 첨가하고 37℃, 150 rpm으로 1시간 동안 진탕-배양하였다. 인큐베이션 후, 200 ㎕의 형질전환 세포 현탁액을 카나마이신 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하고 도포한 후, 뒤집은 채로 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 단일 콜로니를 선택하고 25 ml의 LB 액체배지로 옮기고, 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600 nm)가 0.6-0.8에 도달할 때까지 37℃, 150 rpm에서 진탕-배양하였다. 최종 농도 0.2 mM의 IPTG를 배양액에 첨가하여 표적 단백질의 발현을 3시간 동안 유도하였다. SDS-PAGE를 이용하여 선택된 클론의 표적 단백질 발현을 분석하였다. 보다 높은 단백질 발현을 갖는 클론을 조작된 박테리아로 글리세롤 스톡으로 저장하였다.
실시예 4: 부위 특이적 변이 아르기나제 I의 발현 및 단백질 정제.
변이 아르기나제 I (rhArgI) 플라스미드 (pET30a(+)-rhArgI-A303, pET30a(+)-rhArgI-A168, pET30a(+)-rhArgI-A45, pET30a(+)-rhArgI-A168/303, pET30a(+)-rhArgI-A45/303, pET30a(+)-rhArgI-A45/168 또는 pET30a(+)-rhArgI-A45/168/303)에 의해 형질전환된 조작된 E. coli 세포를 15L 발효기 중에서 유가배양하였다. OD600 nm가 12-13에 도달했을 때, 최종 농도 0.2 mM의 IPTG를 배양액에 첨가하여 표적 단백질의 발현을 3-4시간 동안 유도하였다. 박테리아 세포를 수집하고 파쇄하였다. 후속의 표적 단백질 분리 및 정제를 위해 세포 파쇄물을 원심분리하고 상층액을 수집하였다.
CM 양이온 액체 크로마토그래피를 이용하여 표적 단백질 정제를 수행하였다. 시료 로딩 전 Tris-HCl을 이용하여 컬럼을 평형화시켰다. 박테리아 세포의 파쇄물 상층액을 컬럼에 로딩한 후, 3 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 세척함으로써 약하게 결합되거나 또는 비-특이적으로 결합된 불순물을 제거하였다. UV280 nm의 판독이 안정화되었을 때, Tris-HCl 및 NaCl를 함유한 용리 완충액을 이용하여 표적 단백질을 용리시켰다. 컬럼으로부터 용리된 단백질 피크를 수집하여, 변이 아르기나제 I rhArgI-A303, rhArgI-A168, rhArgI-A45, rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303를 수득하였다.
수집된 단백질 시료의 순도를 SDS-PAGE 및 HPLC에 의해 분석하였다. 전술된 크로마토그래피 과정을 이용하여, 아르기나제의 순도는 90%를 초과하는 것으로 결정되었다.
실시예 5: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI)의 활성
우레아제 및 글루타메이트 데히드로게나제와 결합된 분광광도법에 의해 아르기나제의 활성을 결정하였고, 이는 하기 모식도에 표시된다. NADPH는 340 nm 파장에서 최적 흡광도를 갖는다. NADPH가 NADP+로 산화될 경우, 340 nm에서의 흡광도는 감소한다. 아르기나제의 활성은 NADPH의 몰 흡광계수(molar extinction coefficient) (ΔE340= 6220 M-1 cm-1)와 함께 340 nm에서의 흡광도 감소를 모니터링함으로써 상관되고 결정될 수 있다.
Figure pct00003
아르기나제 활성 1 유닛 (U)은 30℃, pH 8.3의 조건하에서 1μmol 요소의 방출로 정의하였다.
아르기나제의 비활성(specific activity)을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
비활성 (U/mg) = [(ΔA/Δt) x (1/ε) x 106 x (1/2)] / [E]
ΔA = 340 nm에서의 흡광도 차이
ε = NADPH 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수(Km) (6220M-1cm-1)
[E] = 반응 혼합물 중 효소의 농도 (mg/mL)
전술된 분석을 이용하여, 여러 변이 아르기나제 I (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 비활성은 각각 747 ± 63 U/mg， 814 ± 91 U/mg，786 ± 58 U/mg，782 ± 19 U/mg，및 759 ± 68 U/mg인 것으로 결정되었다. 야생형 사람 아르기나제 I의 비활성은 491 ± 42 U/mg인 것으로 결정되어, 168/303, 45/303, 45/168 및 45/168/303번 위치의 무극성 비이온성 아미노산인 시스테인을 무극성 아미노산인 알라닌으로 돌연변이시킨 후 아르기나제 활성의 유의한 증가가 입증되었다.
실시예 6: 야생형 및 변이 아르기나제 I (rhArgI)의 SDS-PAGE 분석.
종래의 방법을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 분석 전, 환원성 (즉, 시료 로딩 완충액에 β-메캅토에탄올이 포함되어 분자 간 및 분자 내 이황화 결합을 파괴시켰다) 또는 비-환원성 조건하에서 시료를 처리하여, 12% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 야생형 및 여러 변이 아르기나제 I의 분자 내 이황화 가교 형성을 판독하였다 (도 4, 5, 6a, 6b).
도 4는 환원성 및 비-환원성 조건하에서 처리 후 야생형 아르기나제 I의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 레인의 시료는 하기와 같다: 레인 1 및 3: 박테리아 세포 파쇄물 상층액; 레인 2: 정제된 His-tag이 없는 아르기나제 (비-환원성); M: 단백질 분자량 표준 시료; 레인 4: 정제된 His-tag이 없는 사람 아르기나제 I (환원성)
도 5는 환원성 및 비-환원성 조건 하에서 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303 및 rhArgI-A45/303)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각 레인의 시료는 하기와 같다: 레인 1: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A303 (비-환원성); 레인 2: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A168/303 (비-환원성); 레인 3: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/303 (비-환원성); M: 단백질 분자량 표준 시료; 레인 4: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A303 (환원성); 레인 5: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A168/303 (환원성); 레인 6: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/303 (환원성).
도 6a는 비-환원성 조건하에서 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각 레인의 시료는 하기와 같다: M: 단백질 분자량 표준 시료; 레인 1: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/168/303; 레인 2: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/168.
도 6b는 환원성 조건하에서 정제된 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168 및 rhArgI-A45/168/303)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각 레인의 시료는 하기와 같다: M: 단백질 분자량 표준 시료; 레인 1: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/168/303; 레인 2: 변이 아르기나제 I, rhArgI-A45/168.
환원성 및 비-환원성 조건하에서 아르기나제 I의 SDS-PAGE 분석으로부터 나타난 바와 같이, 야생형 사람 아르기나제 I은 본 발명에 기재된 실험 조건하에서 다른 입체구조(conformation)를 갖는다. 그와 같은 조건하에서, 303번 위치의 시스테인이 알라닌으로 돌연변이될 경우, 또한 다른 입체구조가 나타났다. 그러나, 아미노산 위치 45, 168 및 303번에 있는 세 개의 시스테인 잔기 중 두 개 (rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, 또는 rhArgI-A45/168) 또는 모두가 알라닌으로 돌연변이 될 경우, 비-환원성 조건하에서 단지 하나의 입체구조가 검출되었다 (도 5 및 6a). 어떠한 공지된 이론에 의해 한정됨이 없이, 본 발명자는 비-환원성 SDS-PAGE에서 야생형 사람 아르기나제 I에 대한 다수의 입체구조의 존재는 아마도 특정 조건하에서 45, 168 및 303번 시스테인으로 인한 분자 내 이황화 결합 형성으로 인한 것이라고 믿는다. 단지 303번 시스테인이 알라닌으로 돌연변이될 경우, 아마도 변이되지 않은 45번 시스테인과 168번 시스테인 사이의 분자 내 이황화 결합의 형성으로 인해, 그와 같은 아르기나제 I 변이체의 입체구조가 또한 비-환원성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 검출될 수 있었다. 45, 168 및 303번 위치의 세 개의 시스테인 중 두 개 또는 모두가 돌연변이될 경우 (rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, rhArgI-A45/168 또는 rhArgI-A45/168/303), 이황화 결합 형성의 모든 가능성이 폐쇄되어, 단지 하나의 입체구조가 SDS-PAGE 분석에서 검출될 것이다.
실시예 7: 변이 아르기나제 I (rhArgI)의 페길화 및 페길화된 단백질의 정제.
(1) 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 (mPEG-MAL 40000)를 이용한 페길화.
아르기나제 I의 부위-특이적 변이체 (rhArgI-A303/168 또는 rhArgI-A45/303)를 20 mM PBS 완충액 (pH 7.0) 중에서 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 1:5 내지 1:10의 몰비율 범위로 개별적으로 혼합하였다. 상기 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드는 40kDa의 분자량을 갖는 두 개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬로 이루어진, Y-형태의 분지형(Y-shape branched)이었다. 페길화 반응은 실온에서 2 내지 4시간 동안 수행되었다. 반응 종결시, 최종 생성물을 4℃ 냉장고에 저장하였다.
Macro SP matrix 양이온 교환 컬럼을 이용하여 부위-특이적 페길화된 사람 아르기나제 I을 단리하고 정제하여, 잔여의 미반응 단백질 및 PEG를 제거하였다. 인산염 완충액 및 NaCl (1M) 함유 인산염 완충액을 각각 평형화 완충액 및 용리 완충액으로 이용하였다. 시료 로딩 전, 시료의 전기 전도도가 평형화 완충액의 전기 전도도와 동일해질 때까지 페길화된 단백질 시료를 증류수로 희석하고, 컬럼을 5배 컬럼 부피의 평형화 완충액에 의해 평형화시켰다. 시료 로딩 후, 5배 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 컬럼을 더 세척하고 35% 용리 완충액으로 용리시켰다. 단백질 피크를 포함하는 용리액을 수집하고 G25 컬럼을 이용하여 탈염시켰다. 표적 단백질을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
(2) 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)를 이용한 단백질의 페길화 및 페길화된 단백질의 정제.
야생형 및 여러 부위 특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A303/168, rhArgI-A303/45, rhArgI-A45/168, 및 rhArgI-A45/168/303)의 페길화 변형을 수행하였다. 반응 조건은 하기와 같았다: 야생형 또는 여러 부위 특이적 변이 아르기나제 I을, 8 mg/ml의 단백질 농도에서, 20 mM PBS 완충액 (pH 8.5-9.0) 중에서 메톡시 폴리에틸렌 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 1:20 내지 1:30의 몰비율 범위로 2시간 동안 실온에서 개별적으로 혼합하였다. 최종 생성물을 4℃ 냉장고에 저장하였다.
상기 페길화된 생성물을 100 KDa 한외여과 막을 이용한 한외여과에 의해 정제하여 미반응 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 숙시니미딜 프로피오네이트를 제거하였다. 페길화 산물을 10 mM PBS 완충액 (pH 7.5)과 1:1 부피비로 혼합하고 원래 부피까지 한외여과하였다. 이 과정을 15회 반복하고 표적 단백질을 수집하고 전기영동에 의해 분석하였다.
(3) 페길화된 사람 아르기나제 I의 SDS-PAGE 및 효소 활성 분석
정제된 mPEG-MAL-40K 페길화된 아르기나제 I 및 mPEG-SPA-5K 페길화된 아르기나제 I을 8% SDS-PAGE에 의해 분리하고(resolved) 분석하였다.
결과가 도 7에 표시된다.
도 7: 페길화된 아르기나제 I의 SDS-PAGE 분석. 각 래인의 시료는 하기와 같다:
M: 단백질 분자량 표준 시료
RP-V-J5K: 재조합 야생형 아르기나제 I을 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I (RP-V-J5K)을 100kDa 한외여과 막을 이용하여 정제하였고 순도는 95%를 초과한다;
RP-M2-J5K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A168/303)을 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I (RP-V-J5K)을 100kDa 한외여과 막을 이용하여 정제하였고 순도는 95%를 초과한다;
RP-M3-J5K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/303)을 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I (RP-M3-J5K)을 100kDa 한외여과 막을 이용하여 정제하였고 순도는 95%를 초과한다;
RP-M4-J5K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168/303)을 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I (RP-M4-J5K)을 100kDa 한외여과 막을 이용하여 정제하였고 순도는 95%를 초과한다;
RP-M7-J5K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/168)을 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA 5000)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I (RP-M7-J5K)을 100kDa 한외여과 막을 이용하여 정제하였고 순도는 95%를 초과한다;
A168/303-Y40K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A168/303)을 Y-형태의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 40K (Y-MAL-40K)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I을 Macrocap SP matrix 양이온 교환 컬럼에 의해 정제하였다. 45번 시스테인에서 하나의 PEG 사슬 Y-MAL-40K와 접합된 페길화된 아르기나제 I 단백질 (A168/303-Y40K)은 전체 반응 생성물의 85%를 초과한다.
A45/303-Y40K: 부위-특이적 변이 아르기나제 I (rhArgI-A45/303)을 Y-형태의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 40K (Y-MAL-40K)와 반응시켰다. 페길화된 사람 아르기나제 I을 Macrocap SP matrix 양이온 교환 컬럼에 의해 정제하였다. 168번 시스테인에서 하나의 PEG 사슬 Y-MAL-40K와 접합된 페길화 아르기나제 I 단백질 (A45/303-Y40K)은 전체 반응 생성물의 85%를 초과한다.
전술된 결합된(coupled) 분광광도법을 이용하여, 상이한 페길화된 사람 아르기나제 I의 활성을 NADPH의 흡광도 변화에 의해 측정하고 결정하였다. 시험 결과는, 페길화된 생성물이 아르기나제 활성을 보존하고, A168/303-Y40K 및 A45/303- Y40K의 비활성은 각각 551 ± 68 U/mg 및 595 ± 41 U/mg인 반면, RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K 및 RP-M7-J5K의 비활성은 각각 726 ± 66 U/mg， 747 ± 72 U/mg，712 ± 69 U/mg, 및 838 ± 8 U/mg이라는 것을 보여주었다. 페길화된 야생형 사람 아르기나제 I (RP-V-J5K)의 비활성은 537 ± 55 U/mg인 것으로 결정되었다.
(4) 페길화된 사람 아르기나제 I의 분자 질량 분포 분석.
상이한 페길화 방법을 이용하여 상이한 부위에서 페길화된 사람 아르기나제 I을 매트릭스-지원 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight Mass Spectrometry: MALDI-TOF-MS)에 의해 분석하여, 시험 시료의 분자 질량 분포를 결정하였다. 모든 실험을 비행 시간(time-of flight)에 기반하고 시료를 이탈 및 이온화시키는 질소 레이저가 구비된 Bruker Daltonics autoflexTM TOF/TOF 시스템 상에서 수행하였다. 이 기기는 +20kV의 가속 포텐셜(accelerating potential)을 갖는 양-이온 선형 방식에서 작동되었다.
실험 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8a는 페길화된 아르기나제 I인 A168/303-Y40K의 질량 분석 결과를 나타내고, A168/303-Y40K의 분자량이 대략 77 kDa인 것을 나타낸다.
도 8b는 페길화된 아르기나제 I인 A45/303-Y40K의 질량 분석 결과를 나타내고, A45/303-Y40K의 분자량이 대략 77 kDa인 것을 나타낸다.
도 8c는 페길화된 아르기나제 I인 RP-V-J5K의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 8d는 페길화된 아르기나제 I인 RP-M2-J5K의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 8e는 페길화된 아르기나제 I인 RP-M3-J5K의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 8f는 페길화된 아르기나제 I인 RP-M4-J5K의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 8g는 페길화된 아르기나제 I인 RP-M7-J5K의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 페길화된 아르기나제 I인 RP-V-J5K, RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K, 및 RP-M7-J5K의 통합된 도면을 나타내고, mPEG-SPA 5000를 이용한 아르기나제 I의 페길화가 65 내지 95kDa의 분자량을 갖는 생성물, 즉, 각각 5000의 분자량을 갖는 PEG 분자 6-12개와 접합된 아르기나제 I 분자를 생성한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 부위-특이적 페길화된 사람 아르기나제 I의 인-비보 약동학 및 약력학 분석
Sprague Dawley 랫트에 3 mg/kg의 투여량으로 단일 정맥내 투여 후 상이한 페길화된 사람 아르기나제 I의 약동학 및 약력학 프로파일을 평가하였다. 이 연구는 Pharmalegacy Laboratories Limited (Shanghai)에 의해 수행되었다. 혈청 아르기나제 및 아르기닌 분석을 위해 혈액 시료를 투여 전(pre-dose), 투여 후 2분, 1h, 4h, 24h, 72h, 120h, 168h 및 240h에 수집하였다. 이소플루란에 의한 마취 후 각 시점에 대략 0.4 mL의 혈액 시료를 안구 정맥(orbital vein)으로부터 수집하고 2-mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 4,000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리할 때까지, 시료를 실온에서 30분 동안 방치하였다.
아르기나제 I의 혈청 농도를 Shanghai ExCell Biology, Inc.에 의해 제공된 키트에 의한 정량적 샌드위치 효소 면역분석법에 의해 결정하였다. 항-사람 아르기나제 I 단일클론 항체를 ELISA 플레이트의 웰의 표면에 코팅하였다. 사람 아르기나제 I의 시료 또는 단백질 표준 시료를 ELISA 플레이트의 웰에 별도로 첨가하고 (100 ㎕/웰), 그 후 밀봉 테잎(sealer tape)으로 덮고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하여 단일클론 항체와 사람 아르기나제 I 간의 면역복합체(immunocomplex) 형성을 가능하게 하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 5회 세척하고 래빗 항-사람 아르기나제 I 다중클론 항체 (100 ㎕/웰)를 웰에 첨가하였다. 밀봉 테잎으로 덮고 37℃에서 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 두 번째 인큐베이션 후, 플레이트를 다시 5회 세척하고 HRP-결합 고트 항-래빗 IgG (100 ㎕/ well)를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 공동-인큐베이션하였다. 또 다른 5회의 세척 후, 발색 기질(chromogenic substrate)을 웰에 첨가하고 암 상태에서 10-15분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액(stop solution)을 각 웰에 첨가하고 잘 혼합하였다. 정지 용액을 첨가한 후 10분 내에 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 회귀식을 위한 이차 피팅(quadratic fit) 방법을 이용하여 표준 곡선을 생성하고 측정된 OD 값을 이용하여 각 시료 중 아르기나제 I 농도를 계산하였다. WinnoLin 및 비-구분(non-compartmental) 분석 방법을 이용하여 PK 파라미터를 유도하였다. 부위-특이적 페길화된 사람 아르기나제 I의 여러 형태인, A168/303-Y40K，A45/303-Y40K, RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K 및 RP-M7-J5K의 반감기 (T1 /2) 값은 각각 27.2 ± 3.8h，15.1 ± 0.6h，40.7 ± 13.2h，53.5 ± 14.2h，59.5 ± 9.9h，및 50.5 ± 13.0h인 것으로 결정되었다. 페길화된 야생형 사람 아르기나제 I인 RP-V-J5K의 반감기 (T1 /2) 값은 43.8 ± 4.4h인 것으로 결정되었다.
표 1: 랫트에서 페길화된 사람 아르기나제 I의 단일 투여량 투여의 약동학 파라미터 (평균 ± 표준편차; n=6).
　 T 1 /2
(h) 		C max
(㎍/ mL ) 		AUC last
(h*㎍/ mL ) 		AUC INF
(h*㎍/ mL )
A168/303-Y40K 27.2 ±3.8 45.2 ±5.1 2077.5 ±160.6 2083.9 ±163.3
A45/303-Y40K 15.1 ±0.6 105.2 ±66.9 548.1 ±50.3 564.5 ±50.8
RP-V-J5K 43.8 ±4.4 42.2 ±3.6 1918.7 ±271.0 2687.0 ±290.2
RP-M2-J5K 40.7 ±13.2 36.0 ±6.0 1585.0 ±184.8 2505.6 ±534.8
RP-M3-J5K 53.5 ±14.2 34.4 ±7.4 2675.3 ±560.4 3577.4 ±865.8
RP-M4-J5K 59.5 ±9.9 34.7 ±8.7 2265.7 ±659.8 3147.8 ±673.0
RP-M7-J5K 50.5 ±13.0 56.5 ±11.0 4574.6 ±1268.2 4939.5 ±1308.1
혈청 아르기닌 농도를 HPLC - 질량 분석기 (API 4000 트리플-쿼드러플(triple-quadrupole) MS와 결합된 Agilent 1200 HPLC)를 이용하여 측정하였다. 랫트 혈청의 분취물(aliquot)을 490 ㎕의 탈이온수로 희석하였다. 아세토니트릴 (380 ㎕)을 첨가하고 20 ㎕의 희석된 혈청 시료와 혼합하였다. 혼합물을 14,000 rpm에서 14분 동안 원심분리하고 상층액을 로딩하고 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. HPLC는 Venusil HILIC/ VH951002-0 컬럼과 이동상 A로 0.1% TFA 및 이동상 B로 95% 아세토니트릴을 이용하여 0.3 ml/분의 유속으로 수행하였다. 투여 전 및 투여 후 2분, 1h, 4h, 24h, 72h, 120h, 168h 및 240h에 혈청 아르기닌 수준을 결정하였다. 결과는, 시험체(test article)가 상이한 방식으로 페길화되었음에도 불구하고, 모든 시험 동물에서 혈청 아르기닌 수준이 매우 짧은 시간(time frame)(5분) 내에 검출 한계 (0.5 ㎍/ml) 미만의 농도로 낮아지고 특정 시간 동안 지속가능한 낮은 아르기닌 수준을 유지한다는 것을 보여주었다. 그 후, 혈청 아르기닌 수준은 점차 그러나, 상이한 속도로 증가하였다. RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K, 또는 RP-M7-J5K에 의해 처리된 연구 그룹에 비하여, 168/303-Y40K 또는 A45/303-Y40K에 의해 처리된 연구 그룹에서 혈청 아르기닌 수준이 보다 빠르게 증가하였다. 투여 후 72h에, 168/303-Y40K 또는 A45/303-Y40K의 단일 투여에 의해 처리된 동물에서 혈청 아르기닌 수준은 투여-전 수준의 15% 내지 20%로 회복되었다. 투여 후 120h에, A45/303-Y40K에 의해 처리된 동물에서 혈청 아르기닌 수준은 거의 투여-전 수준으로 회복되었다. 반면에, RP-M2-J5K，RP-M3-J5K，RP-M4-J5K 또는 RP-M7-J5K에 의해 처리된 동물의 혈청 아르기닌 수준은 보다 장시간 동안 지속가능한 낮은 수준을 유지할 수 있었다. 투여 후 72h에, 혈청 아르기닌은 여전히 투여-전 수준의 5% 미만의 수준을 유지하였다.
본 발명은 보다 높은 비활성을 갖는 사람 아르기나제를 수득하기 위하여, 사람 아르기나제 I의 45, 168 및 303번 위치의 3개의 시스테인 잔기 중 하나, 또는 두 개 또는 모두를 다른 아미노산, 특히, 알라닌으로 돌연변이시키는 부위-지향성 돌연변이 유발을 이용한다. 본 발명의 사람 아르기나제는 잠재적 면역원성 his-tag 단백질 서열을 포함하지 않는다. 또한, 본 발명은 아민-반응성 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 N-말단 α-NH2 또는 표면 라이신의 ε-NH2를 변형시키는 페길화된 사람 아르기나제를 제공한다. 그와 같은 변형은 포유동물에서 그의 반감기를 유의하게 증가시켜, 랫트의 혈청에서 최대 40-60시간일 수 있다.
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Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사람 아르기나제 I으로서, 상기 서열번호 1의 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 하나 또는 두 개, 또는 모든 시스테인이 무극성 아미노산으로 돌연변이된 것인 아르기나제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 45, 168 또는 303번 위치의 시스테인은 독립적으로 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된 것인 아르기나제.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    (1) 상기 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 하나가 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된 것이고, 보다 바람직하게는, 상기 시스테인이 알라닌으로 돌연변이된 것이거나,
    (2) 상기 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 두 개가 돌연변이된 것이고, 예를 들면, 상기 45번 및 303번 위치의 시스테인, 또는 상기 168번 및 303번 위치의 시스테인, 또는 상기 45번 및 168번 위치의 시스테인이 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된 것이거나,
    (3) 상기 45, 168 및 303번 위치의 시스테인이 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된 것인 아르기나제.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기나제는 약 500 U/mg 이상의 활성을 갖고, 바람직하게는, 상기 활성은 약 700 U/mg 이상이고, 보다 바람직하게는, 상기 활성은 약 800 U/mg 이상인 것인 아르기나제.
  5. 페길화된 아르기나제로서, 상기 아르기나제는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고, 상기 아르기나제는 페길화 변형(pegylation modification)에 의해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합된 것인 페길화된 아르기나제.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 아르기나제의 각 분자와 접합된 PEG 분자의 전체 분자량은 약 20 내지 70K이고, 바람직하게는 상기 전체 분자량은 약 30 내지 60K인 것인 페길화된 아르기나제.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 PEG 분자는 약 2 내지 40K의 평균 분자량을 갖고, 바람직하게는, 평균 분자량은 약 5 내지 20K이고, 보다 바람직하게는, 평균 분자량은 약 5K인 것인 페길화된 아르기나제.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페길화는 페길화 시약을 이용하여, PEG 분자를 상기 아르기나제의 모이어티와 공유결합에 의해 접합시킴으로써 달성되고, 상기 페길화 시약은 단백질의 표면 라이신의 ε-NH2 또는 N-말단 α-NH2와 접합된 페길화 시약 및 단백질의 아미노산 중 티올기 또는 카르복실기와 접합된 페길화 시약을 포함하고, 바람직하게는, 상기 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA), mPEG-숙시니미딜 부티레이트 (mPEG-SBA), mPEG-숙시니미딜 숙시네이트 (mPEG-SS), mPEG-숙시니미딜 카보네이트 (mPEG-SC)，mPEG-숙시니미딜 글루타레이트 (mPEG-SG)，mPEG-N-히드록실-숙시니미드 (mPEG-NHS), mPEG-트레실레이트 및 mPEG-알데히드로 구성된 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는, 상기 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트이며, 바람직하게는, 상기 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 프로피오네이트 5000인 것인 페길화된 아르기나제.
  9. 청구항 5 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 상기 45, 168 및 303번 위치의 시스테인 중 어느 두 개가 독립적으로 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된 것으로서, 아르기나제 분자와 접합된 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자와 접합되며, 바람직하게는, 각 아르기나제 분자는 6 내지 12개의 분자와 접합된 것이거나,
    (2) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 상기 45, 168 및 303번 위치의 시스테인이 독립적으로 알라닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린으로 돌연변이된 것이고, 바람직하게는, 상기 시스테인은 알라닌으로 돌연변이된 것으로서, 아르기나제 분자와 접합된 PEG 분자는 약 5K의 평균 분자량을 갖고, 각 아르기나제 분자는 약 4 내지 13개의 PEG 분자와 접합되며, 바람직하게는, 각 아르기나제 분자는 6 내지 12개의 분자와 접합된 것인, 페길화된 아르기나제.
  10. 청구항 5 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 또는 혈청 중에서, 상기 아르기나제는 0.5일 이상의 반감기를 갖고, 바람직하게는, 상기 아르기나제는 2.5일 이상의 반감기를 가지며, 보다 바람직하게는, 상기 아르기나제는 3.5일 이상의 반감기를 갖는 것인 페길화된 아르기나제.
  11. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 아르기나제 또는 청구항 5 내지 10 중 어느 한 항의 페길화된 아르기나제를 제조하는 방법.
  12. 아르기나제-관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 아르기나제 또는 청구항 5 내지 10 중 어느 한 항의 페길화된 아르기나제의 용도로서, 바람직하게는, 상기 질환은 아르기닌혈증(hyperargininemia) 및 아르기닌-의존성 과다형성(hyperplasia) 또는 종양, 예를 들면, 간암, 흑색종, 유방암, 소세포 폐암(small cell lung cancer), 전립선암, 림프종 또는 백혈병으로부터 선택되는 것인 용도.
  13. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 아르기나제 또는 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항의 페길화된 아르기나제를 포함하는, 아르기나제-관련 질환의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 질환은 아르기닌혈증 및 아르기닌-의존성 과다형성 또는 종양, 예를 들면, 간암, 흑색종, 유방암, 소세포 폐암, 전립선암, 림프종 또는 백혈병으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 아르기나제 또는 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항의 페길화된 아르기나제를 투여하는 단계를 포함하는, 아르기나제-관련 질환을 치료하는 방법으로서, 바람직하게는, 상기 질환은 아르기닌혈증 및 아르기닌-의존성 과다형성 또는 종양, 예를 들면, 간암, 흑색종, 유방암, 소세포 폐암, 전립선암, 림프종 또는 백혈병으로부터 선택되는 것인 방법.
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