WO2012120176A2 - Proteínas recombinantes con efecto antitumoral - Google Patents

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WO2012120176A2
WO2012120176A2 PCT/ES2012/070150 ES2012070150W WO2012120176A2 WO 2012120176 A2 WO2012120176 A2 WO 2012120176A2 ES 2012070150 W ES2012070150 W ES 2012070150W WO 2012120176 A2 WO2012120176 A2 WO 2012120176A2
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rnase
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María VILANOVA BRUGUES
Antoni BENITO MUNDET
Marc RIBÓ PANOSA
Jessica CASTRO GALLEGOS
Pere TUBERT JUHE
Anna VERT COMPANY
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Universitat De Girona
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y301/27005—Pancreatic ribonuclease (3.1.27.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal

Definitions

  • the present invention is related to the field of medicine, and particularly to the field of oncology. Specifically it refers to recombinant proteins with ribonucleolytic activity that have an antitumor effect.
  • RNases Some enzymes of the ribonuclease family (hereinafter referred to as RNases) have aroused special interest due to their cytotoxic activity, since they could be used as therapeutic agents for the treatment of cancer.
  • RNases As an example of RNase that have a cytotoxic effect, Onconase ® (hereinafter referred to as ONC) stands out, an RNase from oocytes and early embryos of Rana pipiens that is found in phase III clinical studies as an antitumor agent for the treatment of
  • ONC By binding to the surface of tumor cells and being internalized in the cytosol, the ONC causes cell death as a result of the potent inhibition of protein synthesis through a mechanism that involves the degradation of cellular RNA. It is known that ONC is not inhibited by the RNase protein inhibitor present in the mammalian cell cytosol (also
  • IR cytotoxicity of ONC compared to other mammalian RNases and, consequently, its antitumor effect.
  • ONC has undesirable properties. Due to its non-human origin, ONC typically stimulates adverse immune responses in man and causes high renal toxicity. In addition, the fact that it is obtained from a natural source makes it even more difficult and expensive to obtain sufficient amounts of protein.
  • Various strategies have been used to obtain cytotoxic RNases that overcome ONC deficiencies. Most of these strategies have been focused on the recombinant obtaining of human RNases resistant to the action of IR thanks to the introduction of mutations in its sequence that cause a deficiency in its ability to bind to IR.
  • PE5 includes mutations that determine the existence of a discontinuous bipartite nuclear localization signal (Rodr ⁇ guez M, Benito A, Tubert P, Castro J, Ribó M, Beaumelle B, Vilanova M. "A Cytotoxic Ribonuclease Variant with a Discontinuous Nuclear Localization Signal Constituted by Basic Residues Scattered Over Three Areas of the Molecule. "Journal of Molecular Biology 2006, vol. 360, p. 548-557).
  • Said signal constitutes an unconventional nuclear localization signal (hereafter SLN) composed of different basic residues, which, despite being located in remote sections in the protein sequence, are close in the three-dimensional structure of the same, which allows its interaction with alpha importina and consequent import to the nucleus.
  • SLN unconventional nuclear localization signal
  • the result is a modified RNase with cytotoxic activity against leukemia cell lines, lung carcinoma, breast carcinoma, ovarian carcinoma, cervical carcinoma and Burkitt lymphoma, among others, being more active in tumor lines that have a multiresistance phenotype to antitumor medications.
  • the PE5 variant is of human origin, so it has fewer side effects than ONC and other cytotoxic RNases of non-human origin.
  • PE5 has an inefficient cytotoxic activity.
  • the activity of PE5 is between 5 and 15 times lower (Bosch et al, 2004, supra). The lower efficiency of PE5 would condition an increase in the cost of antitumor treatment and could cause other side effects to occur since higher doses would be necessary.
  • one aspect of the invention relates to a recombinant protein with ribonuclease activity comprising (a) a sequence derived from human pancreatic ribonuclease (RNase-PH) of sequence SEQ ID NO: 37, said sequence derived being fused through its N-terminal end a (b) a conventional nuclear localization sequence.
  • RNase-PH human pancreatic ribonuclease
  • RNAse-PH fused at their N-terminal end with a conventional SLN result in recombinant proteins with ribonucleolytic activity that possess a cytotoxic activity far superior to the RNases from which they are derived.
  • the recombinant proteins of the invention exert a cytotoxic effect approximately 10 times greater than the RNases from which they are derived. This is a clear advantage for use in anticancer therapy, since the recombinant proteins according to the invention achieve the same antitumor effect at lower doses. This implies lower side effects in the patient, in addition to a substantial saving in the cost of therapy.
  • the recombinant proteins of the invention are very similar to wild RNase-PH, so they have fewer adverse effects than ONC, which is of non-human origin, while exerting a cytotoxic effect comparable to this.
  • the low systemic toxicity of the recombinant proteins of the invention has been demonstrated in an in vivo model (example B-1 and Fig. 5). Due to their cytotoxic effect, the recombinant proteins of the invention are useful as a medicament, in particular as antitumor agents for the treatment of cancer.
  • another aspect of the invention provides a Recombinant protein according to the invention for use as a medicament.
  • a further aspect of the invention provides a method for the construction of the recombinant protein according to the invention comprising: a) introducing the sequence coding for SEQ ID NO: 37 into an expression vector, wherein said vector contains the elements necessary for carry out the expression of the gene contained in said vector; b) incorporating into the vector resulting from step (a) a nucleotide chain that codes for a conventional nuclear localization sequence at the end of the sequence that codes for the N-terminal region of the sequence that codes for SEQ ID NO: 37, where said incorporation is carried out by cassette mutagenesis techniques; c) modifying by oligonucleotide-directed mutagenesis the sequence coding for SEQ ID NO: 37 comprised in the vector resulting from step (b) so that the sequence encoding the sequence
  • the recombinant protein resulting from step (d) can be subsequently purified by methods known in the state of the art.
  • the purification of recombinant RNases is described in Ribó M, Benito A, Canals A, Nogués MV, Knife C, Vilanova M. "Purification of engineered human pancreatic ribonuclease". Methods in Enzymology 2001, vol. 341, p. 221-234.
  • the recombinant protein with RNase activity of the present invention can be prepared by phase expression of a nucleic acid sequence encoding an SLN and the nucleic acid sequence encoding the polypeptide chain defined by SEQ ID NO: 37, where the SLN is located at the N-terminal end of SEQ ID NO: 37, followed if necessary by the purification of the protein so expressed.
  • Other aspects of the invention provide an isolated nucleic acid molecule encoding the recombinant protein of the invention, an expression vector comprising the nucleic acid sequence encoding said recombinant protein and a host cell comprising said vector.
  • FIG. one Cytotoxicity of two independent productions of the ⁇ 55 ⁇ _ ⁇ 4- ⁇ 5 variant against various cell lines.
  • A production 1;
  • B production 2.
  • the percentage of living cells (ordinate axis) with respect to the concentration of protein tested (abscissa axis) is indicated in each graph.
  • FIG. 1 corresponds to the results of section 2.1.
  • FIG. 2 Cytotoxicity of a third independent production (production 3) of the ⁇ 55 ⁇ 4- ⁇ 5 variant against various cell lines.
  • production 3 The percentage of live cells (ordinate axis) with respect to the concentration of protein tested (abscissa axis) is indicated in each graph.
  • FIG. 2 also corresponds to the results of section 2.1.
  • FIG. 3 Inhibition of recombinant proteins and ONC due to IR.
  • the assay was carried out by incubating the indicated recombinant proteins, with (+) or without (-) IR, in the presence of the substrate (rRNA).
  • FIG. 3 corresponds to the results of section 2.2.
  • FIG. 4 Degradation of nuclear RNA in HeLa cells treated with ONC and SLNPE5. 1, control (untreated HeLa cells); 2, ONC; 3, SLNPE5. FIG.
  • FIG. 5 Variation of body weight in nude mice treated with 5, 20, 40 and 80 mg / kg of SLNPE5.
  • the X axis represents the post-administration days and the Y axis represents the percentage variation of the animal's weight with respect to the day of administration.
  • SEQ ID NO: 37 means a sequence obtained by modifying some amino acids of RNase-PH, whose sequence is SEQ ID NO: 37.
  • said modifications in SEQ ID NO: 37 should not result in a decrease in ribonucleolytic activity of the resulting protein with respect to the original RNase-PH.
  • said modifications cause the resulting protein to have a greater tendency to be imported into the cell nucleus.
  • a “nuclear localization sequence” or “SLN” is an amino acid sequence whose function is to allow the importation into the nucleus of a protein found in the cytosol through interaction with cytosolic proteins that interact with specific receptors found in the membrane nuclear.
  • the best characterized SLNs are composed of one or more basic amino acid clusters, although not
  • SLN monopartites which contain a single grouping of basic amino acids
  • bipartite SLNs which contain two basic clusters separated by a segment of 10-12 unconserved amino acids. . It is mostly linear sequences. In the scope of the present invention these SLNs are called "conventional SLNs”.
  • SLNs In addition to these types of conventional SLNs, there may be other types of less conventional SLNs defined by amino acids that, although they are located in remote sections in the protein sequence, are close in the three-dimensional structure of the protein, which allows their interaction with proteins that in turn interact with membrane receptors responsible for nuclear importation. These SLNs are called "unconventional discontinuous SLNs" here.
  • nucleic acid sequence refers to a single or double stranded DNA or RNA polymer and, unless otherwise limited, encompasses known analogs of natural nucleotides that hybridize with nucleic acids of a nucleotide-like manner natural Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence includes its complementary sequence.
  • amino acid sequence refers to a polymer of
  • recombinant DNA is meant an artificial DNA molecule deliberately formed in vitro by the modification of DNA sequences or by the binding of DNA sequences that are not normally found together. The construction of recombinant DNA and the successive expression of said DNA results in the production of recombinant proteins that contain desired modifications with respect to the original proteins.
  • an "expression vector” includes an expression cassette comprising a recombinant DNA encoding a polypeptide according to the invention that can be transcribed and translated by a host cell.
  • the recombinant expression cassette is a nucleic acid construct, generated by recombination or synthetically, with a series of specified nucleic acid elements that allows the transcription of a particular nucleic acid into a host cell.
  • the recombinant expression vector may be part of a plasmid, virus or nucleic acid fragment.
  • the recombinant expression cassette portion of the expression vector includes a nucleic acid to be transcribed and a promoter operably linked thereto.
  • a host cell is a cell that comprises an expression vector and is capable of expressing one or more recombinant proteins encoded by the DNA sequence of said vector.
  • isolated refers to the biological material that is substantially or essentially free of components that normally accompany it in its natural environment.
  • “conservative modifications” on a sequence Particular nucleic acid refers to those modifications that result in a sequence encoding a polypeptide with properties similar to that encoded by the original nucleic acid sequence, as long as said changes do not affect the activity and properties of the polypeptide in question. This happens when in the peptide there has been the change from one amino acid to another that manifests a very similar chemical functionality or when the change occurs in an amino acid that is located in a region that is irrelevant to the functionality of the peptide.
  • the person skilled in the art is able to modify said sequence by introducing conservative modifications therein, so that he can obtain, without any technical effort, a protein that maintains the properties of the original.
  • an amino acid can be encoded by more than one triplet or codon.
  • the codons GCA, GCC, GCG and GCU encode the amino acid alanine. Modifications in the nucleic acid sequence that do not result in changes in the amino acid chain encoded by said sequence are called "silent modifications.”
  • “Derived amino acids” are those that contain chemical modifications in the amino acid. Potentially interesting derivative amino acids are aminated, acetylated, sulfated, phenylated, phosphorylated, glycosed or oxidized amino acids.
  • amino acids means the percentage of positions of the sequence with identical amino acids.
  • the percentage of homology or identity between amino acid or nucleic acid sequences can be calculated by "sequence alignment".
  • the sequence alignment can be global or local. In the sense of the present invention the% homology or identity will preferably be calculated based on an alignment global, that is to say throughout the entire sequence, or along an active fragment of said sequence. Global alignments are most useful when the sequences are similar and about the same size.
  • the state of the art provides different algorithms for carrying out global alignments, as well as bioinformatics programs that use these algorithms to provide the user with the percentage of identity between the problem sequences.
  • the global alignment of amino acid sequences can be carried out by means of the GGSEARCH or GLSEARCH programs, which are well known in the state of the art.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to compounds that, according to a medical criterion, are suitable for use in a subject, human or non-human, without excessive toxicity, irritation, allergic reaction or other problem or complication for the subject.
  • excipients of a pharmaceutical composition must also be “acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation.
  • the present invention is related to recombinant RNases derived from RNase-PH that have a high cytotoxic effect and are well tolerated by the human body, avoiding undesirable side effects.
  • the recombinant proteins according to the invention are characterized by being efficiently imported into the cell nucleus, such that they exert their ribonucleolytic activity mainly by degrading RNA in the cell nucleus. This characteristic determines that these recombinant RNases possess a high cytotoxic activity.
  • the recombinant proteins of the invention comprise or consist of a sequence derived from RNase-PH fused through its N-terminal end with a sequence of
  • the cytotoxic activity of the recombinant proteins of the invention resulting in variants of high interest for a therapeutic application.
  • the protein defined by SEQ ID NO: 9 is a sequence derived from RNase-PH by point modifications in the sequence thereof containing a non-discontinuous nuclear localization sequence.
  • the present invention relates to a recombinant protein with ribonuclease activity comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 fused through its N-terminal end to a conventional nuclear localization sequence.
  • the present invention relates to a recombinant protein with ribonuclease activity consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 fused through its N-terminal end to a conventional nuclear localization sequence.
  • the present invention also contemplates recombinant proteins with ribonuclease activity comprising an amino acid sequence that has at least 80% homology with SEQ ID NO: 9 fused through its N-terminal end with a conventional nuclear localization sequence.
  • the invention relates to recombinant proteins with ribonuclease activity consisting of an amino acid sequence that has at least 80% homology with SEQ ID NO: 9 fused through its N-terminal end with a sequence of conventional nuclear location.
  • the homology percentage with respect to SEQ ID NO: 9 is at least 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98 or 99%.
  • the percentages indicated above refer to percentages of sequence identity. Said percentage of homology or identity is calculated by alignment along the entire sequence or by alignment along an active fragment thereof. In other
  • sequence that presents homology or identity with SEQ ID NO: 9 has the same length as SEQ ID NO: 9 and contains an unconventional discontinuous SLN defined by amino acids Ki, R 3 , R 32 , R33, Rsg , R90 and R91 (subscripts indicate the position of the amino acid in SEQ ID NO: 9).
  • the recombinant protein of the invention may contain a sequence 100% identical to SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 9 contains at least one of the following modifications: Q by E in the amino acid located in position 9,
  • Recombinants have additional advantages. For example, the substitution of Q for E at position 9, D for G at position 16 and S for N at position 17 of SEQ ID NO: 9 results in a recombinant protein according to the invention that causes less side effects in patients to those who are administered. These modifications in SEQ ID NO: 9 give rise to a sequence with 98% identity with SEQ ID NO: 9.
  • the sequence that presents identity with SEQ ID NO: 9 is the SEC ID NO: 13.
  • This variant has the additional advantage of being more similar to wild RNase-PH, that is, it is a more humanized protein that causes less adverse reactions in the human body.
  • preferred variants according to the invention can be defined as those comprising or consisting of the amino acid sequence defined by SEQ ID NO: 1 fused through its N-terminal end with a conventional SLN, SEQ ID NO: one
  • KESAAAKFX 9 RQHMDSX 16 X 17 SPSSSSTYCNQMMRRRNMTQGRCKPVNTFV HEPLVDVQNVCFQEKVTCKNGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAY RTSPKERHIIVACEGSPYVPVHFDASVEDST where X 9 is E or Q, X 16 is G or D, and X 17 is N or S (the subscripts indicate amino acid position "X" in SEQ ID NO: 1 ).
  • Conventional SLNs that are part of the recombinant proteins of the invention can be monopartites, bipartites, or any SLN that does not interfere with the activity of the enzyme.
  • the conventional SLN is the SLN of the SV 40 virus major antigen with SEQ ID NO: 2.
  • the SLN is defined by the sequence SEQ ID NO: 3.
  • the SLN is defined. by the sequence SEQ ID NO: 4
  • the recombinant protein of the invention is defined by SEQ ID NO: 10.
  • the recombinant protein of the invention is defined by SEQ ID NO: 14.
  • Proteins containing conservative modifications with respect to the recombinant proteins described above are part of the present invention. Proteins are also part of the invention.
  • modified recombinants by substituting some amino acids for derived amino acids, provided that such substitutions do not decrease the cytotoxic activity of the proteins.
  • the invention contemplates modifications made in those regions of the proteins that are little significant for the catalytic activity thereof, for their folding or, in the case of the proteins of the invention, for their
  • the regions of the bonds which include amino acids M 3 to T 24 , R33 to R39, H 48 to P 5 or, K 66 to N71, S 75 to S 78 , T 87 to N 94 , Em to Y 5 and E 2 5 to T 28 of SEQ ID NO: 37, are not involved in the functionality of the enzyme and, therefore, a person skilled in the art could, without exerting any effort technician, introduce modifications that will not affect your activity.
  • amino acids that make up the recombinant proteins of the invention may have an L or D configuration. Those with a D configuration are preferred since they are more resistant to degradation by proteases.
  • the construction of recombinant proteins according to the invention can be carried out using techniques known in the field of molecular biology.
  • the recombinant nucleic acid encoding the recombinant protein according to the invention will first be prepared by restriction and cloning of appropriate sequences.
  • the DNA sequence comprises the sequence derived from RNAse-PH, and a conventional SLN, both sequences located in phase.
  • the RNAse-PH derived sequence and the conventional SLN sequence may be separated by a spacer sequence.
  • Spacer sequences typically consist of serine, glycine and / or alanine residues (non-rigid spacer) or sequences containing proline residues (rigid spacer).
  • the spacer sequences can be more or less long, although they usually contain between 4 and 8 residues.
  • the recombinant DNA sequence is contained in an expression vector. The recombinant DNA is then introduced into a suitable host to achieve protein expression
  • the person skilled in the art will select the most suitable expression vector taking into account the characteristics of the recombinant protein to be expressed and the host to be used.
  • the recombinant protein is purified using ion exchange chromatography or any other purification method known in the state of the art.
  • the person skilled in the art will apply methods known in the art to proceed with the folding and subsequent activation of said protein.
  • the person skilled in the art In order to facilitate the purification of the recombinant protein it is customary to introduce a sequence of a protein at one end of the protein.
  • amino acids specially designed for this purpose.
  • An amino acid sequence that can be introduced into the recombinant protein to facilitate its purification is a polyhistidine (His-Tag) sequence. These His-Tag sequences are widely used for the purification of recombinant proteins by affinity chromatography.
  • Other sequences that facilitate purification that can be used in the present invention are, for example, antigenic sequences such as hematoglutinin, T7, GST or myc.
  • the gene encoding the recombinant protein according to the invention can also be prepared by chemical synthesis.
  • Chemical synthesis produces a single chain oligonucleotide. This can be converted into a double stranded DNA by hybridization with a complementary sequence, or by polymerization with a DNA polymerase using the single strand as a template.
  • chemical synthesis is limited to sequences of
  • recombinant protein of the invention there are other options for producing the recombinant protein of the invention, such as by cleavage or fusion of synthetic or semi-synthetic polypeptides.
  • the recombinant protein can also be obtained by a combination of the techniques described above.
  • the recombinant proteins of the invention are useful as a medicament in anticancer therapy because of their high cytotoxicity.
  • the cytotoxic effect of these proteins against cell lines of cervical carcinoma, myeloid lymphoma, ovarian and lung carcinoma is demonstrated in example A-2.1.
  • a preferred embodiment of the invention provides a recombinant protein as described for use as an antitumor agent.
  • a preferred embodiment provides a recombinant protein according to the invention for use in the treatment of cancer.
  • This embodiment can be reformulate as the use of the recombinant protein of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the invention also provides a method of cancer treatment which comprises administering to a patient in need thereof an amount.
  • the recombinant proteins according to the invention can be used for the treatment of leukemia, epidermoid carcinoma, breast carcinoma, cervical carcinoma, myeloid lymphoma, ovarian carcinoma, pancreas, liver and lung.
  • the recombinant proteins of the invention have a greater effect in vitro for tumor cell lines with a multiresistance to drug phenotype, that is, representative of advanced stages of cancers.
  • Recombinant is for the treatment of all types of cancer that respond to therapy, mainly ovarian, lung and breast cancer.
  • proteins can be directed towards a type of tumor cells of interest by conjugation with specific antibodies against antigens expressed on the cell surface of the cells of choice or by binding to receptor ligands expressed on the cell surface of cells of choice.
  • proteins can be directed towards a type of tumor cells of interest by conjugation with specific antibodies against antigens expressed on the cell surface of the cells of choice or by binding to receptor ligands expressed on the cell surface of cells of choice.
  • antibodies useful for targeting anticancer agents to their target cells are known in the state of the art.
  • Another aspect of the invention relates to pharmaceutical compositions comprising a therapeutically effective amount of the protein.
  • pharmaceutically acceptable excipients are suitable for therapy.
  • compositions of the invention will be administered to patients intravenously.
  • the compositions can be prepared in different forms suitable for intravenous administration.
  • the recombinant protein of the invention can also be administered topically or orally.
  • the protein of the invention is administered orally, it preferably comprises a coating that prevents its
  • compositions of the present invention may comprise,
  • compositions are administered to a patient suffering from a disease in a therapeutically effective amount, which is defined as an amount sufficient to produce benefits to the patient.
  • a therapeutically effective amount which is defined as an amount sufficient to produce benefits to the patient.
  • the amount of recombinant protein of the invention to be administered can be determined by a person skilled in the art following standard protocols in the field of medical clinic. The exact amount will depend on the severity of the disease and the general state of health of the patient.
  • Single or multiple dosages (at time intervals) of the compositions may be administered depending on the dose required. For example, for intravenous administration of ONC amounts between 300 ⁇ g m 2 weight and 1000 ⁇ g m 2 weight are used
  • the therapeutically effective amount also depends on whether the recombinant protein of the invention is used as the sole antitumor agent or is used in combination with another antitumor agent.
  • Combinatorial therapies are common in the field of cancer treatment. Therefore, in a particular embodiment, the recombinant protein according to the invention is for use in combination with another anti-tumor agent in the treatment of cancer.
  • This embodiment can be reformulated as the use of the recombinant protein according to the invention for the preparation of a medicament for the treatment of cancer in combination with another antitumor agent.
  • Also part of the present invention is a method for the treatment of cancer that comprises or consists of administering to a patient in need of a recombinant protein according to the invention in combination with another antitumor agent.
  • the antitumor agents of the present invention can be used in combination with other antitumor agents such as tamoxifen, lovastatin, cis-platinum, vincristine, proteasome inhibitors, interferons, doxorubicin and rosiglitazone, among others.
  • the design of RNase vanants of human origin with cytotoxic activity for therapeutic applications is not simple. This is because the cytotoxic effect of an RNase is the result of a multitude of
  • the octapeptide incorporates several copies of the SLN of the SV 40 major antigen.
  • internalization to the nucleus requires the incorporation of multiple SLNs in the octapeptide sequence.
  • the examples show the results obtained from the recombinant proteins with ribonuclease activity designed by the inventors, results that surprisingly demonstrate that said proteins exert a high cytotoxic effect as a result of their rapid importation into the cell nucleus.
  • the recombinant protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 fused at its N-terminal end with a conventional SLN results in a protein whose cytotoxic activity is comparable to that of the ONC (see SNLPE5 in table 1).
  • the word “comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • the word “comprises” includes the case “consists of”.
  • the sequence SEQ ID NO: 2 was introduced at the C-terminal end of the RNase-PH variant PM5cct contained in the pM5cct vector (the pM5cct construct was obtained from pM5 by oligonucleotide-directed mutagenesis, using the T7PROM oligonucleotides ( SEQ ID NO: 35) and M9CCT1 (SEQ ID NO: 36)
  • the PM5 gene was amplified by PCR with oligonucleotides T7PROM and M9CCT1 and the resulting DNA was subsequently digested with restriction enzymes Ndel and Sal ⁇ .
  • the digestion product was inserted into the fragment of plasmid pM5 resulting from eliminating the RNase gene by digestion with the restriction enzymes Ndel and Sal ⁇ .
  • the complementary oligonucleotides CTSLNJ (SEQ ID NO: 17) and CTSLN_2 (SEQ ID NO: 18) were mixed at equimolar concentrations, they were heated to 90 ° C, and the temperature was allowed to gradually decrease to 25 ° C for 30 min.
  • the paired oligonucleotides were purified by agarose gel electrophoresis and linked to the pM5cct vector previously digested with BamHI and Hind III. With the resulting DNA, DH5a cells were transformed to obtain pM5SLN.
  • This variant was built in two steps. First the pLINKM5 variant was built. For this, the RNase-PH variant gene contained in plasmid pM5 (Canals et al, supra) was amplified using the
  • T7TERM oligonucleotides SEQ ID NO: 19
  • PLINKMEJ SEQ ID NO: 20
  • the PCR product was digested with Hindlll and Sal ⁇ , and linked to the vector pET17b (Novagen (Madison, Wl)) previously digested with Hindlll and Xhol.
  • the DH5a line was transformed with the ligation reaction product
  • NTSLN_1 SEQ ID NO: 21
  • NTSLN 2 SEQ ID NO: 22
  • paired oligonucleotides were purified by agarose gel electrophoresis and bound to pLINKM5, previously digested with Hindlll and
  • DH5a cells were transformed to obtain pSLNPM5.
  • the pM5 vector was started (Bosch et al, 2004) and by means of directed mutagenesis using the kit "Quik-change PCR site-directed mutagenesis "(Stratagene, USA) according to the
  • BM1 SEQ ID NO: 23
  • BM2 SEQ ID NO: 24
  • BamHI and Munl restriction targets were introduced which replaced the 86-93 sequence of the PM5 variant of RNase-PH .
  • the PCR products were digested with Dpnl and used to transform DH5a cells to obtain pM5int.
  • SEQ ID NO: 2 The sequence coding for SEQ ID NO: 2 was introduced into the ⁇ 4- ⁇ 5 loop of the protein encoded by the RNase-PH variant PM5 gene to create ⁇ 55 ⁇ ( ⁇ 4- ⁇ 5).
  • the complementary oligonucleotides INTSLNJ (SEQ ID NO: 25) and INTSLN_2 (SEQ ID NO: 26) were mixed at equimolar concentrations, heated to 90 ° C, and the temperature was allowed to gradually decrease to 25 ° C for 30 min. .
  • Paired oligonucleotides were purified by agarose gel electrophoresis and bound to pM5int, previously digested with BamHI and Munl. With the resulting DNA, DH5a cells were transformed to obtain ⁇ 55 ⁇ ( ⁇ 4- ⁇ 5).
  • pSLNPE5 and pE5SLN were obtained from pSLNPM5 and pM5SLN
  • PE10 is the variant defined by SEQ ID NO: 1 where X 9 is Gln, X 6 is Asp, and X-I7 is Ser. This variant was constructed in two steps. First, the PE9 variant (SEQ ID NO: 12) was constructed by introducing the changes
  • pE5 vector obtained according to Bosch et al was digested with the restriction enzymes Sacl and Sal ⁇ and a fragment of 320 base pairs (corresponding to the segment of the gene between codons 21 to 128) was linked to vector pM9 (vector containing the wild gene encoding RNase-PH) previously digested with the same Sacl-Sall restriction enzymes and DH5a cells were transformed to obtain pE9.
  • pE10 was obtained from pE9 by introducing the changes Arg4Ala and Lys6Ala.
  • PCR products were digested with Dpnl and used to transform DH5a cells to obtain pE10.
  • This variant is built in two stages. In a first stage the Glu9Gln mutation is introduced into the pSLNPE5 vector (giving rise to the vector
  • the Gly16Asp and Asn17Ser mutation is introduced into the SLNPE5Glu9Gln variant (giving rise to the pSLNPEI 0 vector) by the same directed mutagenesis procedure described above (QuikChange de Stratagene) and the oligonucleotides D16S17_1 (SEQ ID NO: 33) i D16S17_2 (SEQ ID NO: 34).
  • PCR products are digested with Dpnl and used to transform DH5a cells to obtain pSLNPEI O.
  • the frozen sediments were thawed and resuspended in 30 mL of 50 mM Tris-acetate pH 8.0, 10 mM EDTA, the cells were lysed by a French press and centrifuged at 9400 xg for 45 min to isolate the inclusion bodies. Protein aggregates were dissolved in 10 mL of 6 M guanidinium chloride, 100 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 8.0, and reduced by adding GSH to a final concentration of 0.1 M. The pH was adjusted to 8.5 by adding solid Tris and the sample was incubated at room temperature, under nitrogen atmosphere, for 2h.
  • the soluble protein was diluted in 2 L of 0.1 M Tris-acetate, 0.5 M L-arginine, 1 mM GSSG, 2 mM EDTA, pH 8.5, and was incubated at 10 ° C for at least 48 h.
  • the sample was adjusted to pH 5.0 with glacial acetic acid and concentrated to 150 mL by tangential ultrafiltration. The concentrated sample was dialyzed
  • the refolded recombinant proteins were purified by cation exchange chromatography on a Mono-S HR 5/5 FPLC column, equilibrated with 50mM sodium acetate at pH 5.0 and eluted with a linear gradient of 0 to 1 M NaCI. Recombinant proteins eluted at the following NaCl concentrations: 550 mM (PE5), 540 mM (PE10) and 620mM (SLNPE5), 600 mM (PE5SLN), 510 mM (SLNPM5), 500 mM
  • NCI / ADR-RES cells from the laboratory of Dr. K. Cowan of the Natiocal Cancer Institute, NHI, Bethesda, MD, USA), NCI-H460 / R
  • the cells were treated with various concentrations of PE5 (0.1-30 ⁇ ), PE10 (0.1-30 ⁇ ), SLNPE5 (0.001-10 ⁇ ), PE5SLN (0.1 -30 ⁇ ), SLNPM5 (0.1-30 ⁇ ), PM5SLN (0.1-30 ⁇ ), ⁇ 55 ⁇ ( ⁇ 4- ⁇ 5) (0.1-30 ⁇ ) or ONC (0.001-10 ⁇ ) for 72 h.
  • the sensitivity to the different proteins was determined by the MTT method essentially as described by the manufacturer (Sigma, USA). Data were collected by absorbance readings at
  • IC 5 values represent the concentration of the RNase tested that is required to inhibit cell proliferation by 50% and were calculated for some variants by linear interpolation from the growth curves obtained.
  • the cells were treated with 0.1 ⁇ ONC, 0.3 ⁇ SLNPE5. These concentrations correspond to values close to the Ido values according to the MTT test. After 24h of incubation, the cells were collected by centrifugation at 400xg for 5min at 4 ° C and washed with ice-cold PBS. The nuclear and cytoplasmic RNA fraction was extracted using the PARIS k kit (Applied
  • RNA samples were loaded on a 1.5% agarose gel under denaturing conditions and the degree of RNA degradation was measured by comparison with purified RNA from untreated HeLa cells.
  • PM5 is a variant of RNase-PH presented by the changes Arg4Ala, Lys6Ala, Gln9Glu, Asp16Gly and Ser17Asn.
  • PM5SLN, SLNPM5 and PM5SLN (4- ⁇ 5) are vacancies of PM5 that have the NLS defined by SEQ ID NO: 2 at its C-terminal (PM5SLN), N-terminal (SLNPM5) or in the ⁇ 4- ⁇ 5 ( ⁇ 55 ⁇ _ ⁇ ( ⁇ 4- ⁇ 5)) loop.
  • FIG. 1 and FIG. 2 show the cytotoxicity results of 3 independent productions of the ⁇ 55 ⁇ 4- ⁇ 5 variant (productions 1-3).
  • the percentage of live cells (viability) with respect to the concentration of protein tested (dose-response curve) is indicated in each graph.
  • Each of the lines corresponds to a different cytotoxicity test against a cell line.
  • the cytotoxicity was in all cases identical to that of the control without protein, that is, zero.
  • the same negative result was obtained by testing the cytotoxicity of the PM5SLN and SLNPM5 variants, which contain a SLN at the C-terminal and N-terminal, respectively (results not shown). All these data indicate that, regardless of where the SLN was introduced, the variant derived from PM5 showed no cytotoxic activity.
  • Cytotoxicity assays were also carried out with the recombinant proteins PE10, PE5, SLNPE5 and PE5SLN, using ONC as a positive control. From the results obtained in the tests, the IC 5 value was calculated for each of these recombinant proteins and the ONC as explained in section 1 .3. The results are expressed in table 1.
  • the insertion of the SLN at the N-terminal end of the PE5 variant results in a recombinant protein whose cytotoxic activity is of equal magnitude as the ONC.
  • FIG. 3 represents the inhibition of recombinant proteins and ONC due to cytoplasmic IR.
  • the assay was carried out by incubating the indicated recombinant proteins, with or without IR, in the presence of the substrate (rRNA). If the recombinant protein escapes to the IR as is the case of the ONC (positive control), the substrate degrades both in the absence and in the presence of the inhibitor. PE5, PE10 and SLNPE5, do not degrade the substrate in the presence of the inhibitor, indicating that these proteins are sensitive to IR.
  • FIG. 4 shows the results of nuclear RNA degradation tests because of the action of recombinant proteins performed as indicated in section 1 .5. As can be seen in the figure, SLNPE5 degrades nuclear RNA, while leaving the RNA intact
  • mice To assess the antitumor capacity of SLNPE5 in murine animal models bearing human tumors, the systemic toxicity of this RNase in mice (Har ⁇ an Laboratories Inc.) nude female nude mice between 6-8 weeks of age and with an approximate weight was first determined of 25 g. To conduct this study, four groups of 3 mice were treated with increasing concentrations of SLNPE5 (5, 20, 40 and 80 mg / kg) dissolved in 0.6 ml of PBS and filtered using 0.2 ⁇ filters and low protein retention. In parallel, the same volume of PBS was injected into a fifth group of 3 mice that was used as a control. To begin with, a single injection of the different doses of SLNPE5 was administered intraperitoneally and the general condition of the animals (activity, physical appearance, weight) was monitored daily to detect the presence of signs of discomfort.
  • the general condition of the animals activity, physical appearance, weight
  • the lung cancer line NCI-H460 was selected. This tumor line is the one that had presented one of the greatest sensitivities to SLNPE5 in in vitro tests.
  • the effect of SLNPE5 on survival and tumor size was studied. To do this, the animals were anesthetized with isofluorane and 2x10 6 cells in 0.2 ml of PBS were injected subcutaneously in the left and right flanks of the same mouse. Since the implantation efficiency of the tumor lines is not 100%, 15 mice were inoculated to obtain 12 implanted mice.
  • mice were randomly assigned to two groups of 6 animals which were treated with 80 mg / kg of SLNPE5 (maximum applicable dose) or with PBS in the case of control animals.
  • the administration of SLNPE5 was performed intraperitoneally twice a week for three weeks.
  • the mice were monitored daily and three times a week the tumor and the animal's weight were measured. Samples of the tumor and of different organs such as the kidney and liver are being analyzed for studies in the laboratory.

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Abstract

La presente invención proporciona una proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende una secuencia derivada de la ribonucleasa pancreática humana (RNasa-PH) de secuencia SEC ID NO: 37 fusionada a través de su extremo N-terminal a una secuencia de localización nuclear convencional, así como una molécula de ADN recombinante que codifica para esta proteína, un vector que comprende dicha molécula de ADN y una célula que comprende dicho vector. Adicionalmente la presente invención está referida a un procedimiento para la obtención de la proteína recombinante y el uso de la misma como agente antitumoral.

Description

Proteínas recombinantes con efecto antitumoral
La presente invención está relacionada con el campo de la medicina, y particularmente con el campo de la oncología. Específicamente se refiere a proteínas recombinantes con actividad ribonucleolítica que presentan un efecto antitumoral.
ESTADO DE LA TÉCNICA Algunas enzimas de la familia de las ribonucleasas (de ahora en adelante denominada RNasas) han suscitado un especial interés debido a su actividad citotóxica, ya que se podrían usar como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer. Como ejemplo de RNasa que tienen efecto citotóxico destaca la Onconasa® (de ahora en adelante denominada ONC), una RNasa procedente de oocitos y embriones tempranos de Rana pipiens que se encuentra en estudios clínicos de fase III como agente antitumoral para el tratamiento de
mesotelioma maligno presentando selectividad para células tumorales. Al unirse a la superficie de células tumorales y ser internalizada en el citosol, la ONC causa la muerte celular como resultado de la potente inhibición de la síntesis proteica mediante un mecanismo que implica la degradación del RNA celular. Es conocido que la ONC no es inhibida por el inhibidor proteico de RNasas presente en el citosol de células de mamífero (también
denominado IR), lo que explica la mayor citotoxicidad de la ONC en comparación con otras RNasas de mamífero y, por consiguiente, su efecto antitumoral.
Sin embargo, la ONC presenta propiedades no deseables. Debido a su origen no humano, la ONC típicamente estimula respuestas inmunológicas adversas en el hombre y provoca una elevada toxicidad renal. Además, el hecho de que se obtenga a partir de una fuente natural hace todavía más difícil y caro obtener cantidades suficientes de proteína. Se han utilizado diversas estrategias para obtener RNasas citotóxicas que superen las deficiencias de la ONC. La mayor parte de estas estrategias han estado enfocadas a la obtención recombinante de RNasas humanas resistentes a la acción del IR gracias a la introducción de mutaciones en su secuencia que provocan una deficiencia en su capacidad de unión al IR.
El trabajo publicado por Bosch et al (Bosch M, Benito B, Ribó M, Puig T, Beaumelle B, Vilanova M. "A Nuclear Localization Sequence Endows Human Pancreatic Ribonuclease with Cytotoxic Activity". Biochemistry 2004, vol. 43, p. 2167-2177) propone una alternativa diferente en tanto que describe una variante de la RNasa pancreática humana (de ahora en adelante RNasa-PH) que, aún siendo sensible al IR, escapa a su acción por ser importada al núcleo, donde el IR no está presente. Esta variante, denominada PE5, incluye mutaciones que determinan la existencia de una señal de localización nuclear bipartita discontinua (Rodríguez M, Benito A, Tubert P, Castro J, Ribó M, Beaumelle B, Vilanova M. "A Cytotoxic Ribonuclease Variant with a Discontinuous Nuclear Localization Signal Constituted by Basic Residues Scattered Over Three Areas of the Molecule". Journal of Molecular Biology 2006, vol. 360, p. 548-557). Dicha señal constituye una señal de localización nuclear (de ahora en adelante SLN) no convencional integrada por diferentes residuos básicos, los cuales, a pesar de estar situados en tramos alejados en la secuencia de la proteína, se encuentran próximos en la estructura tridimensional de la misma, lo que permite su interacción con importina alfa y consiguiente importación al núcleo. El resultado es una RNasa modificada con actividad citotóxica frente a líneas celulares de leucemia, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma cervical y linfoma de Burkitt, entre otros, siendo más activa en líneas tumorales que presentan un fenotipo de multirresitencia a medicamentos antitumorales.
Ventajosamente, la variante PE5 es de origen humano, por lo que presenta menos efectos secundarios que la ONC y otras RNasas citotóxicas de origen no humano. Sin embargo PE5 presenta una actividad citotóxica poco eficiente. En comparación con la ONC, por ejemplo, la actividad de PE5 es entre 5 y 15 veces menor (Bosch et al, 2004, supra). La menor eficiencia de PE5 condicionaría un incremento en el coste del tratamiento antitumoral y podría provocar la aparición de otros efectos secundarios dado que serían necesarias dosis más elevadas.
A pesar de los avances antes descritos, es deseable proporcionar agentes y tratamientos más eficientes para los enfermos de cáncer con menos efectos secundarios y a un coste más asequible.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente invención han desarrollado variantes de la RNasa-PH con elevado efecto citotóxico con la finalidad de proporcionar a los enfermos de cáncer un tratamiento antitumoral eficiente, con menos efectos secundarios. Así, un aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende (a) una secuencia derivada de la ribonucleasa pancreática humana (RNasa-PH) de secuencia SEC ID NO: 37, dicha secuencia derivada estando fusionada a través de su extremo N- terminal a (b) una secuencia de localización nuclear convencional.
Los inventores han encontrado que secuencias derivadas de la RNAsa-PH fusionadas en su extremo N-terminal con una SLN convencional da como resultado proteínas recombinantes con actividad ribonucleolítica que poseen una actividad citotóxica muy superior a las RNasas de las que derivan. Tal y como se demuestra en el ejemplo A-2.1 , las proteínas recombinantes de la invención ejercen un efecto citotóxico aproximadamente 10 veces mayor que las RNasas de las que derivan. Esto supone una clara ventaja de cara al uso en terapia anticancerígena, ya que las proteínas recombinantes según la invención consiguen el mismo efecto antitumoral a dosis más bajas. Esto implica menores efectos secundarios en el paciente, además de un ahorro sustancial en el coste de la terapia.
Adicionalmente, las proteínas recombinantes de la invención son muy similares a la RNasa-PH salvaje, por lo que presentan menos efectos adversos que la ONC, que es de origen no humano, a la vez que ejercen un efecto citotóxico comparable a ésta. La baja toxicidad sistémica de las proteínas recombinantes de la invención se ha demostrado en un modelo in vivo (ejemplo B-1 y Fig. 5). Debido a su efecto citotóxico, las proteínas recombinantes de la invención son útiles como medicamento, en concreto como agentes antitumorales para el tratamiento del cáncer. Así, otro aspecto de la invención proporciona una proteína recombinante según la invención para uso como medicamento.
De cara a un uso médico, es habitual que los agentes activos sean
formulados en composiciones farmacéuticas que contienen excipientes adecuados para su administración en humanos. Así, otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante según la invención junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables. Un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para la construcción de la proteína recombinante según la invención que comprende: a) introducir la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37 en un vector de expresión, donde dicho vector contiene los elementos necesarios para llevar a cabo la expresión del gen contenido en dicho vector; b) incorporar en el vector resultante del paso (a) una cadena de nucleótidos que codifica para una secuencia de localización nuclear convencional en el extremo de la secuencia que codifica para la región N-terminal de la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37, donde dicha incorporación se lleva a cabo mediante técnicas de mutagénesis en casette; c) modificar mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37 comprendida en el vector resultante del paso (b) de modo que se obtiene la secuencia que codifica la secuencia derivada de SEQ ID NO: 37; y d) llevar a cabo la expresión del vector resultante del paso (c). La proteína recombinante resultante del paso (d) puede ser posteriormente purificada mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Como ejemplo, la purificación de RNasas recombinantes se describe en Ribó M, Benito A, Canals A, Nogués MV, Cuchillo C, Vilanova M. "Purification of engineered human pancreatic ribonuclease". Methods in Enzymology 2001 , vol. 341 , p. 221 -234.
Así, la proteína recombinante con actividad RNasa de la presente invención puede prepararse mediante la expresión en fase de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una SLN y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la cadena polipeptídica definida por SEC ID NO: 37, donde la SLN está situada en el extremo N-terminal de la SEC ID NO: 37, seguida si es necesario de la purificación de la proteína así expresada. Otros aspectos de la invención proporcionan una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para la proteína recombinante de la invención, un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína recombinante y una célula hospedadora que comprenda dicho vector.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1 . Citotoxicidad de dos producciones independientes de la variante ΡΜ55Ι_Νβ4-β5 frente a diversas líneas celulares. A, producción 1 ; B, producción 2. En cada gráfica se indica el porcentaje de células vivas (eje de ordenadas) respecto a la concentración de proteína ensayada (eje de abscisas). La FIG. 1 se corresponde con los resultados del apartado 2.1 .
FIG. 2. Citotoxicidad de una tercera producción independiente (producción 3) de la variante ΡΜ55ίΝβ4-β5 frente a diversas líneas celulares. En cada gráfica se indica el porcentaje de células vivas (eje de ordenadas) respecto a la concentración de proteína ensayada (eje de abscisas). La FIG. 2 también se corresponde con los resultados del apartado 2.1 .
FIG. 3. Inhibición de las proteínas recombinantes y ONC a causa del IR. El ensayo se llevó a cabo incubando las proteínas recombinantes que se indican, con (+) o sin (-) IR, en presencia del sustrato (rRNA). 1 , PE10 + IR; 2, PE10 - IR; 3, PE5 + IR; 4, PE5 - IR; 5, SLNPE5 + IR; 6, SLNPE5 - IR; 7, ONC + IR; 8, ONC - IR; 9, control negativo sin proteína recombinante + IR. La FIG. 3 se corresponde con los resultados del apartado 2.2.
FIG. 4. Degradación de RNA nuclear en células HeLa tratadas con ONC y SLNPE5. 1 , control (células HeLa no tratadas); 2, ONC; 3, SLNPE5. La FIG.
4 muestra los resultados del apartado 2.3.
FIG. 5. Variación del peso corporal en ratones nude tratados con 5, 20, 40 y 80 mg/kg de SLNPE5. El eje X representa los días post-administración y el eje Y representa la variación porcentual del peso del animal con respecto al día de la administración. EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN Definiciones Se entiende por "secuencia derivada de la ribonucleasa pancreática humana (RNasa-PH) de secuencia SEC ID NO: 37", una secuencia obtenida mediante la modificación de algunos aminoácidos de la RNasa-PH, cuya secuencia es la SEC ID NO: 37. Según la presente invención, dichas modificaciones en la SEC ID NO: 37 no deben resultar en una disminución de la actividad ribonucleolítica de la proteína resultante con respecto a la RNasa-PH original. Preferentemente, dichas modificaciones provocan que la proteína resultante tenga una mayor tendencia a ser importada al núcleo celular.
Una "secuencia de localización nuclear" o "SLN" es una secuencia de aminoácidos cuya función es permitir la importación al núcleo de una proteína que se encuentra en el citosol mediante la interacción con proteínas citosólicas que interaccionan con receptores específicos que se encuentran en la membrana nuclear. Las SLNs mejor caracterizadas están compuestas por una o más agrupaciones de aminoácidos básicos, si bien no
corresponden a una secuencia de consenso específica, y se clasifican por lo general en dos grupos llamados SLN monopartitas, que contienen una sola agrupación de aminoácidos básicos, y SLN bipartitas, que contienen dos agrupaciones básicas separadas por un segmento de 10-12 aminoácidos no conservados. Mayoritariamente se trata de secuencias lineales. En el ámbito de la presente invención a estas SLN se las denomina "SLN convencionales".
Además de estos tipos de SLNs convencionales, pueden existir otro tipo de SLNs menos convencionales definidos por aminoácidos que, si bien están situados en tramos alejados en la secuencia de la proteína, se encuentran próximos en la estructura tridimensional de la misma, lo que posibilita su interacción con proteínas que a su vez interaccionan con receptores de membrana responsables de la importación nuclear. Estas SLN se llaman aquí "SLN discontinuas no convencionales".
El término "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a un polímero de ADN o ARN en forma de cadena única o doble y, a menos que esté limitado de otra manera, que abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos incluye su secuencia complementaria.
El término "secuencia de aminoácidos" se refiere a un polímero de
aminoácidos unidos por enlaces peptídicos en forma de cadena única y, a menos que esté limitado de otra manera, que abarca análogos conocidos de aminoácidos naturales. Un "polipéptido" está constituido por una secuencia de tamaño variable formada por aminoácidos. Por "ADN recombinante" se entiende una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la modificación de secuencias de ADN o por la unión de secuencias de ADN que normalmente no se encuentran juntas. La construcción de ADN recombinante y la sucesiva expresión de dicho ADN da como resultado la producción de proteínas recombinantes que contienen modificaciones deseadas con respecto a las proteínas originales.
Un "vector de expresión" incluye un cassette de expresión que comprende un ADN recombinante que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención que puede ser transcrito y traducido por una célula hospedadora. El cassette de expresión recombinante es un constructo de ácidos nucleicos, generado por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos especificados de ácidos nucleicos que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedadora. El vector de expresión recombinante puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la parte de cassette de expresión recombinante del vector de expresión incluye un ácido nucleico a ser transcrito y un promotor operablemente ligado al mismo.
Una célula hospedadora es una célula que comprende un vector de expresión y que es capaz de expresar una o varias proteínas recombinantes codificadas por la secuencia de ADN de dicho vector.
El término "aislado" según la presente invención se refiere al material biológico que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su ambiente natural.
Según la invención, "modificaciones conservativas" sobre una secuencia particular de ácidos nucleicos se refiere a aquellas modificaciones que dan como resultado una secuencia que codifica para un polipéptido con propiedades similares al codificado por la secuencia de ácidos nucleicos original, siempre y cuando dichos cambios no afecten a la actividad y propiedades del polipéptido en cuestión. Esto sucede cuando en el péptido se ha producido el cambio de un aminoácido por otro que manifiesta una funcionalidad química muy similar o bien cuando el cambio se produce en un aminoácido que está situado en una región que es irrelevante para la funcionalidad del péptido. Una vez conocida la secuencia de aminoácidos de una proteína, el experto en la materia es capaz de modificar dicha secuencia introduciendo modificaciones conservativas en la misma, de modo que puede obtener, sin ningún esfuerzo técnico, una proteína que mantiene las propiedades de la original. Adicionalmente, es conocido que debido a la degeneración del código genético un aminoácido puede estar codificado por más de un triplete o codón. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Las modificaciones en la secuencia de ácidos nucleicos que no resultan en cambios en la cadena de aminoácidos codificada por dicha secuencia se denominan "modificaciones silenciosas".
"Aminoácidos derivados" son aquellos que contienen modificaciones químicas en el aminoácido. Aminoácidos derivados potencialmente interesantes son aminoácidos amidados, acetilados, sulfatados, fenilados, alquilados fosoforilados, glicosidados u oxidados.
El "porcentaje de homología" entre dos cadenas de aminoácidos se entiende como el porcentaje de posiciones de la secuencia con aminoácidos idénticos o que se han reemplazado por otros con cadenas laterales de características similares, de acuerdo con la clasificación ampliamente aceptada por expertos en la materia. Por "porcentaje de identidad" entre dos cadenas de
aminoácidos se entiende el porcentaje de posiciones de la secuencia con aminoácidos idénticos. El porcentaje de homología o identidad entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se puede calcular mediante "alineamiento de secuencias". El alineamiento de secuencias puede ser global o local. En el sentido de la presente invención el % de homología o identidad se calculará preferentemente sobre la base de un alineamiento global, es decir a lo largo de toda la secuencia, o bien a lo largo de un fragmento activo de dicha secuencia. Los alineamientos globales son más útiles cuando las secuencias son similares y aproximadamente del mismo tamaño. El estado de la técnica proporciona diferentes algoritmos para llevar a cabo alineamientos globales, así como programas bioinformáticos que utilizan estos algoritmos para proporcionar al usuario el porcentaje de identidad entre las secuencias problema. Por ejemplo, el alineamiento global de secuencias de aminoácidos puede llevarse acabo mediante los programas GGSEARCH o GLSEARCH, los cuales son bien conocidos en el estado de la técnica
Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos que, de acuerdo con un criterio médico, son adecuados para su uso en un sujeto, humano o no humano, sin toxicidad excesiva, irritación, reacción alérgica u otro tipo de problema o complicación para el sujeto. Los excipientes de una composición farmacéutica también deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación. Los
excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para cualquier tipo de composición pueden encontrarse en textos estándar de ciencias
farmacéuticas.
La presente invención está relacionada con RNasas recombinantes derivadas de la RNasa-PH que presentan un elevado efecto citotóxico y son bien toleradas por el cuerpo humano, evitando efectos secundarios indeseables.
Las proteínas recombinantes según la invención se caracterizan por ser importadas de manera eficiente al núcleo celular, de tal manera que ejercen su actividad ribonucleolítica principalmente degradando RNA en el núcleo de la célula. Esta característica condiciona que estas RNasas recombinantes posean una elevada actividad citotóxica.
En una realización particular, las proteínas recombinantes de la invención comprenden o consisten en una secuencia derivada de la RNasa-PH fusionada a través de su extremo N-terminal con una secuencia de
localización nuclear convencional, donde la secuencia derivada de la RNasa- PH contiene a su vez una secuencia de localización nuclear discontinua no convencional. La combinación de ambas SLN potencia de manera
sorprendente la actividad citotóxica de las proteínas recombinantes de la invención resultando en variantes de elevado interés de cara a una aplicación terapéutica.
La proteína definida por la SEC ID NO: 9 es una secuencia derivada de la RNasa-PH mediante modificaciones puntuales en la secuencia de la misma que contiene una secuencia de localización nuclear discontinua no
convencional definida por los residuos de K-,, R3i, R32, R33, Rsg, R90 y R91 (los subíndices indican la posición del aminoácido dentro de la SEC ID NO: 9). Esta SLN discontinua no convencional favorece la importación de la variante RNasa al núcleo de la célula, de modo que las RNasas definidas por SEC ID NO: 9 ya poseen cierto efecto citotóxico, si bien, como se ha comentado anteriormente, este efecto es insuficiente de cara a una aplicación
terapéutica.
Sorprendentemente la incorporación de una SLN convencional en el extremo N-terminal de la proteína definida por la SEC ID NO: 9 resulta en una proteína con una actividad citotóxica diez veces superior.
Así, en una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 9 fusionada a través de su extremo N-terminal a una secuencia de localización nuclear convencional. En otra realización la presente invención se refiere a una proteína recombinante con actividad ribonucleasa que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 9 fusionada a través de su extremo N-terminal a una secuencia de localización nuclear convencional. La presente invención también contempla proteínas recombinantes con actividad ribonucleasa que comprenden una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 80% de homología con la SEC ID NO: 9 fusionada a través de su extremo N-terminal con una secuencia de localización nuclear convencional. En una realización particular la invención se refiere a proteínas recombinantes con actividad ribonucleasa que consisten en una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 80% de homología con la SEC ID NO: 9 fusionada a través de su extremo N-terminal con una secuencia de localización nuclear convencional. En una realización particular el porcentaje de homología con respecto a la SEQ ID NO: 9 es de al menos 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%. En otra realización particular los porcentajes indicados anteriormente se refieren a porcentajes de identidad de secuencia. Dichos porcentaje de homología o identidad se calculan mediante alineamiento a lo largo de toda la secuencia o bien por alineamiento a lo largo de un fragmento activo de la misma. En otra
realización particular, la secuencia que presenta homología o identidad con la SEC ID NO: 9 tiene la misma longitud que la SEC ID NO: 9 y contiene una SLN discontinua no convencional definida por los aminoácidos K-i , R3 , R32, R33, Rsg, R90 y R91 (los subíndices indican la posición del amino ácido en la SEC ID NO: 9).
Como se ha comentado anteriormente, la proteína recombinante de la invención puede contener una secuencia 100% idéntica a SEQ ID NO: 9.
En otra realización particular la SEC ID NO: 9 contiene al menos una de las siguientes modificaciones: Q por E en el amino ácido situado en la posición 9,
D por G en el amino ácido situado en la posición 16, y
S por N en el amino ácido situado en la posición 17
Los inventores han encontrado que algunas de estas proteínas
recombinantes presentan ventajas adicionales. Por ejemplo, la sustitución de Q por E en posición 9, D por G en posición 16 y S por N en posición 17 de la SEC ID NO: 9 da lugar a una proteína recombinante según la invención que provoca menores efectos secundarios en los pacientes a los que se administran. Estas modificaciones en la SEQ ID NO: 9 dan lugar a una secuencia con un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 9. Así, en una realización particular, la secuencia que presenta identidad con la SEC ID NO: 9 es la SEC ID NO: 13. Esta variante presenta la ventaja adicional de ser más parecida a la RNasa-PH salvaje, es decir, es una proteína más humanizada que provoca menores reacciones adversas en el cuerpo humano. En general, variantes preferidas según la invención se pueden definir como aquellas que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos definida por la SEC ID NO: 1 fusionada a través de su extremo N-terminal con una SLN convencional, siendo la SEC ID NO: 1
KESAAAKFX9RQHMDSX16X17SPSSSSTYCNQMMRRRNMTQGRCKPVNTFV HEPLVDVQNVCFQEKVTCKNGQGNCYKSNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAY RTSPKERHIIVACEGSPYVPVHFDASVEDST, donde X9 es E o Q, X16 es G o D, y X17 es N o S (los subíndices indican la posición del aminoácido "X" en la SEC ID NO: 1 ).
Las SLN convencionales que forman parte de las proteínas recombinantes de la invención pueden ser monopartitas, bipartitas, o cualquier SLN que no interfiera con la actividad de la enzima. En una realización particular, la SLN convencional es la SLN del antígeno mayor del virus SV40 con SEC ID NO: 2. En otra realización particular la SLN está definida por la secuencia SEC ID NO: 3. En otra realización particular la SLN está definida por la secuencia SEC ID NO: 4 En otra realización particular, la proteína recombinante de la invención está definida por la SEC ID NO: 10. En otra realización particular, la proteína recombinante de la invención está definida por la SEC ID NO: 14.
Son parte de la presente invención proteínas que contengan modificaciones conservativas con respecto a las proteínas recombinantes descritas anteriormente. También forman parte de la invención proteínas
recombinantes modificadas mediante la sustitución de algunos aminoácidos por aminoácidos derivados, siempre que dichas sustituciones no disminuyan la actividad citotóxica de las proteínas. Particularmente, la invención contempla modificaciones realizadas en aquellas regiones de las proteínas que son poco significativas para la actividad catalítica de la misma, para su plegamiento o, en el caso de las proteínas de la invención, para su
direccionamiento al núcleo celular. Un experto en la materia entendería que tales regiones son fácilmente susceptibles de variación por modificación, adición o depleción de aminoácidos, sin que ello afecte a la funcionalidad de la proteína. Por ejemplo, en la RNasa-PH, las regiones de los lazos, que incluyen los aminoácidos M 3 a T24, R33 a R39, H48 a P5o, K66 a N71, S75 a S78, T87 a N94, Em a Y 5 y E 25 a T 28 de la SEC ID NO: 37, no están involucradas en la funcionalidad de la enzima y, por tanto, un experto en la materia podría, sin ejercer ningún esfuerzo técnico, introducir en ellas modificaciones que no afectaran su actividad.
Adicionalmente, los aminoácidos que componen las proteínas recombinantes de la invención pueden tener configuración L o D. Aquellos con configuración D son preferidos puesto que son más resistentes a la degradación por proteasas.
La construcción de proteínas recombinantes de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo empleando técnicas conocidas en el campo de la biología molecular. Típicamente se preparará en primer lugar el ácido nucleico recombinante que codifica para la proteína recombinante según la invención mediante la restricción y el clonado de secuencias apropiadas. La secuencia de ADN comprende la secuencia derivada de la RNAsa-PH, y un SLN convencional, ambas secuencias situadas en fase. La secuencia derivada de la RNAsa-PH y la secuencia SLN convencional pueden estar separadas por una secuencia espaciadora. Las secuencias espaciadoras están constituidas típicamente por residuos serina, glicina y / o alanina (espaciador no rígido) o secuencias que contengan residuos de prolina (espaciador rígido). Las secuencias espaciadoras pueden ser más o menos largas, si bien habitualmente contienen entre 4 y 8 residuos. Típicamente la secuencia de ADN recombinante está contenida en un vector de expresión. A continuación se introduce el ADN recombinante en un hospedador adecuado para conseguir la expresión de la proteína
recombinante. El experto en la materia seleccionará el vector de expresión más adecuado teniendo en cuenta las características de la proteína recombinante a expresar y el hospedador que se va a utilizar. Finalmente la proteína recombinante se purifica empleando cromatografía de intercambio iónico o cualquier otro método de purificación conocido en el estado de la técnica. En caso de que la proteína recombinante sea inactiva debido, por ejemplo, a un plegamiento defectuoso de la misma, el experto en la materia aplicará métodos conocidos en la técnica para proceder al plegamiento y subsiguiente activación de dicha proteína. Con el objeto de facilitar la purificación de la proteína recombinante es habitual introducir en un extremo de la proteína una secuencia de
aminoácidos especialmente diseñada para tal fin. Una secuencia de aminoácidos que se puede introducir en la proteína recombinante para facilitar su purificación es una secuencia de polihistidina (His-Tag). Estas secuencias His-Tag son ampliamente usadas para la purificación de proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad. Otras secuencias que facilitan la purificación que pueden usarse en la presente invención son, por ejemplo, secuencias antigénicas como la hematoglutinina, T7, GST o myc.
El gen que codifica para la proteína recombinante según la invención también puede prepararse por síntesis química. La síntesis química produce un oligonucleótido de una sola cadena. Esta puede convertirse en un ADN de cadena doble mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la cadena única como molde. Aunque la síntesis química se limita a secuencias de
aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas ligando entre sí las secuencias más cortas.
Existen otras opciones para producir la proteína recombinante de la invención, tales como por escisión o fusión de polipéptidos sintéticos o semisintéticos. También se puede obtener la proteína recombinante mediante una combinación de las técnicas arriba descritas.
En los ejemplos que se reproducen más adelante se describe la construcción de algunas proteínas recombinantes según la invención.
Las proteínas recombinantes de la invención son útiles como medicamento en terapia anticancerígena por su elevada citotoxicidad. El efecto citotóxico de estas proteínas frente a líneas celulares de carcinoma cervical, linfoma mieloide, carcinoma de ovario y de pulmón queda demostrado en el ejemplo A-2.1 . Así, una realización preferida de la invención proporciona una proteína recombinante según lo descrito para uso como agente antitumoral.
Así, una realización preferida proporciona una proteína recombinante según la invención para uso en el tratamiento del cáncer. Esta realización se puede reformular como el uso de la proteína recombinante de la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. La invención también proporciona un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad
terapéuticamente efectiva de la proteína recombinante de la invención.
Particularmente, las proteínas recombinantes según la invención se pueden usar para el tratamiento de leucemia, carcinoma epidermoide, carcinoma de mama, carcinoma cervical, linfoma mieloide, carcinoma de ovario, páncreas, hígado y pulmón. Asimismo, las proteínas recombinantes de la invención presentan in vitro mayor efecto para líneas celulares tumorales con fenotipo de multiresistencia a medicamentos, es decir representativas de estadios avanzados de cánceres. En una realización particular la proteína
recombinante es para el tratamiento de todo tipo de cáncer que responda a la terapia, principalmente cáncer de ovario, pulmón y mama.
La actividad antitumoral de estas proteínas puede reforzarse empleando estrategias bien conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, las proteínas pueden dirigirse hacia un tipo de células tumorales de interés mediante su conjugación con anticuerpos específicos frente a antígenos expresados en la superficie celular de las células de elección o su unión a ligandos de receptores expresados en la superficie celular de las células de elección. Varios anticuerpos útiles para el direccionamiento de agentes anticancerígenos a sus células diana son conocidos en el estado de la técnica. Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína
recombinante de la invención, junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, los excipientes farmacéuticamente aceptables son apropiados para la terapia
anticancerígena sin inducir toxicidad, irritación, incompatibilidad,
inestabilidad, respuesta alérgica o similar.
Preferentemente, las composiciones de la invención se administrarán a los pacientes por vía intravenosa. Como podrán apreciar los expertos en la materia, las composiciones pueden prepararse en diferentes formas adecuadas para administrar por vía intravenosa. La proteína recombinante de la invención también puede administrarse por vía tópica o por vía oral. Cuando la proteína de la invención se administra por vía oral preferentemente comprende un recubrimiento que evite su
degradación en el tracto gastrointestinal.
Las composiciones de la presente invención pueden comprender,
adicionalmente, componentes que permitan una liberación controlada o mayor confort. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que sufre de una enfermedad en una cantidad terapéuticamente efectiva, que se define como una cantidad suficiente para producir beneficios al paciente. La cantidad de proteína recombinante de la invención a administrar puede ser determinada por una persona experta en la materia siguiendo protocolos estándar en el campo de la clínica médica. La cantidad exacta dependerá de la severidad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Pueden administrarse dosificaciones únicas o múltiples (a intervalos de tiempo) de las composiciones dependiendo de la dosis requerida. Por ejemplo, para administración intravenosa de ONC se usan cantidades entre 300 μg m2 peso y 1000 μg m2 peso
La cantidad terapéuticamente efectiva también depende de si la proteína recombinante de la invención se usa como único agente antitumoral o se usa en combinación con otro agente antitumoral. Las terapias combinatorias son habituales en el campo del tratamiento del cáncer. Por tanto, en una realización particular, la proteína recombinante según la invención es para uso en combinación con otro agente anti-tumoral en el tratamiento del cáncer. Esta realización se puede reformular como el uso de la proteína recombinante según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con otro agente antitumoral.
También forma parte de la presente invención un método para el tratamiento del cáncer que comprende o consiste en administrar a un paciente que lo necesita una proteína recombinante según la invención en combinación con otro agente antitumoral. Los agentes antitumorales de la presente invención se pueden usar en combinación con otros agentes antitumorales tales como tamoxifen, lovastatin, cis-platino, vincristina, inhibidores del proteasoma, interferones, doxorubicina y rosiglitazona, entre otros. El diseño de vanantes de RNasa de procedencia humana con actividad citotóxica para aplicaciones terapéuticas no es sencillo. Esto se debe a que el efecto citotóxico de una RNasa es el resultado de multitud de
características de la proteína, tales como su estabilidad, su eficiencia en la internalización y en la translocación al citosol, su capacidad para evadir al IR y su actividad catalítica. Cualquier modificación introducida en la secuencia de la proteína podría afectar a una o varias de estas características. Por eso no hay una clara asociación entre una modificación determinada y un incremento en la actividad antitumoral de una RNasa como consecuencia de la modificación.
Así, las modificaciones en la secuencia de las RNasas podrían provocar un cambio conformacional que dificulte el reconocimiento por la importina, lo que supondría también una menor importación al núcleo y la pérdida de citotoxicidad. Este efecto no deseado ha sido descrito por Tubert et al (Tubert P, Rodríguez M, Ribó M, Benito A, Vilanova M. "The nuclear transport capacity of a human-pancreatic ribonuclease variant is critical for its cytotoxicity". Invest. New. Drugs. 2010, DOI 10.1007/s10637-010-9426-2), quienes observaron una disminución de la actividad citotóxica de la variante denominada PE5 cuando se eliminaban los residuos que conforman la SLN no convencional de esta enzima. Por otro lado, las modificaciones podrían afectar al centro activo de la enzima provocando la pérdida de actividad ribonucleolítica de la misma. Así, parece que las RNasas citotóxicas derivadas de RNasa-PH nativa deben mantener un difícil equilibrio entre su estabilidad, actividad ribonucleolítica y capacidad de importación en el núcleo. La modificación de la secuencia de las RNasas podría interferir en cualquiera de estos factores disminuyendo su actividad citotóxica. En algunos casos, se ha logrado dirigir moléculas al núcleo mediante la incorporación de varias SLN. Por ejemplo, la US5674977 describe un octapéptido ramificado sintético como vehículo de direccionamiento de fármacos a un compartimento celular deseado. Cuando el compartimento celular de destino es el núcleo celular, el octapéptido incorpora varias copias del SLN del antígeno mayor de SV40. Según US5674977, la internalización al núcleo requiere de la incorporación de múltiples SLN en la secuencia del octapéptido. Otro documento (Chen P, Wang J, Hope K, Jin L, Dick J, Cameron R, Brandwein J, Minden M, Reilly R M. "Nuclear Localizing
Sequences Promote Nuclear Translocation and Enhance the Radiotoxicity of the Anti-CD33 Monoclonal Antibody HuM195 Labeled with 111ln in Human Myeloid Leukemia Cells". J Nucl Med 2006, vol. 47, p. 827-836), describe que la importación al núcleo del anticuerpo monoclonal HuM195 marcado con 111ln (anticuerpo anti-CD33) se triplica cuando se conjuga con cuatro SLN, y es seis veces mayor cuando se conjuga con ocho SLN. Los
resultados muestran que es necesario conjugar dicho anticuerpo con una media de cinco SLN para obtener una actividad citotóxica dos veces mayor en comparación con el anticuerpo no conjugado. Así, parece que esta estrategia es poco eficiente para el direccionamiento de las moléculas al núcleo de la célula.
El escaso éxito del direccionamiento al núcleo mediante SLNs queda ilustrado en el caso de RNasas citoplasmáticas en el ejemplo A-2.1 , donde se muestra que la incorporación de una SLN en una RNasa recombinante denominada PM5 de secuencia SEC ID NO: 5 no incrementa en modo alguno su citotoxicidad, y esto independientemente de dónde se incorpore la SLN. PM5 no contiene una SLN no discontinua no convencional en su estructura. Del mismo modo, la inserción de una SLN convencional en el extremo C- terminal de una RNasa que sí contiene una SLN discontinua no convencional en su estructura resulta en una variante cuya actividad citotóxica no es significativamente superior a la RNasa de la cual deriva, demostrando así que la SLN convencional en esa posición no favorece su importación al núcleo de la célula (ver tabla 1 ).
Los ejemplos muestran los resultados obtenidos a partir de las proteínas recombinantes con actividad ribonucleasa diseñadas por los inventores, resultados que sorprendentemente demuestran que dichas proteínas ejercen un elevado efecto citotóxico como consecuencia de su rápida importación al núcleo de la célula. Así, la proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 9 fusionada en su extremo N-terminal con una SLN convencional resulta en una proteína cuya actividad citotóxica es equiparable a la de la ONC (ver SNLPE5 en tabla 1 ). A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
EJEMPLOS
A. Ensayos in vitro
1 . Metodología
1 .1 . Construcción de variantes de la ribonucleasa pancreática humana (RNasa-PH).
Las variantes de RNasa-PH descritas y los oligonucleótidos usados para su construcción están enumerados en el listado de secuencias.
1 .1 .1 . Construcción de pM5SLN.
Se introdujo la secuencia SEC ID NO: 2 en el extremo C-terminal de la variante de la RNasa-PH PM5cct contenida en el vector pM5cct (la construcción pM5cct se obtuvo a partir de pM5 mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido, utilizando los oligonucleótidios T7PROM (SEC ID NO: 35) y M9CCT1 (SEC ID NO: 36). Para la construcción, el gen de PM5 fue amplificado por PCR con los oligonucleótidos T7PROM y M9CCT1 y el DNA resultante fue posteriormente digerido con los enzimas de restricción Ndel y Salí. El producto de la digestión se insertó en el fragmento del plásmido pM5 resultado de eliminar el gen de la RNasa mediante la digestión con los enzimas de restricción Ndel y Salí. (Bosch et al, supra; Canals A., Ribo M., Benito A., Bosch M., Mombelli E., Vilanova M. "Production of Engineered Human Pancreatic Ribonucleases, Solving Expression and Purification Problems, and Enhancing Thermostability". Protein Expression and Purification 1999, vol. 17, p. 169-181 ). Para ello, los oligonucleotidos complementarios CTSLNJ (SEC ID NO: 17) y CTSLN_2 (SEC ID NO: 18) se mezclaron a concentraciones equimolares, se calentaron hasta 90°C, y la temperatura se dejó descender gradualmente hasta 25°C durante 30 min. Los oligonucleótidos aparejados fueron purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y ligados al vector pM5cct previamente digerido con BamHI y Hind III. Con el DNA resultante se transformaron células DH5a para obtener pM5SLN.
1 .1 .2. Construcción de pSLNPM5
Esta variante fue construida en dos pasos. Primero se construyó la variante pLINKM5. Para ello, el gen de la variante de la RNasa-PH contenido en el plásmido pM5 (Canals et al, supra) fue amplificado usando los
oligonucleótidos T7TERM (SEC ID NO: 19) y PLINKMEJ (SEC ID NO: 20), el cual introduce una diana de restricción Hind 111 en el extremo 5' del gen. El producto de PCR fue digerido con Hindlll y Salí, y ligado al vector pET17b (Novagen (Madison, Wl)) previamente digerido con Hindlll y Xhol. Con el producto de la reacción de ligamiento se transformó la línea DH5a
(Invitrogen) para obtener el vector pLINKM5. La secuencia que codifica para SEC ID NO: 2 se introdujo en el extremo 5' del gen que codifica para la HP- RNasa del vector pLINKM5 para crear pSLNPM5. Para ello, los
oligonucleotidos complementarios NTSLN_1 (SEC ID NO: 21 ) y NTSLN 2 (SEC ID NO: 22) se mezclaron a concentraciones equimolares, se calentaron hasta 90°C, y la temperatura se dejó descender gradualmente hasta 25°C durante 30 min.
Los oligonucleótidos aparejados fueron purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y ligados a pLINKM5, previamente digerido con Hindlll y
Ndel. Con el DNA resultante se transformaron células DH5a para obtener pSLNPM5.
1 .1 .3. Construcción de pM5SLN( 4- 5).
Para la construcción de esta variante se partió del vector pM5 (Bosch et al, 2004) y mediante mutagénesis dirigida utilizando el kit "Quik-change PCR site-directed mutagénesis" (Stratagene, USA) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y los oligonucleótidos, BM1 (SEC ID NO: 23) y BM2 (SEC ID NO: 24), se introdujeron las dianas de restricción BamHI y Munl que substituían la secuencia 86-93 de la variante PM5 de la RNasa-PH. Los productos de PCR fueron digeridos con Dpnl y se utilizaron para transformar células DH5a para obtener pM5int.
La secuencia que codifica para la SEC ID NO: 2 se introdujo en el lazo β4-β5 de la proteína codificada por el gen de la variante PM5 de la RNasa-PH para crear ρΡΜ55ίΝ(β4-β5). Para ello, los oligonucleótidos complementarios INTSLNJ (SEC ID NO: 25) y INTSLN_2 (SEC ID NO: 26) se mezclaron a concentraciones equimolares, se calentaron hasta 90°C, y la temperatura se dejó descender gradualmente hasta 25°C durante 30 min. Los
oligonucleótidos aparejados fueron purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y ligados a pM5int, previamente digerido con BamHI y Munl. Con el DNA resultante se transformaron células DH5a para obtener ρ55ίΝ(β4- β5).
1 .1 .4. Construcción de pSLNPE5 y pE5SLN. pSLNPE5 y pE5SLN se obtuvieron a partir de pSLNPM5 y pM5SLN
introduciendo los cambios Gly89Arg y Ser90Arg. Estos cambios fueron introducidos mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido utilizando el kit "Quik-change PCR site-directed mutagénesis" (Stratagene, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos utilizados para la construcción de estas variantes fueron: PE5A (SEQ ID NO: 27) y PE5B (SEQ ID NO: 28). Los productos de PCR fueron digeridos con Dpnl y se utilizaron para transformar células DH5a para obtener pSLNPE5 y pE5SLN.
1 .1 .5. Construcción de pE10.
PE10 es la variante definida por la SEC ID NO: 1 donde X9 es Gln, X 6 es Asp, y X-I7 es Ser. Esta variante fue construida en dos pasos. Primero se construyó la variante PE9 (SEQ ID NO: 12) introduciendo los cambios
Gly89Arg y Ser90Arg sobre la secuencia de la RNasa-PH salvaje. Para ello, el vector pE5 obtenido según Bosch et al (supra) fue digerido con los enzimas de restricción Sacl y Salí y un fragmento de 320 pares de bases (que corresponde al segmento del gen comprendido entre los codones 21 a 128) se ligó al vector pM9 (vector que contiene el gen salvaje que codifica para la RNasa-PH) previamente digerido con los mismos enzimas de restricción Sacl-Sall y se transformaron células DH5a para obtener pE9. pE10 se obtuvo a partir de pE9 introduciendo los cambios Arg4Ala y Lys6Ala. Estos cambios fueron introducidos mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido utilizando el kit "Quik-change PCR site-directed mutagénesis" de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleotidos utilizados para la construcción de esta variante fueron R4AK6A3 (SEQ ID NO: 29) y R4AK6A5 (SEQ ID NO: 30).
Los productos de PCR fueron digeridos con Dpnl y se utilizaron para transformar células DH5a para obtener pE10.
1 .1 .6. Construcción de pSLNPEI O.
Esta variante se construye en dos etapas. En una primera etapa se introduce en el vector pSLNPE5 la mutación Glu9Gln (dando lugar al vector
pSLNPE5Glu9Gln) mediante mutagénesis dirigida utilizando el kit "Quik- change PCR site-directed mutagénesis" de Stratagene, USA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los oligonucleotidos E9Q_1 (SEQ ID NO: 31 ) i E9Q_2 (SEQ ID NO: 32). En una segunda etapa, se introduce en la variante SLNPE5Glu9Gln la mutación Gly16Asp y Asn17Ser (dando lugar al vector pSLNPEI 0) mediante el mismo procedimiento de mutagénesis dirigida descrito anteriormente (QuikChange de Stratagene) y los oligonucleotidos D16S17_1 (SEQ ID NO: 33) i D16S17_2 (SEQ ID NO: 34).
Los productos de PCR se digieren con Dpnl y se utilizan para transformar células DH5a para obtener pSLNPEI O.
1 .2. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes derivadas de la RNasa-PH. Se inocularon cultivos de noche de células BL21 (DE3), que habían sido transformadas con el vector derivado de pET17 que contenía la variante deseada, a una dilución 1 :100 en 5 erlenmeyers de 2L cada uno, que contenían 400 mL del medio de cultivo Terrific Broth (Sambrook et al "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (tercera edición) CSHL Press) (suplementado con 50 g/ml de ampicilina). Se permitió su crecimiento a 37°C con agitación vigorosa. La expresión proteica fue inducida en la fase exponencial tardía mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 3-4 h más de crecimiento, las células fueron recogidas mediante centrifugación a 7500xg durante 7 min y los sedimentos fueron almacenados a -20°C hasta su utilización.
Los sedimentos congelados se descongelaron y fueron resuspendidos en 30 mL de 50 mM Tris-acetato pH 8,0, 10 mM EDTA, las células fueron lisadas mediante una prensa de French y centrifugadas a 9400 xg durante 45 min para aislar los cuerpos de inclusión. Los agregados proteicos fueron disueltos en 10 mL de 6 M cloruro de guanidinio, 100 mM Tris-acetato, 2 mM EDTA, pH 8.0, y reducidos mediante la adición de GSH a una concentración final de 0,1 M. El pH se ajustó a 8,5 mediante la adición de Tris sólido y la muestra fue incubada a temperatura ambiente, bajo atmósfera de nitrógeno, durante 2h. Después de la eliminación del material insoluble mediante centrifugación a 1400 xg durante 30 min, la proteína soluble se diluyó en 2 L de 0,1 M Tris-acetato, 0,5 M L-arginina, 1 mM GSSG, 2 mM EDTA, pH 8,5, y fue incubada a 10°C durante al menos 48 h. La muestra se ajustó a pH 5,0 con ácido acético glacial y fue concentrada hasta 150 mL mediante ultrafiltración tangencial. La muestra concentrada fue dializada
exhaustivamente frente a 50 mM acetato sódico, pH 5,0. El material precipitado o insoluble se descartó mediante centrifugación a 15300xg durante 30min.
Las proteínas recombinantes replegadas fueron purificadas mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna Mono-S HR 5/5 FPLC, equilibrada con 50mM acetado sódico a pH 5,0 y eluídas con un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCI. Las proteínas recombinantes eluyeron a las siguientes concentraciones de NaCI: 550 mM (PE5), 540 mM (PE10) y 620mM (SLNPE5), 600 mM (PE5SLN), 510 mM (SLNPM5), 500 mM
(PM5SLN) y 310 mM (ΡΜ55ίΝ(β4β5), en este último caso la cromatografía se llevó a cabo a pH 8,0 y en los anteriores casos a pH 5,0. Las fracciones que contenían las proteínas recombinantes puras y homogéneas fueron dializadas frente a agua ultra pura y liofilizadas para ser almacenadas a - 80°C hasta posteriores análisis. La masa molecular de cada variante se confirmó mediante espectrometría de masas, MALDI-TOF.
1 .3. Ensayos de citotoxicidad.
Células NCI/ADR-RES (procedentes del laboratorio del Dr. K. Cowan del Natiocal Cáncer Institute, NHI, Bethesda, MD, USA), NCI-H460/R
(procedentes del laboratorio del Dr. S. Ruzdijuc del Institute for Biological Research" S. Stankovic, Belgrado, Servia), HeLa, MCF7, A431 (estas tres líneas celulares fueron adquiridas a Eucellbank, Universidad de Barcelona, España), MCF10A (procedentes del laboratorio del Dr. J, Menéndez del Instituto de Investigación Biomédica de Girona), OVCAR-8 (adquiridas al National Cáncer Institute, USA) y Jurkat (procedentes del laboratorio del Dr. B. Beaumelle del CNRS de Montpellier) fueron colocadas en placas de 96 pocilios a una densidad apropiada, es decir, 10000 células por pocilio para la línea celular NCI/ADR-RES, 3000 células por pocilio para la línea celular NCI-H460/R, 1 100 células por pocilio para la línea celular HeLa, 7000 células por pocilio para la línea celular MCF7, 2500 células por pocilio para la línea celular A431 , 2500 células por pocilio para la línea celular MCF10A, 1500 células por pocilio para la línea celular OVCAR-8 y 6000 células por pocilio para la línea celular Jurkat. Después de 24h de incubación, las células fueron tratadas con varias concentraciones de PE5 (0,1-30 μΜ), PE10 (0,1-30 μΜ), SLNPE5 (0,001-10 μΜ), PE5SLN (0,1 -30 μΜ), SLNPM5 (0,1-30 μΜ), PM5SLN (0,1-30 μΜ), ΡΜ55ίΝ(β4-β5) (0,1-30 μΜ) u ONC (0,001-10 μΜ) durante 72 h. La sensibilidad a las diferentes proteínas se determinó mediante el método del MTT esencialmente tal como describe el fabricante (Sigma, USA). Se recogieron los datos mediante lecturas de absorbancia a
570nm con un equipo de multilectura de placas (BioTek Instruments, USA). Los valores de IC5o representan la concentración de la RNasa ensayada que se requiere para inhibir la proliferación celular en un 50% y fueron calculados para algunas variantes mediante interpolación lineal a partir de las curvas de crecimiento obtenidas.
1 .4. Ensayo de inhibición de las proteínas recombinantes Se comprobó la actividad ribonucleolítica de las proteínas recombinantes en presencia de IR utilizando un ensayo en gel de agarosa, descrito en Bosch et al, 2004 (supra). Brevemente, 15 ng de cada proteína recombinante en 20 μΙ de 20mM Hepes, 125 mM NaCI, 2,5 mM DTT, 10 mM EDTA, pH 7,0, se incubaron durante 10 min a 25°C con 0 o 40 unidades de IR (Promega, USA) (1 unidad es la cantidad de IR requerida para inhibir la actividad de 5 ng de RNasa en un 50%). Seguidamente se añadieron 4 g de 16S y 23S rRNA (Roche, Suiza) y las muestras fueron incubadas durante 10 min más a 25°C. Las reacciones se pararon mediante la adición de 3 μΙ de tampón
electroforético de carga (40% (p/v) sacarosa, 0,2% (v/v) pirocarbonato de dietilo, y 0,25% (p/v) de azul de bromofenol) y las muestras fueron sometidas a electroforesis en gel de agarosa (1 ,2% (p/v)) conteniendo bromuro de etidio.
1 .5. Ensayo de degradación de RNA por las proteínas recombinantes
(extracción de RNA nuclear y citoplasmático).
Se colocaron 3 *106 células HeLa en un frasco de cultivo T75 (Nunc).
Después de 4h de incubación las células se trataron con 0,1 μΜ ONC, 0,3 μΜ SLNPE5. Estas concentraciones corresponden a valores cercanos a los valores de Ido según el ensayo con MTT. Después de 24h de incubación, las células fueron recogidas mediante centrifugación a 400xg durante 5min a 4°C y lavadas con PBS enfriado en hielo. La fracción de RNA nuclear y citoplasmático se extrajo utilizando el kit PARIS k (Applied
Biosystems/Ambion, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacenado a -80°C. Se cargaron muestras de 1 g de RNA en un gel de agarosa 1 ,5% en condiciones desnaturalizantes y el grado de degradación del RNA fue medido por comparación con el RNA purificado de células HeLa no tratadas.
2. Resultados 2.1 . Citotoxicidad
PM5 es una variante de la RNasa-PH que presentan los cambios Arg4Ala, Lys6Ala, Gln9Glu, Asp16Gly y Ser17Asn. PM5SLN, SLNPM5 y PM5SLN( 4- β5) son vanantes de PM5 que presentan la NLS definida por la SEC ID NO: 2 en su extremo C-terminal (PM5SLN), N-terminal (SLNPM5) o en el lazo β4-β5 (ΡΜ55Ι_Ν(β4-β5)). Estas variantes fueron producidas y purificadas, observándose al finalizar la producción que las proteínas estaban
correctamente plegadas y activas. A continuación, se estudió su citotoxicidad en diferentes líneas celulares tumorales según se detalla en el apartado 1 .3.
Las figuras FIG. 1 y FIG. 2 muestran los resultados de citotoxicidad de 3 producciones independientes de la variante ΡΜ55ίΝβ4-β5 (producciones 1 - 3). En cada gráfica se indica el porcentaje de células vivas (viabilidad) respecto a la concentración de proteína ensayada (curva dosis-respuesta). Cada uno de los trazos corresponde a un ensayo de citotoxicidad diferente frente a una línea celular. Tal y como se puede observar en las figuras, la citotoxicidad fue en todos los casos idéntica a la del control sin proteína, es decir nula. El mismo resultado negativo se obtuvo al ensayar la citotoxicidad de las variantes PM5SLN y SLNPM5, las cuales contienen una SLN en el extremo C-terminal y N-terminal, respectivamente (resultados no mostrados). Todos estos datos indican que, independientemente de dónde se hubiera introducido la SLN, la variante derivada de PM5 no mostró actividad citotóxica alguna.
Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo también con las proteínas recombinantes PE10, PE5, SLNPE5 y PE5SLN, utilizando ONC como control positivo. A partir de los resultados obtenidos en los ensayos se calculó el valor IC5o para cada una de estas proteínas recombinantes y la ONC tal y como se explica en el apartado 1 .3. Los resultados se expresan en la tabla 1 .
Tabla 1 . Valores medios de IC50 en μΜ de las diferentes proteínas
recombinantes y ONC sobre diferentes líneas tumorales.
ONC SLNPE5 PE5 PE10 PE5SLN
IC50 media + IC50 media + IC50 media + IC50 media + C50 media +
SD (μΜ) SD (μΜ) SD (μΜ) SD (μΜ) SD (μΜ)
NCI/ADR-
1 , 18 + 0, 17 0,97 + 0,05 8,91 + 1 ,31 8,89 + 1 ,57 5.40 + 0.49 RES
NCI-
0,44 + 0, 12 0,40 + 0,01 2,98 + 0,39 3,28 + 0,47 n.e H460/R
HeLa 0, 15 + 0, 01 0,27 + 0,04 1 ,74 + 0,27 1 ,88 + 0,44 n.e OVCAR8 0,54 + 0,08 0,24 + 0,04 3,32 + 0,59 3,65 + 0,80 n.e
Jurkat 0,33 + 0,01 1 ,92 + 0, 17 13, 12 + 1 ,23 13,23 + 0,85 n.e n.e. no ensayado
Estos resultados indican que tanto PE5 como PE10 muestran cierta citotoxicidad frente a las líneas tumorales ensayadas. Sin embargo, su actividad citotóxica es muy inferior a la de la ONC. La inserción de un SLN en el extremo C-terminal de estas variantes da lugar a una proteína
recombinante con una citotoxicidad algo superior, pero que todavía se encuentra muy por debajo de la actividad de la ONC. Sorprendentemente, la inserción del SLN en el extremo N-terminal de la variante PE5 resulta en una proteína recombinante cuya actividad citotóxica es de igual magnitud que la ONC.
2.2. Inhibición de las proteínas recombinantes por el IR.
La FIG. 3 representa la inhibición de las proteínas recombinantes y ONC a causa del IR citoplasmático. El ensayo se llevó a cabo incubando las proteínas recombinantes que se indican, con o sin IR, en presencia del sustrato (rRNA). Si la proteína recombinante escapa al IR como es el caso de la ONC (control positivo), el sustrato se degrada tanto en ausencia como en presencia del inhibidor. PE5, PE10 y SLNPE5, no degradan el sustrato en presencia del inhibidor, lo que indica que estas proteínas son sensibles al IR.
De estos resultados se deduce que la actividad citotóxica de las variantes es independiente del IR.
2.3. Degradación de RNA nuclear y citoplasmático por las proteínas
recombinantes. La FIG. 4 muestra los resultados de los ensayos de degradación de RNA nuclear a causa de la acción de las proteínas recombinantes realizada tal y como se indica en el apartado 1 .5. Como se puede observar en la figura, SLNPE5 degrada RNA nuclear, mientras que deja intacto el RNA
citoplasmático (resultados no mostrados). En cambio, la ONC no degrada el RNA nuclear. Del conjunto de los resultados de las figuras 4 y 5 se deduce que la actividad citotóxica de las variantes PE5, PE10 y SLNPE5, al contrario que la de la ONC, es consecuencia de su eficiente importación al núcleo y no de su capacidad para escapar al IR. Dado que no existe diferencia alguna entre la sensibilidad al IR entre estas tres variantes, la elevada citotoxicidad que presenta SLNPE5 frente a PE5 y PE10 ha de ser consecuencia de una importación más eficiente al núcleo. B. Ensayos in vivo
1 . Determinación de la toxicidad sistémica de SLNPE5
Para evaluar la capacidad antitumoral de SLNPE5 en modelos animales murinos portadores de tumores humanos se determinó en primer lugar la toxicidad sistémica de esta RNasa en ratones (Harían Laboratories Inc.) hembra atímicos nude de entre 6-8 semanas de edad y con un peso aproximado de 25 g. Para realizar dicho estudio se trataron cuatro grupos de 3 ratones con concentraciones crecientes de SLNPE5 (5, 20, 40 y 80 mg/kg) disuelta en 0.6 mi de PBS y filtrada utilizando filtros de 0,2 μιτι y de baja retención de proteína. Paralelamente se inyectó el mismo volumen de PBS a un quinto grupo de 3 ratones que se utilizó como control. Para empezar se administró por vía intraperitoneal una sola inyección de las distintas dosis de SLNPE5 y el estado general de los animales (actividad, aspecto físico, peso) se supervisó diariamente para detectar la presencia de signos de malestar.
No obstante, todas las dosis de SLNPE5 inyectadas mostraron una alta tolerabilidad, de manera que se inició la administración intraperitoneral de SLNPE5 dos veces por semana durante dos semanas. Nuevamente ninguna de las concentraciones utilizadas provocó una pérdida de peso superior al 10% ni ningún otro signo de malestar (FIG. 5), de manera que todos los animales fueron sacrificados 46 días después de la primera administración de la RNAsa. Así pues, debido a la alta tolerabilidad de SLNPE5 no se consideró necesario determinar la máxima dosis tolerada y se ha establecido la dosis de 80 mg/kg como la dosis máxima aplicable.
2. Evaluación de la eficacia antitumoral de NLSPE5 Para determinar la efectividad antitumoral de SLNPE5 sobre xenoinjertos se seleccionó la línea de cáncer de pulmón NCI-H460. Esta línea tumoral es la que ha había presentado una de las mayores sensibilidades a SLNPE5 en ensayos realizados in vitro. Para evaluar in vivo la actividad antitumoral se estudió el efecto de SLNPE5 sobre la supervivencia y el tamaño tumoral. Para ello se anestesiaron los animales con isofluorano y se inyectaron por vía subcutánea 2x106 de células en 0,2 mi de PBS en los flancos izquierdo y derecho de un mismo ratón. Dado que la eficacia de implantación de las líneas tumorales no es del 100%, se inocularon 15 ratones para obtener así 12 ratones implantados. El estado de los animales se supervisó tres veces por semana. Una vez el tumor alcanzó un volumen de 0,05-0,1 cm3, los ratones fueron asignados de forma aleatoria a dos grupos de 6 animales los cuales fueron tratados con 80 mg/kg de SLNPE5 (dosis máxima aplicable) o bien con PBS en el caso de los animales control. La administración de SLNPE5 se realizó por vía intraperitoneal dos veces por semana durante tres semanas. Los ratones se supervisaron diariamente y tres veces por semana se midió el tumor y el peso del animal. Se están analizando muestras del tumor y de distintos órganos como el riñon y el hígado para realizar estudios de los mismos en el laboratorio.
Resultados preliminares indican que SNLPE5 incrementó la supervivencia de los animales tratados versus los animales control y produjo un crecimiento más lento del tumor.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende (a) una secuencia derivada de la ribonucleasa pancreática humana (RNasa-PH) de
5 secuencia SEC ID NO: 37, dicha secuencia derivada estando fusionada a través de su extremo N-terminal a (b) una secuencia de localización nuclear convencional.
2. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la0 secuencia derivada de la RNasa-PH comprende una secuencia de
localización nuclear discontinua no convencional.
3. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde la secuencia derivada de la RNasa-PH contiene al menos una5 modificación en al menos una de las siguientes regiones de la SEC ID NO:
37:
Figure imgf000031_0001
donde los subíndices indican la posición del amino ácido en la SEC ID NO: 37. 0 4 Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 -3, en la que la secuencia derivada de RNasa-PH comprende una secuencia que presenta al menos un 90% de homología con la SEC ID NO: 9. 5 5. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que la secuencia derivada de RNasa-PH comprende una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la SEC ID NO: 9.
6. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la que la secuencia que presenta al menos un 90% de homología o identidad con la SEC ID NO: 9 tiene la misma longitud que la SEC ID NO: 9.
7. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la secuencia derivada de RNasa-PH comprende una secuencia de localización nuclear discontinua no convencional definida por los aminoácidos K-i , R3 , R32, R33, Rsg, R90 y R91 , donde los subíndices indican la posición del amino ácido en la SEC ID NO: 9.
8. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde SEC ID NO: 9 comprende al menos una de las siguientes modificaciones:
Q por E en el amino ácido situado en la posición 9,
D por G en el amino ácido situado en la posición 16, y
S por N en el amino ácido situado en la posición 17 9. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en la que la secuencia derivada de RNasa-PH comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 9.
10. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la secuencia derivada de RNasa-PH comprende la secuencia de aminoácidos
SEC ID NO: 13.
1 1 . Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, donde la secuencia de localización nuclear convencional se selecciona del grupo que consiste en las secuencias SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.
12. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
9 y 1 1 , que consiste en la secuencia SEC ID NO: 10.
13. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
10 y 1 1 , que consiste en la secuencia SEC ID NO: 14.
14. Composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de una proteína recombinante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables.
15. Proteína recombinante según se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 -13, para uso como medicamento. 16. Proteína recombinante según se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 -13 para su uso en el tratamiento del cáncer.
17. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, para uso en el tratamiento de cáncer con fenotipo de multiresistencia a medicamentos.
18. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 17, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer de hígado.
19. Proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 16-18 para uso en combinación con otro agente.
20. Procedimiento para la construcción de una proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende: a) introducir la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37 en un vector de expresión, donde dicho vector contiene los elementos necesarios para llevar a cabo la expresión del gen contenido en dicho vector; b) incorporar en el vector resultante del paso (a) una cadena de nucleótidos que codifica para una secuencia de localización nuclear convencional en el extremo de la secuencia que codifica para la región N-terminal de la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37, donde dicha incorporación se lleva a cabo mediante técnicas de mutagénesis; c) modificar mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 37 comprendida en el vector resultante del paso (b) de modo que se obtiene la secuencia que codifica la secuencia derivada de SEQ ID NO: 37; y d) llevar a cabo la expresión del vector resultante del paso (c).
21 . Molécula de ADN aislada que codifica para la proteína recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -13.
22. Vector de expresión que comprende una molécula de ADN como se define en la reivindicación 21 .
23. Célula hospedadora que comprende el vector de expresión definido en la reivindicación 22.
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