ES2942318T3 - Proteína modificada - Google Patents

Abstract

La presente divulgación es una cohorte de moléculas de unión a ácido siálico que comprenden uno o más módulos de unión a carbohidratos modificados (CBM). Los CBM modificados reducen el riesgo de eventos adversos relacionados con la respuesta inmune del huésped y/o la producción de anticuerpos antidrogas (ADA). Los CBM modificados pueden usarse en terapia o como medicamentos y encontrar una aplicación específica como moléculas para la modulación de una respuesta inmune y/o crecimiento celular. Los CBM modificados también se pueden usar como adyuvantes, por ejemplo, adyuvantes de mucosas y en el tratamiento y/o prevención de cáncer, sepsis y/o enfermedades causadas o a las que contribuye un patógeno que se une a receptores que contienen ácido siálico de la superficie celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína modificada

Campo

La presente divulgación proporciona moléculas de unión al ácido siálico y usos (incluidos los usos médicos) de las mismas.

Antecedentes

Los módulos de unión a hidratos de carbono (CBM, Carbohydrate Binding Modules) que se unen al ácido siálico (incluidos los derivados de Vibrio cholerae y Streptococcus pneumoniae y sus formas multivalentes) han demostrado ser eficaces agentes antimicrobianos, y algunos han demostrado proteger a los ratones contra una exposición letal del virus de la gripe H7N9. El agente biológico, Sp2CBMTD, contiene dos copias de un dominio CBM de la Familia 40 de la neuraminidasa A de S. pneumoniae (SpCBM) fusionado genéticamente con el dominio de trimerización de la pseudominidasa de Pseudomonas aeruginosa (PaTD). La proteína se ensambla a través del dominio de trimerización para formar un oligómero que contiene seis copias de SpCBM.

Sin embargo, con cualquier tratamiento a base de proteínas, existe un riesgo de que se produzcan efectos adversos asociados a las respuestas inmunitarias del paciente hacia el agente biológico. En algunos casos, el agente biológico puede inducir la producción de anticuerpos anti-fármaco (ADA, Anti-Drug Antibodies) que pueden dar lugar a la formación de complejos inmunitarios (CI) entre el ADA y el fármaco. La presencia de dichos complejos puede reducir la eficacia o alterar la semivida del agente terapéutico, o podría provocar efectos adversos como reacciones de hipersensibilidad.

Hay una serie de factores que influyen en la inmunogenicidad de una proteína. Un determinante clave es la presencia de epítopos intrínsecos que pueden desencadenar acontecimientos dependientes de los linfocitos T que conducen a la producción de anticuerpos. Los linfocitos T reconocen fragmentos peptídicos cortos derivados del procesamiento del antígeno proteico que ocurre dentro de una célula presentadora de antígeno (APC, Antigen-Presenting Cell). Algunos de estos fragmentos formarán complejos con el antígeno leucocitario humano (HLA, Human Leukocyte Antigen)/moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, Major Histocompatibility Complex), y, si la unión es lo suficientemente estable, serán llevados a la superficie de la APC y presentados a los linfocitos T. El reconocimiento del péptido no propio por parte del receptor de linfocitos T desencadena la respuesta inmunitaria subsiguiente.

Sumario

Los aspectos de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización o ejemplo que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se proporciona a modo de referencia de los antecedentes.

Las moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento pueden comprender uno o más módulos de unión a hidratos de carbono (CBM) modificados.

Como se ha indicado, con cualquier tratamiento a base de proteínas, existe el riesgo de que se produzcan efectos adversos asociados a las respuestas inmunitarias del paciente hacia el agente biológico. El agente biológico puede provocar la producción de anticuerpos anti-fármaco (ADA) que pueden dar lugar a la formación de complejos inmunitarios (CI) entre el ADA y el fármaco. La presencia de dichos complejos puede reducir la eficacia, alterar la semivida del agente terapéutico o podría provocar efectos adversos tales como reacciones de hipersensibilidad. Los CBM divulgados han sido objeto de modificaciones para reducir el riesgo de estos efectos adversos.

Los módulos de unión a hidratos de carbono se clasifican en familias y los CBM clasificados como los CBM miembros de la Familia 40 (CBM40) pueden ser útiles en la fabricación de las moléculas modificadas descritas en el presente documento. Los CBM de la Familia 40 abarcan moléculas de aproximadamente 200 restos y, a menudo, se encuentran en el extremo N-terminal de las sialidasas GH33. También se pueden encontrar insertados en la hélice p de las sialidasas GH33.

Como tales, las moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento pueden comprender uno o más módulos de unión a hidratos de carbono de la Familia 40 (CBM40) modificados.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión "que comprende" se utiliza para indicar que las realizaciones "comprenden" las características indicadas y, como tales, también pueden incluir otras características. Sin embargo, la expresión "que comprende" también puede abarcar realizaciones que "consisten esencialmente en" las características pertinentes o "que consisten en" las características pertinentes.

En vista de lo anterior, la divulgación puede abarcar moléculas, por ejemplo, moléculas mayores, que comprendan un componente de unión al ácido siálico. Como se ha indicado, ese componente de unión al ácido siálico (es decir, la molécula de unión al ácido siálico) puede comprender (consistir o consistir esencialmente en) un CBM modificado, por ejemplo, un CBM40 modificado. A modo de ejemplo (no limitante), las moléculas de esta divulgación pueden no solo presentar la capacidad de unirse al ácido siálico, sino que también pueden tener una o más funciones. Por ejemplo, las moléculas pueden tener actividad enzimática. Por ejemplo, una molécula útil puede comprender un CBM modificado (como se describe en el presente documento) y presentar alguna actividad de sialidasa.

En un ejemplo, el CBM puede no proporcionarse como parte de, o estar comprendido en, una molécula con actividad enzimática (por ejemplo, sialidasa).

Una molécula de unión al ácido siálico útil puede ser una proteína de fusión que comprenda una parte enzimática y una parte de unión al ácido siálico, en donde la parte de unión al ácido siálico comprende un CBM modificado como se describe en el presente documento. En dichos casos, la parte enzimática se puede fusionar con la parte de unión al ácido siálico. Como se ha indicado, la parte enzimática de cualquier proteína de fusión útil puede comprender (o tener o presentar) actividad sialidasa.

El término "modificado" abarca moléculas que contienen una o más mutaciones con respecto a una secuencia de referencia.

Una "secuencia de referencia" puede ser cualquier secuencia de CBM de tipo natural. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de c Bm de la familia 40 de tipo natural, p. ej., las secuencias de CBM de tipo natural de NanH sialidasa de Vibrio cholerae o de NanA sialidasa de Streptococcus pneumoniae (se debe tener en cuenta que los CBM similares u homólogos (incluidos los CBM40) presentes en otros organismos deben incluirse dentro del alcance del término "CBM" y/o como secuencias de referencia de CBM).

Por consiguiente, una secuencia de CBM modificada puede derivar de un CBM de tipo natural específico o particular.

Una secuencia de CBM modificada puede comprender una secuencia de CBM de tipo natural que incluya una o más mutaciones.

La una o más mutaciones pueden ser funcionales, es decir, pueden modular (alterar, mejorar o suprimir/inhibir) individual (y/o independientemente) o en conjunto (por ejemplo, sinérgicamente) una o más de las propiedades fisiológicas, biológicas, inmunitarias y/o farmacológicas características de un CBM de tipo natural (por ejemplo, el CBM de tipo natural del que deriva el CBM modificado). En particular, la una o más mutaciones pueden:

(i) alterar la inmunogenicidad (o antigenicidad) del CBM; y/o

(ii) alterar (por ejemplo, mejorar) la eficacia (del CBM o de cualquier molécula multimérica que comprenda un CBM modificado) y/o

(iii) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la termoestabilidad del CBM; y/o

(iv) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la solubilidad del CBM; y/o

(v) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la semivida in vivo de la molécula.

Una "mutación" puede incluir cualquier alteración de la molécula de CBM de tipo natural. Por ejemplo, el término "mutación" puede abarcar, por ejemplo:

(i) una o más sustituciones de aminoácidos (donde uno o más de los aminoácidos de tipo natural se intercambian o cambian por otro aminoácido (diferente); el término "sustituciones" incluiría sustituciones conservadoras de aminoácidos); y/o

(ii) una o más deleciones de aminoácidos (donde se eliminan uno o más de los restos de aminoácidos de tipo natural); y/o

(iii) una o más adiciones/inserciones de aminoácidos (donde se añaden restos de aminoácidos adicionales a una secuencia primaria de tipo natural (o de referencia)); y/o

(iv) una o más inversiones de secuencia/aminoácidos (normalmente donde se invierten dos o más aminoácidos consecutivos en una secuencia primaria); y/o

(v) una o más duplicaciones de secuencias/aminoácidos (donde se repite un aminoácido o una parte de la secuencia de aminoácidos primaria (por ejemplo, un tramo de 5-10 aminoácidos)).

Como se ha indicado, un CBM modificado de acuerdo con esta divulgación puede comprender una o más de las mutaciones descritas en el presente documento.

Un CBM de tipo natural ilustrativo (en otras palabras, una secuencia de referencia de la que se puede derivar un CBM modificado útil) es NanA sialidasa de Streptococcus pneumoniae, cuya secuencia de aminoácidos se ha depositado con el número de acceso P62575 y se reproduce a continuación como la SEQ ID NO: 1 (1035 aminoácidos).

SEQ ID NO: 1

MSYFRNRDID IERNSMNRSV QERKCRYSIR KLSVGAVSMI VGAVVFGTSP VLAQEGASEQ

PLANETQLSG ESSTLTDTEK SQPSSETELS GNKQEQERKD KQEEKIPRDY YARDLENVET

VIEREDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVSSATKKD

EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR

LYVNGVLSRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE

VQKRSQLFKR SDLEKKLPEG AALTEKTDIF ESGRNGKPNK D G IK SY R IPA LLKTDKGTLI

AGADERRLHS SDWGDIGMVI RRSEDNGKTW GDRVTITNLR DNPKASDPSI GSPVNIDMVL

VQDPETKRIF SIYDMFPEGK GIFGMSSQKE EAYKKIDGKT YQILYREGEK GAYTIRENGT

VYTPDGKATD YRVVVDPVKP AYSDKGDLYK GNQLLGNIYF TTN K TSPFR I AKDSYLWMSY

SDDDGKTWSA PQDITPMVKA DWMKFLGVGP GTGIVLRNGP HKGRILIPVY TTNNVSHLNG

S Q S S R IIY S D DHGKTWHAGE AVNDNRQVDG QK1HSSTMNN RRAQNTESTV VQLNNGDVKL

FMRGLTGDLQ VATSKDGGVT WEKDIKRYPQ VKDVYVQMSA IHTMHEGKEY IILSN A G G PK

RENGMVHLAR VEENGELTWL KHNPIQKGEF AYNSLQELGN GEYGILYEHT EKGQNAYTLS

FRKFNWDFLS KDLISPTEAK VKRTREMGKG VIGLEFDSEV LVNKAPTLQL ANGKTARFMT

QYDTKTLLFT VDSEDMGQKV TGLAEGAIES MHNLPVSVAG TKLSNGMNGS EAAVHEVPEY

TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTAGEE AAPTVEKPEF

TGGVNGTEPA VHEIAEYKGS DSLVTLTTKE DYTYKAPLAQ QALPETGNKE SDLLASLGLT

AFFLGLFTLG KKREQ

La región de CBM de la SEQ ID NO: 1 es del resto de aminoácido 121 a 305; y esta secuencia se denomina SEQ ID NO: 2 (siendo esa secuencia: VIEKEDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVS-SATKKD EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR LYVNGVL­ SRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE VQKRS).

Por lo tanto, esta divulgación proporciona moléculas de unión al ácido siálico que comprenden formas modificadas de la SEQ ID NO: 2 (y/o la SEQ ID NO: 1). Una forma modificada de la SEQ iD NO: 2 puede comprender uno o más restos mutados, siendo las mutaciones, por ejemplo, sustituciones, adiciones/inserciones, duplicaciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos realizadas con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 2.

Una secuencia de aminoácidos de NanH sialidasa de Vibrio cholerae ilustrativa se deposita con el número de acceso A5F7A4 y se reproduce a continuación como la SEQ ID NO: 3 (781 aminoácidos).

SEQ ID NO: 3

MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA

DGMPAWLVQG IGGRAQWTYS LSTNQHAQAS SFGWRMTTEM KVLSGGMITN YYANGTQRVL

P IISLD SSG N LVVEFEGQTG RTVLATGTAA TEYHKFELVF LPGSNPSASF YFDGKLIRDN

IQPTASKQNM IVWGNGSSNT DGVAAYRDIK FEIQGDVIFR GPDRIPSIVA SSVTPGVVTA

FAEKRVGGGD PGALSNTNDI ITRTSRDGGI TWDTELNLTE QINVSDEFDF SDPRPIYDPS

SNTVLVSYAR WPTDAAQNGD RIKPWMPNGI FYSVYDVASG NWQAPIDVTD QVKERSFQIA

GWGGSELYRR NTSLNSQQDW QSNAKIRIVD GAANQIQVAD GSRKYVVTLS IDESGGLVAN

LNGVSAPIIL QSEHAKVHSF HDYELQYSAL NHTTTLFVDG QQITTWAGEV SQENNIQFGN

ADAQIDGRLH VQKIVLTQQG HNLVEFDAFY LAQQTPEVEK DLEKLGWTKI KTGNTMSLYG

NASVNPGPGH GITLTRQQNI SGSQNGRLIY PAIVLDRFFL NVMSIYSDDG GSNWQTGSTL

PIPFRWKSSS ILETLEPSEA DMVELQNGDL LLTARLDFNQ IVNGVNYSPR QQFLSKDGGI

TWSLLEANNA NVFSNISTGT VDASITRFEQ SDGSHFLLFT NPQGNPAGTN GRQNLGLWFS

FDEGVTWKGP IQLVNGASAY SDIYQLDSEN AIVIVETDNS NMRILRMPIT LLKQKLTLSQ

N

La región de CBM de la SEQ ID NO: 3 es del resto de aminoácido 25 a 216; y esta secuencia puede ser la SEQ ID NO: 4 (siendo esa secuencia: ALFDYNATGD TEFDSPAKQG WMQDNTNNGS GVLTNADGMP AWLVQGIGGR AQWTYS-LSTN QHAQASSFGW RMTTEMKVLS GGMITNYYAN GTQRVLPIIS LDSSGNLVVE FEGQTGRTVL ATGTAATEYH KFELVFLPGS NPSASFYFDG KLIRDNIQPT ASKQNMIVWG NGSSNTDGVA AY).

Por lo tanto, esta divulgación proporciona moléculas de unión al ácido siálico que comprenden formas modificadas de la SEQ ID NO: 4 (y/o la SEQ ID NO: 3). Una forma modificada de la SEQ ID NO: 4 puede comprender uno o más restos mutados, siendo las mutaciones, por ejemplo, sustituciones, adiciones/inserciones, duplicaciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos realizadas con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

Como se ha indicado, las moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento pueden comprender uno o más (por ejemplo, dos o más) CBM modificados. Cuando las moléculas de unión al ácido siálico comprenden dos o más CBM modificados, la molécula puede denominarse CBM multivalente. Una molécula de unión al ácido siálico que es (o comprende) un CBM multivalente, puede prepararse como una construcción que comprenda varios (dos o más) CBM modificados unidos por conectores aminoacídicos/peptídicos. Cada CBM modificado puede estar unidos a otro por, por ejemplo, péptidos que comprenden 5, 10 o 15 aminoácidos. A modo de ejemplo, se puede utilizar uno cualquiera o más de los siguientes péptidos para unir dos o más CBM a fin de producir una molécula de unión al ácido siálico que sea un CBM multivalente:

(i) conectores de ALXGS

5 aminoácidos: LQALG

GGXSG

GGALG

(ii) conectores de GGSLG

10 aminoácidos: ALXGSGGGSG

(iii) conectores de LQALGGGGSL

15 aminoácidos: ALXGSGGGSGGGGSG

donde "X" es cualquier aminoácido.

Las moléculas de unión al ácido siálico para usar pueden comprender además uno o más dominios de oligomerización. Al igual que el componente CBM de las moléculas de unión al ácido siálico divulgadas, los dominios de oligomerización pueden proceder de dominios de oligomerización de tipo natural y, por lo tanto, pueden comprender una o más mutaciones con respecto a una secuencia de dominio de oligomerización de tipo natural correspondiente. Los dominios de oligomerización útiles presentan la capacidad de autoasociarse para formar estructuras multiméricas, por ejemplo, trímeros. Un dominio de oligomerización modificado para usar puede comprender cualquier molécula con esa misma propiedad de oligomerización. Para disipar cualquier duda, la expresión "dominio de oligomerización" como se usa en el presente documento no solo abarca los dominios de oligomerización de tipo natural, sino también aquellos que están modificados (los "dominios de oligomerización modificados" descritos en el presente documento).

Por ejemplo, una molécula de unión al ácido siálico de acuerdo con esta divulgación puede comprender uno o más (por ejemplo, dos) CBM (por ejemplo, uno, dos o más CBM modificados como se describe en el presente documento) unidos, acoplados o fusionados a un dominio de oligomerización. La molécula de unión al ácido siálico resultante es una "fusión" de CBM::dominio de oligomerización (multimérica).

Los dominios de oligomerización adecuados pueden incluir los que se pueden obtener de la pseudominidasa de Pseudomonas aeruginosa. Una secuencia de aminoácidos de la pseudominidasa de Pseudomonas aeruginosa ilustrativa se ha depositado con el número de acceso Q9L6G4 (derivada de la cepa PAO579) y se reproduce a continuación como la SEQ ID NO: 13 (438 aminoácidos). Debe apreciarse que dominios de oligomerización similares, homólogos u otros útiles pueden englobarse dentro del ámbito de la expresión general "dominio de oligomerización".

SEQ ID NO: 1

MNTYFDIPHR LVGKALYESY YDHFGQMDIL SDGSLYLIYR RATEHVGGSD GRVVFSKLEG

GIWSAPTIVA QAGGQDFRDV AGGTMPSGRI VAASTVYETG EVKVYVSDDS GVTWVHKFTL

ARGGADYNFA HGKSFQVGAR YVIPLYAATG VNYELKWLES SDGGETWGEG STIYSGNTPY

NETSYLPVGD GVILAVARVG SGAGGALRQF ISLDDGGTWT DQGNVTAQNG DSTDILVAPS

LSYIYSEGGT PHVVLLYTNR TTHFCYYRTI LLAKAVAGSS GWTERVPVYS APAASGYTSQ

VVLGGRRILG NLFRETSSTT SGAYQFEVYL GGVPDFESDW FSVSSNSLYT LSHGLQRSPR

RVVVEFARSS SPSTWNIVMP SYFNDGGHKG SGAQVEVGSL NIRLGTGAAV WGTGYFGGID

NSATTRFATG YYRVRAWI

El dominio de oligomerización de la SEQ ID NO: 13 es del resto de aminoácido 333 a 438, y esta secuencia puede ser la SEQ ID NO: 14 (siendo esa secuencia: VPDFESDWFS VSSNSLYTLS HGLQRSPRRV VVEFARSSSP STWNIVMPSY FNDGGHKGSG AQVEVGSLNI RLGTGAAVWG TGYFGGIDNS ATTRFATGYY RVRAWI).

Como se ha indicado, la divulgación puede hacer uso de dominios de oligomerización modificados. Un dominio de oligomerización modificado puede comprender un dominio de oligomerización que contenga una o más mutaciones con respecto a una secuencia de oligomerización de referencia.

Una "secuencia de oligomerización de referencia" puede ser cualquier secuencia de dominio de oligomerización de tipo natural, incluyendo, por ejemplo, las SEQ ID NO: 13 y 14 anteriores.

Por consiguiente, un dominio de oligomerización modificado puede derivar de un dominio de oligomerización de tipo natural específico o particular.

Una secuencia de dominio de oligomerización modificado puede comprender una secuencia de dominio de oligomerización de tipo natural que incluya una o más mutaciones.

La una o más mutaciones pueden ser funcionales, es decir, pueden modular (mejorar o suprimir/inhibir) individual (y/o independientemente) o en conjunto (por ejemplo, sinérgicamente) una o más de las propiedades fisiológicas, inmunitarias, biológicas y/o farmacológicas características de un dominio de oligomerización de tipo natural (por ejemplo, el dominio de oligomerización de tipo natural del que deriva el dominio de oligomerización modificado). Como se ha indicado anteriormente, la(s) mutación(es) puede(n)

(i) alterar la inmunogenicidad (o antigenicidad) del dominio de oligomerización; y/o

(ii) mejorar la eficacia (de, por ejemplo, moléculas multiméricas que comprenden uno o más CBM modificados); y/o

(iii) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la termoestabilidad del dominio de oligomerización; y/o

(iv) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la solubilidad del dominio de oligomerización; y/o

(v) pueden modular (por ejemplo, mejorar) la semivida in vivo del dominio de oligomerización.

En el contexto de un dominio de oligomerización modificado, el término "mutación" es como se ha definido anteriormente.

En todos los casos, las mutaciones pueden modular una propiedad inmunitaria/antigénica de un CBM o dominio de oligomerización o una molécula de unión al ácido siálico que comprende el mismo.

Hay una serie de factores que influyen en la inmunogenicidad de una proteína. Un determinante clave es la presencia de epítopos intrínsecos que pueden desencadenar acontecimientos dependientes de los linfocitos T que conducen a la producción de anticuerpos. Los linfocitos T reconocen fragmentos peptídicos cortos derivados del procesamiento del antígeno proteico que ocurre dentro de una célula presentadora de antígeno (APC, Antigen-Presenting Cell). Algunos de estos fragmentos formarán complejos con el antígeno leucocitario humano (HLA)/moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (^m H^c ), y, si la unión es lo suficientemente estable, serán llevados a la superficie de la APC y presentados a los linfocitos T. El reconocimiento del péptido no propio por parte del receptor de linfocitos T desencadena la respuesta inmunitaria subsiguiente. Como tales, para proporcionar CBM que sean menos inmunogénicos, los dominios de oligomerización y/o CBM de tipo natural pueden analizarse para identificar aquellas regiones que sean inmunogénicas/antigénicas (es decir, regiones o dominios que es probable que alberguen o contengan epítopos inmunológicos). La inmunogenicidad (o antigenicidad) es una propiedad que puede evaluarse en relación con, por ejemplo, un hospedador humano o animal particular; en otras palabras, se puede analizar un CBM y/o dominio de oligomerización para determinar qué regiones o dominios pueden ser inmunogénicos/antigénicos en un hospedador específico (por ejemplo, humano). La inmunogenicidad (o antigenicidad) puede evaluarse mediante, por ejemplo, técnicas de cribado informáticas (cribado de, por ejemplo, epítopos de linfocitos T: incluyendo (como ejemplo) análisis informáticos ProPred), ensayos de proliferación de linfocitos T (incluido el ensayo de proliferación de linfocitos T de donantes humanos Proimmune) y otras técnicas inmunológicas. Se puede obtener más información sobre los métodos para "desinmunizar" una proteína en Jawa V., et al. ((2013) T-cell dependent immunogenicity of protein therapeutics: Preclinical assessment and mitigation. Clin Immunol. 149, 534-555) y Singh H. y Raghava GP ((2001) ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17(12), 1236-7).

Utilizando estas técnicas, ha sido posible identificar regiones inmunogénicas/antigénicas tanto de los CBM como de los dominios de oligomerización. La Figura 1 muestra un análisis completo (predicciones de ProPred) de las regiones antigénicas dentro de una secuencia de SpCBM (Figura 1A) y una secuencia de PaTD (Figura 1B). Los aglutinantes previstos son de color azul, mostrándose el primer resto de cada región de unión en rojo. Los péptidos antigénicos previstos (barras verdes) y Prolmmune (barras moradas) se muestran debajo de las secuencias.

Por ejemplo, dentro de la molécula de SpCBM, se han identificado diferentes regiones entre los restos 127 a 300 (como se muestra en la Figura 1A) que albergan dominios inmunogénicos/antigénicos. Por ejemplo, regiones que abarcan los restos 127-135, 146-154, 154-166, 158-166, 143-151, 149-157, 167-176, 167-178, 182-196, 188-196, 185­ 193, 204-212, 213-221, 220-228, 239-246, 239-254, 241-249, 242-249, 241-250, 241-251, 239-251, 239-249, 239­ 247, 246-254, 243-251, 257-265, 267-275, 284-300, 284-299, 284-297, 286-284, 286-300 y 289-296 han sido identificadas como potencialmente inmunogénicas (algunos de los cuales se prevé que se unan a un pequeño número de alelos, mientras que otros se consideran moderadamente o altamente inmunogénicos).

Más concretamente (y utilizando los ensayos informáticos e inmunológicos [proliferación de linfocitos T] descritos anteriormente) las regiones que abarcan los restos:

167 a 178 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia: FYNLFSVSSATK)

167 a 181 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia: FYNLFSVSSATKKDE)

239 a 251 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia: VRLYVNGVLSRTS)

236 a 250 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia KGRVRLYVNGVLSRT)

245 a 254 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia: GVLSRTSLRS)

286 a 294 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, secuencia IRNLTVYNR)

se han identificado como inmunogénicas/antigénicas. Cabe señalar que se ha identificado que la región que abarca los restos 245 a 254 representa un área de inmunogenicidad significativa.

Dentro del dominio de oligomerización de PaTD, se ha identificado que las regiones entre los restos 336 a 424 albergan dominios inmunogénicos/antigénicos. Por ejemplo, las regiones que abarcan los restos 336-344, 340-348, 341-349, 348-356, 353-363, 355-363, 355-370, 362-370, 362-370/371, 375-383, 375-390, 400-407, 402-410, 397-405, 403-410 y 416-424 se han identificado como potencialmente inmunogénicos (algunos de los cuales se prevé que se unan a un pequeño número de alelos, mientras que otros se consideran moderadamente o altamente inmunogénicos). A modo de ejemplo no limitante, los restos 338 a 352 de la SEQ ID NO: 13 han sido identificados como vehículos de dominios inmunogénicos/antigénicos.

Más concretamente (y utilizando los ensayos informáticos e inmunológicos [proliferación de linfocitos T] descritos anteriormente) las regiones que abarcan los restos:

340 a 349 de la SEQ ID NO: 13 (es decir, secuencia: WFSVSSNSLY)

351 a 359 de la SEQ ID NO: 13 (es decir, secuencia: LSHGLQRSP)

398 a 406 de la SEQ ID NO: 13 (es decir, secuencia: GSLNIRLGT)

392 a 406 de la SEQ ID NO: 13 (es decir, secuencia: GAQVEVGSLNIRLGT)

338 a 352 de la SEQ ID NO: 13 (es decir, secuencia: SDWFSVSSNSLYTLS)

se han identificado como inmunogénicas/antigénicas. Cabe señalar que las regiones que abarcan los restos 340-349, 351-359 y 398-406 se identificaron como áreas de inmunogenicidad significativa.

En conjunto, estas regiones (tanto del CBM como del dominio de oligomerización) se denominarán regiones de "inmunogenicidad/antigenicidad".

Por consiguiente, se puede generar un CBM y/o una oligomerización modificados para usar mediante la mutación (por ejemplo, sustitución, deleción, adición a, inversión y/o duplicación) de uno o más de los restos de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) de dentro de, por ejemplo, las regiones de inmunogenicidad/antigenicidad identificadas anteriormente.

Por tanto, un dominio de oligomerización o CBM modificados de acuerdo con esta divulgación puede comprender un perfil de inmunogenicidad (o antigenicidad) modificado. En otras palabras, en comparación con un CBM o un dominio de oligomerización de tipo natural, un CBM/dominio de oligomerización modificado de acuerdo con esta divulgación puede ser menos (o no ser igual de) inmunogénico/antigénico en un hospedador humano o animal. Un experto apreciará que las mutaciones introducidas en la secuencia primaria de aminoácidos de un CBM o un dominio de oligomerización, puede modular la inmunogenicidad haciendo que determinados epítopos sean más o menos inmunogénicos.

Por tanto, en un ejemplo, la divulgación proporciona un método para obtener un CBM con un perfil inmunitario modificado, comprendiendo dicho método, determinar qué regiones o dominios de una secuencia/estructura de aminoácidos primaria, secundaria y/o terciaria de un CBM son inmunogénicos, y mutar uno o más de los restos o secuencias de aminoácidos de dentro de una o más de las regiones o dominios inmunogénicos/antigénicos determinados.

Asimismo, la divulgación proporciona un CBM modificado que se puede obtener mediante un método para obtener un CBM con un perfil inmunitario modificado (como se ha descrito anteriormente).

Asimismo, la divulgación proporciona un método para obtener un dominio de oligomerización con un perfil inmunitario modificado, comprendiendo dicho método, determinar qué regiones o dominios de una secuencia/estructura de aminoácidos primaria, secundaria y/o terciaria de un dominio de oligomerización o CBM son inmunogénicos, y mutar uno o más de los restos o secuencias de aminoácidos de uno o más de las regiones o dominios inmunogénicos/antigénicos determinados.

Asimismo, la divulgación proporciona un dominio de oligomerización modificado que se puede obtener mediante un método para obtener un dominio de oligomerización con un perfil inmunitario modificado (como se ha descrito anteriormente).

La divulgación proporciona además un método para obtener un CBM multimérico modificado. El método puede comprender:

obtener al menos un CBM con un perfil inmunitario modificado como se ha establecido anteriormente; y opcionalmente obtener un dominio de oligomerización con un perfil inmunitario modificado como se ha establecido anteriormente; y

crear un CBM multimérico que comprenda al menos un CBM modificado.

La inmunogenicidad/antigenicidad del CBM/dominio de oligomerización puede estar sujeta a mutaciones de aminoácidos individuales. Por ejemplo, un resto de aminoácido específico puede reemplazarse (sustituirse con otro) o eliminarse. Para predecir el efecto de cualquier mutación dada, se puede introducir una secuencia modificada (la secuencia que contiene al menos una mutación frente a una secuencia de referencia) en, por ejemplo, un programa diseñado para identificar secuencias inmunogénicas (incluyendo, por ejemplo, regiones de unión al MHC dentro de una secuencia antigénica). Un experto estará familiarizado con los programas y sistemas adecuados, pero ProPred es un ejemplo: el objetivo de este servidor es predecir las regiones de unión de MHC de clase II en una secuencia antigénica, utilizando matrices cuantitativas derivadas de la información publicada por Sturniolo et al., 1999. El servidor ayudará a localizar regiones de unión promiscuas.

El usuario tratará de identificar aquellas mutaciones que puedan tener un efecto sobre la inmunogenicidad/antigenicidad del CBM/dominio de oligomerización, pero que al mismo tiempo no afecten la estructura de la proteína (que puede ser crucial para la propiedad de unión al ácido siálico del CBM y para la propiedad de oligomerización del dominio de oligomerización). Por ejemplo, el CBM modificado descrito en el presente documento puede mantener la afinidad de unión por la sialilactosa de acuerdo con lo evaluado mediante, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance).

Basándose en lo anterior y usando la molécula de SpCBM como ejemplo, se pueden mutar uno o más de los siguientes restos:

Resto(s) 167 (F), 168 (Y), 169 (N), 170 (L), 171 (F), 172 (S), 173 (V), 174 (S), 175 (S), 176 (A), 177 (T), 178 (K), 179 (K), 180 (D), 181 (E), 236 (K), 237 (G), 238 (R), 239 (V), 240 (R), 241 (L), 242 (Y), 243 (V), 244 (N), 245 (G), 246 (V), 247 (L), 248 (S), 249 (R), 250 (T), 251 (S), 252 (L), 253 (R), 254 (S), 286 (I), 287 (R), 288 (N), 289 (L), 290 (T), 291 (V), 292 (Y), 293 (N) y/o 294 (R)

Basándose en lo anterior y usando el PaTD como ejemplo, se pueden mutar uno o más de los siguientes restos: Resto(s) 338 (S), 339 (D), 340 (W), 341 (F), 342 (S), 343 (V), 344 (S), 345 (S), 346 (N), 347 (S), 348 (L), 349 (Y), 350 (T), 351 (L), 352 (S), 353 (H), 354 (G), 355 (L), 356 (Q), 357 (R), 358 (S), 359 (P), 392 (G), 393 (A), 394 (Q), 395 (V), 396 (E), 397 (V), 398 (G), 399 (S), 400 (L), 401 (N), 402 (I), 403 (R), 404 (L), 405 (G) y/o 406 (T).

Debe observarse, que el término "mutación" incluye la adición de aminoácido(s) adicional(es) a cualquiera de las regiones (las "regiones de inmunogenicidad/antigenicidad) que contienen estos restos. Asimismo, el término "mutación" puede incluir la duplicación de uno cualquiera o más aminoácidos y/o la inversión de cualquier secuencia dentro de estas regiones. Por ejemplo, se pueden invertir secuencias cortas de dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 (o más)) aminoácidos (y/o duplicarse). Cuando la mutación es una sustitución, el aminoácido sustituido puede ser uno cualquiera de los otros 19 aminoácidos naturales, o un aminoácido artificial o sintético. Asimismo, el aminoácido sustituido puede ser un derivado o análogo del aminoácido de tipo natural de la posición pertinente.

A modo de ejemplo no limitativo y con referencia a SpCBM, se pueden realizar una o más de las siguientes mutaciones (cabe señalar que no todas estas mutaciones pueden estar dirigidas a modular la inmunogenicidad de un CBM), por ejemplo, se pueden utilizar una o más de las mutaciones (incluidas las mutaciones M156F y M185I) para modular la termoestabilidad:

_(i) M156F

_(ii) Y168W (designada "lm15")

_(iii) L170A (designada "lm16")

(iv) L170T (designada "lm17")

(v) V173G (designada "lm18")

(vi) M185I

(vii) V239A (designada "lm19")

(viii) V239T (designada "lm20")

(ix) V246G (designada "lm21")

(x) I286A (designada "lm22")

(xi) Y292E (designada "lm23")

o no limitativo y con referencia a la molécula

o varias de las siguientes mutaciones:

_(i) S342D (designada "lm24")

_(ii) S345D (designada "lm25")

_(iii) L348D (designada "lm26")

(iv) R403K (designada "lm27")

Para disipar cualquier duda, cualquiera de las mutaciones de CBM enumeradas como (i)-(xi) anteriormente y cualquiera de las mutaciones de PaTD enumeradas como (i)-(iv) pueden realizarse individualmente y/o junto con una o más de las mutaciones enumeradas. Por ejemplo, pueden combinarse mutaciones en dos o más de los restos 156, 170 y 185 o 239, 246, 286 y 292 o 156, 170, 185, 239, 246, 286 y 292. Adicionalmente o como alternativa, pueden combinarse las mutaciones en los restos 239 y 246 o 286 y 292.

Asimismo, las mutaciones enumeradas anteriormente son solo ejemplos y debe entenderse que cualquier mutación de las posiciones indicadas que dé lugar a un CBM/dominio de oligomerización que tenga las propiedades deseadas (por ejemplo, inmunogenicidad/antogenicidad reducida en un hospedador humano) debe incluirse dentro del alcance de esta divulgación.

Existen muchas técnicas que permiten a un experto en este campo introducir una o más mutaciones de aminoácidos en una secuencia de CBM o dominio de oligomerización. Cualquiera de esas técnicas puede usarse en este caso e incluyen, por ejemplo, técnicas de mutagénesis, que incluyen: mutagénesis dirigida (al sitio), mutagénesis por PCR, mutagénesis insercional, mutagénesis marcada con distintivo, mutagénesis de transposón y/o mutagénesis de saturación de secuencia. También se pueden utilizar técnicas de síntesis de genes para introducir una cualquiera o más de las mutaciones descritas en el presente documento.

Antes de cualquier procedimiento de mutagénesis, una secuencia de ácido nucleico de dominio de oligomerización y/o CBM de tipo natural se puede someter a un proceso de optimización de codones en el que los codones se optimizan para la expresión en un sistema de expresión, tal como, por ejemplo, un sistema de expresión bacteriana (p. ej., una E. coli).

Si bien las moléculas de unión al ácido siálico útiles pueden comprender un CBM monomérico modificado (es decir, un único CBM modificado), otros pueden ser multiméricos, en otras palabras, moléculas que comprendan dos o más CBM (por ejemplo, dos o más CBM modificados). En dichos casos, la molécula de unión al ácido siálico puede denominarse "CBM multimérico". Las moléculas de unión al ácido siálico, que comprenden una pluralidad de CBM, pueden comprender dos o más CBM modificados, en donde algunos, pero no todos los CBM de dentro de la molécula de unión al ácido siálico están modificados. En otras palabras, una molécula de unión al ácido siálico, que comprende dos o más CBM, puede comprender una mezcla de CBM modificados y no modificados.

En un ejemplo, las moléculas de unión al ácido siálico pueden comprender CBM hexaméricos. Un CBM hexamérico comprende seis monómeros de CBM. En la mayoría de los casos, un CBM hexamérico comprende dos CBM fusionados que se conjugan además entre sí a través de un dominio de oligomerización (trimerización) fusionado.

Como ejemplo, la estructura genérica de las moléculas de CBM hexaméricos útiles puede representarse como:

La estructura esquemática (y genérica) anterior muestra una molécula de unión al ácido siálico que comprende tres unidades repetidas, cada una de las cuales comprende 2 CBM (CBM1 y CBM 2) y un dominio de oligomerización (en este caso, un dominio de trimerización: TD).

Como se describe en el presente documento, uno o ambos restos de CBM pueden ser un CBM modificado como se describe en el presente documento. Cada unidad repetida puede ser igual o diferente; en otras palabras, mientras que cada una de las unidades repetidas puede comprender 2 CBM (modificados o no). El tipo de CBM y/o el nivel o grado de modificación, pueden variar. A modo de ejemplo no limitante, una unidad repetida puede contener dos CBM con secuencias de tipo natural. Otra puede comprender dos CBM diferentes, uno con una secuencia de tipo natural y otro con una secuencia modificada (que comprenda una o más mutaciones como se describe en el presente documento). La tercera unidad de repetición puede comprender dos CBM modificados (que comprendan una o más de las mutaciones descritas en el presente documento). Un experto apreciará que se pueden preparar y probar otras combinaciones de tipo y/o secuencia de CBM (secuencia de tipo natural frente a secuencia mutada).

A modo de ejemplo no limitante, las siguientes representan unidades individuales (denominadas unidades "HEX") que se pueden utilizar para fabricar moléculas de unión al ácido siálico hexaméricas. En cada caso, la unidad HEX comprende dos CBM modificados (denominados CBM1 y CBM 2) con las mutaciones específicas introducidas en cada CBM identificadas entre paréntesis. Cabe señalar que el símbolo "— " indica un conector de aminoácidos (que une un CBM a otro o un CBM a un dominio de oligomerización). Como tal, una molécula de unión al ácido siálico hexamérica puede estar formada por varias (por ejemplo, 3) unidades HEX. En cada caso, el dominio de oligomerización (denominado "TD") conjuga las unidades juntas como un trímero. Si bien cualquier hexámero dado puede comprender copias idénticas de las unidades descritas anteriormente (y a continuación) con las designaciones HEX1, HEX2, HEX3, ^h EX4, HEX5, HEX6 y HEX17, cualquier experto apreciará que hay más opciones disponibles. Por ejemplo, una unidad HEX puede estar compuesta por dos CBM, cada uno con diferentes mutaciones (siendo las mutaciones una o más seleccionadas de las opciones detalladas en el presente documento).

(i) HEX1

CBM1 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----CBM2 (L170T V239A V246G I286A Y292E)— -TD (S342D L348D R403K)

(ii) HEX2

CBM1 (V239A V246G I286A Y292E)-----CBM2 (V239A V246G I286A Y292E)— -TD (S342D R403K)

(iii) HEX3

CBM1 (V239A V246G I286A)-----CBM2 (V239A V246G I286A)— -TD (S342D R403K)

(iv) HEX4

CBM1 (V239A V246G)----CBM2 (V239A V246G)— -TD (S342D)

(v) HEX5

CBM1 (V239A V246G)----CBM2 (V239A V246G)— -TD (R403K)

(vi) HEX6

CBM1 (V239A V246G)----CBM2 (V239A V246G)— -TD (S342D R403K)

(vii) HEX17

CBM1 (V239A V246G A162P) CBM2 (V239A V246G A162P)— -TD (S342D R403K)

Se observará que HEX6 y HEX17 son idénticos a excepción de la mutación A162P adicional. Se ha demostrado que esta mutación de prolina (una sustitución de la alanina de tipo natural en el resto 162) mejora la termoestabilidad (la Tm de CBM individual en 3-4 °C). Se puede obtener más información sobre el uso de mutaciones de prolina en Fu 2009, Increasing protein stability by improving beta-turns (DOI 10.1002/prot.22509), donde se describe la metodología general. La mutación de prolina no afecta (aumenta ni disminuye) la inmunogenicidad prevista de la molécula de CBM, no se encuentra cerca de las otras mutaciones, del extremo N- o C-terminal ni del sitio de unión al ligando. Más bien inesperadamente, más allá de la mejora moderada de la termoestabilidad, se observó que la mutación A162P produce CBM hexaméricos (es decir, HEX17) que muestran una mejora notable en los experimentos in vivo, en particular, en comparación con esos mismos experimentos realizados con HEX6. Por ejemplo, las moléculas modificadas (en particular, una molécula que comprende 3 unidades de HEX17) presentan modulación sobre las citocinas proinflamatorias, incluyendo, por ejemplo, IL-8. En efecto, el efecto modulador (específicamente un efecto inhibidor) sobre la producción de IL-8 por una molécula que comprende 3 unidades de HEX17, se mejoró con respecto a otras moléculas modificadas probadas.

En relación con las secuencias de aminoácidos de Sp2CBMTD (también conocido como "SpOrig"), la secuencia de aminoácidos de las moléculas HEX6 y HEX 17 es:

SpOrig GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT

HEX6 GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT

HEX17 GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSAT

SpOrig KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG

HEX6 KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG

HEX17 KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG

SpOrig RVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT

HEX6 RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT

HEX17 RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT

SpOrig PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF

HEX6 PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF

HEX17 PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAF

SpOrig YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV (continuación)

HEX6 YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV

HEX17 YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV

SpOrig EKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR

HEX6 EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR

HEX17 EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR

SpOrig NLTVYNRALTPEEVQKRSGGALGVPDFESDWFSVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS

HEX6 NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS

HEX17 NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS

SpOrig SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIRLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT

HEX6 SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT

HEX17 SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT

SpOrig GYYRVRAWI

HEX6 GYYRVRAWI

HEX17 GYYRVRAWI

Sin querer ceñirse a ningún uso o aplicación en particular, las moléculas descritas pueden ser útiles:

(i) en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades en un sujeto que lo necesite;

(ii) en la modulación de respuestas inmunitarias (en sujetos humanos o animales);

(iii) en la modulación del crecimiento, la proliferación y/o la diferenciación celular

(iv) como adyuvantes; y/o

(vi) en la fabricación de medicamentos.

De nuevo, sin desear quedar ligados a ningún uso específico, las moléculas divulgadas pueden usarse (como medicamentos) en el tratamiento y/o la prevención de varias enfermedades y/o afecciones: en particular, enfermedades o afecciones provocadas o a las que contribuye un patógeno, particularmente aquellos patógenos que son capaces de unirse a los receptores que contienen ácido siálico de la superficie celular. La presente divulgación también puede proporcionar métodos útiles en el tratamiento de sujetos, particularmente sujetos humanos, que padezcan o estén en riesgo de contraer, una enfermedad y/o una afección provocada o a la que contribuye un patógeno, particularmente aquellos patógenos que son capaces de unirse a los receptores que contienen ácido siálico de la superficie celular. Por ejemplo, el término "patógeno" puede abarcar cualquier patógeno que sea capaz de unirse, reconocer o asociarse de otro modo a un hidrato de carbono de la superficie celular; especialmente aquellos patógenos que han evolucionado para aprovechar o utilizar la presencia de hidratos de carbono en la superficie celular (ácido siálico) como un medio para unirse/adherirse y/o entrar en una célula. Como tal, el término "patógeno" puede abarcar patógenos microbianos y puede incluir patógenos respiratorios tales como virus pertenecientes a las familias Orthomyxoviridae o Paramyxoviridae, por ejemplo, gripe y paragripe humana, así como bacterias pertenecientes al género Streptococcus (tales como Streptococcus pneumoniae) y/o Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, siendo todos ellos son capaces de unirse a los hidratos de carbono de la superficie de las células de mamíferos. Un experto apreciará que la célula de mamífero colonizada/infectada con mayor frecuencia por patógenos del tipo descrito en el presente documento, son células epiteliales, especialmente las que recubren los tubos mucosos (por ejemplo, células epiteliales respiratorias). Para obtener una descripción completa de cómo se pueden usar las moléculas de unión al ácido siálico para tratar o prevenir enfermedades, véase el documento PCT/GB2009/002189. En cuanto a la modulación de las respuestas inmunitarias (en sujetos humanos o animales), las diversas moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento (moléculas que comprenden uno o más CBM modificados) tienen propiedades inmunomoduladoras. Por ejemplo (y sin querer estar ligado a la teoría), las moléculas de unión al ácido siálico descritas modulan las respuestas inmunitarias del hospedador, primovacunan el sistema inmunitario, modulan (por ejemplo, aumentan o disminuyen) la expresión, función y/o actividad de los procesos del sistema inmunitario, vías y/o cualquiera de sus componentes. El término "primovacunación" aplicado a una respuesta inmunitaria, puede abarcar el fenómeno de aumentar la preparación y/o la capacidad de respuesta de un sistema inmunitario a un inmunógeno, antígeno, patógeno, enfermedad o infección. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, además de cualquier propiedad inmunomoduladora asociada a las moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento, los sujetos a los que se les administró o que se pusieron en contacto con las moléculas de unión al ácido siálico descritas pueden ser más capaces de hacer frente a la aparición de una infección/enfermedad. Para obtener una descripción completa de la actividad inmunomoduladora de las moléculas de unión al ácido siálico, véase el documento PCT/GB2015/050161.

Asimismo, se ha demostrado que las moléculas de unión al ácido siálico descritas (moléculas que pueden contener uno o más CBM modificados) pueden usarse para modular aspectos del crecimiento celular y/o la actividad celular. Los términos "crecimiento" y "actividad" aplicados a las células pueden abarcar procesos y/o fenómenos asociados a uno o más de la proliferación celular, la viabilidad celular, la migración celular, el metabolismo celular, la diferenciación celular y/o la morfología/fenotipo celular. Los términos "crecimiento" y/o "actividad" pueden incluir además la respuesta de una célula a determinados factores o estímulos exógenos y/o endógenos que incluyen, por ejemplo, respuestas a determinados compuestos del sistema inmunitario, citocinas, quimiocinas y uno o más factores ambientales (luz, temperatura, presión, tensión mecánica y similares). Por tanto, las moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento pueden usarse para modular (inhibir, disminuir o aumentar) los niveles de respuesta celular. Por consiguiente, cualquiera de las moléculas divulgadas puede usarse en el tratamiento o la prevención de una enfermedad y/o afección provocada, en la que contribuye a y/o caracterizada por un crecimiento y/o actividad celular aberrante o en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la misma.

Sin querer ceñirme a ninguna aplicación médica concreta, cabe señalar que las enfermedades que están provocadas, en las que contribuye o caracterizadas por el crecimiento y/o la actividad celular aberrante pueden incluir, por ejemplo, trastornos de proliferación y/o diferenciación celular que incluyen, aquellos referidos o clasificados como afecciones benignas o malignas. Por ejemplo, la expresión "trastornos de proliferación y/o diferenciación celular" puede incluir aquellas enfermedades y/o afecciones denominadas en conjunto como "cáncer". El término "cáncer" puede incluir, aunque no de forma limitativa, los cánceres denominados formas de cáncer de mama, cáncer de hueso, cáncer cerebral (gliomas), cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer ovárico, cáncer de cuello del útero, cánceres de cabeza y cuello y cáncer de intestino/colon. El término "cáncer" también puede incluir aquellas enfermedades y/o afecciones denominadas en conjunto "leucemias" (tanto crónicas como agudas) y cualquier cáncer que afecte a una superficie o tejido mucoso/asociado a mucosas.

Como tal, una molécula de unión al ácido siálico descrita en el presente documento, molécula que puede comprender uno o más CBM modificados, puede encontrar aplicación (es decir, puede ser para su uso) en el tratamiento y/o la prevención del cáncer. Las moléculas de unión al ácido siálico descritas pueden utilizarse además en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención del cáncer. Para obtener una descripción completa de cómo se pueden usar las moléculas de unión al ácido siálico para modular el crecimiento celular y/o la actividad celular, véase el documento PCT/GB2017/052808.

Cualquiera de las moléculas de unión al ácido siálico descritas (que comprenden uno o más CBM modificados) se puede usar como adyuvante que, a su vez, se puede usar junto con uno o más antígenos para aumentar, modular o potenciar una respuesta inmunitaria del hospedador frente a uno o más antígenos. Cabe señalar que, si bien los adyuvantes basados en moléculas de unión al ácido siálico descritas en el presente documento pueden combinarse con cualquier tipo de antígeno, los adyuvantes, que son objeto de esta divulgación pueden ser particularmente útiles como adyuvantes mucosos; en otras palabras, para usar con antígenos que se van a administrar por vía mucosa. Para una divulgación completa de cómo las moléculas de unión al ácido siálico se pueden usar como adyuvantes, véase el documento PCT/GB2017/052805.

También se ha demostrado que las moléculas de unión al ácido siálico descritas (moléculas que pueden contener uno o más CBM modificados) pueden encontrar utilidad en el tratamiento y/o la prevención de la sepsis. El término "sepsis" se aplica a una serie de enfermedades, afecciones y/o síndromes que pueden tener una etiología infecciosa (por ejemplo, vírica, bacteriana y/o fúngica). Por ejemplo, el término "sepsis", puede englobar esos cuadros clínicos, afecciones o síndromes denominados SIRS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica: véase Singer et al., 2016: JAMA "The third International consensus definitions for sepsis and septic shock), la sepsis (que a menudo se define como "SIRS en respuesta a un proceso infeccioso"), sepsis grave (es decir, sepsis con disfunción orgánica inducida por sepsis o hipoperfusión tisular (que, a su vez, podría manifestarse como hipotensión, lactato elevado o disminución de la diuresis) y choque séptico (sepsis grave más presión arterial persistentemente baja a pesar de, por ejemplo, la administración de líquidos intravenosos). El término "sepsis" se aplica con mayor frecuencia a enfermedades, afecciones y/o síndromes que se deben a la "sepsis bacteriana". La sepsis bacteriana puede deberse a la presencia de bacterias en la sangre y, a veces, se la denomina "bacteriemia" o "septicemia". El término "sepsis" también puede abarcar enfermedades y/o afecciones provocadas o a las que contribuye la presencia de componentes bacterianos tales como LPS, toxinas y/o fragmentos de membrana en la sangre. Los componentes de este tipo pueden tener su origen en infecciones primarias presentes en otros tejidos y/u órganos, por ejemplo, infecciones presentes en los pulmones, el cerebro, la piel, las vías urinarias, la pelvis y/o el abdomen.

Para obtener una descripción completa de cómo se pueden usar las moléculas de unión al ácido siálico en el tratamiento y/o la prevención de la sepsis, véase el documento PCT/GB2017/052800.

Los CBM modificados descritos en el presente documento y cualquier molécula que los comprenda pueden conjugarse, unirse o juntarse o asociarsea otras entidades con el fin de dirigir o administrar esa entidad a algún tejido o célula. Las moléculas de este tipo también se pueden conocer como "ojivas terapéuticas" o "conjugados". Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la presencia de ligandos para los diversos CBM modificados que pueden estar comprendidos dentro de las moléculas de esta divulgación, en ciertos receptores celulares y moléculas unidas a la membrana, puede permitir que las diversas moléculas descritas en el presente documento se utilicen como un medio para administrar moléculas heterólogas conjugadas (siendo estas moléculas distintas y diferentes del CBM modificado o la molécula que comprende el mismo) a dichas células o tejidos que comprenden dichas células. Dichas moléculas conjugadas pueden ser útiles en el tratamiento de varias enfermedades que incluyen, por ejemplo, cáncer, donde las moléculas conjugadas descritas en el presente documento (cuyas moléculas presentan afinidad por los hidratos de carbono expresados en la superficie de las células) pueden usarse para dirigir fracciones terapéuticas y/o citotóxicas a las mismas.

Como ejemplo, una molécula como se describe en el presente documento (que incluye cualquiera de los CBM modificados o moléculas que comprenden los mismos) se puede conjugar con uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) fracciones que son, por ejemplo, terapéuticas y/o citotóxicas.

Las moléculas útiles pueden comprender un CBM modificado de esta divulgación conjugado (juntado, unido o asociado de otro modo) con una fracción heteróloga. La fracción heteróloga puede comprender una fracción terapéutica y/o citotóxica que puede conjugarse con alguna parte de la molécula de CBM modificada.

Por ejemplo, la fracción heteróloga puede conjugarse con uno o ambos extremos de una molécula de CBM modificada. La fracción heteróloga puede conjugarse además o como alternativa (o incluso fusionarse) con una parte interna de una molécula de CBM modificada. Se apreciará que, sin embargo, la fracción heteróloga debe conjugarse con la molécula CBM modificada, la molécula (ni su conjugación) no debe interferir (sustancialmente) con, eliminar ni reducir la propiedad de unión al hidrato de carbono (ácido siálico) de la molécula de CBM modificada.

Como se ha indicado, la fracción heteróloga puede ser un fármaco útil en el tratamiento de una enfermedad que afecte a una célula o un tejido que exprese un receptor que comprenda el ligando para cualquiera de los CBM modificados (o moléculas que comprenden los mismos) descritos en el presente documento. Por ejemplo, el fármaco puede ser un fármaco quimioterápico para usar en el tratamiento del cáncer y similares. La fracción heteróloga puede ser una fracción citotóxica capaz de matar o inducir la apoptosis en, una célula. La fracción heteróloga puede comprender una molécula que sea capaz de reclutar células específicas en un tejido particular. Por ejemplo, la fracción heteróloga puede ser, por ejemplo, un receptor de linfocitos T (TCR) que puede usarse como un medio para reclutar linfocitos T en, por ejemplo, un tumor o tejido canceroso.

La presente divulgación puede proporcionar composiciones para su aplicación en los diversos usos, medicamentos y métodos descritos en el presente documento. Como tales, cualquiera de los CBM modificados descritos en el presente documento (o cualquier molécula que comprenda un CBM modificado) puede formularse para usarlo.

Por conveniencia, y con referencia al siguiente apartado que describe las composiciones, formulaciones y similares, cabe señalar que ambas moléculas que comprenden un c Bm modificado como se describe en el presente documento, una molécula que comprende el mismo y cualquier conjugado que lo comprenda (por ejemplo, conjugados/fusiones de CBM modificado::fármacos) se incluirán en la expresión general "molécula que comprende un ^c B^m modificado".

Se puede formular una molécula que comprenda un CBM modificado para usar como composición terapéutica o farmacéutica. Las diversas composiciones pueden comprender una o más de las moléculas descritas en el presente documento y cualquier tratamiento dado puede requerir la administración (conjunta, concurrente o por separado) de una o más de estas composiciones. Cabe señalar que una composición de acuerdo con esta divulgación puede comprender además una o más fracciones terapéuticas, por ejemplo, moléculas, moléculas pequeñas, anticuerpos, oligonucleótidos y similares útiles en el tratamiento de una o más enfermedades y/o afecciones. Adicionalmente o como alternativa, los CBM modificados pueden administrarse junto con una o más entidades terapéuticas (diferentes), en donde la una o más entidades terapéuticas (diferentes) pueden usarse para el tratamiento de la misma enfermedad o de una diferente. La expresión "administrados conjuntamente" abarca la administración de un CBM modificado antes, después y/o al mismo tiempo que la administración de una o más entidades terapéuticas.

Las moléculas descritas en el presente documento pueden formularse para administración enteral (incluida la oral), administración parenteral y/o tópica, y un experto apreciará que la formulación precisa puede variar dependiendo de la vía de administración.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar de forma convencional, comprendiendo sustancias que se utilicen habitualmente en productos farmacéuticos y como se describe en, por ejemplo, Remington’s The Sciences and Practice of Pharmacy, 22.a edición (Pharmaceutical Press 2012) y/o Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7.a edición (recopilado por Rowe et al., Pharmaceutical Press, 2012).

Una composición terapéutica o farmacéutica de esta divulgación (es decir, una composición que comprende una molécula que comprende un CBM modificado y para usar en cualquiera de los medicamentos o métodos descritos en el presente documento) se puede formular junto con uno o más excipientes, vehículos, adyuvantes y tampones. Las composiciones se pueden administrar, p. ej., por vía oral (incluidas la vía mucosa), por vía parenteral, por vía entérica, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intravenosa o por cualquier otra vía útil para lograr el efecto deseado (por ejemplo, la modulación del crecimiento/actividad celular, el tratamiento o la prevención de enfermedades/afecciones asociadas a las mismas y/o al cáncer, y/o la modulación del crecimiento tumoral). Como se ha indicado, dependiendo de la vía de administración seleccionada, la composición exacta de la formulación puede variar.

Una formulación terapéutica o farmacéutica que comprende una molécula que comprende un CBM modificado y para la administración a un sujeto puede recubrirse, encapsularse o envolverse en un material que proteja a la molécula de la acción de las enzimas, los ácidos y otros compuestos/condiciones naturales (incluyendo, por ejemplo, compuestos (incluyendo anticuerpos), células y procesos del sistema inmunitario) que pueden inactivar o desnaturalizar el compuesto y/o sus propiedades de unión a hidratos de carbono.

Entre los diversos excipientes estándar y convencionales que pueden estar disponibles para su uso en las composiciones que comprenden las moléculas descritas en el presente documento, están aquellas sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables que son adecuadas para la administración parenteral, entérica, oral (incluida la mucosa) y otras vías de administración que no reaccionen perjudicialmente con la(s) molécula(s) que comprende(n) un CBM modificado.

Cuando se vayan a formular moléculas que comprenden un CBM modificado para administración parenteral, las composiciones pueden ser estériles.

La composición puede comprender una solución a base de aceite o acuosa, una suspensión y/o una emulsión.

En otras realizaciones, la composición puede adoptar la forma de un implante, como, por ejemplo, una película (disoluble o biodegradable), un pesario o un implante (incluidos los supositorios).

Las preparaciones farmacéuticas que comprenden las moléculas descritas en el presente documento pueden mezclarse con estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales (para usar en influir la presión osmótica), tampones y/u otras sustancias que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos.

Una o más de las moléculas descritas en el presente documento pueden formularse y administrarse, por vía oral. Como se ha indicado, la administración oral incluiría la administración mucosa que, a su vez, incluiría la administración por vía intranasal y/o por inhalación.

Las composiciones para usar pueden incluir formas farmacéuticas sólidas que sean adecuadas para la administración oral. Estas pueden incluir, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En cualquier forma farmacéutica sólida dada, una molécula que comprende un CBM modificado (o cualquier molécula o conjugado que comprende el mismo) puede mezclarse con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable inerte. Los expertos en este campo conocerán ejemplos de excipientes adecuados, pero pueden incluir, por ejemplo, cargas o extensores, humectantes, agentes humectantes, aglutinantes, agentes disgregantes, retardadores de la disolución, aceleradores de la absorción, adsorbentes, lubricantes o mezclas de los mismos. Un comprimido, pastilla o cápsula puede comprender además un agente tamponador. Las formas farmacéuticas sólidas, tales como comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y/o gránulos también se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos que protegen contra el entorno gastrointestinal y/o los ácidos estomacales.

Una forma farmacéutica sólida puede contener agentes opacificantes y también puede formularse para garantizar la liberación retardada del principio activo (en este caso, una molécula que comprende un CBM modificado o un conjugado que comprende el mismo) en o hacia una parte específica del tubo intestinal.

Las composiciones sólidas para administración oral se pueden formular en forma farmacéutica unitaria, cada dosificación contiene una dosis apropiada de una molécula que comprende un CBM modificado (o conjugado que comprende el mismo). La cantidad exacta de una molécula que comprende un CBM modificado (o un conjugado que comprende el mismo) contenido dentro de cualquier forma farmacéutica sólida determinada variará dependiendo del uso previsto. Una composición sólida puede contener una "dosis unitaria": una dosis unitaria que contiene una cantidad de una molécula que comprende un CBM modificado (o un conjugado que contiene el mismo) calculada para producir el efecto deseado (por ejemplo, modulación del crecimiento y/o de la actividad celular) en el transcurso de un período de tratamiento.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral pueden (como se indica) incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del compuesto o de la composición, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes utilizados habitualmente en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes.

Cualquiera de las moléculas descritas se puede utilizar en cualquier cantidad adecuada. Como se ha indicado, las moléculas pueden formularse para la administración oral, mucosa o parenteral, y como tales, la formulación exacta puede depender de la vía de administración pretendida y/o de los atributos fisiológicos y/u de otros atributos del sujeto.

La cantidad de una molécula que comprende un CBM modificado presente en cualquier dosis dada puede estar en el intervalo de 0,1 jg-1000 |jg. Por ejemplo, cantidades de aproximadamente 0,1 |jg, 0,2 |jg, 0,3 |jg, 0,4 |jg, 0,5 |jg, 1 |jg, 10 jig, 20 jig, 25 jig, 50 jig, 100 jig, 200 jg , 300 jg , 400 jig, 500 jg , 600 jig, 700 jg , 800 jg o 900 jig. Se pueden utilizar cantidades más altas de CBM modificado (o una molécula que comprenda el mismo); por ejemplo, cantidades en el intervalo de 1 mg-10 mg, por ejemplo, cantidades de aproximadamente 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 jig, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg o 9 mg. La cantidad seleccionada de la molécula de CBM modificada puede formularse en un volumen específico de un excipiente, diluyente y/o tampón farmacéuticamente aceptable. El volumen de excipiente, diluyente 0 tampón puede ser de aproximadamente 10 j l a 5 ml. Por ejemplo, la cantidad requerida de molécula CBM32/47/67/70 se puede combinar (o formular) con aproximadamente 15 jl, 20 jl, 25 jl, 30 j l , 35 jl, 40 jl, 45 jl, 50 jl, 55 jl, 60 jl, 65 jl, 70 jl, 75 jl, 80 jl, 85 jl, 90 jl, 95 jl, 100 jl, 200 jl, 250 jl, 300 jl, 400 jl, 500 jl, 600 jl, 700 jl, 800 jl, 900 jl, 1 ml, 2 ml, 3 ml o 4 ml. Se pueden usar dosis a concentraciones de aproximadamente 0,1 jg/m l-10 mg/ml que incluyen, por ejemplo, dosis con 5 jg/ml, 10 jg/ml, 20 jg/ml, 25 jg/ml, 50 jg/ml, 100 jg/ml, 200 jg/ml, 300 jg/ml, 500 jg/ml, 600 jg/ml, 700 jg/ml, 800 jg/ml, o 900 jg/ml, 950 jg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 2,5 mg/ml, 3 mg/ml, 3,5 mg/ml, 4 mg/ml, 4,5 mg/ml, 5 mg/ml, 5,5 mg/ml, 6 mg/ml, 6,5 mg/ml, 7 mg/ml, 7,5 mg/ml, 8 mg/ml, 8,5 mg/ml, 9 mg/ml o 9,5 mg/ml.

Durante el uso, una dosis de una molécula de CBM modificada, administrada como parte del tratamiento y/o de la prevención de una enfermedad (por ejemplo, un trastorno de proliferación y/o diferenciación celular o cáncer), puede administrarse varias veces durante varios días, semanas, meses o años. Por ejemplo, después de una administración inicial (o primera), se puede volver a administrar una dosis de una molécula de CBM modificada aproximadamente (+/-1 o 2 días) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 28 y/o 35 días después. Se pueden administrar varias dosis repetidas a intervalos regulares, por ejemplo, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 día(s) después de una dosis anterior. En un día cualquiera, se puede administrar una dosis específica de una molécula de CBM modificada 1, 2, 3 o más veces. Cada vez, la molécula de CBM modificada puede administrarse (por cualquier vía que se considere mejor) para efectuar un tratamiento adecuado o para inducir la profilaxis contra una enfermedad o afección particular.

Descripción detallada

La presente divulgación se describirá a continuación en detalle con referencia a las siguientes figuras que muestran:

Figura 1: Predicciones de ProPred de péptidos antigénicos. A. Secuencia de SpCBM. B. Secuencia de PaTD. Los aglutinantes previstos son de color azul, mostrándose el primer resto de cada región de unión en rojo. Los péptidos antigénicos previstos por Nordic Biopharma (barras verdes) y Prolmmune (barras moradas) se muestran debajo de las secuencias.

Figura 2: Prueba de expresión de dominios de tipo natural y mutados. Carril 1, patrón de M12; Carril 2, SpCBM de tipo natural (TN); Carriles 3-11, Im15-Im23; Carriles 12-15, Im24-Im27; Carril 16, PaTD TN. A) Extractos de células enteras, B) Extractos solubles.

Figura 3: Posición del péptido 167-181 en la estructura de SpCBM

Figura 4: Desplegable de expresión y Ni-NTA de las variantes Im28 a Im34

Figura 5: Sitios de las mutaciones de HEX17 en la estructura del hexámero. La estructura cuaternaria de HEX17 se modeló ensamblando las estructuras cristalinas de SpCBM (código pdb 4c1x) y PaTD (código pdb 2w38) individuales en el hexámero (es decir, 6 copias de SpCBM y 3 copias de PaTD por molécula). Las posiciones del ligando unido (a2,3-sialilactosa) se muestran en forma de barra (naranja). También se muestran las posiciones de las mutaciones: azul, los sitios de la mutación A162P; cian, los sitios de las otras dos mutaciones c BM; magenta, los sitios de las mutaciones TD.

Figura 6: Estimulación de IL-8. Las células A549 se estimularon mediante la adición de 10 jg de agente biológico (Sp2CBMTD (también conocido como SpOrig), HEX6 o HEX17). El sobrenadante celular se extrajo en puntos de tiempo de 24 h o 48 h y se determinó el contenido de IL-8 mediante ELISA. La significación estadística entre las células de control y las tratadas se determinó con ANOVA unidireccional utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figura 7: Análisis multiplex de mediadores inflamatorios. Las células A549 se estimularon mediante la adición de 10 jg de agente biológico (Sp2CBMTD (también conocido como SpOrig), HEX6 o HEX17). El sobrenadante celular se extrajo en los puntos de tiempo de 6 h, 24 h o 48 h, y los mediadores inflamatorios se analizaron mediante un ensayo de 12 plex de citocinas humanas. La significancia estadística entre el control y/o el hexámero TN y las variantes del hexámero se determinó mediante un ANOVA unidireccional (prueba de comparación múltiple de Tukey).

Figura 8: Porcentaje de supervivencia de ratones tratados y no tratados con CBM cuando se expusieron letalmente a la cepa de gripe PR8. CBM2, CBM3 y CBM4 representan HEX17, HEX6 y TN (SpOrig), respectivamente. A los animales que recibieron una sola dosis de CBM se les administraron 100 |jg de CBM un día antes de la exposición letal con PR8; a los animales con dosis repetidas se les administraron 2 x 0,1 jg de CBM en el día 3 y el día 1 antes de la exposición a PR8.

Figura 9: Puntuaciones sintomáticas de ratones tratados y no tratados con CBM durante la infección con PR8. CBM2, CBM3 y CBM4 representan HEX17, HEX6 y TN (SpOrig), respectivamente. Una puntuación sintomática ascendente de 1 a 5 indica desde la ausencia de síntomas (1), al letargo y la muerte (5), respectivamente.

Figura 10: Porcentaje de pérdida de peso de ratones tratados y no tratados con CBM durante la infección con PR8. CBM2, CBM3 y CBM4 representan HeX17, HEX6 y TN (SpOrig), respectivamente.

Figura 11: Análisis de anticuerpos anti-mCBM de homogeneizados pulmonares y tejido en suero del día 21 de un estudio en ratones expuestos a PR8. La significación estadística entre el hexámero TN y las variantes de hexámero se determinó mediante un ANOVA unidireccional (prueba de comparación múltiple de Tukey).

Figura 12a: Concentraciones de anticuerpos anti-CBM de muestras de LBA de ratón del día 35.

Figura 12b: Concentraciones de anticuerpos anti-CBM de muestras de ratón de suero del día 35

Métodos y resultados

Sp2CBMTD: predicción de regiones inmunogénicas

Cribado informático de Nordic Biopharma

El cribado informático de epítopos de linfocitos T identificó cuatro grupos inmunogénicos significativos y dos en el límite: Significativos:

Dominio Intervalo de restos Secuencia

SpCBM de 245 a 254 GVLSRTSLRS

PaTD de 340 a 349 WFSVSSNSLY

PaTD de 351 a 359 LSHGLQRSP

PaTD de 398 a 406 GSLNIRLGT

Límite:

Dominio Intervalo de restos Secuencia

SpCBM de 167 a 178 FYNLFSVSSATK

SpCBM de 239 a 251 VRLYVNGVLSRTS

Ensayo de proliferación de linfocitos T de donante humano de Prolmmune

El estudio de Prolmmune destacó dos regiones de alta antigenicidad y dos regiones de antigenicidad moderada: Alta antigenicidad:

Dominio Intervalo de restos Secuencia

SpCBM de 236 a 250 KGRVRLYVNGVLSRT

PaTD de 392 a 406 GAQVEVGSLNIRLGT

Antigenicidad moderada:

Dominio Intervalo de restos Secuencia

SpCBM de 167 a 181 FYNLFSVSSATKKDE

PaTD de 338 a 352 SDWFSVSSNSLYTLS

Análisis informático de ProPred

También se utilizó otra herramienta informática, el servidor ProPred en línea4. Los resultados del servidor ProPred se muestra en la Figura 1. Las posiciones relativas de los epítopos de Nordic Biopharma/Prolmmune también se destacan e indican una coincidencia razonable entre los tres métodos. Además de los epítopos enumerados anteriormente, ProPred predijo de manera fiable otro epítopo inmunogénico en el dominio SpCBM:

Dominio Intervalo de restos Secuencia

SpCBM de 286 a 294 IRNLTVYNR

Mutaciones en los dominios CBM y TD individuales

Para guiar el diseño de mutaciones que podrían reducir la inmunogenicidad, se utilizó ProPred para probar el efecto de cambiar cada resto de estos péptidos por cada resto alternativo. Se anotaron aquellos que dieron la mayor reducción en el número previsto de aglutinantes de alelos. Como se conoce la estructura cristalina de los dominios SpCBM y TD, estas mutaciones también se modelaron para reducir la probabilidad de introducir mutaciones que era evidente que alterarían la estructura de la proteína.

Inicialmente, se introdujeron nueve mutaciones únicas en SpCBM y cuatro mutaciones únicas en PaTD y se enumeran a continuación ("Im" es la abreviatura de mutante de inmunogenicidad):

Variantes (SpCBM) Mutación Variantes (PaTD) Mutación

Sp TN - TD TN -Im15 Y168W Im24 S342D

Im16 L170A Im25 S345D

Im17 L170T Im26 L348D

Im18 V173G Im27 R403K

Im19 V239A

Im20 V239T

Im21 V246G

Im22 I286A

Im23 Y292E

Observación: Im1 a Im14 (no se muestra) se introdujeron por mutagénesis en un fondo sin optimización de codones, antes de que los datos de Prolmmune estuvieran disponibles.

Síntesis de construcciones TN y mutadas

Los genes que codifican SpCBM TN, PaTD TN y las variantes Im15 a Im27 se optimizaron por codones para la expresión en E. coli y se sintetizaron mediante GeneArt. A continuación, los genes se clonaron internamente en el vector pHISTEV para su expresión como proteínas marcadas con 6His.

Expresión y caracterización biofísica

Se realizó una prueba de expresión inicial para evaluar la solubilidad. Los resultados muestran que todos se expresaron, pero no todos fueron solubles (Figura 2). Observación: la solubilidad (o la falta de ella) no es necesariamente un predictor de utilidad. Un experto apreciará que al fabricar o producir proteínas, ciertos procesos requieren el uso de material insoluble, ya que este se purifica fácilmente (a partir de cuerpos de inclusión y similares). Los protocolos posteriores pueden rediseñar las proteínas para modular características como la solubilidad.

Los resultados de la prueba de expresión muestran que:

• Im16 (L170A) es insoluble o muy poco soluble

• Im25 (TD, S345D) es insoluble

• Im15 (Y168W) e Im17 (L170T) tienen solubilidad reducida

• Im18 (V173G) e Im22 (I286A) se reducen ligeramente.

• El resto muestra expresión soluble.

Las 13 proteínas solubles se expresaron en E. coli y se purificaron por cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography), seguido de la digestión TEV para eliminar el marcador 6His, luego IMAC inversa y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

Diez dominios purificados (Sp TN, Im19, Im20, Im21, Im22, Im23, TD TN, Im24, Im26 e Im27) se caracterizaron además por:

(i) Termofluor para medir la temperatura de fusión (Tm)

(ii) Dicroísmo circular (DC) cercano al UV para comparar estructuras terciarias con TN

(iii) Dispersión de luz dinámica (DLS) para verificar el estado oligomérico en solución

(iv) Resonancia de plasmones superficiales (SPR) para medir la afinidad de unión a la sialilactosa

(v) Medición de la estimulación de citocinas IL-8

Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen cualitativo de las caracterizaciones biofísicas de los dominios TN y sus variantes. La codificación de colores es de verde a rojo (incluido el verde, naranja y amarillo), donde el verde indica que la variante se parece mucho a su homólogo TN para esa característica particular y el verde pálido (verde) o amarillo indican grados crecientes de diferencias. El rojo o naranja indican diferencias significativas. n.p.: estas caracterizaciones no se realizaron debido a la mala solubilidad/pureza de la proteína. n.d.: no determinado.

Péptido Sp 167-181:

Im15, Im16, Im17, Im18 son todos insolubles o poco solubles (como se indicó, esto no necesariamente afecta la utilidad de la proteína). Estos se encuentran en la región "moderadamente"antigénica 167-181 (FYNLFSVSSATKKDE). Esta región es claramente muy sensible al cambio.

Los resultados anteriores muestran que M156F, que se encuentra junto a L170 (e I286), aumenta la Tm en -4 °C. Por lo tanto, esto podría combinarse con L170T. M156F no aumenta la inmunogenicidad prevista.

M185I aumenta la Tm en 5 °C y se encuentra paralela a L170 (Figura 3). Esta mutación también podría incluirse. Obsérvese que, al igual que M156F, M185I no aumenta la inmunogenicidad prevista, pero reduce ligeramente el número de aglutinantes de alelos previstos.

Péptido Sp 236-250:

Im19, Im20, Im21 todos se comportan de manera similar a TN. Estos están en la región 236-250 "altamente" antigénica (KGRVRLYVNGVLSRT).

Se escogió Im19 (V239A) frente a la mutación de treonina (Im20, V239T). No hay diferencia en la inmunogenicidad prevista, pero Im19 coincide más con la Tm y el espectro de UV cercano de TN Thermoflour. Esto se combinaría con Im21 (V246G).

Péptido Sp 286-294:

Im22 (I286A) es muy similar a TN, mientras que Im23 (Y292E) parece presentar una afinidad por el ligando reducida. Esta región, IRNLTVYNR 286-294, no fue señalada por Prolmmune, pero ProPred pronosticó firmemente que es inmunogénico.

Hay alguna indicación de que Im22 tiene una Tm más baja que el TN. Este resto es adyacente a M156, por lo que puede comportarse de manera diferente si se incluyera M156F.

Péptido TD 338-352:

Im24 (S342D) e Im26 (L348D) muestran características similares al dominio de trimerización TN, pero con alguna sugerencia de Tm reducida en Im26. Estos están en la región "moderadamente" antigénica SDWFSVSSNSLYTLS 338-352. Se predijo que la secuencia TN se uniría a 9 alelos, mientras que Im24 predice 2 alelos y un mutante doble Im24/lm26 predice 1 alelo.

Péptido TD 392-406:

Im27 (R403K) es similar a TN. Es parte de la región "altamente" antigénica GAQVEVGSLNIRLGT 392-406. Los alelos previstos se reducen de 21 a 3 cuando se introduce esta mutación.

Síntesis de múltiples combinaciones de mutaciones Im28-34

Se introdujeron las siguientes mutaciones:

i) M156F/L 170T

ii) M156F/L170T/M185I: En ProPred, los alelos previstos para esta región se reducen de 31 en el TN a 19 para esta combinación.

iii) V239A/V246G: En ProPred, los alelos para esta región se reducen de 44 a 3.

iv) I286A/Y292E: En ProPred, los alelos se reducen de 41 a 1.

v) V239AA/246G/I286A/Y292E combina los dos dobles anteriores.

vi) M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292E combina todas las mutaciones Sp

vii) TD: S342D/L348D/R403K: Los alelos previstos se reducen de 9 a 1 para el péptido TD 338-352 y los alelos para el péptido TD 392-406 se reducen de 21 a 3. Este triple mutante combina todos los mutantes TD. Todos están expuestos en la superficie y distales al extremo N-terminal de TD, por lo que no se esperaría que interfiriera con SpCBM en forma de hexámero.

Las construcciones se denominan Im28 a Im34:

Variante (SpCBM) Mutaciones

Im28 M156F/L170T

Im29 M156F/L170T/M185I

Im30 V239A/V246G

Im31 I286A/Y292E

Im32 V239A/V246G/I286A/Y292E

Im33 M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292E Variante (PaTD) Mutación

Im34 S342D/L348D/R403K

2.5 Expresión y caracterización biofísica de Im28-Im34

Al igual que con las mutaciones sencillas, las combinaciones Im28 a Im34 fueron sintetizadas por GeneArt y subclonadas en pHISTEV para el análisis de la expresión. También se realizó un desplegable con microesferas de níquel en el extracto soluble marcado con His (Figura 4).

Formas hexaméricas

Diseño de construcciones hexaméricas HEX1 a HEX17

Los genes que codifican las formas hexaméricas (denominadas Hex1 a Hex17) fueron sintetizadas por GeneArt: Sp2CBMTD

variante Mutaciones

HEX1 CBM1(L170T V239A V246G 1286A Y292E)-CBM2(L170T V239A V246G 1286A Y292E)-TD

(S342D L348D R403K)

HEX2 CBM1(V239A V246G 1286A Y292E)-CBM2(V239A V246G 1286A Y292E)-TD (S342D R403K) HEX3 CBM1(V239A V246G I286A)-CBM2(V239A V246G 1286A)-TD (S342D R403K)

HEX4 CBM1(V239A V246G)-CBM2(V239A V246G)-TD (S342D)

HEX5 CBM1(V239A V246G)-CBM2(V239A V246G)-TD(R403K)

HEX6 CBM1(V239A V246G)-CBM2(V239A V246G)-TD (S342D R403K)

HEX17 CBM1 (V239A V246G A162P) - CBM2 (V239A V246G A162P) -TD (S342D R403K)

Las formas hexaméricas se sintetizaron en dos partes para evitar problemas asociados a la síntesis de secuencias repetidas en las copias de CBM en tándem. El primer gen cubría el primer CBM y la segunda parte abarcaba el segundo CBM más el TD. Luego, estos podrían clonarse simultáneamente en pHISTEV para crear la construcción Sp2CBMTD que se trimeriza tras la expresión.

El primer hexámero, HEX1, contenía las mutaciones L170T/V239A/V246G/I286A/Y292E en los CBM y S342D/L348D/R403K en el TD.

Los datos de solubilidad de los dominios individuales indicaron que era poco probable que HEX1 fuera soluble (nuevamente, no necesariamente un reflejo de la utilidad de la molécula); una construcción más, HEX3, fue sintetizada. Cabe señalar que HEX2 contenía las mismas mutaciones que Hex3, pero con la adición de Y292E.

HEX3 se sintetizó y se subclonó en el vector pHISTEV. La expresión fue insoluble en todas las condiciones probadas (temperatura variable, concentración de IPTG, densidad celular en la inducción, con o sin choque térmico). El dominio exclusivo de CBM que contiene las tres mismas mutaciones (V239A V246G I286A) es soluble. Un mutante doble (V239A V246G) se comporta de manera muy similar a TN. Por lo tanto, otras variantes (HEX4, HEX5 y HEX6) fueron diseñadas y construidas por PCR/uniones, que excluyen I286A y contienen una o ambas mutaciones de TD.

Durante el trabajo en HEX6, se diseñaron otras versiones que contenían diferentes combinaciones de las mutaciones HEX6 (numeradas HEX7 a HEX16; no caracterizado).

HEX17 contiene las mutaciones HEX6 con una mutación A162P adicional. Se ha demostrado que esta mutación de prolina aumenta la Tm individual del CBM en 3-4 °C. La mutación de prolina no está cerca de las otras mutaciones, del extremo N- o C-terminal ni del sitio de unión al ligando.

Caracterización de las variantes hexaméricas

Los resultados de expresión, purificación y caracterización se muestran en la Tabla 2. Basándose en estos resultados, HEX6 y HEX17 se adelantaron. Las posiciones de las mutaciones HEX17 en el hexámero se muestran en la Figura 5.

Tabla 2

Tabla 2. Resumen cualitativo de las caracterizaciones biofísicas de las variantes hexamérica Sp2CBMTD. El código de colores es de verde a rojo, donde el verde indica que la variante se parece mucho a su homólogo TN para esa característica particular y el verde pálido (verde') o amarillo indican grados crecientes de diferencias. El rojo o naranja indican diferencias significativas. n.p.: estas caracterizaciones no se realizaron debido a la mala solubilidad/pureza de la proteína. n.d.: no determinado.

EJEMPLO 1: Mediadores inflamatorios.

Objetivo: medir la respuesta inmunitaria innata de las células epiteliales de pulmón humano tratadas con mCBM (A549) mediante el análisis de los niveles de mediadores inflamatorios a lo largo del tiempo.

La administración de Sp2CBMTD a células de mamíferos estimuló una respuesta proinflamatoria tanto in vitro como in vivo1’2 Para determinar si esto se seguía observando con moléculas de unión al ácido siálico hexaméricas modificadas, se estimularon células A549 de mamíferos mediante la adición de 10 pg de agente biológico (Sp2CBMTD (también conocido como SpOrig), Se extrajeron HEX6 o HEX17 y el medio de cultivo celular en puntos de tiempo específicos después de la administración. Las concentraciones de mediadores inflamatorios se midieron mediante ELISA y un ensayo multiplex.

Respuesta de IL-8 humana (citocina de referencia para el estudio) mediante un 1 x kit de ELISA CXCL1/KC Quantikine de ratón para seres humanos (R&D BioSystems). Los niveles de concentración de IL-8 de las células A549 estimuladas se muestran en la Figura 6. Es evidente que cuando las células A549 se estimulan con el hexámero modificado HEX17, los niveles de IL-8 son significativamente más bajos en comparación con Sp2CBMTD (también conocido como SpOrig) o células estimuladas con Hex6.

Respuesta de mediadores inflamatorios mediante un ensayo de 12 plex de citocinas humanas (Bio-Plex Pro™, Bio-Rad). La Figura 7 demuestra el análisis de 12 mediadores inflamatorios del medio de cultivo después de la estimulación de células A549 con Sp2CBMTD (TN, también conocido como SpOrig), HEX6 y HEX17 (variantes) en puntos de tiempo específicos (6 h, 24 h, 48 h). Antes del análisis, las muestras se descongelaron y se diluyeron 1:4 en PBS antes de usar un ensayo HS Cytokine-12 plex para seres humanos (R&D Systems). Los datos indican que:

• HEX17 afecta los niveles de casi todas las citocinas probadas en comparación con SpOrig y HEX6. Hay una reducción significativa en la concentración observada (pg/ml) con los analitos IL-6, IL-8, GM-CSF e IFN-gamma a las 48 h en comparación con SpOrig y HEX6.

• En comparación con el control a las 48 h, HEX17 parece provocar un aumento en el nivel de todas las citocinas probadas a excepción de IL-5 y VEGF (aún por confirmar).

• HEX6 solo mostró una estimulación reducida de IL-6 en comparación con SpOrig a las 48 h.

EJEMPLO 2: Datos de ratones PR8 in vivo.

El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de Sp2CBMTD (SpOrig) y sus variantes, en un modelo de ratón de infección letal por gripe. Cada una de las proteínas candidatas también se administró en ausencia de una infección de gripe para evaluar si solo, provocó alguna morbilidad o mortalidad.

Supervivencia, puntuaciones sintomáticas y pérdida de peso.

Los resultados muestran que ninguno de CBM2 (HEX17), CBM3 (HEX6) o CBM4 (TN, SpOrig) provocaron morbilidad o mortalidad evidentes por sí solos. La administración de una dosis única de 100 pg de CBM2 (HEX17), CBM3 (HEX6) y CBM4 (TN, SpOrig) un día antes de una exposición letal con el virus de la gripe PR8 obtuvieron protección contra la infección PR8, con la mayor eficacia observada con HEX17 (100% de supervivencia), seguido de SpOrig y luego HEX6 (Figura 8). Las puntuaciones sintomáticas también fueron más bajas con HEX17 en comparación con SpOrig y HEX6 (Figura 9). Los ratones de los grupos tratados con una sola dosis alta que sobrevivieron perdieron peso en el pico de infección, pero pronto se recuperaron, a diferencia de los ratones infectados no tratados (Figura 10).

Análisis de anticuerpos anti-mCBM de homogeneizados pulmonares y tejido de suero de un estudio en ratones expuestos a PR8.

El objetivo de este estudio fue determinar si los epítopos inmunogénicos modificados de las variantes modificadas de Sp2CBMTD (SpOrig) demostraron niveles reducidos de anticuerpos en ratones en un estudio de exposición a PR8 (cabe señalar que los epítopos se modificaron en función de la información sobre la unión del MHC de clase II humano). Para ello, los ratones supervivientes del estudio de exposición a PR8 fueron sacrificados el día 21, extrayendo los pulmones y sueros, y analizándolos para determinar los anticuerpos anti-mCBM: IgG, IgA, IgE e IgM contra el antígeno recubierto SpOrig (1 pg/pocillo) en formato ELISA. Los datos mostrados en la Figura 11 indicaron que:

• La proteína HEX17 modificada sí mostró una reducción significativa (p<0,05) en los niveles de IgM de pulmón de ratón en comparación con SPORIG. Debido a que solo sobrevivió un ratón para el tratamiento con HEX6, solo se analizaron estadísticamente los datos de HEX17 y SPORIG.

• Hay algunos indicios de una ligera tendencia a la baja de los niveles de anticuerpos en ratones (IgA e IgM de pulmón) que fueron tratados con CBM modificados en comparación con SpOrig.

Ejemplo 3: Efecto de la administración intranasal repetida de mCBM, Sp2CBMTD y HEX17, en el ratón.

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto sintomático y la respuesta inmunitaria de la administración repetida de Sp2CBMTD (SpOrig) y HEX17 en ratones a lo largo del tiempo.

Procedimientos experimentales

Administración intranasal. En los días 1, 15 y 29, las cohortes de ratones (10 ratones BALB/c hembra y 10 ratones BALB/c macho por agente) recibieron 20 |jg de PBS estéril, Sp2CBMTD o HEX17 por vía intranasal, bajo anestesia gaseosa recuperable (mezcla de isoflurano/oxígeno), a un volumen fijo de 40 jl.

Pesos corporales y observaciones posteriores a la dosis. Todos los ratones se pesaron dos veces por semana desde el día -1 hasta el final del estudio (día 35). Las observaciones posteriores a la dosis se registraron cada 15 min durante las primeras 2 h después de la administración de la dosis y luego cada 30 min durante las siguientes 6 h.

Análisis de muestras de tejido. Se analizaron tejidos de ratón (suero y lavado broncoalveolar (LBA)) para detectar respuestas de anticuerpos anti-CBM (IgG, IgA e IgM) contra Sp2CBMTD o HEX17 como antígenos de recubrimiento (1 jg/pocillo) en un formato ELISA. Lecturas de absorbancia en DO⁴⁵⁰nm (fondo de referencia DO⁶²⁰nm) se midieron para cada muestra después de la reacción de un anticuerpo de detección conjugado con HRP con su sustrato cromogénico 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), a los diferentes tipos de anticuerpos.

Resultados:

Puntuaciones sintomáticas.

Otros estudios adicionales sobre el efecto de la administración intranasal repetida de Sp2CBMTD y Hex17 en ratones revelan que ninguna de las moléculas tuvo un efecto significativo sobre el peso corporal o el consumo de comida. Asimismo, a dosis posteriores, HEX17 parece ser mejor tolerado, con algunos signos clínicos (que se resuelven) (incluyendo piloerección, postura encorvada, poca actividad, ojos parcialmente cerrados y respiración irregular) que se observa durante un período limitado después de administración de Sp2CBMTD.

Análisis de anticuerpos anti-mCBM de suero y tejido de LBA de ratones.

Los datos que se muestran en la Figura 12 indicaron que después de 35 días, donde los ratones recibieron 3 dosis de 20 jg de CBM cada dos semanas entre los días 1 y 29, se indujo una respuesta inmunitaria adaptativa hacia ambos CBM. HEX17 (un ejemplo de un CBM modificado o "desinmunizado" donde los epítopos se modifican en función de la información de unión del MHC de clase II humano como se ha descrito anteriormente) demostró una reducción significativa (p<0,05) de IgA tanto en el LBA como en los tejidos séricos en comparación con los ratones tratados con Sp2CBMTD. Esto se observó frente a ambos antígenos recubiertos. La diferencia en la respuesta de IgA entre los dos candidatos también fue significativa entre los ratones macho y hembra. La diferencia en la respuesta de IgG fue más evidente en las muestras de LBA que en los sueros. También hubo una reducción significativa de los niveles de IgM de las muestras de suero y LBA cuando se analizaron contra Sp2CBMTD, pero esta no fue significativa en las placas recubiertas con HEX17.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión al ácido siálico que comprende la siguiente secuencia:

GAM VIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHM EFKPDPKAPAFYNLFSVSSAT

KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG

RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDM PDVTHVQIGATKRANNTVW GSNLQIRNLTVYNRALT

PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHM EFKPDPKAPAF

YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV

EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDM PDVTHVQIGATKRANNTVW GSNLQIR

NLTVYNRALTPEEV QK R SG G SLG V PD FESD W FDV SSN SLY TLSH G LQR SPRR V VV EFA R S

SSPSTW NIVM PSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVW GTGYFGGIDNSATTRFAT

GYYRVRAWI

2. La molécula de unión al ácido siálico de la reivindicación 1 para usar en terapia o como un medicamento.

3. La molécula de unión al ácido siálico para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la molécula de unión al ácido siálico modula respuestas inmunitarias en sujetos humanos o animales.

4. La molécula de unión al ácido siálico para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la molécula de unión al ácido siálico se utiliza como adyuvante.

5. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión al ácido siálico de acuerdo con la reivindicación 1, formulada junto con uno o más excipientes, vehículos, adyuvantes y/o tampones.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde la composición está formulada para la administración oral, mucosa o parenteral.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde la composición está formulada para la administración intranasal o por inhalación.

8. Un método para preparar la composición farmacéutica de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende formular la molécula de unión al ácido siálico de la reivindicación 1 junto con uno o más excipientes, vehículos, adyuvantes y/o tampones.