JP2021511308A - 改変タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、いかなるタンパク質ベースの治療薬(therapeutic)を用いる場合も、生物学的製剤に対する患者の免疫応答と関連する有害作用のリスクがある。ある場合には、生物学的製剤は、抗薬物抗体(ADA)と薬物の間の免疫複合体(IC)の形成をもたらす可能性のあるADAの産生を誘導することもある。そのような複合体の存在は、有効性を低下させるか、もしくは治療薬の半減期を変えることもあり、または過敏症反応などの有害作用を引き起こす可能性もあるであろう。
タンパク質の免疫原性に影響を与える多くの因子が存在する。1つの重要な決定因子は、抗体産生につながるT細胞依存的な事象を誘発する可能性がある固有のエピトープの存在である。T細胞は、抗原提示細胞(APC)内に生じるタンパク質抗原のプロセシングに由来する短いペプチドフラグメントを認識する。これらのフラグメントの一部は、ヒト白血球抗原(HLA)/主要組織適合抗原複合体(MHC)クラスII分子と複合体を形成することになり、十分に安定して結合していれば、APCの表面に運ばれ、T細胞に提示されることになる。T細胞レセプターによる非自己ペプチドの認識は、続いて起こる免疫応答を誘発する。
本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、1つ以上の改変炭水化物結合モジュール(CBM)を含んでもよい。
明記したとおり、いかなるタンパク質ベースの治療薬を用いる場合も、生物学的製剤に対する患者の免疫応答と関連する有害作用のリスクがある。生物学的製剤は、抗薬物抗体(ADA)と薬物の間の免疫複合体(IC)の形成をもたらす可能性のあるADAの産生を誘発する場合もある。そのような複合体の存在は、有効性を低下させるか、もしくは治療薬の半減期を変えることもあり、または過敏症反応などの有害作用を引き起こす可能性もあるであろう。本開示のCBMは、こうした有害作用のリスクを低下させるために改変された。
したがって、本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、1つ以上の改変ファミリー40炭水化物結合モジュール(CBM40)を含んでもよい。
本明細書全体をとおして、「含む(comprising)」という用語は、実施形態が言及された特徴を「含み」、そのように他の特徴を含んでもよいことを示すよう使用される。ただし、「含む(comprising)」という用語はまた、関連する特徴「から本質的になる」または関連する特徴「からなる」実施形態を包含する場合もある。
一実施形態において、CBMは、酵素(例えば、シアリダーゼ)活性を有する分子の一部として提供されなくても、またはその分子内に含まれなくてもよい。
有用なシアル酸結合分子は、酵素部分およびシアル酸結合部分を含む融合タンパク質であってもよく、この場合、シアル酸結合部分は、本明細書に記載される改変CBMを含む。そのような場合には、酵素部分は、シアル酸結合部分と融合されてもよい。明記したとおり、任意の有用な融合タンパク質の酵素部分は、シアリダーゼ活性を含んでもよい(もしくはそれを有するか、またはそれを示してもよい)。
「改変された」という用語は、参照配列に対して1つ以上の変異を含む分子を包含する。
したがって、改変CBM配列は、一定のまたは特定の野生型CBM由来であってもよい。
改変CBM配列は、1つ以上の変異を含む野生型CBM配列を含んでもよい。
(i)CBMの免疫原性(もしくは抗原性)を変えてもよく;および/または
(ii)(CBMもしくは改変CBMを含む任意の多量体分子の)効力を変えてもよく(例えば、向上させてもよく)および/または
(iii)それらは、CBMの熱安定性を調節してもよい(例えば、向上させてもよい);および/または
(iv)それらは、CBMの溶解性を調節してもよい(例えば、向上させてもよい);および/または
(v)それらは、分子の生体内半減期を調節してもよい(例えば、向上させてもよい)
(i)1つ以上のアミノ酸置換(ここでは、1つ以上の野生型アミノ酸が別の(異なる)アミノ酸で置き換えられるか、または変えられ、「置換」という用語は、保存的アミノ酸置換を含むであろう);および/または
(ii)1つ以上のアミノ酸除去(ここでは、1つ以上の野生型アミノ酸残基が除去される);および/または
(iii)1つ以上のアミノ酸付加/挿入(ここでは、追加のアミノ酸残基が野生型(もしくは参照)一次配列に付加される);および/または
(iv)1つ以上のアミノ酸/配列反転(通常、ここでは、一次配列中の2つ以上連続的なアミノ酸が反転される;および/または
(v)1つ以上のアミノ酸/配列重複(ここでは、一次アミノ酸配列のアミノ酸もしくはその一部(例えば、一続きの5〜10アミノ酸)が繰り返される)
明記したとおり、本開示による改変CBMは、本明細書に記載されている1つ以上の変異を含んでもよい。
配列番号1
MSYFRNRDID IERNSMNRSV QERKCRYSIR KLSVGAVSMI VGAVVFGTSP VLAQEGASEQ
PLANETQLSG ESSTLTDTEK SQPSSETELS GNKQEQERKD KQEEKIPRDY YARDLENVET
VIEKEDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVSSATKKD
EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR
LYVNGVLSRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE
VQKRSQLFKR SDLEKKLPEG AALTEKTDIF ESGRNGKPNK DGIKSYRIPA LLKTDKGTLI
AGADERRLHS SDWGDIGMVI RRSEDNGKTW GDRVTITNLR DNPKASDPSI GSPVNIDMVL
VQDPETKRIF SIYDMFPEGK GIFGMSSQKE EAYKKIDGKT YQILYREGEK GAYTIRENGT
VYTPDGKATD YRVVVDPVKP AYSDKGDLYK GNQLLGNIYF TTNKTSPFRI AKDSYLWMSY
SDDDGKTWSA PQDITPMVKA DWMKFLGVGP GTGIVLRNGP HKGRILIPVY TTNNVSHLNG
SQSSRIIYSD DHGKTWHAGE AVNDNRQVDG QKIHSSTMNN RRAQNTESTV VQLNNGDVKL
FMRGLTGDLQ VATSKDGGVT WEKDIKRYPQ VKDVYVQMSA IHTMHEGKEY IILSNAGGPK
RENGMVHLAR VEENGELTWL KHNPIQKGEF AYNSLQELGN GEYGILYEHT EKGQNAYTLS
FRKFNWDFLS KDLISPTEAK VKRTREMGKG VIGLEFDSEV LVNKAPTLQL ANGKTARFMT
QYDTKTLLFT VDSEDMGQKV TGLAEGAIES MHNLPVSVAG TKLSNGMNGS EAAVHEVPEY
TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTAGEE AAPTVEKPEF
TGGVNGTEPA VHEIAEYKGS DSLVTLTTKE DYTYKAPLAQ QALPETGNKE SDLLASLGLT
AFFLGLFTLG KKREQ
よって、本開示は、配列番号2(および/または配列番号1)の改変型を含むシアル酸結合分子を提供する。配列番号2の改変型は、1つ以上の変異した残基を含んでもよく、この変異は、例えば、配列番号2の配列に対して行われたアミノ酸置換、付加/挿入、重複、除去および/または反転である。
配列番号3
MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA
DGMPAWLVQG IGGRAQWTYS LSTNQHAQAS SFGWRMTTEM KVLSGGMITN YYANGTQRVL
PIISLDSSGN LVVEFEGQTG RTVLATGTAA TEYHKFELVF LPGSNPSASF YFDGKLIRDN
IQPTASKQNM IVWGNGSSNT DGVAAYRDIK FEIQGDVIFR GPDRIPSIVA SSVTPGVVTA
FAEKRVGGGD PGALSNTNDI ITRTSRDGGI TWDTELNLTE QINVSDEFDF SDPRPIYDPS
SNTVLVSYAR WPTDAAQNGD RIKPWMPNGI FYSVYDVASG NWQAPIDVTD QVKERSFQIA
GWGGSELYRR NTSLNSQQDW QSNAKIRIVD GAANQIQVAD GSRKYVVTLS IDESGGLVAN
LNGVSAPIIL QSEHAKVHSF HDYELQYSAL NHTTTLFVDG QQITTWAGEV SQENNIQFGN
ADAQIDGRLH VQKIVLTQQG HNLVEFDAFY LAQQTPEVEK DLEKLGWTKI KTGNTMSLYG
NASVNPGPGH GITLTRQQNI SGSQNGRLIY PAIVLDRFFL NVMSIYSDDG GSNWQTGSTL
PIPFRWKSSS ILETLEPSEA DMVELQNGDL LLTARLDFNQ IVNGVNYSPR QQFLSKDGGI
TWSLLEANNA NVFSNISTGT VDASITRFEQ SDGSHFLLFT NPQGNPAGTN GRQNLGLWFS
FDEGVTWKGP IQLVNGASAY SDIYQLDSEN AIVIVETDNS NMRILRMPIT LLKQKLTLSQ
N
よって、本開示は、配列番号4(および/または配列番号3)の改変型を含むシアル酸結合分子を提供する。配列番号4の改変型は、1つ以上の変異した残基を含んでもよく、この変異は、例えば、配列番号4の配列に対して行われたアミノ酸置換、付加/挿入、重複、除去および/または反転である。
(i)5アミノ酸リンカー: ALXGS
LQALG
GGXSG
GGALG
GGSLG
(ii)10アミノ酸リンカー: ALXGSGGGSG
LQALGGGGSL
(iii)15アミノ酸リンカー:ALXGSGGGSGGGGSG
ここで、「X」は、任意のアミノ酸である。
配列番号13
MNTYFDIPHR LVGKALYESY YDHFGQMDIL SDGSLYLIYR RATEHVGGSD GRVVFSKLEG
GIWSAPTIVA QAGGQDFRDV AGGTMPSGRI VAASTVYETG EVKVYVSDDS GVTWVHKFTL
ARGGADYNFA HGKSFQVGAR YVIPLYAATG VNYELKWLES SDGGETWGEG STIYSGNTPY
NETSYLPVGD GVILAVARVG SGAGGALRQF ISLDDGGTWT DQGNVTAQNG DSTDILVAPS
LSYIYSEGGT PHVVLLYTNR TTHFCYYRTI LLAKAVAGSS GWTERVPVYS APAASGYTSQ
VVLGGRRILG NLFRETSSTT SGAYQFEVYL GGVPDFESDW FSVSSNSLYT LSHGLQRSPR
RVVVEFARSS SPSTWNIVMP SYFNDGGHKG SGAQVEVGSL NIRLGTGAAV WGTGYFGGID
NSATTRFATG YYRVRAWI
明記したとおり、本発明は、改変オリゴマー形成ドメインを利用してもよい。改変オリゴマー形成ドメインは、参照オリゴマー形成配列に対して1つ以上の変異を含むオリゴマー形成ドメインを含んでもよい。
「参照オリゴマー形成配列」は、例えば、上記の配列番号13および14を含む、任意の野生型オリゴマー形成ドメイン配列であってもよい。
したがって、改変オリゴマー形成ドメインは、一定のまたは特定の野生型オリゴマー形成ドメイン由来であってもよい。
改変オリゴマー形成ドメイン配列は、1つ以上の変異を含む野生型オリゴマー形成ドメイン配列を含んでもよい。
(i)オリゴマー形成ドメインの免疫原性(もしくは抗原性)を変えてもよく;および/または
(ii)(例えば、1つ以上の改変CBMを含む多量体分子の)効力を向上させてもよく;および/または
(iii)それらは、オリゴマー形成ドメインの熱安定性を調節してもよく(例えば、向上させてもよく);および/または
(iv)それらは、オリゴマー形成ドメインの溶解性を調節してもよく(例えば、向上させてもよく);および/または
(v)それらは、オリゴマー形成ドメインの生体内半減期を調節してもよい(例えば、向上させてもよい)。
改変オリゴマー形成ドメインと関連した、「変異」という用語は、上で定義されたとおりである。
あらゆる場合において、変異は、CBMもしくはオリゴマー形成ドメインまたは同じものを含むシアル酸結合分子の免疫学的/抗原特性を調節してもよい。
配列番号1の167〜178(すなわち、配列:FYNLFSVSSATK)
配列番号1の167〜181(すなわち、配列:FYNLFSVSSATKKDE)
配列番号1の239〜251(すなわち、配列:VRLYVNGVLSRTS)
配列番号1の236〜250(すなわち、配列 KGRVRLYVNGVLSRT)
配列番号1の245〜254(すなわち、配列:GVLSRTSLRS)
配列番号1の286〜294(すなわち、配列 IRNLTVYNR)
は、免疫原性/抗原性と特定された。残基245〜254にわたる領域は顕著な免疫原性の場所であることが特定されていることに留意すべきである。
配列番号13の340〜349(すなわち、配列:WFSVSSNSLY)
配列番号13の351〜359(すなわち、配列:LSHGLQRSP)
配列番号13の398〜406(すなわち、配列:GSLNIRLGT)
配列番号13の392〜406(すなわち、配列:GAQVEVGSLNIRLGT)
配列番号13の338〜352(すなわち、配列:SDWFSVSSNSLYTLS)
は、免疫原性/抗原性と特定された。残基340〜349、351〜359および398〜406にわたる領域は、顕著な免疫原性の場所であることが特定されたことに留意すべきである。
まとめて、(CBMおよびオリゴマー形成ドメインの両方の)これらの領域は、「免疫原性/抗原性」の領域と呼ばれることになる。
したがって、使用のための改変CBMおよび/またはオリゴマー形成は、例えば、免疫原性/抗原性の上で特定された領域内の1つ以上のアミノ酸残基(またはアミノ酸配列)を変異させること(例えば、置換すること、除去すること、付加すること、反転させることおよび/または重複させること)によって形成することができる。
さらに、本発明は、(上記のとおりの)改変された免疫学的プロファイルを有するCBMを得る方法によって得ることができる改変CBMを提供する。
さらに、本発明は、(上記のとおりの)改変された免疫学的プロファイルを有するオリゴマー形成ドメインを得る方法によって得ることができる改変オリゴマー形成ドメインを提供する。
本開示は、改変された多量体CBMを得る方法をさらに提供する。本方法は、
上記のとおり改変された免疫学的プロファイルを有する少なくとも1つのCBMを得ることと、任意に上記のとおり改変された免疫学的プロファイルを有するオリゴマー形成ドメインを得ることと、
少なくとも1つの改変CBMを含む多量体CBMを作り出すことと、を含んでもよい。
ユーザーは、CBM/オリゴマー形成ドメインの免疫原性/抗原性に影響があるが、同時に(CBMのシアル酸結合特性およびオリゴマー形成ドメインのオリゴマー形成特性に非常に重要な場合もある)タンパク質構造に影響を与えないであろう変異を特定することを目指すであろう。例えば、本明細書中で開示されている改変CBMは、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価される場合にシアリルラクトースに対する結合親和性を維持してもよい。
残基167(F)、168(Y)、169(N)、170(L)、171(F)、172(S)、173(V)、174(S)、175(S)、176(A)、177(T)、178(K)、179(K)、180(D)、181(E)、236(K)、237(G)、238(R)、239(V)、240(R)、241(L)、242(Y)、243(V)、244(N)、245(G)、246(V)、247(L)、248(S)、249(R)、250(T)、251(S)、252(L)、253(R)、254(S)、286(I)、287(R)、288(N)、289(L)、290(T)、291(V)、292(Y)、293(N)および/または294(R)
残基338(S)、339(D)、340(W)、341(F)、342(S)、343(V)、344(S)、345(S)、346(N)、347(S)、348(L)、349(Y)、350(T)、351(L)、352(S)、353(H)、354(G)、355(L)、356(Q)、357(R)、358(S)、359(P)、392(G)、393(A)、394(Q)、395(V)、396(E)、397(V)、398(G)、399(S)、400(L)、401(N)、402(I)、403(R)、404(L)、405(G)および/または406(T)。
(i) M156F
(ii) Y168W(「Im15」と呼ぶ)
(iii) L170A(「Im16」と呼ぶ)
(iv) L170T(「Im17」と呼ぶ)
(v) V173G(「Im18」と呼ぶ)
(vi) M185I
(vii) V239A(「Im19」と呼ぶ)
(viii) V239T(「Im20」と呼ぶ)
(ix) V246G(「Im21」と呼ぶ)
(x) I286A(「Im22」と呼ぶ)
(xi) Y292E(「Im23」と呼ぶ)
さらに、再び非限定例として、PaTD分子に関して、以下の変異の1つ以上が生じさせられてもよい。
(i) S342D(「Im24」と呼ぶ)
(ii) S345D(「Im25」と呼ぶ)
(iii) L348D(「Im26」と呼ぶ)
(iv) R403K(「Im27」と呼ぶ)
さらに、上で挙げた変異は例にすぎず、当然のことながら、所望の特性(例えば、ヒト宿主における免疫原性/抗原性の低下)を有するCBM/オリゴマー形成ドメインをもたらす、示した位置にあるあらゆる変異が本発明の範囲内に含まれるべきである。
任意の変異誘発手順に先立って、野生型CBMおよび/またはオリゴマー形成ドメイン核酸配列は、例えば、細菌(例えば、E.coli)発現系などの発現系における発現のためにコドンが最適化される、コドン最適化処理に供されてもよい。
一実施形態において、シアル酸結合分子は、六量体CBMを含んでもよい。六量体CBMは、6つのCBM単量体を含む。大半の場合、六量体CBMは、2つの融合したCBMを含み、それが、融合したオリゴマー形成(三量体形成)ドメインによりそれら自体にさらに結合される。
(i) HEX1
CBM1 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----CBM2 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----TD (S342D L348D R403K)
(ii) HEX2
CBM1 (V239A V246G I286A Y292E)----CBM2 (V239A V246G I286A Y292E)----TD (S342D R403K)
(iii) HEX3
CBM1 (V239A V246G I286A)-----CBM2 (V239A V246G I286A)-----TD (S342D R403K)
(iv) HEX4
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D)
(v) HEX5
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (R403K)
(vi) HEX6
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D R403K)
(vii) HEX17
CBM1 (V239A V246G A162P)-----CBM2 (V239A V246G A162P)-----TD (S342D R403K)
SpOrig GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
HEX6 GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
HEX17 GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSAT
SpOrig KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
HEX6 KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
HEX17 KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
SpOrig RVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
HEX6 RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
HEX17 RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
SpOrig PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
HEX6 PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
HEX17 PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAF
SpOrig YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
HEX6 YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
HEX17 YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
SpOrig EKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
HEX6 EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
HEX17 EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
SpOrig NLTVYNRALTPEEVQKRSGGALGVPDFESDWFSVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
HEX6 NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
HEX17 NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
SpOrig SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIRLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
HEX6 SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
HEX17 SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
SpOrig GYYRVRAWI
HEX6 GYYRVRAWI
HEX17 GYYRVRAWI
(i)疾患の処置および/または予防を必要とする対象における疾患の処置および/または予防に;
(ii)(ヒトまたは動物対象における)免疫応答の調節に;
(iii)細胞成長、増殖および/または分化の調節に
(iv)アジュバントとして;および/または
(vi)医薬の製造に
有用な場合もある。
敗血症の処置および/または予防にシアル酸結合分子をどのように使用することができるかの完全な開示に関しては、内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするPCT/GB2017/052800を参照のこと
例として、(任意の改変CBMまたは同じものを含む分子を含む)本明細書に記載される分子は、1つ以上(例えば、2、3、4つ以上)の例えば、治療的および/または細胞傷害性である部分と結合されてもよい。
有用な分子は、異種部分と結合した(連結された、結びつけられた、または別の方法で関連づけられた)本開示の改変CBMを含んでもよい。異種部分は、改変CBM分子の一部の部分に結合されてもよい治療的および/または細胞傷害性部分を含んでもよい。
例えば、異種部分は、改変CBM分子の一端または両端と結合されてもよい。異種部分は、さらにまたは代わりに改変CBM分子の内部部分に結合されてもよい(またはさらには融合されてもよい)。当然のことながら、異種部分は改変CBM分子に結合されるが、分子は(その結合も)、改変CBM分子の炭水化物(シアル酸)結合特性を(実質的に)妨げても、除去しても、または低下させてもならない。
本開示は、本明細書に記載のさまざまな使用、薬剤および方法に利用するための組成物を提供することができる。したがって、本明細書に記載されている任意の改変CBM(または改変CBMを含む任意の分子)は、使用のために製剤化されてもよい。
都合上、組成物、製剤および同種のものについて記載する下記セクションに関して、本明細書に記載される改変CBMを含む分子、同じものを含む分子および同じものを含む任意の複合物(例えば、改変CBM::薬物複合物/融合物)はともに、一般用語「改変CBMを含む分子」に含まれることになることに留意すべきである。
本明細書に記載されている分子は、(経口を含む)経腸、非経口および/または局所投与用に製剤化されてもよく、当業者は、厳密な製剤化は投与経路に応じて変化する場合もあることを理解するであろう。
改変CBMを含む分子が非経口投与用に製剤化される場合、組成物は、滅菌されてもよい。
本組成物は、油ベースの溶液もしくは水溶液、懸濁液および/またはエマルジョンを含んでもよい。
他の実施形態において、本組成物は、例えば、(溶解性もしくは生分解性)フィルム、ペッサリーまたは(座剤を含む)埋め込み剤(implant)などの埋め込み剤の形をとってもよい。
本明細書に記載されている分子を含む医薬調製物は、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩(浸透圧に影響を与える際に使用するため)、バッファーおよび/または活性化合物と有害な反応をしないその他の物質と混合されてもよい。
本明細書に記載されている1つ以上の分子は、経口用に製剤化され、投与されてもよい。明記したとおり、経口投与は、それ自体が鼻腔内投与および/または吸入による投与を含むであろう、粘膜投与を含むであろう。
固体剤形は、不透明化剤(opacifying agent)を含んでもよく、腸管の特定の部分においてまたはそこへの活性剤(この場合、改変CBMを含む分子または同じものを含む複合物)の遅延放出を確保するよう製剤化されてもよい。
経口投与用の液体剤形(明記したとおり)としては、乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を挙げることができ。液体剤形は、化合物または組成物に加えて、当該技術分野において一般的に使用される水またはその他の溶媒などの不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤を含んでもよい。
本発明は、以下を示す以下の図を参照して詳細に記載される。
Sp2CBMTD:免疫原性領域の予測
Nordic Biopharmaインシリコスクリーニング
インシリコT細胞エピトープスクリーニングは、4つの顕著な免疫原性集団および2つの境界の免疫原性集団を特定した。
顕著:
ドメイン 残基範囲 配列
SpCBM 245〜254 GVLSRTSLRS
PaTD 340〜349 WFSVSSNSLY
PaTD 351〜359 LSHGLQRSP
PaTD 398〜406 GSLNIRLGT
境界:
ドメイン 残基範囲 配列
SpCBM 167〜178 FYNLFSVSSATK
SpCBM 239〜251 VRLYVNGVLSRTS
Proimmune調査は、抗原性が高い2つの領域および抗原性が中程度の2つの領域を強調した。
抗原性が高い:
ドメイン 残基範囲 配列
SpCBM 236〜250 KGRVRLYVNGVLSRT
PaTD 392〜406 GAQVEVGSLNIRLGT
抗原性が中程度:
ドメイン 残基範囲 配列
SpCBM 167〜181 FYNLFSVSSATKKDE
PaTD 338〜352 SDWFSVSSNSLYTLS
さらなるインシリコツール、オンラインProPredサーバ4も使用した。ProPredサーバの結果を図1に示す。Nordic Biopharma/Proimmuneエピトープの相対的な位置も強調され、3つの方法間で妥当な一致を示している。ProPredは、上で挙げたエピトープに加えて、SpCBMドメインに別の1つの免疫原性エピトープを強く予測した。
ドメイン 残基範囲 配列
SpCBM 286〜294 IRNLTVYNR
個々のCBMおよびTDドメインにある変異
免疫原性を低下させるであろう変異の設計を導くために、ProPredを使用して、これらのペプチドの各残基をすべて代替残基に替える影響を試験した。アレルバインダー(allele binder)の予測される数を最も減少させたものが確認された。SpCBMおよびTDドメインの両方の結晶構造はわかっているため、タンパク質構造を明らかに妨害するであろう変異を導入する可能性を低下させるようこれらの変異のモデルも作った。
注:Im1〜Im14(示さず)は、Proimmuneデータが利用可能になる前にコドン最適化されていないバックグラウンドに変異誘発によって導入された。
WTおよび変異コンストラクトの合成
WT SpCBM、WT PaTDおよびバリアントIm15〜Im27をコードする遺伝子をE.coli発現のためにコドン最適化し、GeneArtによって合成した。その遺伝子を、その後、6Hisタグ付きタンパク質としての発現のために社内でpHISTEVベクターにクローン化した。
溶解性を評価するために最初の発現試験を実施した。結果は、すべてが発現したが、すべてが溶解性な訳ではなかったことを示している(図2)。注:溶解性(またはその欠如)が必ずしも有用性の予測因子ではない。当業者は、タンパク質を製造または生産するとき、特定のプロセスには、(封入体および同種のものから)容易に精製されるため、不溶性材料の使用が必要とされることを理解するであろう。下流のプロトコルは、その後、溶解性などの特徴を調節するためにタンパク質を再構築してもよい。
・Im16(L170A)は、不溶性であるか、または非常に難溶性である
・Im25(TD、S345D)は、不溶性である
・Im15(Y168W)およびIm17(L170T)は、低下した溶解性を有する
・Im18(V173G)およびIm22(I286A)は、わずかに低下している。
・残りは、可溶性発現を示す。
13の可溶性タンパク質をE.coliにおいて発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)に続く6Hisタグを除去するためのTEV消化、その後、リバースIMAC(reverse IMAC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。
(i)融解温度(Tm)を測定するためのThermofluor
(ii)三次構造をWTと比較するための近紫外円二色性(CD)
(iii)溶液中のオリゴマー状態を調べるための動的光散乱(DLS)
(iv)シアリルラクトースに対する結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴(SPR)
(v)IL−8サイトカイン刺激の測定
Im15、Im16、Im17、Im18はすべて、不溶性または難溶性である(明記したとおり、これは、必ずしもタンパク質の有用性に影響を与える訳ではない)。これらは、「中程度に」抗原性の領域167〜181(FYNLFSVSSATKKDE)にある。この領域は、明らかに変化に非常に影響されやすい。
前の結果は、L170(およびI286)に隣接したM156FがTmを約4℃上昇させることを示している。
したがって、これはL170Tと組み合わせることができるであろう。M156Fは、予測される免疫原性を増加させない。
Spペプチド236〜250:
Im19、Im20、Im21はすべて、WTと同様に挙動した。これらは、「高度に」抗原性の領域236〜250(KGRVRLYVNGVLSRT)にある。
トレオニン変異(Im20、V239T)よりもIm19(V239A)を選択した。予測される免疫原性に差はないが、Im19は、WT Thermofluor Tmおよび近紫外スペクトルとより一致している。これは、Im21(V246G)と組み合わされるであろう。
Im22(I286A)は、WTと大まかに類似しているが、Im23(Y292E)は、低いリガンド親和性を示すようである。この領域、286〜294IRNLTVYNRは、Proimmuneによってはフラグが立たなかったが、ProPredによっては免疫原性であると強く予測されている。
Im22がWTよりも低いTmを有するいくつかの指標がある。この残基は、M156に隣接しているため、M156Fが含まれた場合、異なるように挙動する可能性がある。
Im24(S342D)およびIm26(L348D)は、WT三量体形成ドメインと類似の特徴を示すが、Im26のTmの低下がいくらか示唆される。これらは、「中程度に」抗原性の領域338〜352SDWFSVSSNSLYTLSにある。WT配列は、9つのアレルと結合することが予測されたが、Im24は、2つのアレルを予測し、Im24/Im26二重変異体は、1つのアレルを予測する。
TDペプチド392〜406:
Im27(R403K)は、WTと類似している。これは、「高度に」抗原性の領域392〜406GAQVEVGSLNIRLGTの一部である。この変異が導入されると、予測されるアレルは、21から3に減少する。
以下の変異を導入した。
i)M156F/L170T
ii)M156F/L170T/M185I:ProPredにおいて、この領域に関して予測されるアレルは、WTの31からこの組み合わせの19に減少している。
iii)V239A/V246G:ProPredにおいて、この領域に関するアレルは、44から3に減少している。
iv)I286A/Y292E:ProPredにおいて、アレルは、41から1に減少している。
v)V239A/V246G/I286A/Y292Eは、先行する前の二重のものを組み合わせている。
vi)M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292Eは、すべてのSp変異を組み合わせている
vii)TD:S342D/L348D/R403K:予測されるアレルは、TDペプチド338〜352に関しては9から1に減少しており、ペプチドTDペプチド392〜406に関するアレルは、21から3に減少している。この三重変異体は、すべてのTD変異体を組み合わせている。これらはすべて、表面に露出し、TDのN末端の遠位にあるため、六量体型のSpCBMを妨げないことが予想されるであろう。
(SpCBM)バリアント 変異
Im28 M156F/L170T
Im29 M156F/L170T/M185I
Im30 V239A/V246G
Im31 I286A/Y292E
Im32 V239A/V246G/I286A/Y292E
Im33 M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292E
(PaTD)バリアント 変異
Im34 S342D/L348D/R403K
2.5 Im28〜Im34の発現および生物物理学的キャラクタリゼーション
単一の変異と同様に、組み合わせIm28〜Im34をGeneArtによって合成し、発現解析のためにpHISTEVにサブクローニングした。Hisタグ付き可溶性抽出物に対するニッケルビーズプルダウンも実施した(図4)。
第1の六量体、HEX1は、CBMに変異L170T/V239A/V246G/I286A/Y292EおよびTDにS342D/L348D/R403Kを含んでいた。
個々のドメインの溶解性データは、HEX1が可溶性ではなさそうであったことを示した(繰り返すが、必ずしも分子の有用性を反映する訳ではない)。さらなるコンストラクト、HEX3を合成した。なおHEX2には、HEX3と同じ変異が含まれたが、Y292Eが追加された。
HEX6に対する研究の間、HEX6変異の異なる組み合わせを含むいくつかの他のバージョンを設計した(HEX7〜HEX16の番号を付けた;特徴づけされていない)。
HEX17は、追加のA162P変異とともにHEX6変異を含む。このプロリン変異は、単一のCBM Tmを3〜4℃上昇させることが示された。プロリン変異は、他の変異、NもしくはC末端またはリガンド結合部位に近くない。
発現、精製およびキャラクタリゼーションの結果を表2に示す。これらの結果に基づいて、HEX6およびHEX17を前に進めた。六量体上のHEX17変異の位置を図5に示す。
炎症性メディエーター。
目的:経時的に炎症性メディエーターのレベルを分析することによってmCBM処理ヒト肺上皮細胞(A549)の自然免疫応答を評価すること。
Sp2CBMTDの哺乳動物細胞への投与は、インビトロおよびインビボの両方において炎症促進応答を刺激した1、2。これが改変六量体シアル酸結合分子を用いても依然として観察されるかどうかを判断するために、10μgの生物学的製剤(Sp2CBMTD(別名SpOrig)、HEX6またはHEX17の添加によって哺乳動物A549細胞を刺激し、投与後の特定の時点に細胞培養培地を採取した。炎症性メディエーターの濃度をELISAおよび多重アッセイの両方によって測定した。
ヒト1×Mouse CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit(R&D BioSystems)を使用したヒトIL−8(試験のための基準サイトカイン)応答。刺激したA549細胞からのIL−8の濃度レベルを図6に示す。A549細胞が改変六量体HEX17により刺激されると、IL−8レベルがSp2CBMTD(別名SpOrig)、またはHEX6刺激細胞と比較した場合よりも有意に低いことが明らかである。
・HEX17は、SpOrigおよびHEX6と比較して、試験したほぼすべてのサイトカインのレベルに影響を及ぼしている。SpOrigおよびHEX6と比較した場合に、48hの時点で分析物IL−6、IL−8、GM−CSFおよびIFN−ガンマの観察された濃度(pg/ml)が有意に低下している。
・48hの時点の対照と比較した場合、HEX17は、IL−5、およびVEGF(まだ確認されていない)を除く試験したすべてのサイトカインのレベルを増加させたようである。
・HEX6は、48hの時点においてSpOrigと比較してIL−6刺激の低下のみを示した。
インビボにおけるPR8マウスデータ。
試験の目的は、致死性インフルエンザ感染症のマウスモデルにおいてSp2CBMTD(SpOrig)およびそのバリアントの効力を評価することであった。単独で病的状態または大量死を引き起こすかどうかを評価するために各候補タンパク質をインフルエンザ感染症でない状態でも投与した。
この結果は、CBM2(HEX17)、CBM3(HEX6)またはCBM4(WT、SpOrig)のいずれも、単独でいかなる明白な病的状態または大量死も引き起こさなかったことを示している。PR8インフルエンザウイルスによる致死的攻撃の1日前のCBM2(HEX17)、CBM3(HEX6)およびCBM4(WT、SpOrig)のいずれかの単回の100μg用量の投与がPR8感染から保護し、最大の効力はHEX17(100%生存)で見られ、続いて、SpOrig、次にHEX6であった(図8)。臨床スコアも、SpOrigおよびHEX6と比較してHEX17で低かった(図9)。生き延びた単回高用量処置群のマウスはすべて、ピーク感染時に体重が減少したが、未処置の感染マウスとは対照的にすぐに回復した(図10)。
この試験の目的は、Sp2CBMTD(SpOrig)の改変されたバリアントの改変された免疫原性エピトープがPR8攻撃試験のマウスにおいて抗体レベルの低下を示せるかどうかを判定することであった(エピトープは、ヒトMHCクラスII結合情報に基づいて改変されたことに留意すべきである)。これに関して、PR8攻撃試験から生き延びたマウスを21日目に選別し、肺および血清を採取し、ELISA方式で被覆抗原SpOrig(1μg/ウェル)に対する抗mCBM抗体、IgG、IgA、IgEおよびIgMに関して試験した。図11に示したデータは、以下のことを示した。
・改変タンパク質HEX17は、SPORIGと比較してマウス肺IgMレベルの有意な(p<0.05)低下を示した。HEX6処置については生き残っているマウスが1匹のみのため、HEX17およびSpOrigのデータのみを統計分析した。
・SpOrigと比較して改変CBMで処置したマウスにおいて抗体レベルのわずかな低下傾向(肺IgAおよびIgM)のいくつかの指標がある。
マウスにおけるmCBM、Sp2CBMTDおよびHEX17の反復鼻腔内投薬の影響。
この試験の目的は、マウスにおける経時的なSp2CBMTD(SpOrig)およびHEX17の両方の反復投薬の臨床的影響および免疫応答を評価することであった。
実験手順
鼻腔内投薬。1、15および29日目に、マウスの群(薬剤毎に10匹の雌、10匹の雄のBALB/cマウス)に、40μLの固定体積で回復可能なガス麻酔(イソフルラン/酸素混合物)下において鼻腔内経路により20μgの滅菌PBS、Sp2CBMTDまたはHEX17のいずれかを投与した。
体重および投与後の所見。−1日目から試験終了(35日目)まで週に2回すべてのマウスを計量した。用量投与後の最初の2hは15分毎、その後、次の6hは30分毎に投与後の所見を記録した。
臨床スコア。
マウスにおけるSp2CBMTDおよびHEX17の反復鼻腔内投薬の影響についてのさらなる試験は、いずれの分子も体重または食餌摂取にいかなる著しい影響もなかったことを明らかにしている。さらに、より後の用量において、HEX17は、より良好な認容性を示したようであり、いくつかの(回復する)臨床徴候(立毛、背中を丸めた姿勢、活動性低下、半ば閉じた眼および不規則な呼吸を含む)がSp2CBMTD投与後の限定された期間に確認された。
図12に示したデータは、1〜29日目の間に2週間毎に20μgのCBMの3用量をマウスに与えた場合、35日後に適応免疫応答が両CBMに対して誘発されたことを示した。HEX17(エピトープが前に示されたヒトMHCクラスII結合情報に基づいて改変された改変CBMまたは「脱免疫化」CBMの例)は、BALおよび血清組織の両方においてSp2CBMTD処置マウスと比較してIgAの有意な(p<0.05)減少を実証した。これは、両被覆抗原に対して観察された。2つの候補間のIgA応答の差も雄および雌マウス間で著しかった。IgG応答の差は、血清よりもBALサンプルでより明らかであった。Sp2CBMTDに対して試験した場合、BALおよび血清サンプルの両方のIgMレベルの有意な低下もあったが、これは、HEX17被覆プレートでは有意でなかった。
Claims (10)
- 1つ以上の改変ファミリー40炭水化物結合モジュール(CBM40)を含む、シアル酸結合分子。
- 1つ以上の改変CBM40が、参照配列に対して1つ以上の変異を含む、請求項1に記載のシアル酸結合分子。
- 参照配列が、
(i)野生型ファミリー40CBM配列;
(ii)Vibrio choleraeの野生型CBM40配列;
(iii)Vibrio choleraeのNanHシアリダーゼ配列;
(iv)Streptococcus pneumoniaeの野生型CBM40配列;
(v)Streptococcus pneumoniaeのNanAシアリダーゼ配列;
(vi)配列番号1の配列;
(vii)配列番号2の配列;
(viii)配列番号3の配列;および
(ix)配列番号4の配列
からなる群から選択される、請求項1または2に記載のシアル酸結合分子。 - 変異が、
(i)1つ以上のアミノ酸置換;
(ii)1つ以上のアミノ酸除去;
(iii)1つ以上のアミノ酸付加/挿入;
(iv)1つ以上のアミノ酸/配列反転;および
(v)1つ以上のアミノ酸/配列重複
からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシアル酸結合分子。 - シアル酸結合分子が、改変オリゴマー形成ドメインを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のシアル酸結合分子。
- 改変オリゴマー形成ドメインが、参照配列に対して1つ以上の変異を含む、請求項5に記載のシアル酸結合分子。
- 参照配列が、
(i)野生型Pseudomonas aeruginosaシュードアミニダーゼ配列;
(ii)受託番号Q9L6G4として寄託されたPseudomonas aeruginosaシュードアミニダーゼアミノ酸配列;
(iii)配列番号13の配列;および
(iv)配列番号14の配列
からなる群から選択される、請求項5または6に記載のシアル酸結合分子。 - 以下の構造:
CBM1(V239A V246G A162P)--CBM2(V239A V246G A162P)--TD(S342D R403K)
を含み、CBM1およびCBM2はCBM40配列由来であり、TDは三量体形成ドメイン由来である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のシアル酸結合分子。 - 以下の配列を含む、シアル酸結合分子。
GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARSSSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFATGYYRVRAWI - (i)治療に
(ii)疾患の処置および/または予防を必要とする対象における疾患の処置および/または予防に;
(iii)(ヒトまたは動物対象における)免疫応答の調節に;
(iv)細胞成長、増殖および/または分化の調節に
(v)アジュバントとして;
(vi)医薬として;
(vii)がんの処置に;および
(viii)細胞表面シアル酸含有レセプターと結合する病原体によって引き起こされるか、またはもたらされる疾患の処置および/または予防に、
使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のシアル酸結合分子。
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