ES2308817T3 - Ribonucleasa humana con afinidad inhibidora de ribonucleasa reducida. - Google Patents

Ribonucleasa humana con afinidad inhibidora de ribonucleasa reducida. Download PDF

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Abstract

Una ribonucleasa diseñada de la superfamilia de la RNasa A, que tiene al menos una sustitución de aminoácido en una región bucle funcionalmente equivalente a los restos de aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina, ribonucleasa diseñada que tiene una afinidad ligante reducida por el inhibidor de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva la actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas.

Description

Ribonucleasa A humana con afinidad inhibidora de ribonucleasa reducida.
Declaración relativa a investigación o desarrollo federalmente patrocinado
Este invento se realizó con ayuda gubernamental a través de la subvención CA73808 concedida por los "National Institutes of Health". El Gobierno de Estados Unidos posee ciertos derechos sobre este invento.
Antecedentes del invento
El desarrollo de nuevos fármacos ha contribuido al progreso que se ha producido en años recientes en el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Sin embargo, ciertos cánceres son refractarios a los agentes quimioterapéuticos que están actualmente en uso. Estas malignidades tienden a ser particularmente virulentas y están asociadas a un elevado índice de mortalidad. Además, la mayoría de los agentes quimioterapéuticos existentes presentan efectos secundarios indeseables. En consecuencia, hay un continuo interés, tanto dentro de la comunidad médica como entre la población general, en el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de tumores malignos y otros tipos de cáncer.
Se ha mostrado en estudios en Fase I/II que una ribonucleasa presente en la naturaleza, aislada de la rana leopardo (Rana pipiens), presenta actividad antitumoral en pacientes con cáncer pancreático y mesotelioma maligno avanzados e inoperables (Delmonte, Oncology Times volumen 18, nº 8, Agosto de 1996). Se ha examinado la actividad antitumoral de esta ribonucleasa (a la que se hace referencia como "onconasa") en más de 350 pacientes con una diversidad de tumores sólidos, y se ha mostrado que presenta actividad antitumoral frente al carcinoma pancreático metastásico, el cáncer metastásico avanzado de mama y el mesotelioma maligno. La onconasa está siendo ahora utilizada en pruebas clínicas humanas en Fase III frente a los cánceres pancreático y hepático.
En general, parece que la onconasa es relativamente segura para ser utilizada como agente quimioterapéutico en seres humanos. No causa ninguna de las principales toxicidades asociadas a los fármacos citotóxicos convencionales, tal como mielosupresión, toxicidad gastrointestinal o mucositis. Aproximadamente la tercera parte de los pacientes tratados con onconasa desarrollaron síntomas de tipo gripal y artralgia de Grado 3 con o sin edema periférico. La complicación más grave asociada a la administración de onconasa es una función renal disminuida, que se observó en pruebas de graduación de dosis en Fase I. La función renal disminuida resultó reversible tras una reducción de la dosis.
Además de en el tratamiento de diversos tipos de cánceres, las ribonucleasas pueden ser útiles en el tratamiento de personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha comunicado que concentraciones no citotóxicas de onconasa inhiben significativamente la producción de VIH en diversas líneas celulares humanas constantemente infectadas con VIH.
La citotoxicidad de las ribonucleasas se demostró por vez primera en tumores sólidos a los que se había inyectado ribonucleasa A pancreática bovina (RNasa A; EC3.1.27.5) en cantidades de miligramos (L. Ledoux, Nature 176: 36-37, 1955; L. Ledoux, Nature 175: 258-259). Se halló que dosis menores no ejercían efecto alguno sobre los tumores (de Lamirande, Nature 192: 52-54, 1961). En plasma seminal de toro se descubrió una ribonucleasa que es citotóxica en niveles bajos (Floridi et al., Ital. Biol. Sper. 43: 32-36, 1967; Dostal et al., J. Reprod. Fertil. 33: 263-274, 1973). De huevos de rana se aisló una ribonucleasa con una citotoxicidad aún mayor (Ardelt et al., J. Biol. Chem. 266: 245-251, 1991), y esta ribonucleasa es la que ahora se está examinando en pruebas clínicas bajo el nombre de onconasa.
Las ribonucleasas catalizan la degradación del RNA. Se ha demostrado que la actividad ribonucleolítica de las ribonucleasas citotóxicas es necesaria para la citotoxicidad (Kim et al., J. Biol. Chem. 270: 10.525-10.530, 1995; Ardelt et al., J. Biol. Chem. 266: 245-251, 1991). Aunque la citotoxicidad de las ribonucleasas requiere actividad ribonucleolítica, la actividad ribonucleolítica sola no es suficiente para explicar las citotoxicidades diferenciales observadas entre las ribonucleasas. Por ejemplo, la actividad ribonucleolítica de la RNasa A es aproximadamente 1000 veces mayor que la de la onconasa, aunque la onconasa tiene una citotoxicidad mucho mayor que la RNasa A. Por lo tanto, otras propiedades de las enzimas deben explicar esta diferencia.
Las células de los vertebrados contienen un inhibidor de ribonucleasas (RI; del inglés, ribonuclease inhibitor) que protege a las células de los efectos potencialmente letales de la ribonucleasa. El RI es una proteína citosólica de 50 kDa que se une a ribonucleasas con una afinidad variable. Por ejemplo, el RI se une a miembros de la superfamilia de ribonucleasas de la ribonucleasa A pancreática bovina (RNasa A) con constantes de inhibición que abarcan 10 órdenes de magnitud, con K_{i} que varían de 10^{-6} a 10^{-16} M.
Parece que la citotoxicidad de una ribonucleasa está inversamente relacionada con la fuerza de la interacción entre el RI y la ribonucleasa. Por ejemplo, la RNasa A, que se une al RI con una afinidad elevada (K_{i} = 10^{-14} M), no es citotóxica. Por contraste, la onconasa se une al RI con una afinidad relativamente pequeña (K_{i} \geq 10^{-6} M).
Algunas ribonucleasas naturales no se unen al RI. La ribonucleasa seminal bovina (BS-RNasa) tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 80% a la de la RNasa A, pero, a diferencia de la RNasa A, la BS-RNasa existe en forma dímera. Se ha mostrado que la estructura cuaternaria de la BS-RNasa evita la unión por el RI, lo que permite que la enzima conserve su actividad ribonucleolítica en presencia de RI (Kim et al., Biochem. J. 308: 547-550, 1995; Kim et al., J. Biol. Chem. 270: 10.525-10.530, 1995; Kim et al., J. Biol. Chem. 270: 31.097-31.102, 1995). Sin embargo, la onconasa, una proteína con 104 restos de aminoácido que comparte un elevado grado de homología con la RNasa A, es resistente a la unión por RI. El complejo de RI-onconasa tiene una K_{d} \geq 10^{-6} M (Boix et al., J. Mol. Biol. 257: 992-1007, 1996), constante que es al menos 100 millones de veces menor que la del complejo de RI-RNasa A.
De este modo, la distinción esencial entre la onconasa y la RNasa A que explica la citotoxicidad diferencial observada en estas ribonucleasas es que la onconasa es resistente a la inhibición por RI. Las células normales producen un RI que se une no covalentemente a las ribonucleasas con una estequiometría de 1:1 e inhibe la actividad ribonucleolítica. La menor afinidad ligante de la onconasa por el RI evita la inhibición eficaz de la actividad ribonucleolítica. Esta es la mejor explicación para el hecho observado de que la onconasa es citotóxica mientras que la ribonucleasa A no lo es.
Recientes estudios en que se examinaron el aclaramiento plasmático y la distribución tisular de onconasa y RNasa A en ratones mostraron que, tres horas después de la inyección de onconasa o RNasa A, se hallaba un 57% de onconasa en el riñón mientras que sólo se hallaba un 0,9% de ribonucleasa pancreática humana en el riñón (Sung et al., Cancer Res. 56: 4180, 1996). La disminuida función renal observada en pacientes que habían recibido onconasa puede ser una consecuencia de una incapacidad para aclarar eficazmente la proteína onconasa de los riñones.
Una ribonucleasa terapéutica preferida sería una ribonucleasa citotóxica que pudiera ser aclarada más prontamente de los riñones que la onconasa. Sería menos probable que una ribonucleasa citotóxica que fuera prontamente aclarada de los riñones causara toxicidad renal. Puesto que la función renal reducida está limitada por la dosis de onconasa, una ribonucleasa citotóxica que no interfiriera en la función renal presentaría posiblemente la ventaja de una mayor flexibilidad a la hora de determinar las dosificaciones óptimas. Una ribonucleasa con menor toxicidad podría ser administrada en dosis mayores cuando fuera indicado, tal como, por ejemplo, en aquellos casos en que unas dosis aumentadas proporcionasen un tratamiento más eficaz para tipos concretos de cánceres o para individuos concretos.
Los efectos secundarios experimentados por los participantes en pruebas clínicas de onconasa son síntomas que están comúnmente asociados a reacciones inmunes. Es razonable esperar que resultaría menos probable que una ribonucleasa de una especie más íntimamente relacionada con los seres humanos que lo es la rana leopardo causara una reacción inmune. Aún sería menos probable que una ribonucleasa humana provocara una respuesta inmune. La intensidad de una reacción inmune puede ser también mayor cuando se administran cantidades más grandes de la proteína inmunogénica. Por lo tanto, una ribonucleasa citotóxica con una actividad específica mayor que la de la onconasa puede ser potencialmente un agente quimioterapéutico más eficaz. Puede resultar posible alcanzar una citotoxicidad eficaz con la administración de cantidades menores de proteína, reduciéndose de este modo la incidencia y la gravedad de los síntomas asociados a una reacción inmune.
Se necesitan nuevas ribonucleasas citotóxicas con actividad antitumoral para aumentar el espectro de agentes quimioterapéuticos disponibles para el tratamiento de cánceres humanos.
Breve sumario del invento
Un objeto del presente invento es proporcionar una nueva ribonucleasa citotóxica que presente una posible utilidad en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad humana.
Un objeto del presente invento es proporcionar un método para modificar la secuencia de aminoácidos de una ribonucleasa de tipo silvestre, para producir una nueva ribonucleasa citotóxica.
El presente invento es una ribonucleasa que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, en que la ribonucleasa modificada conserva su actividad ribonucleolítica, y en que la ribonucleasa modificada tiene una menor afinidad ligante por RI que la ribonucleasa no modificada y conserva la actividad ribonucleolítica de tipo silvestre.
El presente invento es un método para modificar la secuencia de aminoácidos de una ribonucleasa para producir una ribonucleasa modificada, en que la ribonucleasa modificada conserva su actividad ribonucleolítica, y en que la ribonucleasa modificada tiene una afinidad ligante por RI que es menor que la de la ribonucleasa no modificada y conserva la actividad ribonucleolítica de tipo silvestre.
El presente invento es además el uso de una ribonucleasa del invento en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células cancerosas, en que la ribonucleasa tiene una afinidad ligante por RI que es menor que la de la ribonucleasa no modificada y conserva la actividad ribonucleolítica de tipo silvestre. El medicamento proporciona una cantidad eficaz de la ribonucleasa modificada a las células.
De esta manera, el presente invento proporciona una ribonucleasa diseñada de la superfamilia de la RNasa A, que tiene al menos una sustitución de aminoácido en una región bucle funcionalmente equivalente a los restos de aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina, ribonucleasa diseñada que tiene una reducida afinidad ligante por el inhibidor de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva la actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas.
El presente invento también proporciona una ribonucleasa A modificada de la superfamilia de la RNasa A, ribonucleasa A modificada que ha sido diseñada por modificación humana de la misma, ribonucleasa A modificada cuya estructura tiene una alteración con respecto a la de una correspondiente ribonucleasa A de tipo silvestre, (i) alteración que, por análisis de mejor ajuste, está en la región homóloga a los restos de aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina, y (ii) modificación que proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas. La ribonucleasa presenta una citotoxicidad aumentada con respecto a la correspondiente ribonucleasa no diseñada o no modificada.
El invento proporciona además el uso de una ribonucleasa del invento en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales.
El invento también proporciona un método para crear una molécula de ribonucleasa A diseñada del invento que tiene propiedades citotóxicas, que comprende las operaciones de crear un gen alterado que codifica una ribonucleasa A, gen que tiene una alteración en la región de codificación correspondiente a los aminoácidos 85 a 94 de la ribonucleasa A pancreática bovina, hacer que se exprese el gen alterado en un huésped adecuado, y examinar la afinidad de la expresada ribonucleasa A por el inhibidor de ribonucleasas.
Otros objetos, ventajas y características del presente invento resultarán evidentes después de un examen de la memoria descriptiva, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra la viabilidad de células tumorales tratadas con diferentes ribonucleasas.
Descripción detallada del invento
El presente invento es una diseñada ribonucleasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere, en al menos un resto de aminoácido, de la secuencia de aminoácidos de la correspondiente ribonucleasa de tipo silvestre, ribonucleasa de tipo silvestre que es un miembro de la superfamilia de ribonucleasas de la RNasa A. La ribonucleasa modificada conserva su actividad ribonucleolítica; la afinidad ligante de la ribonucleasa modificada por el inhibidor de ribonucleasas está disminuida con respecto a la afinidad ligante de la ribonucleasa no modificada por el inhibidor de ribonucleasas; y la ribonucleasa modificada presenta una actividad citotóxica aumentada. La modificación proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas.
En los ejemplos mostrados más adelante se describen el diseño, la producción y la caracterización de la RNasa A G88R y la RNasa A G88D, dos moléculas modificadas de la ribonucleasa A pancreática bovina que presentan una afinidad ligante reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de tipo silvestre y una citotoxicidad aumentada. La observación y la metodología de esta memoria descriptiva se pueden aplicar a cualquier ribonucleasa de la superfamilia de la RNasa A.
En la práctica del presente invento se puede utilizar cualquier sustitución de aminoácido que reduzca la afinidad ligante de la ribonucleasa por RI y que no interfiera en la actividad ribonucleolítica. Se ha hallado que se puede alterar eficazmente un locus particular de la enzima para reducir la afinidad por RI. La RNasa A G88R tiene un resto de arginina en lugar del resto de glicocola en el resto de aminoácido 88. Similarmente, el resto de glicocola en el resto de aminoácido 88 de la RNasa A G88D está sustituido por un resto de aspartato. La sustitución por otros restos de aminoácido en una posición correspondiente al resto de aminoácido 88 de la ribonucleasa A pancreática bovina dará lugar a una afinidad ligante alterada por RI, particularmente si el resto de aminoácido tiene una cadena lateral cargada. También serán efectivas las sustituciones próximas a este resto de aminoácido 88 que proporcionen una inhibición estérica de la unión con RI.
Otras modificaciones relativas a la secuencia de aminoácidos de la ribonucleasa A pancreática bovina que tengan lugar en una región bucle definida por los restos de aminoácido 85-94 y que creen dicha interferencia estérica producirán ribonucleasas modificadas que tendrán una afinidad ligante reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de tipo silvestre y una citotoxicidad aumentada. Además, se prevé que también surtan efecto otros grupos covalentemente unidos u otras cadenas laterales, tal como una cadena lateral de sacárido, fijados a esta región de la proteína para proporcionar inhibición estérica.
En la ID. SEC. nº 1 y la ID. SEC. nº 2 se muestran, respectivamente, los oligonucleótidos utilizados para obtener la RNasa A G88R y la RNasa A G88D. A la vista de la degeneración del código genético, es bien sabido que se podrían utilizar otros oligonucleótidos para obtener una ribonucleasa modificada idéntica a la RNasa A G88R o la RNasa A G88D. Con el presente invento se pretende abarcar una ribonucleasa modificada que tiene una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido correspondiente a la posición 88 de la RNasa A pancreática bovina, sin tener en cuenta el medio mediante el cual se obtiene la ribonucleasa modificada. Se espera que, además de la RNasa A pancreática bovina, se puedan utilizar otros miembros de la superfamilia de ribonucleasas de la RNasa A en la práctica del invento. Se espera que una modificación, en una ribonucleasa distinta de la RNasa A pancreática bovina, que tenga lugar en una región bucle correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94 de la RNasa A pancreática bovina produzca una ribonucleasa que tenga una afinidad reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de tipo silvestre y una citotoxicidad aumentada. Por "una región bucle correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94 de la RNasa A pancreática bovina" se quiere significar un bucle que tiene aproximadamente 10-12 restos de aminoácido y que está definido por enlaces disulfuro formados entre dos restos de cisteína, en que la región bucle comienza aproximadamente en los restos de aminoácido 75-85 a partir del extremo N-terminal de la ribonucleasa y en que la secuencia, por secuencia de aminoácidos de "mejor ajuste", corresponde a los restos 85 y 94 de la RNasa A bovina.
La superfamilia de ribonucleasas de la RNasa A constituye un grupo de proteínas homólogas (es decir, evolutivamente relacionadas) procedentes de muchas fuentes de mamíferos, aves, reptiles y anfibios. Estas proteínas tienen cadenas polipeptídicas con una plegadura similar y catalizan la escisión de RNA. Se puede hallar una descripción de esta superfamilia en Beintema et al., Ribonucleases: Structures and Functions, 1997, páginas 245-269, que se incorpora aquí por referencia.
Hay cinco productos homólogos humanos ejemplares de la ribonucleasa A pancreática bovina de los que se espera que sean útiles en el desarrollo de ribonucleasas citotóxicas para uso en el tratamiento de enfermedades humanas. Cada uno de estos cinco productos homólogos tiene una región bucle conservada que es análoga a la región bucle de 10 restos de aminoácido de la RNasa A (Tabla 1).
TABLA 1
1
Por "citotoxicidad aumentada" se quiere significar que la ribonucleasa modificada presenta una citotoxicidad mayor que la de la correspondiente ribonucleasa no modificada. En los ejemplos mostrados más adelante, se evaluó la citotoxicidad utilizando la línea celular K-562 de eritroleucemia humana. Se prevé que la ribonucleasa modificada del presente invento sea citotóxica frente a otras células tumorales además de frente a las células K-562.
La inhibición de la proliferación celular es determinada calculando el porcentaje de células K-562 viables tratadas con la ribonucleasa modificada o la no modificada; se considera que la viabilidad del 100% es el número de células viables que fueron tratadas con una disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate-buffered saline).
Preferiblemente, la ribonucleasa modificada reduce la viabilidad de las células en al menos aproximadamente un 10%. Más preferiblemente, la ribonucleasa modificada reduce la viabilidad celular en al menos un 20%. Muy preferiblemente, la ribonucleasa modificada reduce la viabilidad celular en aproximadamente un 50% o incluso en tanto como aproximadamente un 75%.
El presente invento también proporciona el uso de una ribonucleasa citotóxica del invento en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales. El medicamento proporciona una cantidad eficaz de la ribonucleasa a las células tumorales.
Por "cantidad eficaz" se quiere significar la cantidad de ribonucleasa necesaria para causar una reducción significativa de la proliferación de las células tumorales.
Se diseñaron y produjeron diversas especies de ribonucleasa A pancreática bovina modificada, utilizando una mutagénesis dirigida al sitio y mediada por oligonucleótidos, como se describe en los ejemplos descritos más adelante. Cada ribonucleasa modificada tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la ribonucleasa A pancreática bovina de tipo silvestre en un único resto de aminoácido. Se prevé que ribonucleasas modificadas que tengan múltiples sustituciones puedan ser también útiles en la práctica del presente invento.
El RI se une no covalentemente a la RNasa A con una estequiometría de 1:1. Se ha determinado la estructura tridimensional del complejo entre RI y RNasa A hasta una resolución de 2,5 \ring{A} (factor R de 19,4%) (Kobe et al., Nature 374: 183-186, 1995). Esta estructura mostraba que 24 de los 124 restos de aminoácido de la RNasa A entraban en contacto con RI. Se halló que algunas regiones de la RNasa A que entran en contacto con RI son distintas del sitio catalítico.
Se empleó una mutagénesis dirigida al sitio, como se detalla en los ejemplos descritos más adelante, para definir más la función de la interacción RI-ribonucleasa en la citotoxicidad de la ribonucleasa. En resumen, secuencias de DNA que codificaban la ribonucleasa fueron específicamente alteradas de modo que la expresión de la secuencia diera lugar a nuevas ribonucleasas que contuvieran sustituciones de aminoácido específicas. Se desarrollaron diversas secuencias alteradas en las que un codón que especificaba uno de tres restos de aminoácido de los que se había hallado que formaban múltiples contactos con restos del RI era sustituido por un codón que especificaba un resto de arginina o de aspartato. Se suponía que la introducción de un resto de Arg o Asp causaría una repulsión tanto estérica como electrostática entre el RI y la RNasa A. Se esperaba que esto diera lugar a una afinidad ligante reducida de los mutantes de RNasa A por RI.
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Materiales y métodos Mutagénesis de DNA
La modificación de una RNasa A mediante mutagénesis dirigida al sitio se describe con detalle en la Patente de EE.UU. nº 5.389.537, incorporada aquí por referencia. Un cDNA que codifica RNasa A fue ligado a los sitios MscI y SalI del vector de expresión pET22B(+) (Novagen, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.). El plásmido, denominado pBXR (delCardayré et al., Protein Eng. 8: 261-273, 1995), dirige la expresión de RNasa A en E. coli. Se utilizó la mutagénesis del plásmido pBXR, dirigida al sitio y mediada por oligonucleótidos (Kunkel et al., 1987), para generar moléculas de RNasa A modificadas que tenían una sustitución de aminoácido específica en una posición concreta. Una RNasa A modificada que tenía una sustitución por arginina en el resto 88 fue denominada RNasa A G88R, y una RNasa modificada que tenía una sustitución por aspartato en el resto 88 fue denominada RNasa A G88D. El oligonucleótido utilizado para obtener la RNasa A G88R se muestra en la ID. SEC. nº 1, y el oligonucleótido utilizado para obtener G88D se muestra en la ID. SEC. nº 2. Similarmente, utilizando oligonucleótidos especialmente diseñados, el resto de aspartato del resto de aminoácido 38 fue sustituido por un resto de arginina (RNasa A D38R), y el resto de alanina del resto de aminoácido 109 fue sustituido por un resto de arginina (RNasa A A109R).
Purificación de las variantes proteicas
Los mutantes de RNasa A fueron esencialmente purificados del modo previamente descrito (delCardayré et al., Protein Eng. 8: 261-273, 1995). La onconasa fue purificada a partir de huevos de la rana leopardo del Norte del modo descrito por Wu et al. (J. Biol. Chem. 268: 10.686-10.693, 1993). Alternativamente, la onconasa fue purificada a partir de un sistema de expresión de E.coli, esencialmente del modo descrito por Coix et al. (J. Mol. Biol. 257: 992-1007).
Actividad ribonucleolítica
La capacidad de las ribonucleasas mutantes para catalizar la escisión de RNA polímero fue determinada por espectroscopía UV del modo previamente descrito (delCardayré y Raines, Biochemistry 33: 6031-6037, 1994; (delCardayré y Raines, J. Mol. Biol. 252: 328-336, 1995).
Ensayo de actividad antitumoral
La actividad antitumoral de las ribonucleasas fue evaluada de la manera previamente descrita (Kim et al., J. Biol. Chem. 270: 10.525-10.530, 1995). Se incluyó onconasa como un testigo positivo y se incluyó ribonucleasa A pancreática bovina no modificada como un testigo negativo. El efecto de las distintas ribonucleasas sobre la proliferación de la línea celular K-562 de leucemia mieloide humana (ATCC nº CCL-243) fue evaluado de la manera siguiente. Las células se mantuvieron de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC, con adición de antibióticos. Se evaluó la citotoxicidad de las ribonucleasas con respecto a las células K-562 midiendo la incorporación de [^{3}H]-timidina al DNA recién sintetizado. En resumen, se sembraron células K-562 (0,5 x 10^{4} por pocillo) en placas para microtitulación de 96 pocillos, en volúmenes de 95 \mul. Se cultivaron las células en presencia de las ribonucleasas durante 44 horas, lo que fue seguido de un estímulo de 4 horas con [^{3}H]-timidina (7400 Bq). Las células fueron luego recolectadas sobre filtros de fibra de vidrio utilizando un recolector celular PHD (Cambridge Technology, Inc; Cambridge, Massachusetts, EE.UU.) y fueron lisadas al hacer pasar varios mililitros de agua a través de los filtros. El DNA y otras macromoléculas celulares quedan retenidos por el filtro, mientras que las moléculas pequeñas, incluyendo el marcador no incorporado, atraviesan los filtros. Después de un lavado a fondo con agua, los filtros fueron secados con metanol y fueron sometidos a cuenta utilizando un contador de centelleo para muestras líquidas.
La incorporación de [^{3}H]-timidina mide realmente la síntesis de nuevo DNA. Una incorporación reducida de [^{3}H]-timidina refleja citostasis en lugar de muerte celular. Sin embargo, mediante otros ensayos, se ha mostrado que la onconasa causa muerte celular (Wu et al., J. Biol. Chem. 268: 10.686-10.695).
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Afinidad ligante por RI
Las afinidades ligantes de los diversos mutantes de RNasa fueron cualitativamente evaluadas mediante un ensayo basado en gel (Wu et al., J. Biol. Chem. 268: 10.686-10.693) y fueron cuantitativamente evaluadas (Stone y Hofsteenge, Biochemistry 25: 4622-4628).
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Determinación de la estabilidad térmica
Se evaluó la estabilidad térmica de las ribonucleasas mutantes para determinar si los mutantes serían capaces de resistir la exposición a temperaturas relativamente elevadas (37ºC). Los mutantes que tienen temperaturas de fusión reducidas pueden desnaturalizarse y perder actividad. La estabilidad térmica de cada ribonucleasa mutante fue determinada utilizando una espectroscopía de dicroismo ultravioleta o circular para evaluar la T_{m}, que es la temperatura a la cual la mitad de la proteína está plegada y la otra mitad no plegada.
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Resultados
Se halló que las sustituciones de Asp 38 (RNasa A D38R) y Ala 109 (RNasa A A109R) por arginina ejercían poco o ningún efecto sobre la afinidad ligante de estos mutantes por RI. La actividad ribonucleolítica de estos mutantes se redujo en presencia de RI. Por contraste, se halló que las RNasas A mutantes en que Gly 88 estaba sustituido por una arginina o un aspartato (RNasa A G88R y RNasa A G88D, respectivamente) tenían una afinidad ligante por RI reducida, y estos mutantes permanecían catalíticamente activos en presencia de RI (Tabla 2).
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TABLA 2
2 
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Las RNasas A mutantes G88R y G88D eran tóxicas para la línea celular K-562 de leucemia mieloide humana, mientras que la RNasa A D38R y la RNasa A A109R no eran citotóxicas (Figura 1). La RNasa A mutante G88R era aproximadamente tan eficaz como la onconasa a la hora de inhibir la proliferación celular. La RNasa A G88R tenía una concentración inhibitoria del 50% (IC_{50}; del inglés, inhibitory concentration 50) de 5 \muM, mientras que la onconasa tenía una IC_{50} de 0,7 \muM (Tabla 2). Estos resultados muestran que la afinidad ligante de una ribonucleasa por RI puede ser modificada para potenciar la citotoxicidad. Las ribonucleasas modificadas que conservan la actividad catalítica en presencia de RI son citotoxinas eficaces.
Para que sean eficaces en el tratamiento del cáncer, las ribonucleasas citotóxicas deben ser estables a la temperatura corporal. Puesto que las sustituciones de aminoácidos pueden producir proteínas más sensibles a la desnaturalización térmica, se evaluó la termo estabilidad de las ribonucleasas modificadas. Se halló que las sustituciones por arginina y la sustitución por aspartato ejercen efectos mínimos sobre la estabilidad térmica de las enzimas (Tabla 3).
TABLA 3
3
Se espera que, para inhibir la proliferación de células tumorales, la ribonucleasa modificada del presente invento pueda ser distribuida mediante cualquier método estándar. Los modos de distribución comúnmente empleados incluyen las inyecciones intramuscular, intravenosa e intraperitoneal, y la inyección directa en el tumor. Se puede combinar la ribonucleasa con cualquier vehículo farmacológico que no interfiera en la actividad de la ribonucleasa y que sea adecuado para el modo de distribución seleccionado.

Claims (8)

1. Una ribonucleasa diseñada de la superfamilia de la RNasa A, que tiene al menos una sustitución de aminoácido en una región bucle funcionalmente equivalente a los restos de aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina, ribonucleasa diseñada que tiene una afinidad ligante reducida por el inhibidor de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva la actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas.
2. La ribonucleasa de la Reivindicación 1, en que la ribonucleasa modificada procede de la ribonucleasa A pancreática bovina.
3. La ribonucleasa de la Reivindicación 2, en que el resto de glicocola de la posición de aminoácido 88 de la ribonucleasa A pancreática bovina está sustituido por un resto de aminoácido positivamente cargado.
4. La ribonucleasa de la Reivindicación 3, en que el resto de aminoácido positivamente cargado es arginina.
5. La ribonucleasa de la Reivindicación 2, en que el resto de glicocola de la posición de aminoácido 88 de la ribonucleasa A pancreática bovina está sustituido por un resto de aminoácido negativamente cargado.
6. La ribonucleasa de la Reivindicación 5, en que el resto de aminoácido negativamente cargado es aspartato.
7. Uso de una ribonucleasa de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales.
8. Un método para crear una molécula de ribonucleasa A diseñada como la definida en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que tiene propiedades citotóxicas, método que comprende las operaciones de:
(i)
crear un gen alterado que codifica una ribonucleasa A, gen que tiene una alteración en la región de codificación correspondiente a los aminoácidos 85 a 94 de la ribonucleasa A pancreática bovina, alteración que proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas;
(ii)
hacer que se exprese el gen alterado en un huésped adecuado; y
(iii)
examinar la afinidad de la expresada ribonucleasa A por el inhibidor de ribonucleasas.
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