ES2308817T3 - Ribonucleasa humana con afinidad inhibidora de ribonucleasa reducida. - Google Patents
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Abstract
Una ribonucleasa diseñada de la superfamilia de la RNasa A, que tiene al menos una sustitución de aminoácido en una región bucle funcionalmente equivalente a los restos de aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina, ribonucleasa diseñada que tiene una afinidad ligante reducida por el inhibidor de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva la actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas.
Description
Ribonucleasa A humana con afinidad inhibidora de
ribonucleasa reducida.
Este invento se realizó con ayuda gubernamental
a través de la subvención CA73808 concedida por los "National
Institutes of Health". El Gobierno de Estados Unidos posee
ciertos derechos sobre este invento.
El desarrollo de nuevos fármacos ha contribuido
al progreso que se ha producido en años recientes en el tratamiento
de diversos tipos de cáncer. Sin embargo, ciertos cánceres son
refractarios a los agentes quimioterapéuticos que están actualmente
en uso. Estas malignidades tienden a ser particularmente virulentas
y están asociadas a un elevado índice de mortalidad. Además, la
mayoría de los agentes quimioterapéuticos existentes presentan
efectos secundarios indeseables. En consecuencia, hay un continuo
interés, tanto dentro de la comunidad médica como entre la
población general, en el desarrollo de nuevos agentes
quimioterapéuticos para el tratamiento de tumores malignos y otros
tipos de cáncer.
Se ha mostrado en estudios en Fase I/II que una
ribonucleasa presente en la naturaleza, aislada de la rana leopardo
(Rana pipiens), presenta actividad antitumoral en pacientes
con cáncer pancreático y mesotelioma maligno avanzados e
inoperables (Delmonte, Oncology Times volumen 18, nº 8,
Agosto de 1996). Se ha examinado la actividad antitumoral de esta
ribonucleasa (a la que se hace referencia como "onconasa") en
más de 350 pacientes con una diversidad de tumores sólidos, y se ha
mostrado que presenta actividad antitumoral frente al carcinoma
pancreático metastásico, el cáncer metastásico avanzado de mama y el
mesotelioma maligno. La onconasa está siendo ahora utilizada en
pruebas clínicas humanas en Fase III frente a los cánceres
pancreático y hepático.
En general, parece que la onconasa es
relativamente segura para ser utilizada como agente
quimioterapéutico en seres humanos. No causa ninguna de las
principales toxicidades asociadas a los fármacos citotóxicos
convencionales, tal como mielosupresión, toxicidad gastrointestinal
o mucositis. Aproximadamente la tercera parte de los pacientes
tratados con onconasa desarrollaron síntomas de tipo gripal y
artralgia de Grado 3 con o sin edema periférico. La complicación
más grave asociada a la administración de onconasa es una función
renal disminuida, que se observó en pruebas de graduación de dosis
en Fase I. La función renal disminuida resultó reversible tras una
reducción de la dosis.
Además de en el tratamiento de diversos tipos de
cánceres, las ribonucleasas pueden ser útiles en el tratamiento de
personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH). Se ha comunicado que concentraciones no citotóxicas de
onconasa inhiben significativamente la producción de VIH en diversas
líneas celulares humanas constantemente infectadas con VIH.
La citotoxicidad de las ribonucleasas se
demostró por vez primera en tumores sólidos a los que se había
inyectado ribonucleasa A pancreática bovina (RNasa A; EC3.1.27.5) en
cantidades de miligramos (L. Ledoux, Nature 176:
36-37, 1955; L. Ledoux, Nature 175:
258-259). Se halló que dosis menores no ejercían
efecto alguno sobre los tumores (de Lamirande, Nature 192:
52-54, 1961). En plasma seminal de toro se descubrió
una ribonucleasa que es citotóxica en niveles bajos (Floridi et
al., Ital. Biol. Sper. 43: 32-36, 1967;
Dostal et al., J. Reprod. Fertil. 33:
263-274, 1973). De huevos de rana se aisló una
ribonucleasa con una citotoxicidad aún mayor (Ardelt et al.,
J. Biol. Chem. 266: 245-251, 1991), y esta
ribonucleasa es la que ahora se está examinando en pruebas clínicas
bajo el nombre de onconasa.
Las ribonucleasas catalizan la degradación del
RNA. Se ha demostrado que la actividad ribonucleolítica de las
ribonucleasas citotóxicas es necesaria para la citotoxicidad (Kim
et al., J. Biol. Chem. 270:
10.525-10.530, 1995; Ardelt et al., J.
Biol. Chem. 266: 245-251, 1991). Aunque la
citotoxicidad de las ribonucleasas requiere actividad
ribonucleolítica, la actividad ribonucleolítica sola no es
suficiente para explicar las citotoxicidades diferenciales
observadas entre las ribonucleasas. Por ejemplo, la actividad
ribonucleolítica de la RNasa A es aproximadamente 1000 veces mayor
que la de la onconasa, aunque la onconasa tiene una citotoxicidad
mucho mayor que la RNasa A. Por lo tanto, otras propiedades de las
enzimas deben explicar esta diferencia.
Las células de los vertebrados contienen un
inhibidor de ribonucleasas (RI; del inglés, ribonuclease
inhibitor) que protege a las células de los efectos
potencialmente letales de la ribonucleasa. El RI es una proteína
citosólica de 50 kDa que se une a ribonucleasas con una afinidad
variable. Por ejemplo, el RI se une a miembros de la superfamilia
de ribonucleasas de la ribonucleasa A pancreática bovina (RNasa A)
con constantes de inhibición que abarcan 10 órdenes de magnitud, con
K_{i} que varían de 10^{-6} a 10^{-16} M.
Parece que la citotoxicidad de una ribonucleasa
está inversamente relacionada con la fuerza de la interacción entre
el RI y la ribonucleasa. Por ejemplo, la RNasa A, que se une al RI
con una afinidad elevada (K_{i} = 10^{-14} M), no es citotóxica.
Por contraste, la onconasa se une al RI con una afinidad
relativamente pequeña (K_{i} \geq 10^{-6} M).
Algunas ribonucleasas naturales no se unen al
RI. La ribonucleasa seminal bovina (BS-RNasa) tiene
una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 80% a la de la
RNasa A, pero, a diferencia de la RNasa A, la
BS-RNasa existe en forma dímera. Se ha mostrado que
la estructura cuaternaria de la BS-RNasa evita la
unión por el RI, lo que permite que la enzima conserve su actividad
ribonucleolítica en presencia de RI (Kim et al., Biochem.
J. 308: 547-550, 1995; Kim et al., J.
Biol. Chem. 270: 10.525-10.530, 1995; Kim et
al., J. Biol. Chem. 270: 31.097-31.102,
1995). Sin embargo, la onconasa, una proteína con 104 restos de
aminoácido que comparte un elevado grado de homología con la RNasa
A, es resistente a la unión por RI. El complejo de
RI-onconasa tiene una K_{d} \geq 10^{-6} M
(Boix et al., J. Mol. Biol. 257:
992-1007, 1996), constante que es al menos 100
millones de veces menor que la del complejo de
RI-RNasa A.
De este modo, la distinción esencial entre la
onconasa y la RNasa A que explica la citotoxicidad diferencial
observada en estas ribonucleasas es que la onconasa es resistente a
la inhibición por RI. Las células normales producen un RI que se
une no covalentemente a las ribonucleasas con una estequiometría de
1:1 e inhibe la actividad ribonucleolítica. La menor afinidad
ligante de la onconasa por el RI evita la inhibición eficaz de la
actividad ribonucleolítica. Esta es la mejor explicación para el
hecho observado de que la onconasa es citotóxica mientras que la
ribonucleasa A no lo es.
Recientes estudios en que se examinaron el
aclaramiento plasmático y la distribución tisular de onconasa y
RNasa A en ratones mostraron que, tres horas después de la inyección
de onconasa o RNasa A, se hallaba un 57% de onconasa en el riñón
mientras que sólo se hallaba un 0,9% de ribonucleasa pancreática
humana en el riñón (Sung et al., Cancer Res. 56:
4180, 1996). La disminuida función renal observada en pacientes que
habían recibido onconasa puede ser una consecuencia de una
incapacidad para aclarar eficazmente la proteína onconasa de los
riñones.
Una ribonucleasa terapéutica preferida sería una
ribonucleasa citotóxica que pudiera ser aclarada más prontamente de
los riñones que la onconasa. Sería menos probable que una
ribonucleasa citotóxica que fuera prontamente aclarada de los
riñones causara toxicidad renal. Puesto que la función renal
reducida está limitada por la dosis de onconasa, una ribonucleasa
citotóxica que no interfiriera en la función renal presentaría
posiblemente la ventaja de una mayor flexibilidad a la hora de
determinar las dosificaciones óptimas. Una ribonucleasa con menor
toxicidad podría ser administrada en dosis mayores cuando fuera
indicado, tal como, por ejemplo, en aquellos casos en que unas
dosis aumentadas proporcionasen un tratamiento más eficaz para tipos
concretos de cánceres o para individuos concretos.
Los efectos secundarios experimentados por los
participantes en pruebas clínicas de onconasa son síntomas que
están comúnmente asociados a reacciones inmunes. Es razonable
esperar que resultaría menos probable que una ribonucleasa de una
especie más íntimamente relacionada con los seres humanos que lo es
la rana leopardo causara una reacción inmune. Aún sería menos
probable que una ribonucleasa humana provocara una respuesta
inmune. La intensidad de una reacción inmune puede ser también mayor
cuando se administran cantidades más grandes de la proteína
inmunogénica. Por lo tanto, una ribonucleasa citotóxica con una
actividad específica mayor que la de la onconasa puede ser
potencialmente un agente quimioterapéutico más eficaz. Puede
resultar posible alcanzar una citotoxicidad eficaz con la
administración de cantidades menores de proteína, reduciéndose de
este modo la incidencia y la gravedad de los síntomas asociados a
una reacción inmune.
Se necesitan nuevas ribonucleasas citotóxicas
con actividad antitumoral para aumentar el espectro de agentes
quimioterapéuticos disponibles para el tratamiento de cánceres
humanos.
Un objeto del presente invento es proporcionar
una nueva ribonucleasa citotóxica que presente una posible utilidad
en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de
una enfermedad humana.
Un objeto del presente invento es proporcionar
un método para modificar la secuencia de aminoácidos de una
ribonucleasa de tipo silvestre, para producir una nueva ribonucleasa
citotóxica.
El presente invento es una ribonucleasa que
tiene una secuencia de aminoácidos modificada, en que la
ribonucleasa modificada conserva su actividad ribonucleolítica, y
en que la ribonucleasa modificada tiene una menor afinidad ligante
por RI que la ribonucleasa no modificada y conserva la actividad
ribonucleolítica de tipo silvestre.
El presente invento es un método para modificar
la secuencia de aminoácidos de una ribonucleasa para producir una
ribonucleasa modificada, en que la ribonucleasa modificada conserva
su actividad ribonucleolítica, y en que la ribonucleasa modificada
tiene una afinidad ligante por RI que es menor que la de la
ribonucleasa no modificada y conserva la actividad ribonucleolítica
de tipo silvestre.
El presente invento es además el uso de una
ribonucleasa del invento en la fabricación de un medicamento para
inhibir la proliferación de células cancerosas, en que la
ribonucleasa tiene una afinidad ligante por RI que es menor que la
de la ribonucleasa no modificada y conserva la actividad
ribonucleolítica de tipo silvestre. El medicamento proporciona una
cantidad eficaz de la ribonucleasa modificada a las células.
De esta manera, el presente invento proporciona
una ribonucleasa diseñada de la superfamilia de la RNasa A, que
tiene al menos una sustitución de aminoácido en una región bucle
funcionalmente equivalente a los restos de aminoácido
85-94 de la RNasa A pancreática bovina, ribonucleasa
diseñada que tiene una reducida afinidad ligante por el inhibidor
de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva la
actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un
impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de
ribonucleasas.
El presente invento también proporciona una
ribonucleasa A modificada de la superfamilia de la RNasa A,
ribonucleasa A modificada que ha sido diseñada por modificación
humana de la misma, ribonucleasa A modificada cuya estructura tiene
una alteración con respecto a la de una correspondiente ribonucleasa
A de tipo silvestre, (i) alteración que, por análisis de mejor
ajuste, está en la región homóloga a los restos de aminoácido
85-94 de la RNasa A pancreática bovina, y (ii)
modificación que proporciona un impedimento estérico o
electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas. La
ribonucleasa presenta una citotoxicidad aumentada con respecto a la
correspondiente ribonucleasa no diseñada o no modificada.
El invento proporciona además el uso de una
ribonucleasa del invento en la fabricación de un medicamento para
inhibir la proliferación de células tumorales.
El invento también proporciona un método para
crear una molécula de ribonucleasa A diseñada del invento que tiene
propiedades citotóxicas, que comprende las operaciones de crear un
gen alterado que codifica una ribonucleasa A, gen que tiene una
alteración en la región de codificación correspondiente a los
aminoácidos 85 a 94 de la ribonucleasa A pancreática bovina, hacer
que se exprese el gen alterado en un huésped adecuado, y examinar
la afinidad de la expresada ribonucleasa A por el inhibidor de
ribonucleasas.
Otros objetos, ventajas y características del
presente invento resultarán evidentes después de un examen de la
memoria descriptiva, los dibujos y las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra la viabilidad de células
tumorales tratadas con diferentes ribonucleasas.
El presente invento es una diseñada ribonucleasa
modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere, en
al menos un resto de aminoácido, de la secuencia de aminoácidos de
la correspondiente ribonucleasa de tipo silvestre, ribonucleasa de
tipo silvestre que es un miembro de la superfamilia de ribonucleasas
de la RNasa A. La ribonucleasa modificada conserva su actividad
ribonucleolítica; la afinidad ligante de la ribonucleasa modificada
por el inhibidor de ribonucleasas está disminuida con respecto a la
afinidad ligante de la ribonucleasa no modificada por el inhibidor
de ribonucleasas; y la ribonucleasa modificada presenta una
actividad citotóxica aumentada. La modificación proporciona un
impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor
de ribonucleasas.
En los ejemplos mostrados más adelante se
describen el diseño, la producción y la caracterización de la RNasa
A G88R y la RNasa A G88D, dos moléculas modificadas de la
ribonucleasa A pancreática bovina que presentan una afinidad
ligante reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de tipo
silvestre y una citotoxicidad aumentada. La observación y la
metodología de esta memoria descriptiva se pueden aplicar a
cualquier ribonucleasa de la superfamilia de la RNasa A.
En la práctica del presente invento se puede
utilizar cualquier sustitución de aminoácido que reduzca la afinidad
ligante de la ribonucleasa por RI y que no interfiera en la
actividad ribonucleolítica. Se ha hallado que se puede alterar
eficazmente un locus particular de la enzima para reducir la
afinidad por RI. La RNasa A G88R tiene un resto de arginina en
lugar del resto de glicocola en el resto de aminoácido 88.
Similarmente, el resto de glicocola en el resto de aminoácido 88 de
la RNasa A G88D está sustituido por un resto de aspartato. La
sustitución por otros restos de aminoácido en una posición
correspondiente al resto de aminoácido 88 de la ribonucleasa A
pancreática bovina dará lugar a una afinidad ligante alterada por
RI, particularmente si el resto de aminoácido tiene una cadena
lateral cargada. También serán efectivas las sustituciones próximas
a este resto de aminoácido 88 que proporcionen una inhibición
estérica de la unión con RI.
Otras modificaciones relativas a la secuencia de
aminoácidos de la ribonucleasa A pancreática bovina que tengan
lugar en una región bucle definida por los restos de aminoácido
85-94 y que creen dicha interferencia estérica
producirán ribonucleasas modificadas que tendrán una afinidad
ligante reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de tipo
silvestre y una citotoxicidad aumentada. Además, se prevé que
también surtan efecto otros grupos covalentemente unidos u otras
cadenas laterales, tal como una cadena lateral de sacárido, fijados
a esta región de la proteína para proporcionar inhibición
estérica.
En la ID. SEC. nº 1 y la ID. SEC. nº 2 se
muestran, respectivamente, los oligonucleótidos utilizados para
obtener la RNasa A G88R y la RNasa A G88D. A la vista de la
degeneración del código genético, es bien sabido que se podrían
utilizar otros oligonucleótidos para obtener una ribonucleasa
modificada idéntica a la RNasa A G88R o la RNasa A G88D. Con el
presente invento se pretende abarcar una ribonucleasa modificada que
tiene una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido
correspondiente a la posición 88 de la RNasa A pancreática bovina,
sin tener en cuenta el medio mediante el cual se obtiene la
ribonucleasa modificada. Se espera que, además de la RNasa A
pancreática bovina, se puedan utilizar otros miembros de la
superfamilia de ribonucleasas de la RNasa A en la práctica del
invento. Se espera que una modificación, en una ribonucleasa
distinta de la RNasa A pancreática bovina, que tenga lugar en una
región bucle correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94 de
la RNasa A pancreática bovina produzca una ribonucleasa que tenga
una afinidad reducida por RI, una actividad ribonucleolítica de
tipo silvestre y una citotoxicidad aumentada. Por "una región
bucle correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94 de la
RNasa A pancreática bovina" se quiere significar un bucle que
tiene aproximadamente 10-12 restos de aminoácido y
que está definido por enlaces disulfuro formados entre dos restos
de cisteína, en que la región bucle comienza aproximadamente en los
restos de aminoácido 75-85 a partir del extremo
N-terminal de la ribonucleasa y en que la secuencia,
por secuencia de aminoácidos de "mejor ajuste", corresponde a
los restos 85 y 94 de la RNasa A bovina.
La superfamilia de ribonucleasas de la RNasa A
constituye un grupo de proteínas homólogas (es decir, evolutivamente
relacionadas) procedentes de muchas fuentes de mamíferos, aves,
reptiles y anfibios. Estas proteínas tienen cadenas polipeptídicas
con una plegadura similar y catalizan la escisión de RNA. Se puede
hallar una descripción de esta superfamilia en Beintema et
al., Ribonucleases: Structures and Functions, 1997,
páginas 245-269, que se incorpora aquí por
referencia.
Hay cinco productos homólogos humanos ejemplares
de la ribonucleasa A pancreática bovina de los que se espera que
sean útiles en el desarrollo de ribonucleasas citotóxicas para uso
en el tratamiento de enfermedades humanas. Cada uno de estos cinco
productos homólogos tiene una región bucle conservada que es análoga
a la región bucle de 10 restos de aminoácido de la RNasa A (Tabla
1).
Por "citotoxicidad aumentada" se quiere
significar que la ribonucleasa modificada presenta una citotoxicidad
mayor que la de la correspondiente ribonucleasa no modificada. En
los ejemplos mostrados más adelante, se evaluó la citotoxicidad
utilizando la línea celular K-562 de eritroleucemia
humana. Se prevé que la ribonucleasa modificada del presente
invento sea citotóxica frente a otras células tumorales además de
frente a las células K-562.
La inhibición de la proliferación celular es
determinada calculando el porcentaje de células
K-562 viables tratadas con la ribonucleasa
modificada o la no modificada; se considera que la viabilidad del
100% es el número de células viables que fueron tratadas con una
disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate-buffered saline).
Preferiblemente, la ribonucleasa modificada
reduce la viabilidad de las células en al menos aproximadamente un
10%. Más preferiblemente, la ribonucleasa modificada reduce la
viabilidad celular en al menos un 20%. Muy preferiblemente, la
ribonucleasa modificada reduce la viabilidad celular en
aproximadamente un 50% o incluso en tanto como aproximadamente un
75%.
El presente invento también proporciona el uso
de una ribonucleasa citotóxica del invento en la fabricación de un
medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales. El
medicamento proporciona una cantidad eficaz de la ribonucleasa a
las células tumorales.
Por "cantidad eficaz" se quiere significar
la cantidad de ribonucleasa necesaria para causar una reducción
significativa de la proliferación de las células tumorales.
Se diseñaron y produjeron diversas especies de
ribonucleasa A pancreática bovina modificada, utilizando una
mutagénesis dirigida al sitio y mediada por oligonucleótidos, como
se describe en los ejemplos descritos más adelante. Cada
ribonucleasa modificada tiene una secuencia de aminoácidos que
difiere de la secuencia de aminoácidos de la ribonucleasa A
pancreática bovina de tipo silvestre en un único resto de
aminoácido. Se prevé que ribonucleasas modificadas que tengan
múltiples sustituciones puedan ser también útiles en la práctica del
presente invento.
El RI se une no covalentemente a la RNasa A con
una estequiometría de 1:1. Se ha determinado la estructura
tridimensional del complejo entre RI y RNasa A hasta una resolución
de 2,5 \ring{A} (factor R de 19,4%) (Kobe et al.,
Nature 374: 183-186, 1995). Esta estructura
mostraba que 24 de los 124 restos de aminoácido de la RNasa A
entraban en contacto con RI. Se halló que algunas regiones de la
RNasa A que entran en contacto con RI son distintas del sitio
catalítico.
Se empleó una mutagénesis dirigida al sitio,
como se detalla en los ejemplos descritos más adelante, para
definir más la función de la interacción
RI-ribonucleasa en la citotoxicidad de la
ribonucleasa. En resumen, secuencias de DNA que codificaban la
ribonucleasa fueron específicamente alteradas de modo que la
expresión de la secuencia diera lugar a nuevas ribonucleasas que
contuvieran sustituciones de aminoácido específicas. Se
desarrollaron diversas secuencias alteradas en las que un codón que
especificaba uno de tres restos de aminoácido de los que se había
hallado que formaban múltiples contactos con restos del RI era
sustituido por un codón que especificaba un resto de arginina o de
aspartato. Se suponía que la introducción de un resto de Arg o Asp
causaría una repulsión tanto estérica como electrostática entre el
RI y la RNasa A. Se esperaba que esto diera lugar a una afinidad
ligante reducida de los mutantes de RNasa A por RI.
\vskip1.000000\baselineskip
La modificación de una RNasa A mediante
mutagénesis dirigida al sitio se describe con detalle en la Patente
de EE.UU. nº 5.389.537, incorporada aquí por referencia. Un cDNA que
codifica RNasa A fue ligado a los sitios MscI y SalI
del vector de expresión pET22B(+) (Novagen, Inc., Madison,
Wisconsin, EE.UU.). El plásmido, denominado pBXR (delCardayré et
al., Protein Eng. 8: 261-273, 1995),
dirige la expresión de RNasa A en E. coli. Se utilizó la
mutagénesis del plásmido pBXR, dirigida al sitio y mediada por
oligonucleótidos (Kunkel et al., 1987), para generar
moléculas de RNasa A modificadas que tenían una sustitución de
aminoácido específica en una posición concreta. Una RNasa A
modificada que tenía una sustitución por arginina en el resto 88 fue
denominada RNasa A G88R, y una RNasa modificada que tenía una
sustitución por aspartato en el resto 88 fue denominada RNasa A
G88D. El oligonucleótido utilizado para obtener la RNasa A G88R se
muestra en la ID. SEC. nº 1, y el oligonucleótido utilizado para
obtener G88D se muestra en la ID. SEC. nº 2. Similarmente,
utilizando oligonucleótidos especialmente diseñados, el resto de
aspartato del resto de aminoácido 38 fue sustituido por un resto de
arginina (RNasa A D38R), y el resto de alanina del resto de
aminoácido 109 fue sustituido por un resto de arginina (RNasa A
A109R).
Los mutantes de RNasa A fueron esencialmente
purificados del modo previamente descrito (delCardayré et
al., Protein Eng. 8: 261-273, 1995). La
onconasa fue purificada a partir de huevos de la rana leopardo del
Norte del modo descrito por Wu et al. (J. Biol. Chem.
268: 10.686-10.693, 1993). Alternativamente, la
onconasa fue purificada a partir de un sistema de expresión de
E.coli, esencialmente del modo descrito por Coix et
al. (J. Mol. Biol. 257: 992-1007).
La capacidad de las ribonucleasas mutantes para
catalizar la escisión de RNA polímero fue determinada por
espectroscopía UV del modo previamente descrito (delCardayré y
Raines, Biochemistry 33: 6031-6037, 1994;
(delCardayré y Raines, J. Mol. Biol. 252:
328-336, 1995).
La actividad antitumoral de las ribonucleasas
fue evaluada de la manera previamente descrita (Kim et al.,
J. Biol. Chem. 270: 10.525-10.530, 1995). Se
incluyó onconasa como un testigo positivo y se incluyó ribonucleasa
A pancreática bovina no modificada como un testigo negativo. El
efecto de las distintas ribonucleasas sobre la proliferación de la
línea celular K-562 de leucemia mieloide humana
(ATCC nº CCL-243) fue evaluado de la manera
siguiente. Las células se mantuvieron de acuerdo con las
recomendaciones de la ATCC, con adición de antibióticos. Se evaluó
la citotoxicidad de las ribonucleasas con respecto a las células
K-562 midiendo la incorporación de
[^{3}H]-timidina al DNA recién sintetizado. En
resumen, se sembraron células K-562 (0,5 x 10^{4}
por pocillo) en placas para microtitulación de 96 pocillos, en
volúmenes de 95 \mul. Se cultivaron las células en presencia de
las ribonucleasas durante 44 horas, lo que fue seguido de un
estímulo de 4 horas con [^{3}H]-timidina (7400
Bq). Las células fueron luego recolectadas sobre filtros de fibra de
vidrio utilizando un recolector celular PHD (Cambridge Technology,
Inc; Cambridge, Massachusetts, EE.UU.) y fueron lisadas al hacer
pasar varios mililitros de agua a través de los filtros. El DNA y
otras macromoléculas celulares quedan retenidos por el filtro,
mientras que las moléculas pequeñas, incluyendo el marcador no
incorporado, atraviesan los filtros. Después de un lavado a fondo
con agua, los filtros fueron secados con metanol y fueron sometidos
a cuenta utilizando un contador de centelleo para muestras
líquidas.
La incorporación de
[^{3}H]-timidina mide realmente la síntesis de
nuevo DNA. Una incorporación reducida de
[^{3}H]-timidina refleja citostasis en lugar de
muerte celular. Sin embargo, mediante otros ensayos, se ha mostrado
que la onconasa causa muerte celular (Wu et al., J. Biol.
Chem. 268: 10.686-10.695).
\vskip1.000000\baselineskip
Las afinidades ligantes de los diversos mutantes
de RNasa fueron cualitativamente evaluadas mediante un ensayo
basado en gel (Wu et al., J. Biol. Chem. 268:
10.686-10.693) y fueron cuantitativamente evaluadas
(Stone y Hofsteenge, Biochemistry 25:
4622-4628).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la estabilidad térmica de las
ribonucleasas mutantes para determinar si los mutantes serían
capaces de resistir la exposición a temperaturas relativamente
elevadas (37ºC). Los mutantes que tienen temperaturas de fusión
reducidas pueden desnaturalizarse y perder actividad. La estabilidad
térmica de cada ribonucleasa mutante fue determinada utilizando una
espectroscopía de dicroismo ultravioleta o circular para evaluar la
T_{m}, que es la temperatura a la cual la mitad de la proteína
está plegada y la otra mitad no plegada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se halló que las sustituciones de Asp 38 (RNasa
A D38R) y Ala 109 (RNasa A A109R) por arginina ejercían poco o
ningún efecto sobre la afinidad ligante de estos mutantes por RI. La
actividad ribonucleolítica de estos mutantes se redujo en presencia
de RI. Por contraste, se halló que las RNasas A mutantes en que Gly
88 estaba sustituido por una arginina o un aspartato (RNasa A G88R
y RNasa A G88D, respectivamente) tenían una afinidad ligante por RI
reducida, y estos mutantes permanecían catalíticamente activos en
presencia de RI (Tabla 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
Las RNasas A mutantes G88R y G88D eran tóxicas
para la línea celular K-562 de leucemia mieloide
humana, mientras que la RNasa A D38R y la RNasa A A109R no eran
citotóxicas (Figura 1). La RNasa A mutante G88R era aproximadamente
tan eficaz como la onconasa a la hora de inhibir la proliferación
celular. La RNasa A G88R tenía una concentración inhibitoria del 50%
(IC_{50}; del inglés, inhibitory concentration
50) de 5 \muM, mientras que la onconasa tenía una IC_{50}
de 0,7 \muM (Tabla 2). Estos resultados muestran que la afinidad
ligante de una ribonucleasa por RI puede ser modificada para
potenciar la citotoxicidad. Las ribonucleasas modificadas que
conservan la actividad catalítica en presencia de RI son
citotoxinas eficaces.
Para que sean eficaces en el tratamiento del
cáncer, las ribonucleasas citotóxicas deben ser estables a la
temperatura corporal. Puesto que las sustituciones de aminoácidos
pueden producir proteínas más sensibles a la desnaturalización
térmica, se evaluó la termo estabilidad de las ribonucleasas
modificadas. Se halló que las sustituciones por arginina y la
sustitución por aspartato ejercen efectos mínimos sobre la
estabilidad térmica de las enzimas (Tabla 3).
Se espera que, para inhibir la proliferación de
células tumorales, la ribonucleasa modificada del presente invento
pueda ser distribuida mediante cualquier método estándar. Los modos
de distribución comúnmente empleados incluyen las inyecciones
intramuscular, intravenosa e intraperitoneal, y la inyección directa
en el tumor. Se puede combinar la ribonucleasa con cualquier
vehículo farmacológico que no interfiera en la actividad de la
ribonucleasa y que sea adecuado para el modo de distribución
seleccionado.
Claims (8)
1. Una ribonucleasa diseñada de la superfamilia
de la RNasa A, que tiene al menos una sustitución de aminoácido en
una región bucle funcionalmente equivalente a los restos de
aminoácido 85-94 de la RNasa A pancreática bovina,
ribonucleasa diseñada que tiene una afinidad ligante reducida por el
inhibidor de ribonucleasas, y ribonucleasa modificada que conserva
la actividad ribonucleolítica y cuya modificación proporciona un
impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor
de ribonucleasas.
2. La ribonucleasa de la Reivindicación 1, en
que la ribonucleasa modificada procede de la ribonucleasa A
pancreática bovina.
3. La ribonucleasa de la Reivindicación 2, en
que el resto de glicocola de la posición de aminoácido 88 de la
ribonucleasa A pancreática bovina está sustituido por un resto de
aminoácido positivamente cargado.
4. La ribonucleasa de la Reivindicación 3, en
que el resto de aminoácido positivamente cargado es arginina.
5. La ribonucleasa de la Reivindicación 2, en
que el resto de glicocola de la posición de aminoácido 88 de la
ribonucleasa A pancreática bovina está sustituido por un resto de
aminoácido negativamente cargado.
6. La ribonucleasa de la Reivindicación 5, en
que el resto de aminoácido negativamente cargado es aspartato.
7. Uso de una ribonucleasa de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en la fabricación de un medicamento
para inhibir la proliferación de células tumorales.
8. Un método para crear una molécula de
ribonucleasa A diseñada como la definida en cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 6, que tiene propiedades citotóxicas, método
que comprende las operaciones de:
- (i)
- crear un gen alterado que codifica una ribonucleasa A, gen que tiene una alteración en la región de codificación correspondiente a los aminoácidos 85 a 94 de la ribonucleasa A pancreática bovina, alteración que proporciona un impedimento estérico o electrostático a la unión por el inhibidor de ribonucleasas;
- (ii)
- hacer que se exprese el gen alterado en un huésped adecuado; y
- (iii)
- examinar la afinidad de la expresada ribonucleasa A por el inhibidor de ribonucleasas.
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