CN113557297A - 具有抗肿瘤活性的肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离的肽和其变体及其治疗用途。特别地，这种肽具有高选择性、高功效和低毒性的抗肿瘤活性。还描述了包含本发明所述肽的药物组合物。
Description
描述
发明领域
本发明涉及分离的肽和其变体及其治疗用途。特别地，这种肽具有高选择性、高功效和低毒性的抗肿瘤活性。还描述了包含本发明所述肽的药物组合物。
技术状态
开发有效的抗肿瘤治疗(antineoplastic treatment)需要鉴定选择性地对于肿瘤生长为必需的分子特征。事实上，这些特征将构成理想的药理学靶，允许消除恶性细胞，同时使健康细胞免遭消除。结果将是在没有任何副作用的情况下根除肿瘤。
不幸的是，目前常规化疗以非常非特异性的方式发挥作用，往往引起严重的组织和器官损伤，并且即使是最具创新性的靶向疗法，迄今为止也显示出不完全和不足的疗效范围。因此，肿瘤仍然是世界上仅次于心血管问题的第二大死亡原因。
用于开发抗肿瘤治疗的一个潜在靶是蛋白己糖激酶2(HK2)。事实上，虽然HK2仅在有限的一组非肿瘤组织中存在，但HK2在大多数实体肿瘤和血液肿瘤中或者从头表达或者高表达。HK2与肿瘤细胞的线粒体缔合，促进其细胞内的复制代谢，并且使其对细胞死亡刺激(诸如化疗和放疗)的敏感性大幅降低。这种蛋白的存在与在各种肿瘤形式的耐药性和对放疗的抗性有关，并且对于肿瘤的发展是必不可少的。
攻击(hit)HK2可能是一种优秀的抗肿瘤方法。然而，由于HK2在重要器官(心脏、骨骼肌、肾)中表达的事实，以及HK2酶抑制剂也阻断在所有人体组织中发挥重要功能的己糖激酶家族中其他酶的活性的事实，因此迄今为止，严重副作用的发生使得抑制HK2功能(酶活性)的分子的开发变得不可能。因此，迄今为止作为潜在的抗肿瘤药物治疗研究的HK2抑制剂(例如化合物3-溴丙酮酸盐(3-bromopyruvate))缺乏足够的选择性，引起阻碍其使用或足够功效的副作用，并且因此被证明是无功能的。
因此，本发明的目的是提供一种适用于治疗肿瘤的抗肿瘤治疗，该抗肿瘤治疗选择性地和有效地作用于蛋白HK2，而不抑制其酶活性。
发明概述
本发明涉及一种分离的肽，其作为被创新性地构思并且具有SEQ ID NO:1的序列的抗肿瘤分子发挥作用。
它是一种命名为ACPP-HK2(靶向己糖激酶2的可活化细胞穿透肽(ActivatableCell Penetrating Peptide targeting HexoKinase 2))的肽，该肽选择性地靶向己糖激酶2或II(或HK2)，HK2是一种在肿瘤细胞中强烈表达的蛋白。与目前的药理学方法相比，创新特性如下：1.ACPP-HK2被设计成仅在肿瘤细胞附近活化；2.活化后，ACPP-HK2穿透肿瘤细胞，在若干分钟内引起其死亡；3.ACPP-HK2发挥作用而不阻断靶蛋白生物功能，同时引起其细胞内再分配。
根据另一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽作为药物的用途。
根据又另一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽在肿瘤治疗中的用途。
其整体特性使得ACPP-HK2成为潜在的广谱、高选择性、无副作用的抗肿瘤药物。在体外、在动物模型中和在原代肿瘤细胞上进行的实验证实了ACPP-HK2的这些特性。
在另外的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽以及药学上可接受的媒介物。
附图描述
现在将详细地并参考附图描述本发明，在附图中：
图1报告了示出如在实施例2中所述的肿瘤治疗后肿瘤体积评价结果的图。
图2报告了在用具有SEQ ID NO:1的序列的分离的肽进行全身治疗后通过监测肿瘤生长获得的图。
图3报告了在用具有SEQ ID NO:1的序列的分离的肽进行全身治疗后通过监测肿瘤生长获得的图。
图4示出了在用具有SEQ ID NO:1的序列的分离的肽进行全身治疗后通过监测肿瘤生长获得的图。
图5报告了来自用对照肽ACPP-SCR或用具有SEQ ID NO:1的序列的分离的肽处理的小鼠的组织样品的实例。
图6报告了如在实施例4中所述的离体测试数据。
图6A示出了用ACPP-HK2(SEQ ID NO:1)的活性部分(命名为pepHK2)和用pepSCR(实验对照)处理从患者活检新鲜分离的B-CLL细胞。
图6B示出了由不同浓度的pepHK2诱导的B-CLL细胞死亡(剂量/响应分析)。
图7报告了用pepHK2处理后患者来源的细胞(B-CLL)和来自健康供体的B淋巴细胞(CD19+)之间的比较。
图7A报告了在较长时间段内的实验数据，
图7B报告了在较高pepHK2浓度在较短时间段内的实验数据。
图8示出了实施例6中的实验数据，其中展示了来源于不同人类肿瘤的各种细胞模型在用pepSCR和pepHK2处理后的存活力。
图9报告了在各种时间段和浓度用肽ACPP-HK2(SEQ ID NO:1)处理的肿瘤细胞和那些用肽ACPP-HK2 II(SEQ ID NO:8)、ACPP-HK2 III(SEQ ID NO:9)和ACPP-HK2 IV(SEQID NO:10)处理的肿瘤细胞之间的细胞存活力比较，如实施例6所述。
图9A报告了用不同的分离的肽处理后18小时的细胞存活力。
图9B报告了用不同的分离的肽处理后36小时的细胞存活力。
图10示出了如实施例7中所述的酶活性测试。
图10A报告了在存在或不存在肽ACPP-HK2的活性形式(pepHK2)的情况下测量的人类HK2的酶活性。
图10B示出了在细胞提取物中，在存在或不存在pepHK2两种情况下，HK2、HK1(体内普遍存在的同功酶)的酶活性。
图11报告了通过皮下注射CT26细胞诱导的肿瘤样品的免疫组化分析的实例，如实施例2所述。
发明详述
本发明涉及一种具有SEQ ID NO:1的序列的分离的肽，其为一种以创新方式构思的抗肿瘤分子。
有利的是，SEQ ID NO:1的肽的结构被设计成为其提供特异性作用，因为它仅在肿瘤细胞附近活化并变得可透过细胞膜。活化机制利用基质金属蛋白酶(MMP)的酶促作用，MMP是在肿瘤细胞膜上或肿瘤微环境中高表达的蛋白，并且在健康组织中不表达或以非常低的量存在。
如预期的，在靶向化疗药物的开发中必须解决的一般问题是全身毒性和缺乏功效。
迄今为止，已知的针对HK2并且因此将HK2作为治疗靶的药物具有即使在不必要的情况下也抑制重要己糖激酶活性的缺点。因此，这些药物已被显示不能够选择性地攻击肿瘤细胞，潜在地导致严重的副作用。
如将在实施例中示出的，本发明通过使用以下解决针对肿瘤细胞的作用的选择性的问题的策略，开发了在杀伤肿瘤细胞方面极其有效的分子：
a.开发选择性地定向针对在肿瘤中表达强烈增加的蛋白HK2的分子。这构成了避免非选择性毒性作用的第一个概念基础；
b.设计不阻断HK2酶活性、同时改变HK2亚细胞定位的肽。事实上，本发明的肽使HK2从线粒体(与HK2蛋白缔合的细胞内细胞器)解离(足以触发细胞死亡的条件)。以这种方式，存在于非肿瘤细胞中的其他HK形式的酶功能不受影响；
c.设计由于以下结构而只能在肿瘤细胞附近活化的肽：用于输入到细胞中的氨基酸序列的存在，该氨基酸序列与屏蔽这种输入功能的序列和肿瘤微环境的蛋白酶识别的序列两者缔合，只在肿瘤附近通过使屏蔽序列解离而活化该肽。
为了本发明的目的，每种肽具有对应于以下SEQ ID NO的序列：
SEQ ID NO：1对应于命名为ACPP-HK2(靶向己糖激酶2的可活化细胞穿透肽)的肽，具有氨基酸序列：MIASHLLAYFFTELN βA RRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：2对应于SCR对照肽，具有氨基酸序列：VGAHAGEYGAEALER βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE(SCR对照)。
SEQ ID NO：3对应于肽ACPP-HK2的变体，具有氨基酸序列：MIATHLLAYFFTELN βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：4对应于肽ACPP-HK2的变体，具有氨基酸序列：MIASHLLAYFFSELN βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：5对应于肽ACPP-HK2的变体，具有氨基酸序列：MIATHLLAYFFSELN βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：6对应于肽ACPP-HK2的变体，具有氨基酸序列：MIASHLLAFFFTELN βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：7对应于肽ACPP-HK2的变体，具有氨基酸序列：MIASHLLAYYFTELN βARRRRRRRRR PLGLAG Ahx EEEEEEEE。
SEQ ID NO：8对应于肽ACPP-HK2的变体ACPP-HK2 II，具有氨基酸序列：SHLLAYFFTELN-RRRRRRRRR-PLGLAG-Ahx-EEEEEEEE，这样的36-氨基酸肽与ACPP-HK2(SEQ IDNO:1)的序列具有90％的序列同一性，4/40氨基酸不同。
SEQ ID NO:9对应于肽ACPP-HK2的变体ACPP-HK2 III，具有氨基酸序列：SHLLAYFFTELN-GRKKRRQRRRG-PLGLAG-Ahx-EEEEEEEE，这样的38-氨基酸肽与ACPP-HK2(SEQID NO:1)的序列具有77.5％的序列同一性，9/40氨基酸不同。
SEQ ID NO:10对应于肽ACPP-HK2的变体ACPP-HK2 IV，具有氨基酸序列：SHLLAYFFTELNHD-RRRRRRRRR-PLGLAG-Ahx-EEEEEEEE，这样的38-氨基酸肽与ACPP-HK2(SEQID NO:1)的序列具有87.5％的序列同一性，5/40氨基酸不同。
SEQ ID NO:1的肽ACPP-HK2由四个功能单位组成，每个功能单位由以下短氨基酸序列形成：
1.允许ACPP-HK2快速通过细胞膜的聚阳离子部分或“细胞穿透序列”。所述部分由精氨酸(R)序列组成，该序列的范围从SEQ ID NO:1的第17位氨基酸到第25位氨基酸；
2.MMP的靶序列，即“可裂解序列”，其允许ACPP-HK2仅在肿瘤微环境中活化，由一段6氨基酸组成，从SEQ ID NO:1的第26位氨基酸到第31位氨基酸；
3.屏蔽前述聚阳离子序列的聚阴离子序列，其防止ACPP-HK2随机进入非肿瘤细胞。这种屏蔽功能由从SEQ ID NO:1第33位氨基酸到第40位氨基酸的谷氨酸(E)序列进行，并且在肿瘤细胞附近被MMP切割后被消除；
4.活性部分(人类HK2蛋白的一种肽)，其通过与蛋白本身竞争与线粒体的相互作用，使内源性HK2离开肿瘤细胞线粒体。该单位由从SEQ ID NO:1的第1位氨基酸到第15位氨基酸的15个氨基酸的序列组成。活性部分负责细胞死亡，并且是该肽最重要的部分。
本发明被设计成具有高度的灵活性。事实上，可以改变一些区域的氨基酸序列，特别是由MMP识别的序列，以允许它们更好地适应肿瘤的类型和/或肿瘤发生的部位。这种在常规化疗剂中不存在的特殊灵活性，允许创建用于高度靶向和选择性的抗肿瘤疗法(antineoplastic therapy)的特定肽的组。
作为手性分子，SEQ ID NO:1的氨基酸及其变体可以具有两种不同的构型；事实上，每种氨基酸都以两种对映异构体的形式存在。
在优选的形式中，本发明的肽是由SEQ ID NO:1描述的序列的序列变体，它可以变化并且具有与SEQ ID NO:1具有高达70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
序列变体可以变化，例如，在聚阳离子部分的序列方面变化。在SEQ ID NO:1中，该序列长度是9个或11个氨基酸。该序列可以更长或更短，并且可以被修饰，因为有许多不同长度和氨基酸组成的穿透质膜的聚阳离子(或两亲性)序列，如在Borrelli et al.表1(Molecules.2018Jan 31；23(2))中所述。优选的序列长度是在6个和16个氨基酸之间。
SEQ ID NO:1的变体可以不同，例如，在使得分子能够在肿瘤微环境中特异性地释放效应物部分(由聚阳离子+HK2序列组成)的序列方面不同。在SEQ ID NO:1中，这是由MMP2和MMP 9切割的共有序列，并且长度为6个氨基酸。不同的共有序列可用于不同的细胞外蛋白酶，为本发明提供了在各种肿瘤微环境(特征是基质蛋白酶的异质性表达)中有效所必需的可塑性。例如，激肽释放酶3蛋白酶，也称为PSA(前列腺特异性抗原)，仅在前列腺癌中高表达(事实上，它被用作诊断和预后的生物标志物)；因此，激肽释放酶3可能是专门在前列腺肿瘤组织中特异性释放肽活性部分的优秀候选物。
SEQ ID NO:1的9氨基酸-聚阴离子序列(其通过屏蔽聚阳离子序列来避免肽的非特异性积累)可以具有更长或更短的变体。然而，这些变体应该保持抗衡相应聚阳离子序列的电荷的必要的约束，以防止分离的肽SEQ ID NO:1的变体非特异性地进入细胞。如果聚阴离子部分的变体不能满足这一要求，则相应的聚阳离子部分可能导致SEQ ID NO:1(和变体)的整个结构穿透到任何细胞甚至非肿瘤细胞中，并且因此治疗可能是有毒性的。
活性序列部分，在SEQ ID NO:1的这种情况下为HK2的15个氨基酸，主要是疏水的，可以在多若干个或少若干个氨基酸的情况下发挥作用。由于序列的化学特性，一些氨基酸可以被其他非常相似的氨基酸取代(例如，Y被F取代，并且反之亦然；S被T取代，并且反之亦然；I被L取代，并且反之亦然；以及E被D取代)。SEQ ID NO:1的一些变体描述于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中。显示出较好活性的肽是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的肽。
SEQ ID NO:1具有两个修饰的氨基酸：第15位的氨基酸是β-丙氨酸，而第32位的氨基酸是氨基己酸(Ahx)。这两个修饰的氨基酸不是必需的，并且充当部分之间的间隔物。序列变异体可以缺少这两个间隔序列。
根据另一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽作为药物的用途。
在低浓度，分子的活性部分已经能够在几分钟(3分钟至15分钟)内杀伤肿瘤细胞。这种快速的作用不存在于目前或潜在的抗肿瘤治疗中。
根据又另一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽在肿瘤治疗中的用途。
已经发现HK2定位于肿瘤细胞内的特定区域，即线粒体的特定部分中，在此HK2抑制导致这些细胞死亡的信号。因此，我们假设从这个特定的细胞内区域去除HK2可以导致肿瘤细胞的死亡。
在优选的形式中，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽用于治疗肿瘤的用途，其中所述肿瘤是实体肿瘤或液体肿瘤。
在甚至更优选的形式中，本发明涉及具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽用于治疗选自由以下组成的组的肿瘤的用途：结肠癌、乳腺癌、白血病、宫颈子宫癌、丛状神经纤维瘤、周围神经鞘恶性肿瘤、神经鞘瘤(schwannoma)和肝癌。
在又另一优选形式中，这些肿瘤是表达HK2的肿瘤。
金属蛋白酶，并且特别是MMP 2和MMP 9，在转移瘤中表达。SEQ ID NO:1的ACPP-HK2肽及其变体具有针对MMP 2和MMP 9的共有序列，并且因此可用于治疗转移性肿瘤。
SEQ ID NO:1的ACPP-HK2肽具有抗肿瘤细胞毒性作用，因为它能够从线粒体置换其靶HK2蛋白，而不抑制其酶活性。
令人惊讶的是，SEQ ID NO:1的肽ACPP-HK2允许：
a)HK2蛋白的活性部分(肽)在肿瘤细胞(原发性和转移性肿瘤块)附近的特异性释放；
b)穿透细胞膜；
c)快速杀伤肿瘤细胞。
我们的研究显示，本发明加上适当的施用方案快速杀伤靶细胞。我们已经观察到，ACPP-HK2从处理的第一天起就能有效地降低实验动物的实体肿瘤生长，并且对人类B细胞型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞也有快速的细胞毒性作用。此外，如对实验动物的组织学分析所示，ACPP-HK2在健康器官和组织中是无毒性的。
在另外的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含具有SEQ ID NO:1的序列或其序列变体的分离的肽以及药学上可接受的媒介物。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物呈固体或液体形式。
有利地，在优选的实施方案中，根据本发明的组合物用于通过静脉内、腹膜内、口服、舌下、气雾剂、吸入、喷雾剂、直肠、眼内、局部或透皮施用途径的肠内和肠胃外施用。
令人惊讶的是，SEQ ID NO:1的肽的特性防止细胞毒性部分非特异性地释放到健康组织中。与目前使用的其他化疗方法相比，ACPP-HK2设计具有以下优势：
a)它赋予了针对肿瘤的作用的特异性，从而限制并潜在地消除了经典化疗特有的毒副作用；
b)特殊的活化和穿透ACPP-HK2细胞的系统确保其向肿瘤细胞内的连续流动，直到诱导细胞死亡；
c)在肿瘤细胞膜中存在将经典化疗剂携带到细胞外的活性机制，从而降低其细胞内浓度，并且因此降低其功效。鉴于较大的尺寸和特殊的肽结构，ACPP-HK2不受这些机制的作用；
d)ACPP-HK2通过活化称为凋亡的过程在几分钟内杀伤肿瘤细胞。凋亡的诱导允许被该肽攻击的肿瘤细胞被快速地和选择性地去除，而不会活化任何可能具有次级毒性作用的炎症过程；
e)由于特定的活化系统及其约5000Da的分子量，该肽不会进入负责外源分子的转化和失活的细胞(例如在肝细胞中，如在经典化疗剂的许多情况下所发生的)，也不会被免疫系统识别；这两个特征一起使ACPP-HK2在施用后的降解最小化，从而使其功效最大化。
结果是一种能够非常快速和选择性地靶向肿瘤细胞的工具，依据本发明的作用机制和分子结构建立了完全创新的抗肿瘤方法。
本发明可以代表用于治疗仍然缺乏有效治愈的肿瘤(例如肝癌、胰腺癌等)并且明显用于表达HK2的所有肿瘤形式的潜在的一线药物。在对当前抗肿瘤治疗获得抗性的肿瘤的情况(例如，与利妥昔单抗敏感患者相比，高表达HK2的对利妥昔单抗耐药的B细胞型慢性淋巴细胞白血病的情况)下，它也可以成为有效的二线药物。
本发明具有范围从实体肿瘤到血液肿瘤治疗的多种应用。肽分子结构使得其非常通用和灵活，根据患者和肿瘤类型，具有进行个性化治疗的具体可能性。
本发明是在证明其横向功效的多个体外肿瘤模型上进行和测试的。
我们还进行了体内研究，显示本发明在治疗实体瘤方面是有效的。实验动物的解剖和内脏器官的组织学检查显示在健康组织中没有(细胞)毒性的迹象。
根据对分离自白血病患者的人类肿瘤细胞的离体研究，本发明针对这些肿瘤细胞的反应性和功效以及对非病态细胞对应物缺乏或不存在毒性是明显的。
最后，根据我们的体内数据，显示HK2和MMP的表达没有因肽的处理而降低。这表明肿瘤细胞未经历能够损害肽功效的适应形式。
在另外的实施方案中，本发明涉及通过使用SEQ ID NO:1的肽或其序列变体之一治疗肿瘤的方法。
这种方法用于治疗实体肿瘤或液体肿瘤，优选选自由结肠癌、乳腺癌、白血病、宫颈子宫癌、丛状神经纤维瘤、周围神经鞘恶性肿瘤、神经鞘瘤和肝细胞癌组成的组的肿瘤。
特别地，所述肿瘤可以是表达II型己糖激酶的肿瘤和转移性肿瘤。
出于说明的目的，下面给出了本发明实施方案的实施例。
实施例
实施例1
肽及其序列变体的合成
合成SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7的肽。
一些肽以对映异构体的不同组合合成。特别地，在SEQ ID NO:1的肽中，聚阳离子序列中的精氨酸(R)氨基酸呈构象“D”或构象“L”，并且聚阴离子序列中的所有谷氨酸(E)氨基酸呈“D”或“L”构象，相对于聚阳离子序列交替或不交替。
这些肽用自动多重合成仪使用所谓的固相合成程序产生，该程序提供了树脂作为氨基酸链延伸的支持物。合成后，使肽从树脂上解离并且通过反相高效液相色谱法(HPLC)纯化，直到获得至少95％纯度。使用MALDI-TOF质谱仪进行分子量分析。
实施例2
体内测试：结肠癌
将来自鼠结肠癌细胞系CT26的100,000个肿瘤细胞皮下注射(在右侧腹)到雄性Balb/c小鼠中。移植的细胞在刚超过一周的时间内产生了从外部清晰可见的皮下肿瘤。使用这种体内肿瘤形成程序，我们进行了三项不同的实验(如下所述)，其结果在图1、图2和图3中展示。
在细胞接种后8天，将小鼠分成三组(图1)，并且将不含任何其它溶质、或包含蛋白水解切割产生的ACPP-HK2的活性形式(pepHK2，2nmol/注射)或最后的包含完整ACPP-HK2(2nmol/注射)的盐水推注(saline bolus)(NaCl)注射到肿瘤中。每次推注由20μl溶液组成，并且每12小时注射一次直到60小时。处理开始后72小时，处死小鼠，并且测量肿瘤体积。在这个实验中，发现ACPP-HK2更有效，尽管肽的已活化形式(pepHK2)和我们的发明(ACPP-HK2)都降低了肿瘤生长。
在第二项实验中，在细胞接种后8天，将小鼠分成两组，施用ACPP-HK2肽或非常相似但对HK2(加扰的可活化细胞穿透肽(Activatable Cell Penetrating PeptideScramble)，ACPP-SCR)无活性的包括实验阴性对照功能的肽结构。这些数据示于图2中。通过腹膜内注射各包含30nmol肽(ACPP-HK2或ACPP-SCR)的500μl的方式每12小时进行施用。肽到达体循环并由此通过淋巴系统到达肿瘤。每48小时从外部测量肿瘤的尺寸，并计算其体积。48小时和96小时后，用ACPP-HK2处理的肿瘤在体积上显著地小于注射ACPP-SCR的对照肿瘤，由此展示我们的发明至少能够限制肿瘤生长。
图3示出了实验数据，其中两组小鼠在接种后8天开始施用ACPP-HK2肽或ACPP-SCR肽，每12小时一次，直至第60小时。与第二项实验相比，在该实验中施用了双倍剂量的肽(60nmol/注射)，同样通过腹膜内注射。在该剂量，注射ACPP-HK2强有力的降低直至几乎阻断了肿瘤的生长。
体内测试：乳腺癌
在该实验中(图4)，将200,000个鼠乳腺癌细胞系4T1皮下注射到雌性小鼠中。在细胞接种后9天，将小鼠分成两个实验组，并且腹膜内注射溶于500μl盐水溶液中的60nmol的肽(ACPP-HK2或ACPP-SCR)。每12小时注射一次，直到60小时，并且实验在72小时结束。如之前的实验(图3)，肿瘤块的测量显示，用ACPP-HK2处理的肿瘤在体积上显著地小于注射ACPP-SCR的对照肿瘤。同样，在该肿瘤模型中，肿瘤生长几乎被ACPP-HK2阻断。
总之，我们的发明(SEQ ID NO:1的分离的肽—ACPP-HK2)显示在不同肿瘤模型中有效降低肿瘤生长的结果(图1、图2、图3和图4)。此外，我们的数据示出，在小鼠中，携带序列HK2或在肿瘤细胞中执行细胞死亡的肽部分的优选方案是腹膜内注射(图1)。
实施例3
组织的组织学评价
在图2、图3和图4所示以及在实施例2中描述的每项实验结束时，在解剖病理学专家的帮助下对雄性和雌性Balb/c小鼠进行了完整的解剖。随后，对大部分内脏器官进行了组织学分析(完整列表如下所示，并且一些实例如图5所示)。解剖病理学专家在显微镜下评估了所有样品的福尔马林固定切片的组织学特征，在不同实验组(ACPP-SCR和ACPP-HK2)之间未发现任何差异或任何组织改变。没有接受任何肽处理(NaCl)的小鼠组作为另外的对照。专家的结论是，用ACPP-HK2处理对非肿瘤组织和整个生物体都没有毒副作用。
分析的器官或组织的列表：心脏、骨骼肌、肾、脾、肺、肝、脑、肠、胰腺、骨髓、淋巴结、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺。
同时，源自图2、图3和图4所示实验以及实施例2中描述的肿瘤样品还通过免疫组化分析使用针对HK2和MMP2的特异性抗体进行评价(图10)。与ACPP-SCR处理或无处理相比，用ACPP-HK2处理后的HK2和MMP2蛋白表达没有变化。这表明肿瘤没有经历能够影响治疗功效的任何适应形式(两种分子水平的降低或消失)。
实施例4
离体测试
在这项研究中，使用了从B细胞型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者血液采样后分离的人类肿瘤细胞。它们被认为是评价该肽在血液肿瘤中的效应的良好模型。这些细胞源自尚未接受任何抗肿瘤疗法的患者。如在图6A和图6B中示出的，肽的活性形式pepHK2在所有被分析的患者中诱导大多数肿瘤细胞的浓度依赖性死亡是非常快速和有效的，而无关他们中的每一个人存在的不同的促肿瘤遗传改变。
为了评估pepHK2治疗的可能毒性，将它对B-CLL细胞存活力的影响与对非肿瘤对应物(即正常人类B淋巴细胞(CD19+))的影响进行了比较。研究的两种细胞类型均源自新鲜活检样本。CD19+B淋巴细胞表达HK2；因此，如预期的，pepHK2降低了这些细胞的存活力，但与它对B-CLL细胞的作用相比，功效显著更低，并且时间更长(图7A和图7B)。来自健康受试者的B淋巴细胞对pepHK2较不敏感的事实清楚地强调了使用ACPP-HK2的治疗窗的可能性。此外，如文献中所述，B-CLL细胞比非肿瘤B淋巴细胞表达更大量的MMP。因此，我们的发明可以在低剂量(随着时间延长)非常有效，而对健康细胞没有任何毒性作用，如对实体肿瘤所展示的。
实施例5
其他体外模型
因此，我们的抗肿瘤策略分析已经扩展到其他人类肿瘤类型。图8示出从宫颈癌(HeLa)、结肠癌(COLO-741)、乳腺癌(MDA-231)、丛状神经纤维瘤(IFPN 04.4)、周围神经鞘恶性肿瘤(S462)、神经鞘瘤(HEI-193)和肝细胞癌(HepG2)产生的细胞模型中对ACPP-HK2的活性形式(pepHK2，5μM)的响应的实例。处理15分钟后，pepHK2诱导所有这些肿瘤类型的几乎所有细胞的死亡，而具有实验对照功能的肽(pepSCR，5μM)无效。所有细胞模型均已证明对pepHK2处理高度敏感，显示我们的发明在治疗极端异质性肿瘤类型(诸如本实施例中列出的那些)方面是有效的。
实施例6
抗HK2序列变体对癌细胞的证据
图9A和图9B报告了在不同浓度和不同时间用肽ACPP-HK2(SEQ ID NO:1)、ACPP-HK2 II(SEQ ID NO:8)、ACPP-HK2 III(SEQ ID NO:9)和ACPP-HK2 IV(SEQ ID NO:10)处理肿瘤细胞(HeLa宫颈癌细胞系)后的细胞存活力。结果清楚地展示，所有四种测试肽都能够降低癌细胞的细胞存活力，依赖于浓度(在5μM至50μM之间)和处理时间(18小时或36小时)具有不同功效。
实施例7
酶活性
图10A报告了酶活性，即在存在或不存在肽ACPP-HK2的活性形式的情况下，纯化的重组人类HK2蛋白(hHK2)的葡萄糖磷酸化能力。结果显示，pepHK2不抑制酶活性。图10B示出了在源自用于体内实验的CT26结肠癌细胞和4T1乳腺癌细胞的提取物中，在存在或不存在pepHK2的情况下，HK2、HK1(体内普遍存在的同功酶)以及它们两者的酶活性。ACPP-HK2的活性形式未降低肿瘤细胞中己糖激酶的酶活性。这表明穿透细胞的肽ACPP-HK2的活性形式不会降低己糖激酶家族的葡萄糖磷酸化活性，并且因此不会引起在其他类型的抗HK2治疗中发现的全身性副作用。
根据详细描述并根据上述实施例，本发明的肽提供的优势是明显的。特别地，这些肽及其序列变体已被证明在肿瘤治疗中有效，而不会引起目前使用的抗肿瘤策略中出现的一般问题，诸如全身性毒性和功效的缺乏。
序列表
<110> 帕多瓦大学
<120> 具有抗肿瘤活性的肽
<130> P020970WO-01
<150> IT102019000002321
<151> 2019-02-18
<160> 10
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 (靶向己糖激酶的可活化细胞穿透肽)
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 1
Met Ile Ala Ser His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Glu Leu Asn Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35 40
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SCR对照
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 2
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35 40
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 变体
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 3
Met Ile Ala Thr His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Glu Leu Asn Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35 40
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 变体
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<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
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<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 4
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1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
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35 40
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 变体
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 5
Met Ile Ala Thr His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Ser Glu Leu Asn Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
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<210> 6
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 变体
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 6
Met Ile Ala Ser His Leu Leu Ala Phe Phe Phe Thr Glu Leu Asn Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35 40
<210> 7
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 变体
<220>
<221> NON_STD
<222> 16
<223> β丙氨酸
<220>
<221> NON_STD
<222> 32
<223> 氨基己酸
<400> 7
Met Ile Ala Ser His Leu Leu Ala Tyr Tyr Phe Thr Glu Leu Asn Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35 40
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 II
<220>
<221> NON_STD
<222> 28
<223> 氨基己酸
<400> 8
Ser His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Glu Leu Asn Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 III
<220>
<221> NON_STD
<222> 30
<223> 氨基己酸
<400> 9
Ser His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Glu Leu Asn Gly Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACPP-HK2 IV
<220>
<221> NON_STD
<222> 30
<223> 氨基己酸
<400> 10
Ser His Leu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Glu Leu Asn His Asp Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Xaa Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
35
Claims (14)
1.一种分离的肽，所述分离的肽具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的分离的肽，所述分离的肽具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的分离的肽，所述分离的肽具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的肽，所述分离的肽具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10组成的组的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的肽，所述分离的肽具有SEQ ID NO:1的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，所述肽用于作为药物使用。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，所述肽用于在治疗肿瘤中使用。
8.根据权利要求7所述的用于使用的肽，其中所述肿瘤是实体肿瘤或液体肿瘤。
9.根据权利要求7所述的用于使用的肽，其中所述肿瘤选自由结肠癌、乳腺癌、白血病、宫颈和子宫癌、丛状神经纤维瘤、周围神经鞘恶性肿瘤、神经鞘瘤、肝癌组成的组。
10.根据权利要求7所述的用于使用的肽，其中所述肿瘤是表达II型己糖激酶的肿瘤。
11.根据权利要求7所述的用于使用的肽，其中所述肿瘤是转移性肿瘤。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至5中任一项所述的肽以及药学上可接受的媒介物。
13.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物呈固体或液体的形式。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，所述组合物用于通过静脉内、腹膜内、口服、舌下、气雾剂、吸入、喷雾剂、直肠、眼内、局部或透皮施用途径肠内或肠胃外施用。
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