CN102858794A - 细胞内吸收可控制的肽 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式：(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。

Description

细胞内吸收可控制的肽
交叉参考
本申请要求2009年7月15日提交的美国临时申请No.61/225,872的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
关于联邦赞助研究的声明
本发明是在美国国防部(US Army Department of Defense)授予的批准号W81XWH-05-1-0183和NTH授予的批准号NIBIB-K08EB008122下在政府资助下进行。政府在本发明中享有某些权利。
发明背景
细胞膜界定细胞的外部边界，并且调控进入和离开细胞内部的转运。其主要由脂质和蛋白质构成，提供封闭疏水性内部的亲水性表面，物质在进入细胞中前必须穿过所述疏水性内部。尽管许多小的亲脂性化合物能够被动穿过细胞膜，但大部分化合物、粒子和物质须仰仗主动机制才能进入活细胞。
发明概要
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B-C)-M的分子，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
在一些实施方案中，A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，A和B包含D-氨基酸。在一些实施方案中，X是可裂解连接子。在一些实施方案中，X包含肽键。在一些实施方案中，X包含6-氨基己酰基、5-氨基-3-氧戊酰基或其组合。在一些实施方案中，X包含二硫键。在一些实施方案中，X长约6至约30个原子。在一些实施方案中，X是pH值敏感性连接子。在一些实施方案中，X在细胞外空间中裂解。在一些实施方案中，X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。在一些实施方案中，X由还原剂裂解。在一些实施方案中，X选自：PLGLAG、PLGLAx(其中X是任何氨基酸)、PLG-C(me)-AG、ESPAYYTA和RLQLKL以及RLQLK(AC)。在一些实施方案中，M是选自树枝状聚合物、葡聚糖、PEG聚合物或白蛋白的大分子载体。在一些实施方案中，M是PEG聚合物。在一些实施方案中，C包含成像剂、治疗剂或其组合。在一些实施方案中，C包含选自以下的成像剂：荧光部分、发光部分、磷光部分、荧光淬灭部分、放射性部分、不透射线部分、顺磁性部分、造影剂或其组合。在一些实施方案中，C包含选自以下的治疗剂：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。在一些实施方案中，货物是吲哚羰花青(indocarbocyanine)染料。在一些实施方案中，货物是吲哚羰花青染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRDYE 800CW、ALEXA647或其组合。在一些实施方案中，货物是MRI造影剂。在一些实施方案中，货物是[4，7，10-三(羰甲基)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B)n-L的分子，其中
L包含脂质或被脂质包覆的治疗剂或成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
n是1与20之间的整数；并且
其中L通过与B所成的键连接至(A-X-B)部分。
在一些实施方案中，A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，A和B包含D-氨基酸。在一些实施方案中，X是可裂解连接子。在一些实施方案中，X包含肽键。在一些实施方案中，X包含6-氨基己酰基、5-(氨基)-3-氧戊酸或其组合。在一些实施方案中，X包含二硫键。在一些实施方案中，X长约6至约30个原子。在一些实施方案中，X是pH值敏感性连接子。在一些实施方案中，X在细胞外空间中裂解。在一些实施方案中，X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。在一些实施方案中，X由还原剂裂解。在一些实施方案中，X选自：PLGLAG、PLGLAx(其中x是任何氨基酸)、PLG-C(me)-AG、ESPAYYTA和RLQLKL以及RLQLK(AC)。在一些实施方案中，脂质被聚乙二醇化。在一些实施方案中，脂质是PEG(2K)-磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，治疗剂是疏水性的。在一些实施方案中，治疗剂选自：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。在一些实施方案中，治疗剂是阿霉素(doxorubicin)或紫杉醇(paclitaxel)。
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B)n-D的分子，其中
D是树枝状聚合物；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
N是1与20之间的整数；并且
其中D通过与B所成的键连接至(A-X-B)部分。
在一些实施方案中，D包含至少一种货物部分。在一些实施方案中，至少一种货物部分是成像剂、治疗剂或其组合。在一些实施方案中，至少一种货物部分是选自以下的成像剂：荧光部分、发光部分、磷光部分、荧光淬灭部分、放射性部分、不透射线部分、顺磁性部分、造影剂或其组合。在一些实施方案中，至少一种货物部分是选自以下的治疗剂：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。在一些实施方案中，至少一种货物部分是吲哚羰花青染料。在一些实施方案中，至少一种货物部分是吲哚羰花青染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRDYE 800CW、ALEXA647或其组合。在一些实施方案中，至少一种货物部分是MRI造影剂。在一些实施方案中，至少一种货物部分是[4，7，10-三(羰甲基)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。在一些实施方案中，A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，A和B包含D-氨基酸。在一些实施方案中，X是可裂解连接子。在一些实施方案中，X包含肽键。在一些实施方案中，X包含6-氨基己酰基、5-(氨基)-3-氧戊酸或其组合。在一些实施方案中，X包含二硫键。在一些实施方案中，X长约6至约30个原子。在一些实施方案中，X是pH值敏感性连接子。在一些实施方案中，X在细胞外空间中裂解。在一些实施方案中，X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。在一些实施方案中，X由还原剂裂解。在一些实施方案中，X选自：PLGLAG、PLGLAx(其中x是任何氨基酸)、PLG-C(me)-AG、ESPAYYTA和RLQLKL以及RLQLK(AC)。
在某些实施方案中，本文公开对受试者的肿瘤进行成像的方法，所述方法包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后对所述肿瘤进行成像，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于对有需要的受试者的肿瘤进行成像的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
在某些实施方案中，本文公开对受试者的肿瘤或组织切除术的手术边缘进行成像的方法，所述方法包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后对所述手术边缘进行成像，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于对有需要的受试者的肿瘤或组织切除术的手术边缘进行成像的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
在某些实施方案中，本文公开移除受试者的肿瘤的方法，所述方法包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后移除所述肿瘤，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；并且
其中M结合于A或B。
在某些实施方案中，本文公开具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于总有需要的受试者移除肿瘤的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
附图简述
本发明的新颖特征在随附权利要求书中具体阐明。通过参考以下阐述利用了本发明的原理的说明性实施方案和以下附图将获得对本发明的特征和优势的更充分理解：
图1。白蛋白反应性选择性转运分子与天然白蛋白产生稳固反应并且所述选择性转运分子可由MMP9裂解掉。(A)具有可与小鼠或人的白蛋白的C34反应的硫醇反应性基团的游离肽选择性转运分子的示意图。(B)具有相继c端马来酰亚胺与e9-(MMP裂解底物)-r9c(有效货物)序列的白蛋白反应性选择性转运分子的化学结构，在此情况下oPLG(Cme)AG是底物而Cy5是远红外标签。(C)白蛋白反应性肽与经过纯化的小鼠血清白蛋白的水溶液和新鲜冷冻小鼠血浆两者在一小时内反应。在15∶1的白蛋白与肽比率下(50μL 40mg/mL MSA与2nmol肽)，血浆接近反应完全。(D)在短于4小时内所反应的选择性转运分子从白蛋白上裂解接近完全。凝胶示出结合白蛋白的未裂解的肽，和用50nM MMP-9酶处理20分钟和4小时时裂解的肽。
图2。白蛋白反应性肽在带有HT1080肿瘤的小鼠和在多瘤病毒肿瘤中产生明显的对比度。(A)HT1080小鼠在同一天静脉内注射3nmol白蛋白反应性肽与可裂解和不可裂解选择性转运分子。24小时后对小鼠进行成像并处死。示出每种肽2只小鼠在带皮肤和除去皮肤情况下的荧光影像，其中箭头指向肿瘤。(B)将来自以上小鼠的肿瘤和肌肉均质化并将上清液在凝胶上电泳，揭示在肿瘤中同时存在裂解的和未裂解的白蛋白结合肽。(C)当向HT1080小鼠注射相同剂量的游离肽并在24小时时成像时，吸收和对比度与白蛋白反应性肽相比可忽略(白色箭头指向肿瘤)。(D)白蛋白反应性肽还可注射至多瘤病毒中T抗原自发性肿瘤中，并且在可裂解与不可裂解肽之间存在差异。
图3。HT1080肿瘤的组织学分析表明大部分吸收发生在肿瘤基质边缘。(A)HT1080肿瘤的荧光组织学分析和H&E染色的低倍和高倍放大均显示明显吸收发生于肿瘤被膜附近肿瘤基质与可裂解肽的边界处。(B)不可裂解肽与可裂解肽相比具有较少吸收。
图4。白蛋白选择性转运分子在4T1.2小鼠乳腺腺癌移植物中产生明显对比。向六只小鼠注射3纳摩尔白蛋白反应性选择性转运分子。三只小鼠注射可裂解肽而三只小鼠注射不可裂解肽。24小时后处死小鼠，除去皮肤并对小鼠进行成像。一组小鼠允许发展成极大肿瘤以便尝试检测肺中的转移。
图5。4T1.2小鼠中的白蛋白反应性选择转运分子的肿瘤组织学分析。(A)示出4T1.2肿瘤的荧光组织学分析和H&E的低倍和高倍放大影像，显示在肿瘤实质中有明显吸收，而在可裂解白蛋白反应性肽的基质入侵区域中吸收甚至更强。坏死区域不具有明显吸收，如在先前的工作中利用游离肽注射所见。(B)示出来自注射了不可裂解肽的小鼠的肿瘤的荧光和H&E，其中吸收较少。
图6。白蛋白反应性选择性转运分子由肺转移灶以特定方式吸收。(A)来自具有大4T1.2肿瘤的小鼠的肺的整体影像，显示在整个肺中具有明亮荧光斑点。与不可裂解肽相比，注射了可裂解肽的小鼠的斑点和实质中的信号较亮。(B)肺的荧光组织学分析和H&E证实存在转移。(C)被可裂解选择性转运分子肽明亮染色的小转移灶。
图7。三种主要类型的选择性转运分子的比较揭示，白蛋白反应性选择性转运分子如果在其它配置方面没有改良，那么是类似的。使用此处所示的三只带有4T1.2肿瘤的小鼠测试三种不同选择性转运分子设计，以确定哪个提供最佳肿瘤对比度并且在背景组织中的比吸收率较低。左图示出注射后6小时的游离肽，此时其具有最佳对比度，接着在中图示出48小时后的PAMAM树枝状聚合物，并且右图示出注射后24小时的白蛋白反应性肽。
图8。预先使选择性转运分子与血浆反应显著增加半衰期和肿瘤吸收。(A)在注射至带有4T1.2肿瘤的小鼠中前预先使选择性转运分子与新鲜冷冻血浆反应30分钟在注射后第3、24和48小时与未反应肽相比显著增加血液水平。这些荧光影像显示在各自用未反应白蛋白反应性选择性转运分子和血浆预反应选择性转运分子静脉内注射两只小鼠后的这些不同时点抽取的血液的毛细管。(B)注射未反应和预反应白蛋白反应性选择性转运分子48小时后的4T1.2肿瘤的荧光影像。各处理包含在同一时间注射的两只小鼠。(C)与选择性转运分子肽相比，Cy5-马来酰亚胺对照在肿瘤中产生较少积累。影像增亮5倍。
图9。可利用经过111In标记的白蛋白反应性选择性转运分子获得临床对比度。(A)注射了0.3nmol可裂解和不可裂解白蛋白反应性选择性转运分子的小鼠的平面γ影像。黑色箭头显示在注射48小时后肿瘤产生良好对比度。蓝色箭头显示，当肽通过肾脏清除时，大部分肽保留且缓慢清除。(B)注射48小时后由111In和Cy5双重标记的白蛋白结合肽成像的肿瘤的荧光影像。肿瘤荧光能够用比标准光学剂量低10倍的剂量检测。(C)多个组织的生物分布(ID/g％)，其显示在可裂解肽与不可裂解肽之间存在稍许不同。仅在肝脏和肾脏中发现较高肽分布。(D)显示与在先前研究中所测试的基于树枝状聚合物的选择性转运分子相比，利用白蛋白反应性选择性转运分子时存在较大组织对比度的表。
图10。游离肽药物具有显著毒性和极低治疗活性。(A)基于游离肽选择性转运分子的药物偶联的示意图。蛋白水解后，聚精氨酸-药物被释放，使得能够实现细胞吸收和治疗活性。Suc-e8-xPLGLAG-r9-c(ss-鬼臼毒素)(选择性转运分子-Podo)的结构。(C)通过腹膜内注射偶联的选择性转运分子-Podo药物以及媒介物、选择性转运分子和Podo对照，3次注射10μmol/kg(箭头＝注射日)处理HT1080异种移植物。游离肽Podo的治疗活性须伴随选择性转运分子处理的毒性，3次剂量后引起体重减轻和濒临死亡。单独Podo不具有治疗活性或毒性。(D)在整个实验持续时间内的小鼠质量显示，如通过身体质量降低所表明，选择性转运分子和选择性转运分子-Podo处理导致显著毒性。
图11。偶联阿霉素的树枝状聚合物的结构和品质控制。(A)根据抗肿瘤活性筛选的四种含阿霉素树枝状聚合物的结构。硫醚是稳定的硫醇偶联物。芳香族、脲和Peg是所测试的不同阿霉素酸不稳定性腙连接子。(B)在pH 7.4和pH 5下处理18小时的不同树枝状聚合物的凝胶判定何种连接子最具酸反应性。硫醚具有几乎不可检测到的游离阿霉素污染物并且大部分连接于树枝状聚合物。芳香族和脲腙连接子不是非常具有酸反应性并且存在许多游离药物污染物。Peg连接子有利得多的水解能力。
图12。能够获得成像和治疗活性的脲和Peg阿霉素腙连接子的动物测试。(A)用阿霉素、脲PAMAM腙-Dox、Peg PAMAM腙-Dox和PBS对照处理的小鼠的影像。动物用467/47激发光进行激发并收集光谱立方体(spectral cube)。将阿霉素荧光从影像进行去卷积并覆盖在自发荧光上。(B)两组小鼠的肿瘤都以与解剖后的小鼠相同的方式进行成像；去卷积的荧光以灰度显示于覆盖下方。四个处理组的顺序与(A)中相同，示出来自实验的两组肿瘤。下图是亮视野影像和切去一半的各组肿瘤之一的光谱去卷积影像，揭示Peg dox树枝状聚合物的明显血液性坏死核心。(C)在第1天进行注射的脲和Peg连接子测试实验中所有8只小鼠的肿瘤生长曲线。(D)在实验的整个持续时间中身体质量没有显著变化。
图13。偶联选择性转运分子的阿霉素树枝状聚合物的品质控制和小鼠实验。(A)管柱过滤之前和之后再悬浮阿霉素树枝状聚合物的凝胶，其揭示大部分大分子量聚集体和游离阿霉素由此纯化方法清除。(B)在酸性条件下显示水解阿霉素的能力的3种合成树枝状聚合物的凝胶。凝胶显示加有Peg 8帽的选择性转运分子G5PAMAM树枝状聚合物、加有Peg4-OH帽的选择性转运分子树枝状聚合物和加有Peg8帽的没有选择性转运分子的阿霉素树枝状聚合物。(C)注射了1mg/kg含选择性转运分子的树枝状聚合物的小鼠的HT1080异种移植物的肿瘤生长曲线，其揭示单独低剂量阿霉素和包覆有阿霉素的树枝状聚合物不足以明显抑制肿瘤生长。
图14。偶联pDox的Cy5树枝状聚合物的验证。(A)在中性pH值或pH 5下处理整夜的pDox Cy5PAMAM树枝状聚合物的HPLC迹线。470-490nm和645-655nm吸光度迹线均显示分别有助于鉴别经过pDox和Cy5标记的树枝状聚合物。在pH 5下孵育后，在恰具有pDox的质量的470-490通道中出现新峰。(B)示出用于灵敏荧光检测和定量偶联pDox的树枝状聚合物和水解掉pDox的树枝状聚合物的不同HPLC上的Cy5吸光度和pDox荧光HPLC迹线。(C)发现存在pDox校正标准物的多个降解峰。
图15。pDox树枝状聚合物减缓肿瘤生长并且可在注射后11日检测到Cy5树枝状聚合物荧光。(A)HT1080异种移植物的肿瘤生长曲线，其显示较高剂量的pDox树枝状聚合物确实比媒介物和较低剂量更能减缓肿瘤生长。(B)处死和解剖经过pDox树枝状聚合物处理的小鼠后，获取荧光影像，其证明甚至在11日后，仍在小鼠全身保留大量树枝状聚合物。
图16。可合成选择性转运分子以包覆紫杉醇的白蛋白悬浮液。(A)来自Abraxane的Abraxis网站的流程图，其描绘悬浮于130nm白蛋白外壳中的胶体紫杉醇和纳米粒子的透射电子显微照片。此处我们描绘我们可以使选择性转运分子与Abraxane的表面反应，此可用于增强Abraxane对肿瘤的靶向。(B)我们证明，1％和10％的选择性转运分子与白蛋白的摩尔百分比可使多达84％的选择性转运分子在再悬浮的30分钟内反应在Abraxane的表面上。此稳固反应与较长孵育时间或声波处理无关。(C)与Abraxane反应后，选择性转运分子可在用MMP-9酶处理后从纳米粒子上裂解掉，在1小时内接近完全。(D)动态光散射证实，具有或不具有选择性转运分子肽的再悬浮Abraxane呈单分散性并且具有130nm的z-平均直径。
图17。含阿霉素的聚乙二醇化脂质体可用选择性转运分子包覆。(A)包覆有选择性转运分子的脂质体的示意图。MMP酶裂解使得CPP性质恢复并且细胞吸收增强。(B)合成供在配制期间并入聚乙二醇化脂质体中的DSPE-选择性转运分子-Cy5的化学结构。(C)含有阿霉素的包覆有选择性转运分子的聚乙二醇化脂质体的代表性尺寸与体积％动态光散射图。其揭示脂质体呈单分散性并具有130nm的z-平均尺寸。(D)包覆有选择性转运分子的阿霉素脂质体可在与MMP-9一起孵育后从脂质体表面裂解掉。SDS-PAGE证实，大部分Cy5-e9从所并入的DSPE-选择性转运分子-Cy5裂解。
图18。脂质体上的表面选择性转运分子与培养物中(而非体内)的吸收的线性关系。(A)将HT1080人纤维肉瘤与含50μM阿霉素的包覆有选择性转运分子的聚乙二醇化脂质体一起孵育30分钟，接着洗涤3次，并在初始处理1小时后进行成像。共聚焦显微镜显示，在较大摩尔百分比的含有选择性转运分子的聚乙二醇化脂质的情况下，较多阿霉素(绿色)吸收至细胞中。除非对影像重新缩放，否则难以检测0.3％和无选择性转运分子的脂质体(插图)。(B)将包覆有0.3摩尔％、1摩尔％和3摩尔％选择性转运分子的脂质体以3mg/kg阿霉素当量静脉内注射至带有HT1080肿瘤的小鼠体内。将所述处理与媒介物对照(300mM蔗糖缓冲液)和非靶向阿霉素脂质体进行比较。在第10至第17天，与阿霉素脂质体相比，0.3％选择性转运分子具有统计学显著性(p-值＜0.02，t-检验)。每组处理各自具有两个肿瘤的四只小鼠(除3％选择性转运分子的3只小鼠外)。
图19。聚集导致治疗效果消失。(A)动态光散射揭示，脂质体制剂在其通过离心浓缩后聚集。此聚集在通过0.2μm过滤器后存在。左图示出0.3摩尔％阿霉素脂质体制剂的微米聚集体，右图示出未浓缩的新鲜制剂。(B)聚集的脂质体在用未聚集制剂正面测试时在动物中没有治疗效果。向各自具有2个肿瘤的四只小鼠注射3mg/kg的0.3％新鲜制剂、非靶向阿霉素脂质体和仅媒介物。
图20。较少选择性转运分子具有较强治疗效果；不可裂解对照肽的有效性不如可裂解肽。(A)每个处理组八只各自具有一个肿瘤的HT1080小鼠在第8天和第22天注射3mg/kg阿霉素相等物。0.1摩尔％和0.3摩尔％肽标记为每个脂质体约9或27个选择性转运分子。这些数据显示，减少选择性转运分子的数目使肿瘤生长曲线的治疗效果进一步增强。(B)图标示出在第18、21、25和29天由t-检验测定的p-值。在每个时点，在9个选择性转运分子与非靶向对照之间存在肿瘤体积具有多达4倍差异的统计显著性。所述资料示出0.1摩尔％和0.3摩尔％与非靶向脂质体的比较以及肽的可裂解型式与不可裂解型式的比较。(C)所有处理组在实验结束时均具有体重减轻。
图21。血液半衰期与载体尺寸之间的关系。分子变化大于30kD是归因于载体的形状(线性与球形)。
图22。淋巴结吸收兼具肿瘤和裂解依赖性。示出注射葡聚糖可裂解选择性转运分子48小时后，来自带肿瘤小鼠(A)与不带肿瘤小鼠(B)的暴露淋巴结的整体影像。所述结构的身份通过冷冻切片组织学分析进行证实(C)和(D)，比例尺＝1mm。(E)和(F)示出来自注射可裂解(E)和不可裂解(F)葡聚糖偶联肽48小时后的小鼠的淋巴结。比例尺＝200μm。
图23。淋巴结染色局限于产生F4/80的吞噬细胞。(A)示出淋巴结的特写cy5影像。(B)示出用经过FITC标记的针对F4/80的抗体染色的系列切片。(C)示出用苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)染色的系列切片。插图示出明亮染色区域的细胞形态。比例尺＝200μm。
图24。偶联于PEG-12WD的肽。(A)示出注射4.8nmol偶联于PEG-12的可裂解肽2小时后的小鼠。插图示出分析型凝胶，其显示所注射构筑体的纯度。(B)示出不可裂解d-氨基酸肽的相同内容。(C)示出所示区域随时间的相对强度。
图25。偶联于白蛋白的肽。(A)显示注射剂纯度的凝胶和注射4.5nmol偶联于白蛋白的可裂解肽36小时后的小鼠。(B)示出不可裂解d-氨基酸肽的相同内容。(C)示出所示区域随时间的归一化强度。
图26。偶联于70kD葡聚糖的肽。(A)示出注射6nmol偶联于70kD葡聚糖的可裂解肽36小时后的小鼠。各小鼠的左边示出注射剂的分析型凝胶。黑色箭头指示认为是所要产物的条带；浅色箭头指示游离肽。(B)示出不可裂解d-氨基酸肽的相同内容。(C)示出所示区域随时间的归一化强度。
图27。偶联于PAMAM树枝状聚合物的肽。(A)示出注射4.5nmol偶联于第5代加有琥珀酰基帽的PAMAM树枝状聚合物的可裂解(PLGLAX)肽36小时后的小鼠。各小鼠的左边示出注射剂的分析型凝胶。黑色箭头指示所要产物；浅色箭头指示游离肽。(B)示出加有PEG-4帽的类似树枝状聚合物的相同内容。(C)示出所示区域随时间的归一化强度。应注意，第一影像在橙色滤光片下获取而第二影像在红色滤光片下获取。
图28。较快裂解序列增加加有PEG-4帽的选择性转运分子的吸收。(A)显示注射剂纯度的分析型凝胶和注射3nmol偶联于第5代加有PEG-4帽的PAMAM树枝状聚合物的可裂解(PLG(MeC)AG)肽48小时后的小鼠。黑色箭头指示所要产物；浅色箭头指示游离肽。(B)示出使用PLGLAG作为裂解序列的类似构筑体的相同内容。(C)示出所示区域随时间的归一化强度。
图29。注射偶联选择性转运分子的葡聚糖后的动物的T1-MRI成像。(A)示出注射显影剂前和注射后48小时的PyMT小鼠。应注意，注射显影剂后在肿瘤与假影比率方面并无显著不同。(B)示出注射显影剂前和注射后48小时的野生型小鼠。(C)示出未注射、野生型和PyMT注射小鼠中推定颈部淋巴结区域内的弛豫率。
图30。PAMAM构筑体的纯度凝胶。认为缩水甘油基和PEG-16构筑体对于使用此方法注射至动物体内来说不可接受。
图31。注射加有磺酸基苯甲酰基帽的化合物的小鼠的体内时程。插图示出所采集器官的荧光影像。
图32。注射加有乙酰基和琥珀酰基帽的树枝状聚合物的小鼠的体内影像。(A)示出注射加有乙酰基帽的树枝状聚合物后立即、注射后24小时和注射后48小时的小鼠的影像。示出荧光解剖影像并且标记为T(肿瘤)、L(肝脏)和K(肾脏)。(B)示出在胸部抽取的肿瘤和背景区域的相对强度。为便于比较，最高背景值归一化为1。(C)和(D)示出加有琥珀酰基帽的化合物的类似数据。
图33。注射加有PEG-2、PEG-4、PEG-8和PEG-12帽的树枝状聚合物的小鼠的示例性体内影像。(A)示出注射加有PEG-2帽的树枝状聚合物后立即、注射后24小时和注射后48小时的小鼠的影像。示出荧光解剖影像并且标记为T(肿瘤)、L(肝脏)和K(肾脏)。(B)示出在胸部抽取的肿瘤和背景区域的强度。为便于比较，最高背景值归一化为1。(C)和(D)示出加有PEG-4帽的化合物的类似数据，并且(E)和(F)示出加有PEG-8帽的化合物的类似数据。PEG-12的特性与PEG-8类似。
图34。具有指定帽的树枝状聚合物的器官组织学分析。
图35。偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子在肿瘤中引起局部吸收，所述吸收甚至在48小时后仍停留在肿瘤中。(A)示出新型分子的示意图。选择性转运分子通过聚阳离子连接。裂解后，聚阴离子释放，从而留下高度带电的分子粘附于细胞并进入细胞。(B-D)示出注射10nmol cy5后48小时的影像。(E)示出注射偶联于树枝状聚合物纳米粒子的可裂解和全d-氨基酸选择性转运分子的动物的皮肤值与注射可裂解游离肽的动物的皮肤值的时间推移比较。(F)示出比较肿瘤、肝脏、肾脏和肌肉的三种肽的标准化吸收值。游离肽数据是来自六个小时后的PLG-C(me)-AG肽(MeC＝S-甲基半胱氨酸)。
图36。蛋白酶依赖性吸收突出将可裂解探针注射至MMTV-PyMT体内后的残余肿瘤。(A)示出注射探针和移除皮肤48小时后的PyMT小鼠。(B)示出整体移除肿瘤后的相同小鼠。在胸肌上保留一长条肿瘤。(C)示出移除胸肌后的小鼠，其中肌肉在插图中示出。存在小片残余肿瘤。(D)示出肿瘤条带的横截面，显示在肿瘤与胸肌之间的界面处存在蛋白酶活化的强条纹。(E)示出MMTV-PyMT模型中可裂解和全d-氨基酸探针与单独PAMAM树枝状聚合物的标准化吸收值的比较。
图37。偶联于树枝状聚合物纳米粒子显影剂的选择性转运分子较亮并且显示与类似去淬灭剂相比对比度较高。(A)和(B)示出注射了选择性转运分子-弹药(A)或Prosense(一种由细胞内组织蛋白酶活化的去淬灭探针)(B)的代表性小鼠。各小鼠在认为得到最佳对比度的时间处死(对于选择性转运分子来说是48小时，对于Prosense来说根据制造商的说明是24小时)。(E-G)和(H-J)示出分别来自(A)和(B)中的小鼠的肺转移灶的整体影像和冷冻切片组织学分析。比例尺是200μm。(K)和(L)分别示出(E)和(H)中所示的肺转移灶的定量吸收数据和荧光比率。
图38。偶联于负载有钆的树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子允许通过T1 MRI观测蛋白酶活性。(A)未注射探针(左)、注射可裂解探针(PLG-C(me)-AG，中)或全d-氨基酸对照探针(plg-(meC)ag，右)48小时后的带有HT-1080异种移植物的动物的影像。示出可裂解和不可裂解探针相对于未注射小鼠的强度和T1的实测差异。T1和弛豫度均已根据水假影强度进行归一化以消除扫描之间的变化性。(C)示出来自注射可裂解或全d-氨基酸对照探针的动物的组织中钆的标准化吸收值。钆使用ICPMS进行定量。
图39。具有高局部钆吸收的肿瘤的区域与肿瘤由巨噬细胞介导侵入肌肉中有关。(A)示出T1加权MR影像，其显示肿瘤浸润至周围肌肉中。示出轴向、冠状和矢状切面。(B)示出相应光学影像。(C-F)(C)示出使用cy5荧光成像的相同肿瘤的组织学切片。(D)示出相同切面的原位酶谱分析。比例尺表示200μm。(E)示出在较高功率下被原位酶谱分析覆盖的cy5区域。(F)示出出于鉴别目的，(E)中所示的区域的H/E影像。
图40。使用T1MRI观测肺中的探针。极亮细胞的身份未知。
发明详述
选择性转运分子允许将治疗剂和/或成像剂靶向递送到特定细胞和/或组织。选择性转运分子包含(a)分子转运序列(部分B)、(b)结合于部分B的货物(部分C或D)和有效抑制或防止吸收到细胞中的酸性部分A。连接子X的裂解允许部分A与部分B分离，有效允许部分B和所连接的货物吸收至细胞中。然而，选择性转运分子可能经受快速药物动力学分布，而具有短血浆半衰期、宽广分布并从具有特异性和非特异性吸收的组织缓慢洗脱。因此，对具有增加的体内循环和受到调节的外渗选择性的选择性转运分子存在需要。
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式：(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。
某些定义
除非另外说明，否则以下术语具有归属于其的含义。术语细胞渗透肽(CPP)、膜易位序列(MTS)和蛋白质转导结构域可互换使用。如本文所用，所述术语意谓能够易位穿过细胞的质膜的肽(多肽或蛋白质)序列。在一些实施方案中，CPP促进细胞外分子易位穿过细胞的质膜。在一些实施方案中，CPP通过直接渗透质膜、内吞作用介导的进入或形成暂时结构来易位穿过质膜。
如本文所用，术语“适体”是指基于与靶分子的非Watson和Crick相互作用根据以高亲和力特异性结合其它分子的能力从随机池选出的DNA或RNA分子(参见，例如Cox和Ellington，Bioorg.Med.Chem.9：2525-2531(2001)；Lee等，Nuc.Acids Res.32：D95-D100(2004))。在一些实施方案中，适体结合核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素、无机化合物、细胞和甚至完整生物体。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(即，抗原)，其中氨基酸残基由共价肽键连接。如本文所用，术语“肽”是指长度通常在2至约50个残基范围内的氨基酸残基的聚合物。在某些实施方案中，肽长度在约2、3、4、5、7、9、10或11个残基至约50、45、40、45、30、25、20或15个残基的范围内。在某些实施方案中，肽长度在约8、9、10、11或12个残基至约15、20或25个残基的范围内。在本文提供氨基酸序列的情况下，也涵盖所述序列的L-、D-或β氨基酸型式以及反转、倒位和反转-倒位同功异型物。肽还包括一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。另外，所述术语适用于由肽键或其它经过修饰的键联(例如其中肽键被α-酯、β-酯、硫代酰胺、磷酰胺、氨基甲酸酯、羟基化物等置换(参见例如Spatola，(1983)Chem.Biochem.Amino Acids and Proteins 7：267-357)，其中酰胺被饱和胺置换(参见例如美国专利No.4,496,542，其以引用的方式并入本文，和Kaltenbronn等，(1990)第11届美国肽研讨会会刊(Proc.11thAmerican_Peptide Symposium)，ESCOM Science Publishers，TheNetherlands，第969-970页等))联接的氨基酸。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后经过修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，结合于氢、羧基、氨基和R基团的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜。所述类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。氨基酸可为D氨基酸或L氨基酸。在本说明书通篇的肽序列中，小写字母表示氨基酸的D异构体(相反，大写字母表示氨基酸的L异构体)。
氨基酸可以其通常已知的三字母符号或国际纯化学与应用化学联合会生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以其通常公认的单字母代码表示。
本领域的技术人员将认识到，肽、多肽或蛋白质序列中改变、添加或缺失所编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是熟知的。所述保守性修饰变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八个组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
如本文所用，“连接子”是能够结合(例如共价)本文公开的选择性转运分子的部分A和部分B的任何分子。连接子包括但不限于直链或支链碳连接子、杂环碳连接子、肽连接子和聚醚连接子。例如，聚(乙二醇)连接子可从Quanta Biodesign，Powell，OH获得。这些连接子任选地具有酰胺键、巯基键或杂官能键。
如本文所用，术语“标记”是指促进对本文公开的选择性转运分子的观测和/或检测的任何分子。在一些实施方案中，标记是荧光标记。
术语“载体”意谓增加(a)血浆半衰期和(b)溶解度的惰性分子。在一些实施方案中，载体通过降低肾小球过滤来增加血浆半衰期和溶解度。在一些实施方案中，载体因肿瘤脉管系统的渗透性和滞留性增强(EPR)而增加肿瘤吸收。
术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。如本文所用，其意谓任何哺乳动物(即，生物分类学分类动物界：脊索动物门：脊椎动物亚门：哺乳纲内的任何目、科和属的物种)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。所述术语均不要求或均不限于特征为在健康护理工作者(例如医生、注册护士、执业护士、助理医师、护理员或安养院工作人员)监督下(例如始终或间断性)的情形。
如本文所用，术语“施用(administer/administering/administration)”等是指可用于达成将药剂或组合物递送到所要生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于胃肠外注射(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部)。任选地用于本文所述的药剂和方法的施用技术包括例如Goodman和Gilman，ThePharmacological Basis of Therapeutics，现版；Pergamon；和Remington′s，Pharmaceutical Sciences(现版)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.中所论述的技术。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指材料不消除本文所述的药剂的生物活性或性质，并且相对无毒(即，材料的毒性明显超过材料的益处)。在一些情况下，药学上可接受的材料可在不引起明显不当生物作用或不明显与含有其的组合物的任何组分以有害方式相互作用的情况下施用至个体。
如本文所用，术语“手术”是指可通过身体介入用来操作、改变或引起作用的任何方法。这些方法包括但不限于开放式手术、内窥镜手术、腹腔镜手术、微创手术和机器人手术。
以下符号在使用时以所示含义使用：Fl＝荧光素；aca＝ahx＝X＝氨基己酸连接子(-HN-(CH2)5-CO-)；C＝L-半胱氨酸；E＝L-谷氨酸；R＝L-精氨酸；D＝L-天冬氨酸；K＝L-赖氨酸；A＝L-丙氨酸；r＝D-精氨酸；c＝D-半胱氨酸；e＝D-谷氨酸；P＝L-脯氨酸；L＝L-亮氨酸；G＝甘氨酸；V＝缬氨酸；I＝异亮氨酸；M＝甲硫氨酸；F＝苯丙氨酸；Y＝酪氨酸；W＝色氨酸；H＝组氨酸；Q＝谷氨酰胺；N＝天冬酰胺；S＝丝氨酸；且T＝苏氨酸。
选择性转运分子
调控进入和离开细胞的转运对于其保持持续活力来说是重要的。例如，细胞膜含有能够促进许多重要物质跨膜通过的离子通道、泵和交换器。然而，跨膜转运是选择性的：除了促进所要物质进入细胞中外，并且还促进其它物质离开，这是细胞膜防止物质不受控进入细胞内部的主要作用。细胞膜的此屏障功能使得难以将标志、药物、核酸和其它外源性材料递送至细胞中。
已鉴别出多种膜易位信号(MTS)。例如，人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的Tat蛋白能够从细胞外环境进入细胞。来自触角足(Antennapedia)同源框蛋白的结构域也能够进入细胞。
包含MTS的分子也可用于将其它分子连同其一起携带至细胞中。最重要的MTS富含诸如精氨酸等具有带正电荷侧链的氨基酸。由所述阳离子肽转运至细胞中的分子可称为“货物”并且可以可逆地或不可逆地连接至所述阳离子肽。
由包含MTS的分子促进的吸收在当前没有专一性地增强大部分或所有细胞的吸收。需要能够使货物的递送靶向动物体内某一类型的细胞，或靶向某一组织，或靶向某一位置或区域。因此，我们确认需要具有增加的体内循环的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。
在实施方案中，本文公开的选择性转运分子是线性分子。在实施方案中，本文公开的选择性转运分子是环状分子，如图1B中所图示说明。在实施方案中，本文公开的选择性转运分子包含环状部分和线性部分。
本文公开的选择性转运分子可具有任何长度。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子长约7至约40个氨基酸，不包括连接子X和货物部分C的长度。在其它实施方案中，特别是在部分A和B中的一者或两者中包括多个非酸性(在部分A中)或非碱性(在部分B中)氨基酸的情况下，本文公开的选择性转运分子的部分A和B可总共长约50，或约60，或约70个氨基酸。本文公开的选择性转运分子的环状部分可包括约12至约60个氨基酸，不包括连接子X和货物部分C的长度。例如，本文公开的线性选择性转运分子可具有包含约5至约20个之间的碱性氨基酸(优选约9至约16个之间的碱性氨基酸)的碱性部分B和包含约2至约20个之间的酸性氨基酸(例如约5至约20个之间，优选约5至约9个之间的酸性氨基酸)的酸性部分A。在一些优选实施方案中，本文公开的选择性转运分子可具有包含约9至约16个之间的碱性氨基酸的碱性部分B和约5至约9个之间的酸性氨基酸。在一些实施方案中，A是8个连续谷氨酸(即，EEEEEEEE，E9，eeeeeeee，或e9)，B是9个连续精氨酸(即，RRRRRRRRR，R9，rrrrrrrrr，或r9)，并且X是PLGLAG。
在一些实施方案中，选择性转运分子具有下文给出的式。应注意，在一些情况下，肽序列以氨基酸符号和说明氨基酸数目的数字给出(例如，R9解释为RRRRRRRRR或9个连续L-精氨酸；而r9解释为9个连续D-精氨酸或rrrrrrrrr)。
·EDDDDKA-aca-R9-aca-C(Fl)-CONH2
·Fl-aca-CRRRRRRRRR-aca-EEEEEEEEEC-CONH2
·Fl-aca-CEEEE-aca-RRRRRRRRRC-CONH2
·H2N-EEEEEDDDDKA-aca-RRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-EDDDDKA-aca-RRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-EEEEEDDDDKARRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-EEDDDDKA-aca-rrrrrrrrr-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-DDDDDDKARRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-EEDDDDKAR-aca-RR-aca-RR-aca-RR-aca-RR-aca-C(Fl)-CONH2
·H2N-eeeeee-aca-PLGLAG-rrrrrrrrr-aca-c(Fl)-CONH2
·EDA-aca-R5-aca-C(Fl)-CONH2
·EDDDDKA-aca-R6-aca-C(DOX)-CONH2
.EEEDDDEEEDA-aca-R9-aca-Y(125I)-CONH2
·ededdAAeeeDDDDKA-aca-R11-aca-C(Fl)-CONH2
·eddedededDDDDKA-aca-R6-AGA-R6-aca-C(DOX)-CONH2
·Ggedgddeeeeeeddeed-aca-PLGLAG-aca-R8-AAA-R12-aca-C(Fl)-CONH2
·eeddeeddKA-aca-R7-aca-C(Fl)-CONH2
·eDDDDKA-aca-RGRGRRR-aca-C(Fl)-CONH2
·eddddeeeeeee-aca-PLGLAGKA-aca-R10-aca-C(Fl)-CONH2
·eeeeeeeeeeeeeeee-aca-DDDDKA-aca-R20-aca-C(Fl)-CONH2
·eeeeeeeeeddddd-aca-DDDDKA-aca-R17-aca-Y(125I)-CONH2
·dddddddddddddddd-aca-PLGLAG-aca-R14-aca-C(DOX)-CONH2
·NH2-eeeeee-ahx-PLG
·LAG-rrrrrrrrr-ahx-c(Fl)-CONH2，其中“ahx”表示氨基己酸
·EEEEEDDDDKAXRRRRRRRRRXC(Fl)
·EEEEEDDDDKARRRRRRRRRXC(Fl)
·EDDDDKAXRRRRRRRRRXC(Fl)
·EEDDDDKARXRRXRRXRRXRRXC(Fl)
·DDDDDDKARRRRRRRRRXC(Fl)
·EEDDDDKAXrrrrrrrrrXC(Fl)
·eeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXc(Fl)
·UeeeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXk(F l)
·eeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXc(Cy5)
·UeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXc(Cy5)
·UeeeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXk(Cy5.5)
·11-kDa PEG]XeeeeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrrXk(Cy5)
·[11-kDa PEG]XeeeeeeeeeXLALGPGrrrrrrrrrXk(Cy5)
·Fl-XrrrrrrrrrXPLGLAGeeeeeeee-βAla
·Fl-XrrrrrrrrrXSGRSAeeeeeeee-βAla
·eeeeeeXSGRSAXrrrrrrrrrXc(Cy5)
·Fl-rrrrrrrrrc-SS-ceeeeee
·琥珀酰基-e8-XPLGLAG-r9-Xk，其中X表示6-氨基己酰基
·[11kDa PEG]-X-e9-XPLGLAG-r9
·[11-kDa PEG]-X-e9-XPLGLAG-r9-Xk(Cy5)
·H2N-e6-XPLGLAG-r9-Xc(Cy5)-CONH2，其中X＝氨基己酸
·H2N-eeeeee-(ahx)-PLG LAG-rrrrrrrrr-(ahx)-c(荧光)-CONH2
·XeeeeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrXk
·eeeeeeeeeXLALGPG-rrrrrrrrrXk(Cy5)
·mPEG(11kd)-S-CH2-CONH-ahx-e9-ahx-PLGLAG-r9-ahx-k-CONH2
·mPEG-S-CH2CONH-e9-ahx-PLGLAG-r9-K[DOTA(Gd)]-CONH2
·(11KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3]
·70KDa-葡聚糖)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3]
·(鼠类血清白蛋白)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3]，
·(PAMAM第5代树枝状聚合物)-e9-XPLGLAX-r9-[DPK-99mTc(CO)3]
·(70KDa葡聚糖)-e9-XPLGLAX-r9-(DOTA-111In)
·(11-KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd)
·Suc9-(70KDa葡聚糖)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd)
·Suc9-(70KDa葡聚糖)-e9-XPLGLAX-r9-K(DOTA-Gd)
·Suc9-(70KDa葡聚糖)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd)
·环[琥珀酰基-PLGLAG-c(11KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-K]-k(Cy5)
·Cy5-X-e6-XPLGLAG-r9-Xk(Cy5)
·Cy7-X-e6-XPLGLAG-r9-Xk(Cy5)
·11KDa mPEG-e9-PLGLAG-r9
·Ac-r9-k-NH2
·mPEG(11kd)-e9-XPLGLAG-r9-Xk-NH2
·e9-XPLGLAG-r9-Xk-NH2
表1
Figure BPA00001525247000291
Figure BPA00001525247000301
Figure BPA00001525247000311
肽合成
本文公开的选择性转运分子通过任何适合方法合成，如固相合成，包括固相肽合成。使用Fmoc进行肽合成的一实例在下文作为实施例1给出。例如，用于合成肽的常规固相方法可始于N-α保护的氨基酸酸酐，其是以结晶形式制备或在溶液中新鲜制备，并用于在N-端上连续添加氨基酸。在添加各残基时，将生长中的肽(在固体载体上)用酸处理以移除N-α保护基，洗涤若干次以移除残余酸并促进肽末端对于反应介质的可达性。接着使肽与经过活化的N-保护氨基酸对称酸酐反应，并洗涤固体载体。在各残基添加步骤中，氨基酸添加反应可重复总共两次或三次单独添加反应，以增加所反应的生长肽分子的百分比。通常，前12个残基添加使用1至2个反应循环，而剩余残基使用2至3个反应循环。
生长肽链完成后，用强酸(如液态氢氟酸或三氟乙酸)处理受到保护的肽树脂以使肽从载体脱离并释放。为制备酰胺化肽，选择合成中所用的树脂载体以便在肽从树脂裂解后供应C-端酰胺。移除强酸后，可将肽提取至1M乙酸溶液中并冻干。肽可通过利用凝胶过滤进行初始分离加以分离，以移除肽二聚体和较高分子量聚合物，以及移除不合需要的盐。经过部分纯化的肽可通过制备型HPLC色谱进行进一步纯化，并利用氨基酸组成分析、质谱法和分析型HPLC(例如在两个不同溶剂系统中)确认肽的纯度和身份。
聚核苷酸合成
在某些实施方案中，本文公开编码本文所述的选择性转运分子的聚核苷酸。术语“聚核苷酸”是指长至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。核苷酸包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述术语包括DNA的单链和双链形式。因此，所述术语包括例如并入载体(例如表达载体)中的重组DNA；并入自主复制质粒或病毒中的重组DNA；或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA；或者以独立于其它序列的单独分子(例如cDNA)形式存在的重组DNA。
这些聚核苷酸包括编码本文所述的选择性转运分子或其部分的DNA、cDNA和RNA序列。在一些实施方案中，聚核苷酸包括启动子和其它序列，并且可并入载体中以供转染(其可为稳定或瞬时转染)于宿主细胞中。
表达载体的构建和转染细胞中基因的表达包括使用本领域中熟知的分子克隆技术。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编著，(Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.and lohn Wiley & Sons，Inc.，最新增补本)。用于利用编码相关多肽的表达的序列转染细胞的核酸通常呈包括表达控制序列可操作地连接于编码多肽的表达的核苷酸序列的表达载体形式。如本文所用，“可操作地连接”是指所述组分的并置关系允许其以预定方式起作用。可操作地连接于编码序列的控制序列经过连接使得可在与控制序列相容的条件下达成编码序列的表达。“控制序列”是指实现其所连接的编码和非编码序列的表达所必需的聚核苷酸序列。控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意欲至少包括能够影响表达的组分，并且还包括存在是有利的其它组分，例如前导序列和融合搭配物序列。如本文所用，术语“编码聚核苷酸的表达的核苷酸序列”是指在mRNA转录和翻译后产生多肽的序列。其包括含有例如内含子的序列。如本文所用，术语“表达控制序列”是指调控其所可操作地连接的核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控一核酸序列的转录和(适当时)翻译时，所述表达控制序列可操作地连接于所述核酸序列。因此，表达控制序列包括适当启动子、强化子、转录终止子、蛋白质编码基因前方的起始密码子(即，ATG)、内含子拼接信号、维持所述基因的正确阅读框以允许mRNA适当翻译、和终止密码子。
使用任何适合方法来构建含有荧光指示剂编码序列和适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。(参见例如Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989中所述的技术)。用重组DNA转化宿主细胞可利用本领域的技术人员熟知的常规技术进行。
如果宿主是原核宿主，如大肠杆菌(E.coli)，那么可从在指数生长期后采集的细胞制备感受态细胞(即，能够吸收DNA的细胞)并随后用CaCl2、MgCl2或RbCl处理。在某些情况下，在形成宿主细胞的原生质体后或利用电穿孔进行转化。
当宿主是真核宿主时，可使用以下DNA转染方法，如磷酸钙共沉淀、常规机械程序(如微弹轰击、电穿孔、插入包裹在脂质体中的质粒或病毒载体)。在某些情况下，将真核细胞用编码本文公开的分子的DNA序列和编码可选择表型的第二外来DNA分子(如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转染。另一方法使用真核病毒载体，如猿病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，来瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman编著，1982)。用于分离和纯化原核细胞或真核细胞中所表达的本发明多肽的技术可利用任何常规方式，如制备型色谱分离和免疫分离，如涉及使用单克隆或多克隆抗体或抗原的技术。
部分A
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)n-D，其中D包含至少两个货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且n是1与20之间的整数。
在具有本发明的特征的分子的一些实施方案中，肽部分A包括约2至约20个之间，或约5至约20个之间的酸性氨基酸，并且可为一系列酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸或其它酸性氨基酸)。在一些实施方案中，A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。
在一些实施方案中，部分A包含8个连续谷氨酸(即，EEEEEEEE或eeeeeeee)。
酸性部分A可包括非酸性氨基酸。酸性部分A可包含其它部分，如带负电部分。在本文公开的选择性转运分子的实施方案中，酸性部分A可为不包括氨基酸的带负电部分，优选在生理pH值下具有约2至约20个负电荷。在优选实施方案中，部分A中负电荷的量大致与部分B中正电荷的量相同。
部分A为L-氨基酸或D-氨基酸。在本发明的实施方案中，优选是D-氨基酸以便使免疫原性和由背景肽酶或蛋白酶所致的非特异性裂解降至最低。已知寡聚D-精氨酸序列的细胞吸收与寡聚L-精氨酸的吸收一样好或者优于寡聚L-精氨酸的吸收。
应了解，部分A可包括非标准氨基酸，如羟赖氨酸、锁链素、异锁链素或其它非标准氨基酸。部分A可包括修饰氨基酸，包括翻译后修饰氨基酸，如甲基化氨基酸(例如甲基组氨酸、赖氨酸的甲基化形式等)、乙酰化氨基酸、酰胺化氨基酸、甲酰化氨基酸、羟基化氨基酸、磷酸化氨基酸或其它修饰氨基酸。部分A还可包括肽模拟部分，包括由非肽键连接的部分和由非氨基酸部分连接的氨基酸或连接至非氨基酸部分的氨基酸。
通用结构A-X-B和-A-X-B-C是有效的，其中A位于氨基端或者其中A位于羧基端，即肽键的任一取向都是允许的。
部分B(膜易位序列)
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)n-D，其中D包含至少两个货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且n是1与20之间的整数。在一些实施方案中，B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。在一些实施方案中，B具有包含9个连续精氨酸的序列。
在具有本发明的特征的分子的一些实施方案中，肽部分B包括约5至约20个之间，或约9至约16个之间的碱性氨基酸，并且可为一系列碱性氨基酸(例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸或其它碱性氨基酸)。
在一些实施方案中，部分B包含9个连续谷氨酸(即，RRRRRRRRR或rrrrrrrrr)。
碱性部分B可包括非碱性氨基酸。碱性部分B可包含其它部分，如带正电部分。在实施方案中，碱性部分B可为不包括氨基酸的带正电部分，优选在生理pH值下具有约5与约20个之间的正电荷。在优选实施方案中，部分A中负电荷的量大致与部分B中正电荷的量相同。
部分B为L-氨基酸或D-氨基酸。在本发明的实施方案中，优选是D-氨基酸以便使免疫原性和由背景肽酶或蛋白酶所致的非特异性裂解降至最低。已知寡聚D-精氨酸序列的细胞吸收与寡聚L-精氨酸的吸收一样好或者优于寡聚L-精氨酸的吸收。
应了解，部分B可包括非标准氨基酸，如羟赖氨酸、锁链素、异锁链素或其它非标准氨基酸。部分B可包括修饰氨基酸，包括翻译后修饰氨基酸，如甲基化氨基酸(例如甲基组氨酸、赖氨酸的甲基化形式等)、乙酰化氨基酸、酰胺化氨基酸、甲酰化氨基酸、羟基化氨基酸、磷酸化氨基酸或其它修饰氨基酸。部分B还可包括肽模拟部分，包括由非肽键连接的部分和由非氨基酸部分连接的氨基酸或连接至非氨基酸部分的氨基酸。
在X是可由蛋白酶裂解的肽的实施方案中，X的C-端联接于B的N-端可为优选的，以使得由X的裂解产生的新氨基端贡献另一正电荷添加至已存在于B中的正电荷。
部分X(连接子)
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。裂解条件
在一些实施方案中，X是可裂解连接子。
在一些实施方案中，连接子X设计成在特定条件存在下或在特定环境中裂解。在优选实施方案中，连接子X可在生理条件下裂解。此种连接子X的裂解可能因特定病理学信号或与需要货物递送的细胞相关的特定环境而增强或者可能受所述信号或环境影响。将连接子X设计成因特定条件而裂解(例如由特定酶裂解)允许使细胞吸收靶向获得所述条件的特定位置。因此，选择性转运分子用于使细胞吸收特异性靶向所要细胞、组织或区域的一种重要方式为将连接子部分X设计成由所述所靶向细胞、组织或区域附近的条件裂解。连接子X裂解后，则分子的部分B-C为B与C的简单偶联物，在一些情况下保留从连接子X的残余部分残留下来的相对较小的惰性残端。
在一些实施方案中，X是pH值敏感性连接子。在一些实施方案中，X在碱性pH值条件下裂解。在一些实施方案中，X在酸性pH值条件下裂解。在一些实施方案中，X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。在一些实施方案中，X由还原剂裂解。
信号的一个重要类别是基质金属蛋白酶(MMP)的水解活性，其在转移肿瘤细胞的侵入性迁移中极其重要。在某些情况下，MMP在炎症部位附近发现。在某些情况下，MMP在中风(即，特征在于血流减少后出现脑损伤的病症)部位附近发现。在一些实施方案中，X由MMP裂解。因此，具有本发明特征的分子的吸收能够将货物C的细胞吸收引导至在细胞外环境中具有活性MMP的特定细胞、组织或区域。
在一些实施方案中，包括氨基酸序列PLGLAG(SEQ ID NO：1)的连接子X由金属蛋白酶MMP-2(癌症和炎症中的主要MMP)裂解。此种连接子X的裂解发生在中央G与L残基之间，引起细胞吸收增加10至20倍(参见实施例4)。在一些实施方案中，设计成由膜锚定MMP裂解的连接子X因其活性保持定位于表达细胞的外表面而特别优选。在替代实施方案中，设计成由可溶性分泌MMP裂解的连接子X是优选的，其中可能需要货物C扩散离开裂解的确切位置，由此增加货物的空间分布。可由其它MMP裂解的其它连接子X在实施例9中论述。
在一些实施方案中，连接子设计成使得其由蛋白水解酶或还原环境裂解，所述蛋白水解酶或还原环境可在癌细胞附近发现。此种环境或所述酶通常在正常细胞附近不会发现。
低氧是一种重要的病理学信号。例如，认为低氧使得癌细胞变得对辐射和化学疗法更具抗性，并且还起始血管生成。在一些实施方案中，适于在遭受低氧的组织中或附近裂解的连接子X能够使部分B和C靶向癌细胞和癌性组织、梗塞区和其它低氧区。在一些实施方案中，包括二硫键的连接子X优先在低氧区中裂解并因此使货物靶向递送至此种区域中的细胞。在有例如渗漏或坏死细胞存在的低氧环境中，游离硫醇和其它还原剂变得可在细胞外获得，而顾名思义，正常保持细胞外环境氧化性的O2耗乏。在一些实施方案中，氧化还原平衡的此转变促进连接子X内二硫键的还原和裂解。除利用硫醇-二硫化物平衡的二硫键外，在设计成在低氧环境中裂解的连接子X中还使用包括在还原成氢醌时崩解的醌在内的键联。
坏死常导致可用于引发连接子X裂解的酶或其它细胞内含物的释放。在一些实施方案中，设计成在低氧不存在下在坏死区域中裂解的连接子X包含钙蛋白酶(calpain)(或从坏死细胞释放的其它蛋白酶)。所述连接子X被钙蛋白酶裂解将使得连接的部分B-C从部分A释放，从而允许货物被患病细胞或尚未变得完全渗漏的相邻细胞吸收。
酸中毒也常在损伤或低氧组织部位中观察到，这是因为沃伯格转变(Warburg shift)从氧化磷酸化转变为无氧糖酵解和乳酸产生。所述局部酸性可通过制备酸不稳定性连接子X(例如，通过在X中纳入缩醛或乙烯醚键联)来感知。或者或另外，可通过将B内的一些精氨酸置换成仅在低于pH 7时变成阳离子的组氨酸，使用酸中毒作为货物吸收的引发因素。
连接子
在一些实施方案中，使用由一个或多个氨基酸组成的连接子联接肽序列A(即，设计成阻止吸收至细胞中的序列)与肽序列B(即，MTS)。一般来说，肽连接子除了联接分子或保持其间一定程度的最小距离或其它空间关系外，将不具有特定生物活性。然而，可选择连接子的组成氨基酸以便影响分子的一些性质，如折叠、净电荷或疏水性。
在一些实施方案中，X是可裂解连接子。
在一些实施方案中，连接子是柔性的。在一些实施方案中，连接子是刚性的。
在一些实施方案中，连接子包含线性结构。在一些实施方案中，连接子包含非线性结构。在一些实施方案中，连接子包含分支结构。在一些实施方案中，连接子包含环状结构。
在一些实施方案中，X长约5至约30个原子。在一些实施方案中，X长约6个原子。在一些实施方案中，X长约8个原子。在一些实施方案中，X长约10个原子。在一些实施方案中，X长约12个原子。在一些实施方案中，X长约14个原子。在一些实施方案中，X长约16个原子。在一些实施方案中，X长约18个原子。在一些实施方案中，X长约20个原子。在一些实施方案中，X长约25个原子。在一些实施方案中，X长约30个原子。
在一些实施方案中，连接子通过共价键使肽部分A(即，阻止细胞吸收的肽序列)结合于肽部分B(即，MTS序列)。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。
在一些实施方案中，X包含肽键。肽键包含L-氨基酸和/或D-氨基酸。在本发明的实施方案中，优选是D-氨基酸以便使免疫原性和由背景肽酶或蛋白酶所致的非特异性裂解降至最低。已知寡聚D-精氨酸序列的细胞吸收与寡聚L-精氨酸的吸收一样好或者优于寡聚L-精氨酸的吸收。
应了解，本文公开的连接子可包括非标准氨基酸，如羟赖氨酸、锁链素、异锁链素或其它非标准氨基酸。本文公开的连接子可包括修饰氨基酸，包括翻译后修饰氨基酸，如甲基化氨基酸(例如甲基组氨酸、赖氨酸的甲基化形式等)、乙酰化氨基酸、酰胺化氨基酸、甲酰化氨基酸、羟基化氨基酸、磷酸化氨基酸或其它修饰氨基酸。本文公开的连接子还可包括肽模拟部分，包括由非肽键连接的部分和由非氨基酸部分连接的氨基酸或连接至非氨基酸部分的氨基酸。
在一些实施方案中，X包含选自以下的肽：PLGLAG、PLGLAX、PLG-C(me)-AG、ESPAYYTA和RLQLKL以及RLQLK(AC)。
在一些实施方案中，X包含选自以下的肽：PR(S/T)(L/I)(S/T)(SEQID NO：29，其中括号中的字母表示所示氨基酸中的任一者可在序列中的彼位置)；GGAANLVRGG(SEQ ID NO：30)；SGRIGFLRTA(SEQID NO：31)；SGRSA(SEQ ID NO：32)；GFLG(SEQ ID NO：33)；ALAL(SEQ ID NO：34)；FK；PIC(Et)F-F(SEQ ID NO：35，其中C(Et)表示S-乙基半胱胺酸(一种具有乙基连接于硫醇的半胱胺酸)并且“-”表示此序列和后续序列中的典型裂解位点)；GGPRGLPG(SEQ IDNO：36)；HSSKLQ(SEQ ID NO：37)；LVLA-SSSFGY(SEQ ID NO：38)；GVSQNY-PIVG(SEQ ID NO：39)；GVVQA-SCRLA(SEQ ID NO：40)；f(Pip)R-S(SEQ ID NO：41，其中“f”表示D-苯丙氨酸并且“Pip”表示哌啶-2-甲酸(哌可酸，一种具有六元环的脯氨酸类似物)；DEVD(SEQ ID NO：42)；GWEHD-G(SEQ ID NO：43)；或其组合。
在一些实施方案中，X在低氧条件下裂解。在一些实施方案中，X包含二硫键。在一些实施方案中，X包含奎宁。
在一些实施方案中，X在坏死条件下裂解。在一些实施方案中，X包含可由钙蛋白酶裂解的分子。
在一些实施方案中，X包含6-氨基己酰基、5-(氨基)-3-氧戊酰基或其组合。在一些实施方案中，X包含二硫键。
在一些实施方案中，连接子是烷基。在一些实施方案中，连接子是杂烷基。
在一些实施方案中，连接子是亚烷基。在一些实施方案中，连接子是亚烯基。在一些实施方案中，连接子是亚炔基。在一些实施方案中，连接子是亚杂烷基。
“烷基”是指脂肪族烃基。烷基部分可为饱和烷基或不饱和烷基。视结构而定，烷基可为单基或二基(即，亚烷基)。
“烷基”部分可具有1至10个碳原子(在本文无论何时出现，如“1至10”等数值范围都是指指定范围内的整数；例如“1至10个碳原子”意谓烷基可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直至且包括10个碳原子，不过本另一还涵盖术语“烷基”在没有指定数值范围的情况下出现)。烷基还可以是具有1至6个碳原子的“低级烷基”。本文所述化合物的烷基可以称为“C1-C4烷基”或类似名称。仅举例来说，“C1-C4烷基”说明在烷基链中存在1至4个碳原子，即，所述烷基链选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基等。
在一些实施方案中，连接子包含环结构(例如芳基)。如本文所用，术语“环”是指任何共价闭合结构。环包括例如碳环(例如芳基和环烷基)、杂环(例如杂芳基和非芳香族杂环)、芳香族基(例如芳基和杂芳基)和非芳香族基(例如环烷基和非芳香族杂环)。环可任选地被取代。环可为单环或多环。
如本文所用，术语“芳基”是指形成环的各原子是碳原子的芳香族环。芳基环可由5个、6个、7个、8个、9个或多于9个碳原子形成。芳基可任选地被取代。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基和茚基。视结构而定，芳基可为单基或二基(即，亚芳基)。
术语“环烷基”是指单环或多环非芳香族基，其中形成环的各原子(即，骨架原子)是碳原子。环烷基可为饱和或部分不饱和。环烷基包括具有3至10个环原子的基团。环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
在一些实施方案中，环是环烷烃。在一些实施方案中，环是环烯烃。
在一些实施方案中，环是芳香族环。术语“芳香族”是指具有含4n+2个π电子的离域π电子系统的平面环，其中n是整数。芳香族环可由5个、6个、7个、8个、9个或多于9个原子形成。芳香族基可任选地被取代。术语“芳香族”包括碳环芳基(例如苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香族基”)(例如吡啶)两者。所述术语包括单环或稠合环多环(即，共享数对相邻碳原子)基团。
在一些实施方案中，环是杂环。术语“杂环”是指含有1至4个选自O、S和N的杂原子的杂芳香族和杂脂环族基团，其中各杂环基在其环系统中具有4至10个原子，并且其限制条件为所述基团的环不含两个相邻O或S原子。非芳香族杂环基包括在其环系统中仅具有3个原子的基团，但芳香族杂环基在其环系统中必须具有至少5个原子。杂环基包括苯并稠合环系统。3元杂环基的一实例是氮杂环丙烷基。4元杂环基的一实例是氮杂环丁烷基(衍生自氮杂环丁烷)。5元杂环基的一实例是噻唑基。6元杂环基的一实例是吡啶基，并且10元杂环基的一实例是喹啉基。非芳香族杂环基的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢哌喃基、二氢哌喃基、四氢硫哌喃基、哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂卓基、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、1，2，3，6-四氢吡啶基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、二氢吲哚基、2H-哌喃基、4H-哌喃基、二恶烷基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢哌喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮双环[3.1.0]己基、3-氮双环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。芳香族杂环基的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、噻唑基、恶唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、恶二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。上述基团在可能时可以是C连接型或N连接型。例如，衍生自吡咯的基团可以是吡咯-1-基(N连接型)或吡咯-3-基(C连接型)。此外，衍生自咪唑的基团可以是咪唑-1-基或咪唑-3-基(都是N连接型)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(都是C连接型)。杂环基包括苯并稠合环系统和被一个或两个氧代基(＝O)部分取代的环系统，如吡咯烷-2-酮。视结构而定，杂环基可为单基或二基(即，亚杂环基)。
在一些实施方案中，环是稠合环。术语“稠合”是指两个或多个环共享一个或多个键的结构。在一些实施方案中，环是二聚体。在一些实施方案中，环是三聚体。在一些实施方案中，环被取代。
术语“碳环(carbocyclic/carbocycle)”是指形成环的各原子是碳原子的环。碳环包括芳基和环烷基。因此，所述术语区分碳环与环主链含有至少一个不同于碳的原子(即，杂原子)的杂环(heterocycle/heterocyclic)。杂环包括杂芳基和杂环烷基。碳环和杂环可任选地被取代。
在一些实施方案中，连接子被取代。术语“任选地被取代”或“被取代”意谓所述基团可被一个或多个个别地并且独立地选自以下的其它基团取代：C1-C6烷基、C3-C8环烷基、芳基、杂芳基、C2-C6杂脂环族基、羟基、C1-C6烷氧基、芳氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、C1-C6烷基亚砜、芳基亚砜、C1-C6烷基砜、芳基砜、氰基、卤基、C2-C8酰基、C2-C8酰氧基、硝基、C1-C6卤烷基、C1-C6氟烷基和氨基，包括C1-C6烷基氨基，和其受保护衍生物。举例来说，可选取代基可以是LsRs，其中各Ls独立地选自化学键、-O-、-C(＝O)-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、S(＝O)2NH-、-NHS(＝O)2-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-、-(C1-C6烷基)-或-(C2-C6烯基)-；并且各Rs独立地选自H、(C1-C4烷基)、(C3-C8环烷基)、杂芳基、芳基和C1-C6杂烷基。任选地被取代的非芳香族基团可被一个或多个氧代基(＝O)取代。可以形成上述取代基的保护衍生物的保护基为本领域的技术人员所已知。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子包含单个连接子。使用单一机制同时介导成像和治疗货物两者的吸收特别有价值，因为利用无害量的示踪剂进行成像可用于测试后续治疗剂量是否可能在靶组织中正确浓缩。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子包含多个连接子。在本文公开的选择性转运分子包括多个键联X的情况下，使部分A与分子的其它部分分离需要裂解所有键联X。多个连接子X可同时或依序裂解。多个键联X可包括具有不同特异性的键联X，以使得使部分A与分子的其它部分分离需要分子遭遇多于一种条件或环境(“细胞外信号”)。因此，多个连接子X的裂解可用作所述细胞外信号的组合的探测器。例如，选择性转运分子可包括连接碱性部分B与酸性部分A的两个连接子部分Xa和Xb。在酸性部分A与碱性部分B分离从而允许部分B进入和货物部分C(如果存在的话)进入细胞之前，连接子Xa和Xb都必须裂解。应了解，连接子区可独立于另一可能存在的连接子连接于碱性部分B或货物部分C，并且需要时，可包括多于两个连接子区X。
可使用两个或多个连接子X的组合来进一步调节分子对所要细胞、组织或区域的靶向和递送。必要时，使用细胞外信号的组合来放宽或缩窄连接子X裂解的特异性。当平行连接多个连接子X时，裂解的特异性变窄，因为在部分A可以从分子的其余部分分离之前，各连接子X都必须裂解。当串联连接多个连接子X时，裂解的特异性变宽，因为任一连接子X的裂解都允许部分A与分子的其余部分分离。例如，为检测蛋白酶或低氧(即，在蛋白酶或低氧存在下裂解X)，将连接子X设计成将蛋白酶敏感性和还原敏感性位点串联放置，以使得任一者的裂解都将足以允许酸性部分A分离。或者，为检测蛋白酶和低氧两者的存在(即，在蛋白酶和低氧两者存在下但并非在仅一者单独存在下裂解X)，将连接子X设计成将蛋白酶敏感性位点放置在至少一对二硫键彼此键结的半胱氨酸之间。在此情况下，为允许部分A分离，将同时需要蛋白酶裂解和二硫键还原。
细胞外裂解
在健康细胞中，具有结构A-X-B或A-X-B-C的完整化合物将因存在部分A而不能进入细胞。因此，裂解X的完全细胞内过程在健康细胞中将因部分A阻止吸收至细胞中而无法裂解X，将不会被健康细胞中的细胞内酶有效裂解，因为其将不被吸收并且不能获得接近所述细胞内酶。然而，在细胞受损或患病的情况下(例如癌性细胞、低氧细胞、缺血细胞、凋亡细胞、坏死细胞)，所述细胞内酶渗漏出细胞并且发生A的裂解，从而允许部分B或B-C进入细胞，实现部分B或货物部分C至相邻细胞的靶向递送。在一些实施方案中，X在细胞外空间中裂解。
毛细血管在肿瘤和其它创伤部位周围通常渗漏的实情应增强高分量分子(例如，分子量为约40kDa或更大)到达间质代谢区的能力。因为连接子X的裂解通常在细胞外，预期存在一些旁观者标记，即，不表达相关蛋白酶但紧邻表达细胞的细胞可能染上一些货物。对于肿瘤来说，由于细胞表型的异质性和希望消除尽可能高百分比的可疑细胞，因此所述旁观者靶向视为有益的。
大分子载体
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
术语“载体”意谓增加(a)血浆半衰期和(b)溶解度的惰性分子。
在一些实施方案中，载体减少选择性转运分子至软骨中的吸收。在一些实施方案中，载体减少选择性转运分子至关节中的吸收。在一些实施方案中，载体减少选择性转运分子至肝脏中的吸收。在一些实施方案中，载体减少选择性转运分子至肾脏中的吸收。
在一些实施方案中，载体通过降低肾小球过滤来增加血浆半衰期和溶解度。在一些实施方案中，载体因肿瘤脉管系统的渗透性和滞留性增强(EPR)而增加肿瘤吸收。关于组织切除手术中游离选择性转运分子与偶联于载体的选择性转运分子的比较，请参见表2和实施例8。
表2
Figure BPA00001525247000481
Figure BPA00001525247000491
在一些实施方案中，M结合于A。在一些实施方案中，M结合于A的n端聚谷氨酸。在一些实施方案中，M通过共价键结合于A(n端聚谷氨酸)。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。
在一些实施方案中，M结合于B。在一些实施方案中，M结合于B的c端聚精氨酸。在一些实施方案中，M通过共价键结合于B(或c端聚精氨酸)。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。
在一些实施方案中，M选自蛋白质、合成或天然聚合物，或树枝状聚合物。在一些实施方案中，M选自葡聚糖、PEG聚合物(例如PEG5kDa和PEG 12kDa)、白蛋白或其组合。在一些实施方案中，M是PEG聚合物。
在一些实施方案中，载体的尺寸在50与70kD之间。在一些实施方案中，少量负电荷使肽保持不进入肝脏，同时不引起滑液吸收。
在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于白蛋白。在某些情况下，白蛋白在正常生理条件下，白蛋白从肾小球过滤物中排除。在一些实施方案中，选择性转运分子包含可与白蛋白形成共价偶联物的反应性基团，如马来酰亚胺。包含白蛋白的选择性转运分子以裂解依赖性方式使得所裂解的选择性转运分子在肿瘤中的积累增强。参见实施例2。在一些实施方案中，白蛋白偶联物具有良好的药物动力学性质，但难以有效合成。
在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于PEG聚合物。在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于PEG 5kDa聚合物。在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于PEG 12kDa聚合物。在一些实施方案中，5kD PEG偶联物的特性类似于游离肽。在一些实施方案中，12kDPEG偶联物与游离肽相比具有较长半衰期。关于使用PEG聚合物的作用的详细分析，请参见实施例5。
在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于葡聚糖。在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于70kDa葡聚糖。在一些实施方案中，作为分子量混合物的葡聚糖偶联物难以重复合成和纯化。关于使用葡聚糖的作用的详细分析，请参见实施例5。
在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于抗生蛋白链菌素。关于使用抗生蛋白链菌素的作用的详细分析，请参见实施例5。
在一些实施方案中，选择性转运分子偶联于第5代PAMAM树枝状聚合物。关于使用树枝状聚合物的作用的详细分析，请参见实施例5。
关于血浆半衰期和吸收的变化的详情，请参见表3。
表3
Figure BPA00001525247000521
在一些实施方案中，载体加有帽结构。关于加帽的方法，请参见实施例1。在一些实施方案中，对载体进行加帽改良药物动力学并且通过添加亲水性使载体的细胞毒性降低。在一些实施方案中，帽结构选自：乙酰基、琥珀酰基、3-羟基丙酰基、2-磺酸基苯甲酰基、缩水甘油基、PEG-2、PEG-4、PEG-8和PEG-12。关于加帽的作用的详细分析，请参见实施例6。
树枝状聚合物
在某些实施方案中，本文公开一种选择性转运分子。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)n-D，其中D是树枝状聚合物；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且n是1与20之间的整数；并且其中D通过与B所成的键结合于(A-X-B)部分。在一些实施方案中，D通过与聚精氨酸末端所成的键连接至(A-X-B)部分。在一些实施方案中，D包含至少一种货物部分。关于使肽与树枝状聚合物偶联的方法，请参见实施例1。
如本文所用，“树枝状聚合物”意谓多官能(或多分支)分子。在一些实施方案中，树枝状聚合物是中心分子重复并且反复分支的结构。在一些实施方案中，树枝状聚合物是纳米粒子。
在一些实施方案中，D通过共价键结合于B(或c端聚精氨酸)。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。
在一些实施方案中，多个(A-X-B)部分连接于D。参见实施例3。在一些实施方案中，多个货物部分连接于D。在一些实施方案中，(a)多个(A-X-B)部分连接于D；并且(b)多个货物部分连接于D。
在一些实施方案中，树枝状聚合物包含可与白蛋白形成共价偶联物的反应性基团，如马来酰亚胺。在一些实施方案中，树枝状聚合物通过位于选择性转运分子的C末端的马来酰亚胺连接子偶联于选择性转运分子。
在一些实施方案中，偶联选择性转运分子与树枝状聚合物使得血浆半衰期与未偶联(或游离)选择性转运分子相比增加。在一些实施方案中，偶联于树枝状聚合物的选择性转运分子使得急性毒性与未偶联选择性转运分子相比降低。在一些实施方案中，偶联于树枝状聚合物的选择性转运分子使得滑液、软骨和肾脏吸收与未偶联选择性转运分子相比减少。
在一些实施方案中，使用偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子来靶向肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，使用偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子来毒杀皮下巨噬细胞，其中所述纳米粒子进一步包含蓖麻毒素A(Ricin A)。关于使用树枝状聚合物纳米粒子的作用的详细分析，请参见实施例7。
货物
在某些实施方案中，本文公开体内循环增加的选择性转运分子。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B-C)-M，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且M是大分子载体。
在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)-D，其中C是货物部分；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；X是连接子；并且D是树枝状聚合物。在一些实施方案中，D包含货物部分。关于连接标记与选择性转运分子的方法，请参见实施例1。
本文公开的选择性转运分子适于运载不同货物，包括不同类型的货物和相同类型不同种类的货物，以供细胞吸收。例如，不同类型的货物可包括标志货物(例如荧光或放射性标记部分)和治疗货物(例如化学治疗分子，如甲氨蝶呤或阿霉素)，或其它货物。当治疗上需要破坏异常或患病细胞时，治疗货物可包括“细胞毒性剂”，即，抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。
诸如荧光分子等货物的递送可用于观测患有某些病状的细胞或展现特定病状的区域中的细胞。例如，血栓症(凝块形成)可通过将连接子X设计成被血凝块形成级联中多种蛋白酶中的任一者裂解以便将包括荧光或其它标志在内的货物递送至所述区域中进行观测。类似地，补体活化可通过将连接子X设计成被补体活化级联中的任一种或多种蛋白酶裂解以便将荧光或其它标志递送至所述区域中进行观测。因此，荧光分子是部分A因连接子X裂解而释放后可被递送至靶细胞和区域的标志的一个实例。
在一些实施方案中，货物部分选自成像剂、治疗剂、脂质或其组合。
在一些实施方案中，货物部分包含至少两个货物部分。在一些实施方案中，C包含标志货物和治疗货物。多个货物部分可允许例如同时递送放射性标志和超声波或造影剂，从而允许利用不同模态成像。或者，例如将放射性货物连同抗癌剂一起递送以提供增强的抗癌活性，或者将放射性货物与荧光货物一起递送以允许以多种方式定位和鉴别已吸收了货物的细胞。
货物部分的连接
货物部分以任何位置或方向连接于B。货物部分无需定位于部分B上与连接子X相反的末端。货物部分与B在任何位置连接都是可以接受的，只要所述连接在X裂解后保留即可。例如，如图2A和2B所说明，货物部分可连接于部分B的一个末端或末端附近，而连接子X连接于部分B的相反末端。货物部分还可连接于部分B的一个末端或末端附近，而连接子X连接于相同末端或其附近。
在分子包括树枝状聚合物的情况下，货物直接连接于D。作为非限制性实例，货物如下连接：
(A-X-B)-D-货物。
在一些实施方案中，货物部分通过共价键结合于B(或c端聚精氨酸)或D。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。
成像剂作为货物
在一些实施方案中，货物部分是荧光分子，如荧光素。荧光货物部分能够利用荧光显微镜或流式细胞仪在未固定培养细胞中容易地测量。
在一些实施方案中，货物部分被以下标记：正电子发射同位素(例如18F)用于正电子发射断层摄影术(PET)、γ射线同位素(例如99mTc)用于单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、顺磁性分子或纳米粒子(例如Gd3+螯合物或包覆磁铁矿纳米粒子)用于磁共振成像(MRI)、近红外荧光团用于近红外线(近IR)成像、荧光素酶(萤火虫、细菌或腔肠动物)或其它发光分子用于生物发光成像，或全氟化碳填充的囊泡用于超声波。
在一些实施方案中，货物部分是放射性部分，例如放射性同位素，如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p和Lu的放射性同位素，以及其它放射性部分。
在一些实施方案中，货物部分是荧光部分，如荧光蛋白、肽或荧光染料分子。荧光染料的常见类别包括但不限于：氧杂蒽，如若丹明(rhodamine)、对甲氨基酚(rhodol)和荧光素，和其衍生物；bimanes；香豆素和其衍生物，如伞形酮(umbelliferone)和氨甲基香豆素；芳香族胺，如丹磺酰基；方酸染料；苯并呋喃；荧光花青；咔唑；二氰基亚甲基吡喃、聚甲炔、氧杂苯并蒽、氧杂蒽、吡喃鎓、喹诺酮、二萘嵌苯、吖啶酮、喹吖酮、红荧烯、蒽、六苯并苯、菲、芘、丁二烯、芪、镧系金属螯合络合物、稀土金属螯合络合物和所述染料的衍生物。荧光染料论述于例如美国专利No.4,452,720、美国专利No.5,227,487和美国专利No.5,543,295中。
在一些实施方案中，货物部分是荧光素染料。典型荧光素染料包括但不限于5-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯和6-羧基荧光素；其它荧光素染料的实例可见于例如美国专利No.6,008,379、美国专利No.5,750,409、美国专利No.5,066,580和美国专利No.4,439,356中。货物部分C可包括若丹明染料，如四甲基若丹明-6-异硫氰酸酯、5-羧基四甲基若丹明、5-羧基对甲氨基酚衍生物、四甲基和四乙基若丹明、二苯基二甲基和二苯基二乙基若丹明、二萘基若丹明、若丹明101磺酰氯(以商品名TEXAS RED
Figure BPA00001525247000561
销售)和其它若丹明染料。其它若丹明染料可见于例如美国专利No.6,080,852、美国专利No.6,025,505、美国专利No.5,936,087、美国专利No.5,750,409中。货物部分C可包括花青染料，如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7。
一些上述化合物或其衍生物除荧光外还将产生磷光，或仅产生磷光。一些磷光化合物包括卟啉、酞菁、聚芳香族化合物(如芘、蒽和苊)等，并且可以是货物部分或包括在货物部分中。货物部分还可以是或包括荧光淬灭剂，如(4-二甲基氨基-苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)基团。
在一些实施方案中，货物部分是荧光标记。在一些实施方案中，货物部分是吲哚羰花青染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRDYE 800CW、ALEXA647或其组合。在一些实施方案中，货物部分是MRI造影剂。在一些实施方案中，货物部分是[4，7，10-三(羰甲基)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。
在一些实施方案中，货物部分是分子信标的全部或一部分。如本文所用，“分子信标”意谓具有含荧光团和荧光淬灭剂的互补区以便荧光团的荧光被淬灭剂淬灭的一对连接化合物。互补区中的一者或两者可为货物部分的一部分。如果互补区中的仅一者(例如荧光部分)是货物部分的一部分，并且如果淬灭剂是连接子X或酸性部分A的一部分，那么连接子X的裂解将允许荧光部分发射荧光和检测所述裂解。细胞吸收后，分子信标的荧光部分将允许检测细胞。例如，淬灭剂Q可连接至酸性部分A以形成具有本发明特征的选择性转运分子Q-A-X-B-C，其中货物是荧光并被Q淬灭。Q对货物部分的淬灭在X裂解后解除，从而允许对吸收部分B-C的细胞进行荧光标记。荧光去淬灭与选择性吸收的组合应增强能够裂解X的组织相比于不能裂解X的组织之间的对比度。
治疗剂作为货物
在一些实施方案中，货物部分是治疗剂，如适用于治疗癌症、缺血组织或坏死组织的化合物。
出于治疗目的，例如，货物的适合类别包括但不限于：a)化学治疗剂；b)辐射致敏剂；或c)调节细胞凋亡、细胞周期或其它关键信号转导级联的肽或蛋白质。
在一些实施方案中，货物部分是调节细胞死亡(例如通过细胞凋亡或坏死)的药剂。在一些实施方案中，货物部分是促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，药物是抗细胞凋亡剂。在一些实施方案中，药物选自：二甲胺四环素(minocycline)；SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；PD 169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)；SB 202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；RWJ 67657(4-[4-(4-氟苯基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-3-丁炔-1-醇)；SB220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)；D-JNKI-1((D)-hJIP175-157-DPro-DPro-(D)-HIV-TAT57-48)；AM-111(Auris)；SP600125(蒽并[1，9-cd]吡唑-6(2H)-酮)；JNK抑制剂I((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20)；JNK抑制剂III((L)-HIV-TAT47-57-gaba-c-Junδ33-57)；AS601245(1，3-苯并噻唑-2-基(2-[[2-(3-吡啶基)乙基]氨基]-4嘧啶基)乙腈)；JNK抑制剂VI(H2N-RPKRPTTLNLF-NH2)；JNK抑制剂VIII(N-(4-氨基-5-氰基-6-乙氧基吡啶-2-基)-2-(2，5-二甲氧基苯基)乙酰胺)；JNK抑制剂IX(N-(3-氰基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-基)-1-萘甲酰胺)；双香豆素(dicumarol)(3，3′-亚甲基双(4-羟基香豆素))；SC-236(4-[5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯-磺酰胺)；CEP-1347(Cephalon)；CEP-11004(Cephalon)；包含Bcl-2多肽的至少一部分的人工蛋白质；重组FNK；V5(也称为Bax抑制剂肽V5)；Bax通道阻断剂((±)-1-(3，6-二溴咔唑-9-基)-3-哌嗪-1-基-丙-2-醇)；Bax抑制肽P5(也称为Bax抑制剂肽P5)；Kp7-6；FAIM(S)(Fas细胞凋亡抑制性分子-短)；FAIM(L)(Fas细胞凋亡抑制性分子-长)；Fas：Fc；FAP-1；NOK2；F2051；F1926；F2928；ZB4；Fas M3 mAb；EGF；740 Y-P；SC 3036(KKHTDDGYMPMSPGVA)；PI 3-激酶活化因子(Santa CruzBiotechnology，Inc.)；Pam3Cys((S)-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH，三盐酸盐)；Act1(NF-κB活化因子1)；抗IkB抗体；乙酰基-11-酮基-b-乳香脂酸；穿心莲内酯(Andrographolide)；咖啡酸苯乙酯(CAPE)；胶毒素(Gliotoxin)；异土木香内酯(Isohelenin)；NEMO结合结构域结合肽(DRQIKIWFQNRRMKWKKTALDWSWLQTE)；NF-κB活化抑制剂(6-氨基-4-(4-苯氧基苯基乙基氨基)喹唑啉)；NF-κB活化抑制剂II(4-甲基-N1-(3-苯基丙基)苯-1，2-二胺)；NF-κB活化抑制剂III(3-氯-4-硝基-N-(5-硝基-2-噻唑基)-苯甲酰胺)；NF-κB活化抑制剂IV((E)-2-氟-4′-甲氧基芪)；NF-κB活化抑制剂V(5-羟基-(2，6-二异丙基苯基)-1H-异吲哚-1，3-二酮)；NF-κB SN50(AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMP)；冬凌草素甲(Oridonin)；小白菊内酯(Parthenolide)；PPM-18(2-苯甲酰胺基-1，4-萘醌)；Ro106-9920；柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)；TIRAP抑制剂肽(RQIKIWFNRRMKWKKLQLRDAAPGGAIVS)；醉茄素A(Withaferin A)；汉黄芩素(Wogonin)；BAY 11-7082((E)3-[(4-甲基苯基)磺酰基]-2-丙烯腈)；BAY 11-7085((E)3-[(4-叔丁基苯基)磺酰基]-2-丙烯腈)；(E)-辣椒素((E)-Capsaicin)；金硫苹果酸盐(ATM或AuTM)；吴茱萸碱(Evodiamine)；嫣红蔓素(Hypoestoxide)；IKK抑制剂III(BMS-345541)；IKK抑制剂VII；IKK抑制剂X；IKK抑制剂II；IKK-2抑制剂IV；IKK-2抑制剂V；IKK-2抑制剂VI；IKK-2抑制剂(SC-514)；IkB激酶抑制剂肽；IKK-3抑制剂IX；ARRY-797(ArrayBioPharma)；SB-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)；SB-239063(反-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)；SB-202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；JX-401(-[2-甲氧基-4-(甲硫基)苯甲酰基]-4-(苯乙基)哌啶)；PD-169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)；SKF-86002(6-(4-氟苯基)-2，3-二氢-5-(4-吡啶基)咪唑并[2，1-b]噻唑二盐酸盐)；SB-200646(N-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-N′-3-吡啶基脲)；CMPD-1(2′-氟-N-(4-羟基苯基)-[1，1′-联苯]-4-丁酰胺)；EO-1428((2-甲基苯基)-[4-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-2-氯苯基]甲酮)；SB-253080(4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲磺酰基)苯基]-1H-咪唑-4-基]吡啶)；SD-169(1H-吲哚-5-甲酰胺)；SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；TZP-101(TranzymePharma)；TZP-102(Tranzyme Pharma)；GHRP-6(生长激素释放肽-6)；GHRP-2(生长激素释放肽-2)；EX-1314(Elixir Pharmaceuticals)；MK-677(Merck)；L-692，429((R)-3-氨基-3-甲基-N-(2，3，4，5-四氢-2-氧代-1-((2′-(1H-四唑-5-基)(1，1′-联苯)-4-基)甲基)-1H-1-苯并氮杂卓-3-基)-丁酰胺)；EP1572(Aib-DTrp-DgTrp-CHO)；地尔硫卓(diltiazem)；地尔硫卓代谢物；BRE(脑和生殖器官表达蛋白)；维拉帕米(verapamil)；尼莫地平(nimodipine)；地尔硫卓；ω-芋螺毒素(omega-conotoxin)；GVIA；氨氯地平(amlodipine)；非洛地平(felodipine)；拉西地平(lacidipine)；咪拉地尔(mibefradil)；NPPB(5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸)；氟桂嗪(flunarizine)；红细胞生成素；胡椒碱；血晶素(hemin)；巴西木素(brazilin)；z-VAD-FMK(苄氧羰基-Val-Ala-Asp(OMe)-氟甲基酮)；z-LEHD-FMK(苄氧羰基-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-氟甲基酮)；B-D-FMK(boc-天冬氨酰基(Ome)-氟甲基酮)；Ac-LEHD-CHO(N-乙酰基-Leu-Glu-His-Asp-CHO)；Ac-IETD-CHO(N-乙酰基-Ile-Glu-Thr-Asp-CHO)；z-IETD-FMK(苄氧羰基-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-氟甲基酮)；FAM-LEHD-FMK(苄氧羰基Leu-Glu-His-Asp-氟甲基酮)；FAM-LETD-FMK(苄氧羰基Leu-Glu-Thr-Asp-氟甲基酮)；Q-VD-OPH(喹啉-Val-Asp-CH2-O-Ph)；XIAP；cIAP-1；cIAP-2；ML-IAP；ILP-2；NAIP；存活素(Survivin)；布鲁斯(Bruce)；IAPL-3；fortilin；亮肽素(leupeptine)；PD-150606(3-(4-碘苯基)-2-巯基-(Z)-2-丙烯酸)；MDL-28170(Z-Val-Phe-CHO)；钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)；乙酰基-钙蛋白酶抑素；MG 132(N-[(苯基甲氧基)羰基]-1-亮氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-1-亮氨酰胺)；MYODUR；BN 82270(Ipsen)；BN 2204(Ipsen)；AHLi-11(QuarkPharmaceuticals)，一种mdm2蛋白，pifithrin-α(1-(4-甲基苯基)-2-(4，5，6，7-四氢-2-亚氨基-3(2H)-苯并噻唑基)乙酮)；反式芪；顺式芪；白藜芦醇；白皮杉醇(piceatannol)；土大黄苷(rhapontin)；脱氧土大黄苷；紫铆因(butein)；查尔酮(chalcon)；异甘草根糖精宁(isoliquirtigen)；紫铆因；4，2′，4′-三羟基查尔酮；3，4，2′，4′，6′-五羟基查尔酮；黄酮；桑色素(morin)；非瑟酮(fisetin)；毛地黄黄酮(luteolin)；槲皮素(quercetin)；堪非醇(kaempferol)；芹菜素(apigenin)；棉黄素(gossypetin)；杨梅酮(myricetin)；6-羟基芹菜素；5-羟基黄酮；5，7，3′，4′，5′-五羟基黄酮；3，7，3′，4′，5′-五羟基黄酮；3，6，3′，4′-四羟基黄酮；7，3′，4′，5′-四羟基黄酮；3，6，2′，4′-四羟基黄酮；7，4′-二羟基黄酮；7，8，3′，4′-四羟基黄酮；3，6，2′，3′-四羟基黄酮；4′-羟基黄酮；5-羟基黄酮；5，4′-二羟基黄酮；5，7-二羟基黄酮；黄豆苷元(daidzein)；染料木素(genistein)；柚皮素(naringenin)；黄烷酮；3，5，7，3′，4′-五羟基黄烷酮；氯化花葵素(pelargonidin chloride)；氯化花青素(cyanidin chloride)；氯化花翠素(delphinidin chloride)；(-)-表儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(-)-儿茶酚(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(-)-没食子儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′，5′)；(+)-儿茶酚(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(+)-表儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；日扁柏素(Hinokitiol)(b-大叶崖柏素(b-Thujaplicin)；2-羟基-4-异丙基-2，4，6-环戊三烯-1-酮)；L-(+)-麦硫因(L-(+)-Ergothioneine)((S)-a-羧基-2，3-二氢-N，N，N-三甲基-2-硫代-1H-咪唑4-乙铵内盐)；咖啡酸苯酯；MCI-186(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)；HBED(N，N′-二-(2-羟基苄基)乙二胺-N，N′-四乙酸·H2O)；氨溴素(Ambroxol)(反-4-(2-氨基-3，5-二溴苄基氨基)环己烷-HCl；和U-83836E((-)-2-((4-(2，6-二-1-吡咯烷基-4-嘧啶基)-1-哌嗪基)甲基)-3，4-二氢-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-6-醇·2HCl)；β-1′-5-甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖；β-D-1′-5-甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖呋喃糖苷；β-1′-4，5-二甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖；β-D-1′-4，5-二甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧呋喃糖苷；1-萘基PP1(1-(1，1-二甲基乙基)-3-(1-萘基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；薰草菌素A(LavendustinA)(5-[[(2，5-二羟基苯基)甲基][(2-羟基苯基)甲基]氨基]-2-羟基苯甲酸)；MNS(3，4-亚甲基二氧基-b-硝基苯乙烯)；PP1(1-(1，1-二甲基乙基)-1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；PP2(3-(4-氯苯基)1-(1，1-二甲基乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；KX-004(Kinex)；KX-005(Kinex)；KX-136(Kinex)；KX-174(Kinex)；KX-141(Kinex)；KX2-328(Kinex)；KX-306(Kinex)；KX-329(Kinex)；KX2-391(Kinex)；KX2-377(Kinex)；ZD4190(Astra Zeneca；N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-(2-(1H-1，2，3-三唑-1-基)乙氧基)喹唑啉-4-胺)；AP22408(AriadPharmaceuticals)；AP23236(Ariad Pharmaceuticals)；AP23451(AriadPharmaceuticals)；AP23464(Ariad Pharmaceuticals)；AZD0530(AstraZeneca)；AZM475271(M475271；Astra Zeneca)；达沙替尼(Dasatinib)(N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-(6-(4-(2-羟基乙基)-哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基氨基)噻唑-5-甲酰胺)；GN963(反-4-(6，7-二甲氧基喹喔啉-2基氨基)环己醇硫酸酯)；伯舒替尼(Bosutinib)(4-((2，4-二氯-5-甲氧基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基)-3-喹啉甲腈)；或其组合。
在一些实施方案中，货物部分是细胞毒性剂。在一些实施方案中，货物部分是美坦素、甲氨蝶呤(RHEUMATREX
Figure BPA00001525247000621
氨甲喋呤)；环磷酰胺(CYTOXAN
Figure BPA00001525247000622
)；沙利度胺(THALIDOMID
Figure BPA00001525247000623
)；紫杉醇；培美曲塞(pemetrexed)；喷司他丁(pentostatin)；哌血生(pipobroman)；匹杉琼(pixantrone)；光神霉素(plicamycin)；丙卡巴肼(procarbazine)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))；雷替曲塞(raltitrexed)；蝶霉素(rebeccamycin)；卢比替康(rubitecan)；SN-38；放线菌内酰胺A(salinosporamide A)；沙铂(satraplatin)；链脲霉素(streptozotocin)；苦马豆碱(swainsonine)；塔瑞奎达(tariquidar)；紫杉烷(taxane)；喃氟啶-尿嘧啶(tegafur-uracil)；替莫唑胺(temozolomide)；睾内酯；硫代TEPA；硫鸟嘌呤；拓扑替康(topotecan)；他比特啶(trabectedin)；维甲酸(tretinoin)；四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)；三(2-氯乙基)胺；曲沙他滨(troxacitabine)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；戊柔比星(valrubicin)；长春碱(vinblastine)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；伏立诺他(vorinostat)；左苏奎达(zosuquidar)；或其组合。
脂质作为货物
在某些实施方案中，本文公开一种选择性转运分子。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子具有式(A-X-B)n-L，其中L是脂质；A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；并且X是连接子。关于使用脂质囊封的治疗剂作用货物的作用的详细分析，请参见实施例4。
在一些实施方案中，L通过共价键结合于B(或c端聚精氨酸)。在一些实施方案中，共价键包括醚键、硫醚键、胺键、酰胺键、碳碳键、碳氮键、碳氧键或碳硫键。在一些实施方案中，L通过非共价相互作用结合于B。
在一些实施方案中，多个(A-X-B)部分连接于L。参见实施例3。在一些实施方案中，多个货物部分由L囊封。在一些实施方案中，(a)多个(A-X-B)部分连接于L；并且(b)多个货物部分由L囊封。
在一些实施方案中，脂质包覆疏水性分子。在一些实施方案中，脂质包覆至少一种选自由治疗性部分或成像部分组成的组的药剂。在一些实施方案中，药剂是阿霉素。在一些实施方案中，药剂是紫杉醇。在一些实施方案中，药剂是他莫昔芬(tamoxifen)。在一些实施方案中，药剂选自：阿洛泼林(aloxiprin)、醋丁洛尔(acebutolol)、乙酰唑胺(acetazolamide)、醋磺己脲(acetohexamide)、阿伐斯汀(acrivastine)、阿苯达唑(albendazole)、别嘌呤醇(allopurinol)、阿普唑仑(alprazolam)、烯丙洛尔(alprenolol)、阿米洛利(amiloride)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、盐酸安碘达隆(amiodarone、HCl)、氨氯地平(amlodipine)、阿莫地喹(amodiaquine)、阿莫沙平(amoxapine)、安非他明(amphetamine)、两性霉素(amphotericin)、氨利酮(amrinone)、氨吖啶(amsacrine)、硝酸戊酯、戊巴比妥(amylobarbitone)、阿司咪唑(astemizole)、阿替洛尔(atenolol)、阿托品(atropine)、金诺芬(auranofin)、阿扎丙酮(azapropazone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巴比妥(barbitone)、贝克拉胺(beclamide)、倍氯米松(beclomethasone)、苄氟噻嗪(bendrofluazide)、贝尼地平(benidipine)、扑炎痛(benorylate)、苯他西泮(bentazepam)、盐酸苯海索(benzhexol HCl)、苄硝唑(benznidazole)、羟萘酸酚乙铵(bephenium hydroxynaphthoate)、β-胡萝卜素(betacarotene)、倍他米松(betamethasone)、苯扎贝特(bezafibrate)、比哌立登(biperiden)、比沙可啶(bisacodyl)、溴基安定(bromazepam)、甲磺酸溴麦角环肽(bromocriptine mesylate)、溴哌利多(bromperidol)、溴替唑仑(brotizolam)、布地缩松(budesonide)、布美他尼(bumetanide)、白消安(busulphan)、丁巴比妥(butobarbitone)、硝酸布康唑(butoconazolenitrate)、堪苯达唑(cambendazole)、卡巴咪嗪(carbamazepine)、甲亢平(carbimazole)、卡溴脲(carbromal)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、利眠宁(chlordiazepoxide)、氯甲噻唑(chlormethiazole)、氯喹(chloroquine)、氯噻嗪(chlorothiazide)、盐酸氯丙胍(chlorproguanilHCl)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、氯噻酮(chlorthalidone)、西咪替丁(cimetidine)、桂利嗪(cinnarizine)、西诺沙星(cinoxacin)、盐酸环丙沙星(ciprofloxacin HCl)、西沙必利(cisapride)、克拉霉素(clarithromycin)、氯碘羟喹(clioquinol)、氯巴占(clobazam)、氯苯吩嗪(clofazimine)、氯贝丁酯(clofibrate)、柠檬酸克罗米芬(clomiphene citrate)、氯硝西泮(clonazepam)、氯噻西泮(clotiazepam)、克霉唑(clotrimazole)、氯洒西林(cloxacillin)、氯氮平(clozapine)、可待因(codeine)、偶联雌激素、乙酸可的松(cortisone acetate)、赛克利嗪(cyclizine)、环孢菌素(cyclosporin)、盐酸赛庚啶(cyproheptadine HCl)、氮烯唑胺(dacarbazine)、达那唑(danazol)、达罗地平(darodipine)、地可喹酯(decoquinate)、地美环素(demeclocycline)、去氧米松(desoxymethasone)、地塞米松(dexamethasone)、右旋安非他明(dexamphetamine)、右旋芬氟拉明(dexfenfluramine)、右旋丙氧酚(dextropropyoxyphene)、海洛因(diamorphine)、安定(diazepam)、二氮嗪(diazoxide)、双氯酚(dichlorophen)、双香豆素(dicoumarol)、二氟尼柳(diflunisal)、洋地黄毒苷(digitoxin)、地高辛(digoxin)、二氢可待因(dihydrocodeine)、甲磺酸二氢麦角胺(dihydroergotamine mesylate)、二碘羟基喹啉(diiodohydroxyquinoline)、盐酸地尔硫卓(dilitazem HCl)、糠酸二氯尼特(diloxanide furoate)、乘晕宁(dimenhydrinate)、二硝托胺(dinitolmide)、盐酸苯乙哌啶(diphenoxylate HCl)、潘生丁(dipyridamole)、达舒平(disopyramide)、多潘立酮(domperidone)、强力霉素(doxycycline)、氟哌利多(droperidol)、硝酸益康唑(econazolenitrate)、依诺西酮(enoximone)、酒石酸麦角胺(ergotamine tartrate)、红霉素(erythromycin)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、利尿酸(ethacrynic acid)、炔己乙胺(ethinamate)、乙炔雌二醇(ethinylestradiol)、乙硫异烟胺(ethionamide)、盐酸爱普杷嗪(ethopropazineHCl)、乙苯妥英(ethotoin)、依托度酸(etodolac)、依托泊苷(etoposide)、法莫替丁(famotidine)、非洛地平(felodipine)、芬布芬(fenbufen)、氟苯丙胺(fenfluramine)、菲诺贝特(fenofibrate)、菲诺洛芬钙(fenoprofen calcim)、乙酸氟卡胺(flecainide acetate)、氟康唑(fluconazole)、氟可龙(flucortolone)、氟胞嘧啶(flucytosine)、乙酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、氟阿尼酮(flunanisone)、盐酸氟桂嗪(flunarizine HCl)、氟尼缩松(flunisolide)、氟硝西泮(flunitrazepam)、三氟丙嗪(fluopromazine)、癸酸三氟噻醇(flupenthixol decanoate)、癸酸氟非那嗪(fluphenazine decanoate)、氟胺安定(flurazepam)、氟比洛芬(flurbiprofen)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、速尿(frusemide)、呋喃唑酮(furzolidone)、吉非贝齐(gemfibrozil)、格列本脲(glibenclamide)、格列齐特(gliclazide)、格列甲嗪(glipizide)、三硝酸甘油酯(glyceryl trinitrate)、灰黄霉素(griseofulvin)、乙酸胍那苄(guanabenz acetate)、乙酸氯氟非醇(halofantrine HCl)、氟哌啶醇(haloperidol)、氢化可的松(hydrocortisone)、天仙子胺(hyoscyamine)、布洛芬(ibuprofen)、亚胺培南(imipenem)、吲哚美辛(indomethacin)、二硝酸异山梨醇酯(isosorbide dinitrate)、单硝酸异山梨醇酯(isosorbide mononitrate)、依拉地平(isradipine)、伊曲康唑(itraconazole)、伊维菌素(ivermectin)、酮康唑(ketoconazole)、酮洛芬(ketoprofen)、拉贝洛尔(labetalol)、毛花苷C(lanatoside C)、洛莫司汀(lomustine)、洛哌丁胺(loperamide)、氯雷他定(loratadine)、劳拉西泮(lorazepam)、氯甲西泮(lormetazepam)、马来酸麦角乙脲(lysuride maleate)、盐酸马普替林(maprotiline HCl)、马吲哚(mazindol)、甲苯达唑(mebendazole)、甲氯灭酸(meclofenamic acid)、盐酸美克洛嗪(meclozine HCl)、美达西泮(medazepam)、甲基地高辛(medigoxin)、乙酸甲孕酮(medroxyprogesterone acetate)、甲灭酸(mefenamic acid)、盐酸甲氟喹(mefloquine HCl)、美法仑(melphalan)、溴美喷酯(mepenzolatebromide)、眠而通(meprobamate)、美普他酚(meptazinol)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美沙拉嗪(mesalazine)、美雌醇(mestranol)、美沙酮(methadone)、安眠酮(methaqualone)、美索因(methoin)、甲氨蝶呤、甲琥胺(methsuximide)、甲基苯巴比妥(methylphenobarbitone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、马来酸二甲麦角新碱(methysergide maleate)、美托拉腙(metolazone)、美托洛尔(metoprolol)、甲硝哒唑(metronidazole)、盐酸米安色林(mianserin HCl)、咪康唑(miconazole)、咪达唑仑(midazolam)、米诺地尔(minoxidil)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitozantrone)、吗啡(morphine)、萘普酮(nabumetone)、纳多洛尔(nadolol)、纳布啡(nalbuphine)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、萘普生(naproxen)、游霉素(natamycin)、盐酸尼卡地平(nicardipine HCl)、新抗凝(nicoumalone)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼莫拉唑(nimorazole)、硝西泮(nitrazepam)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、呋喃西林(nitrofurazone)、尼扎替丁(nizatidine)、炔诺酮(norethisterone)、炔诺孕酮(norgestrel)、盐酸去甲替林(nortriptyline HCl)、制霉菌素(nystatin)、奥美拉唑(omeprazole)、盐酸昂丹司琼(ondansetron HCl)、奥硝唑(ornidazole)、羟胺硝喹(oxamniquine)、双羟萘酸甲嘧烯酚(oxantel embonate)、奥沙米特(oxatomide)、奥沙西泮(oxazepam)、奥卡西平(oxcarbazepine)、奥芬达唑(oxfendazole)、氧烯洛尔(oxprenolol)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、盐酸羟苄利明(oxyphencylcimine HCl)、紫杉醇、甲乙双酮(paramethadione)、四硝酸季戊四醇酯、戊唑辛(pentazocine)、戊巴比妥(pentobarbitone)、奋乃静(perphenazine)、哌迷清(pimozide)、苯乙酰脲(phenacemide)、苯茚二酮(phenindione)、苯巴比妥(phenobarbitone)、盐酸苯氧苄胺(phenoxybenzamine HCl)、苯琥胺(phensuximide)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、苯妥英(phenytoin)、吲哚洛尔(pindolol)、吡罗昔康(piroxicam)、马来酸苯噻啶(pizotifen maleate)、吡喹酮(praziquantel)、盐酸哌唑嗪(prazosin HCl)、脱氢皮质醇(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、扑米酮(primidone)、丙磺舒(probenecid)、普罗布考(probucol)、盐酸丙卡巴肼(procarbazine HCl)、氯吡嗪(prochlorperazine)、孕酮盐酸氯胍(proguanil HCl)、普萘洛尔(propranolol)、丙基硫尿嘧啶(propylthiouracil)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel embonate)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、硫酸奎尼丁(quinidine sulphate)。抗菌剂：苄乙胺青霉素(benethamine penicillin)、硫酸奎宁(quinine sulphate)、盐酸雷尼替丁(ranitidine HCl)、利血平(reserpine)、利福平(rifampicin)、螺旋霉素(spiramycin)、螺内酯(spironolactone)、司坦唑醇(stanozolol)、乙烯雌酚(stibestrol)、硝酸硫康唑(sulconazole nitrate)、舒林酸(sulindac)、磺胺苯酰(sulphabenzamide)、磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulphadiazine)、长效磺胺(sulphadoxine)、磺胺异恶唑(sulphafurazole)、磺胺甲基嘧啶(sulphamerazine)、磺胺甲恶唑(sulphamethoxazole)、磺胺吡啶(sulphapyridine)、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)、苯磺唑酮(sulphin-pyrazone)、舒必利(sulpiride)、舒噻嗪(sulthiame)、琥珀酸舒马普坦(sumatriptan succinate)、柠檬酸他莫昔芬(tamoxifencitrate)、替马西泮(temazepam)、盐酸特拉唑嗪(terazosin HCl)、盐酸特比萘芬(terbinafine HCl)、特康唑(terconazole)、特非那定(terfenadine)、睾内酯(testolactone)、睾酮(testosterone)、四环素(tetracycline)、噻苯咪唑(thiabendazole)、甲硫达嗪(thioridazine)、替勃龙(tibolone)、替硝唑(tinidazole)、噻康唑(tioconazole)、妥拉磺脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、盐酸曲唑酮(trazodoneHCl)、曲安西龙(triamcinolone)、三氨喋呤(triamterene)、三唑仑(triazolam)、甲氧苄啶(trimethoprim)、马来酸曲米帕明(trimipraminemaleate)、托品酰胺(tropicamide)、十一碳烯酸、丙戊酸、维生素A、维生素B 2、维生素D、维生素E、维生素K、吡嗪哌酯(zopiclone)或其组合。
在一些实施方案中，脂质被聚乙二醇化。在一些实施方案中，脂质是PEG(2K)磷脂酰乙醇胺。
使用方法
标记组织
在某些实施方案中，本文公开通过向有需要的患者施用本文所述的选择性转运分子来标记组织(例如，以界定肿瘤切除的手术边缘)的方法。在一些实施方案中，组织是肿瘤。在一些实施方案中，组织是缺血组织。在一些实施方案中，组织是低氧组织。在一些实施方案中，组织是坏死组织。在一些实施方案中，组织是酸中毒组织。在一些实施方案中，组织是患病组织(例如，受感染原感染的组织、与毒物接触的组织、罹患自体免疫性病症的组织、炎症组织)。
在一些实施方案中，对组织进行标记以供在手术期间进行鉴别和移除。在一些实施方案中，对受试者的肿瘤或组织切除的手术边缘进行成像的方法包括在向受试者施用本文公开的选择性转运分子后对手术边缘进行成像。在一些实施方案中，对受试者的肿瘤进行成像的方法包括在向受试者施用本文公开的选择性转运分子后对肿瘤进行成像。在一些实施方案中，移除受试者的肿瘤的方法包括在向受试者施用本文公开的选择性转运分子后移除肿瘤。
在一些实施方案中，所述方法包括向将进行手术的受试者施用本文所述的选择性转运分子。在一些实施方案中，所述方法包括向正进行手术的受试者施用本文所述的选择性转运分子。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子是向患者全身性施用。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子是向患者局部施用。
在一些实施方案中，在评估和治疗癌症的多个阶段利用本文公开的选择性转运分子。在一些实施方案中，双重模态(MR和荧光)选择性转运分子允许肿瘤科医师和放射科医师进行术前分期，特别是对于被膜入侵是重要的癌症(如前列腺癌)进行术前分期，从而阻止不为手术候选者的患者进行手术。在一些实施方案中，利用双重标记选择性转运分子给出的解剖和生物化学信息适用于供外科医生计划复杂手术程序。在一些实施方案中，选择性转运分子与裂解位点的紧密结合提供关于肿瘤生物学的局部信息，其不仅允许外科医生通过手术中荧光成像着重关注肿瘤生长的最具侵入性的区域，而且还允许病理学家通过手术中组织学分析对其进行关注。在一些实施方案中，在手术后，双重探针允许利用第二MRI进一步评估肿瘤移除的完成度。
药物递送
在某些实施方案中，本文公开靶向药物递送的方法。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至特定标靶(例如细胞或多个细胞)。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至肿瘤。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至缺血组织。在一些实施方案中，本文公开的选择性转运分子将药物递送至低氧组织。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至坏死组织。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至酸中毒组织。在一些实施方案中，本文所述的选择性转运分子将药物递送至患病组织(例如，受感染原感染的组织、与毒物接触的组织、罹患自体免疫性病症的组织、炎症组织)。
在一些实施方案中，药物是调节细胞死亡(例如通过细胞凋亡或坏死)的药剂。在一些实施方案中，药物是细胞毒性剂。在一些实施方案中，药物是美坦素、甲氨蝶呤(RHEUMATREX
Figure BPA00001525247000691
氨甲喋呤)；环磷酰胺(CYTOXAN
Figure BPA00001525247000701
)；沙利度胺(THALEDOMID
Figure BPA00001525247000702
)；紫杉醇；培美曲塞；喷司他丁；哌血生；匹杉琼；光神霉素；丙卡巴肼；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)；雷替曲塞；蝶霉素；卢比替康；SN-38；放线菌内酰胺A；沙铂；链脲霉素；苦马豆碱；塔瑞奎达；紫杉烷；喃氟啶-尿嘧啶；替莫唑胺；睾内酯；硫代TEPA；硫鸟嘌呤；拓扑替康；他比特啶；维甲酸；四硝酸三铂；三(2-氯乙基)胺；曲沙他滨；尿嘧啶氮芥；戊柔比星；长春碱；长春新碱；长春瑞宾；伏立诺他；左苏奎达；或其组合。在一些实施方案中，药物是促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，药物是抗细胞凋亡剂。在一些实施方案中，药物选自：二甲胺四环素；SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；PD 169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)；SB 202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；RWJ 67657(4-[4-(4-氟苯基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-3-丁炔-1-醇)；SB 220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)；D-JNKI-1((D)-hJIP175-157-DPro-DPro-(D)-HIV-TAT57-48)；AM-111(Auris)；SP600125(蒽并[1，9-cd]吡唑-6(2H)-酮)；JNK抑制剂I((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20)；JNK抑制剂III((L)-HIV-TAT47-57-gaba-c-Junδ33-57)；AS601245(1，3-苯并噻唑-2-基(2-[[2-(3-吡啶基)乙基]氨基]-4嘧啶基)乙腈)；JNK抑制剂VI(H2N-RPKRPTTLNLF-NH2)；JNK抑制剂VIII(N-(4-氨基-5-氰基-6-乙氧基吡啶-2-基)-2-(2，5-二甲氧基苯基)乙酰胺)；JNK抑制剂IX(N-(3-氰基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-基)-1-萘甲酰胺)；双香豆素(3，3′-亚甲基双(4-羟基香豆素))；SC-236(4-[5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯-磺酰胺)；CEP-1347(Cephalon)；CEP-11004(Cephalon)；包含Bcl-2多肽的至少一部分的人工蛋白质；重组FNK；V5(也称为Bax抑制剂肽V5)；Bax通道阻断剂((±)-1-(3，6-二溴咔唑-9-基)-3-哌嗪-1-基-丙-2-醇)；Bax抑制肽P5(也称为Bax抑制剂肽P5)；Kp7-6；FAIM(S)(Fas细胞凋亡抑制性分子-短)；FAIM(L)(Fas细胞凋亡抑制性分子-长)；Fas：Fc；FAP-1；NOK2；F2051；F1926；F2928；ZB4；Fas M3mAb；EGF；740Y-P；SC 3036(KKHTDDGYMPMSPGVA)；PI 3-激酶活化因子(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)；Pam3Cys((S)-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH，三盐酸盐)；Act1(NF-κB活化因子1)；抗IkB抗体；乙酰基-11-酮基-b-乳香脂酸；穿心莲内酯；咖啡酸苯乙酯(CAPE)；胶毒素；异土木香内酯；NEMO结合结构域结合肽(DRQIKIWFQNRRMKWKKTALDWSWLQTE)；NF-κB活化抑制剂(6-氨基-4-(4-苯氧基苯基乙基氨基)喹唑啉)；NF-κB活化抑制剂II(4-甲基-N1-(3-苯基丙基)苯-1，2-二胺)；NF-κB活化抑制剂III(3-氯-4-硝基-N-(5-硝基-2-噻唑基)-苯甲酰胺)；NF-κB活化抑制剂IV((E)-2-氟-4′-甲氧基芪)；NF-κB活化抑制剂V(5-羟基-(2，6-二异丙基苯基)-1H-异吲哚-1，3-二酮)；NF-κB SN50(AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMP)；冬凌草素甲；小白菊内酯；PPM-18(2-苯甲酰胺基-1，4-萘醌)；Ro106-9920；柳氮磺胺吡啶；TIRAP抑制剂肽(RQIKIWFNRRMKWKKLQLRDAAPGGAIVS)；醉茄素A；汉黄芩素；BAY 11-7082((E)3-[(4-甲基苯基)磺酰基]-2-丙烯腈)；BAY 11-7085((E)3-[(4-叔丁基苯基)磺酰基]-2-丙烯腈)；(E)-辣椒素；金硫苹果酸盐(ATM或AuTM)；吴茱萸碱；嫣红蔓素；IKK抑制剂III(BMS-345541)；IKK抑制剂VII；IKK抑制剂X；IKK抑制剂II；IKK-2抑制剂IV；IKK-2抑制剂V；IKK-2抑制剂VI；IKK-2抑制剂(SC-514)；IkB激酶抑制剂肽；IKK-3抑制剂IX；ARRY-797(ArrayBioPharma)；SB-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)；SB-239063(反-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)；SB-202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；JX-401(-[2-甲氧基-4-(甲硫基)苯甲酰基]-4-(苯乙基)哌啶)；PD-169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)；SKF-86002(6-(4-氟苯基)-2，3-二氢-5-(4-吡啶基)咪唑并[2，1-b]噻唑二盐酸盐)；SB-200646(N-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-N′-3-吡啶基腺；CMPD-1(2′-氟-N-(4-羟基苯基)-[1，1′-联苯]-4-丁酰胺)；EO-1428((2-甲基苯基)-[4-[(2-氨基-4-溴苯基)氨基]-2-氯苯基]甲酮)；SB-253080(4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲磺酰基)苯基]-1H-咪唑-4-基]吡啶)；SD-169(1H-吲哚-5-甲酰胺)；SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；TZP-101(TranzymePharma)；TZP-102(Tranzyme Pharma)；GHRP-6(生长激素释放肽-6)；GHRP-2(生长激素释放肽-2)；EX-1314(Elixir Pharmaceuticals)；MK-677(Merck)；L-692，429((R)-3-氨基-3-甲基-N-(2，3，4，5-四氢-2-氧代-1-((2′-(1H-四唑-5-基)(1，1′-联苯)-4-基)甲基)-1H-1-苯并氮杂卓-3-基)-丁酰胺)；EP1572(Aib-DTrp-DgTrp-CHO)；地尔硫卓；地尔硫卓代谢物；BRE(脑和生殖器官表达蛋白)；维拉帕米；尼莫地平；地尔硫卓；ω-芋螺毒素；GVIA；氨氯地平；非洛地平；拉西地平；咪拉地尔；NPPB(5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸)；氟桂嗪；红细胞生成素；胡椒碱；血晶素；巴西木素；z-VAD-FMK(苄氧羰基-Val-Ala-Asp(OMe)-氟甲基酮)；z-LEHD-FMK(苄氧羰基-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-氟甲基酮)；B-D-FMK(boc-天冬氨酰基(Ome)-氟甲基酮)；Ac-LEHD-CHO(N-乙酰基-Leu-Glu-His-Asp-CHO)；Ac-IETD-CHO(N-乙酰基-Ile-Glu-Thr-Asp-CHO)；z-IETD-FMK(苄氧羰基-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-氟甲基酮)；FAM-LEHD-FMK(苄氧羰基Leu-Glu-His-Asp-氟甲基酮)；FAM-LETD-FMK(苄氧羰基Leu-Glu-Thr-Asp-氟甲基酮)；Q-VD-OPH(喹啉-Val-Asp-CH2-O-Ph)；XIAP；cIAP-1；cIAP-2；ML-IAP；ILP-2；NAIP；存活素；布鲁斯；IAPL-3；fortilin；亮肽素；PD-150606(3-(4-碘苯基)-2-巯基-(Z)-2-丙烯酸)；MDL-28170(Z-Val-Phe-CHO)；钙蛋白酶抑制剂；乙酰基-钙蛋白酶抑素；MG 132(N-[(苯基甲氧基)羰基]-1-亮氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-1-亮氨酰胺)；MYODUR；BN 82270(Ipsen)；BN 2204(Ipsen)；AHLi-11(Quark Pharmaceuticals)，一种mdm2蛋白，pifithrin-α(1-(4-甲基苯基)-2-(4，5，6，7-四氢-2-亚氨基-3(2H)-苯并噻唑基)乙酮)；反式芪；顺式芪；白藜芦醇；白皮杉醇；土大黄苷；脱氧土大黄苷；紫铆因；查尔酮；异甘草根糖精宁；紫铆因；4，2′，4′-三羟基查尔酮；3，4，2′，4′，6′-五羟基查尔酮；黄酮；桑色素；非瑟酮；毛地黄黄酮；槲皮素；堪非醇；芹菜素；棉黄素；杨梅酮；6-羟基芹菜素；5-羟基黄酮；5，7，3′，4′，5′-五羟基黄酮；3，7，3′，4′，5′-五羟基黄酮；3，6，3′，4′-四羟基黄酮；7，3′，4′，5′-四羟基黄酮；3，6，2′，4′-四羟基黄酮；7，4′-二羟基黄酮；7，8，3′，4′-四羟基黄酮；3，6，2′，3′-四羟基黄酮；4′-羟基黄酮；5-羟基黄酮；5，4′-二羟基黄酮；5，7-二羟基黄酮；黄豆苷元；染料木素；柚皮素；黄烷酮；3，5，7，3′，4′-五羟基黄烷酮；氯化花葵素；氯化花青素；氯化花翠素；(-)-表儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(-)-儿茶酚(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(-)-没食子儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′，5′)；(+)-儿茶酚(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；(+)-表儿茶素(羟基位点：3，5，7，3′，4′)；日扁柏素(b-大叶崖柏素；2-羟基-4-异丙基-2，4，6-环戊三烯-1-酮)；L-(+)-麦硫因((S)-a-羧基-2，3-二氢-N，N，N-三甲基-2-硫代-1H-咪唑4-乙铵内盐)；咖啡酸苯酯；MCI-186(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)；HBED(N，N′-二-(2-羟基苄基)乙二胺-N，N′-四乙酸·H2O)；氨溴素(反-4-(2-氨基-3，5-二溴苄基氨基)环己烷-HCl；和U-83836E((-)-2-((4-(2，6-二-1-吡咯烷基-4-嘧啶基)-1-哌嗪基)甲基)-3，4-二氢-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-6-醇·2HCl)；β-1′-5-甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖；β-D-1′-5-甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖呋喃糖苷；β-1′-4，5-二甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧核糖；β-D-1′-4，5-二甲基-烟碱酰胺-2′-脱氧呋喃糖苷；1-萘基PP1(1-(1，1-二甲基乙基)-3-(1-萘基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；薰草菌素A(5-[[(2，5-二羟基苯基)甲基][(2-羟基苯基)甲基]氨基]-2-羟基苯甲酸)；MNS(3，4-亚甲基二氧基-b-硝基苯乙烯)；PP1(1-(1-二甲基乙基)-1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；PP2(3-(4-氯苯基)1-(1，1-二甲基乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)；KX-004(Kinex)；KX-005(Kinex)；KX-136(Kinex)；KX-174(Kinex)；KX-141(Kinex)；KX2-328(Kinex)；KX-306(Kinex)；KX-329(Kinex)；KX2-391(Kinex)；KX2-377(Kinex)；ZD4190(Astra Zeneca；N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-(2-(1H-1，2，3-三唑-1-基)乙氧基)喹唑啉-4-胺)；AP22408(Ariad Pharmaceuticals)；AP23236(AriadPharmaceuticals)；AP23451(Ariad Pharmaceuticals)；AP23464(AriadPharmaceuticals)；AZD0530(Astra Zeneca)；AZM475271(M475271；Astra Zeneca)；达沙替尼(N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-(6-(4-(2-羟基乙基)-哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基氨基)噻唑-5-甲酰胺)；GN963(反-4-(6，7-二甲氧基喹喔啉-2基氨基)环己醇硫酸酯)；伯舒替尼(4-((2，4-二氯-5-甲氧基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基)-3-喹啉甲腈)；或其组合。
混杂使用
在一些实施方案中，使用货物部分是成像剂和钆的选择性转运分子对转移进行成像。在一些实施方案中，在纵向实验中使用货物部分是成像剂和钆的选择性转运分子来判定炎症是在明显转移之前还是在其后不久发生(图40)。在一些实施方案中，使用货物部分是成像剂和钆的选择性转运分子对病症进行成像，其中MMP起重要作用并且其中观测MMP和炎症适用于提高对疾病过程的理解(例如，肠病、类风湿性关节炎或多发性硬化症)。关于偶联选择性转运分子与树枝状聚合物纳米粒子的作用的详细分析，其中所述纳米粒子还与钆偶联，请参见实施例40。
在一些实施方案中，使用偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子来靶向肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，使用偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子来毒杀皮下巨噬细胞，其中所述纳米粒子进一步包含蓖麻毒素A。
药物组合物
在某些实施方案中，本文公开包含本文公开的选择性转运分子的药物组合物。本文中的药物组合物是使用一个或多种生理学上可接受的载剂进行配制，所述载剂包括有利于将活性剂加工成药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当制剂取决于所选施用途径。关于药物组合物的概述可见于以下文献中，例如Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，第9版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编著，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decke r，New York，N.Y.，1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams & Wilkins，1999)。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。在一些实施方案中，药物组合物包括其它医学或医药剂、载剂、佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，药物组合物还含有其它治疗上有价值的物质。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物通过任何适合的施用途径施用至受试者，所述途径包括但不限于胃肠外(静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部)施用。
适于肌肉内、皮下、静脉内注射的制剂包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及供复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。适合水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等)、其适合混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。例如通过使用涂层(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。适于皮下注射的制剂还含有可选添加剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。
对于静脉内注射，任选地在水溶液中配制活性剂，优选在生理上相容的缓冲液(如弗兰克溶液(Flank′s solution)、林格溶液(Ringer′ssolution)或生理盐水缓冲液)中配制。
胃肠外注射任选地包括快速注射或连续输注。用于注射的制剂任选地以单位剂型，例如于添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中提供。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是呈适于胃肠外注射的形式，如油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液，并且含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配方剂。用于胃肠外施用的药物制剂包括呈水溶性形式的活性剂的水溶液。另外，悬浮液任选地制备成适当油性注射悬浮液。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是呈适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成含有适量本文公开的活性剂的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量呈含有离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装片剂或胶囊，和于小瓶或安瓿中的散剂。在一些实施方案中，水性悬浮液组合物包装于单剂量不可再封口容器中。或者，使用多剂量可再封口容器，在此情况下组合物中通常包括防腐剂。仅举例来说，用于胃肠外注射的制剂是以单位剂型提供，所述单位剂型包括但不限于安瓿，或于添加有防腐剂的多剂量容器中提供。
实施例
实施例1 肽合成
合成多种细胞吸收可进行调节的肽。以下符号在使用时以所示含义使用：Fl＝荧光素；aca＝ahx＝X＝氨基己酸连接子(-HN-(CH2)5-CO-)；C＝L-半胱氨酸；E＝L-谷氨酸；R＝L-精氨酸；D＝L-天冬氨酸；K＝L-赖氨酸；A＝L-丙氨酸；r＝D-精氨酸；c＝D-半胱氨酸；e＝D-谷氨酸；P＝L-脯氨酸；L＝L-亮氨酸；G＝甘氨酸；V＝缬氨酸；I＝异亮氨酸；M＝甲硫氨酸；F＝苯丙氨酸；Y＝酪氨酸；W＝色氨酸；H＝组氨酸；Q＝谷氨酰胺；N＝天冬酰胺；S＝丝氨酸；且T＝苏氨酸。
在以下所论述的序列中，小写字母表示氨基酸的D异构体。
在肽合成仪(Applied Biosystems的先锋肽合成系统(PioneerPeptide Synthesis System))上使用固相合成法和市售Fmoc氨基酸、树脂和其它试剂合成肽。肽用TFA/茴香硫醚/三异丙基硅烷或TFA/茴香硫醚/三异丙基硅烷/乙烷二硫醇进行裂解。
将肽用5-(和-6)羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯在肽的氨基上或用5-碘乙酰胺基荧光素在肽的硫醇基上进行标记。
粗肽利用HPLC进行纯化并冻干过夜。
通过质谱法确认各肽的组成。
合成选择性转运分子(下文称为肽1)
通过标准Fmoc固相肽合成法合成Suc-e8-(Aop)-PLGC9Me)AG-r9-c-NH2。通过与琥珀酸酐反应向肽添加N-端琥珀酰基，同时仍保留在树脂上。在室温下在标准混合液(含各自为2％的茴香硫醚、三异丙基硅烷和乙烷二硫醇的三氟乙酸)中过夜使肽从树脂上裂解。利用旋转蒸发器移除大部分三氟乙酸，添加己烷的50％乙醚溶液并通过离心收集肽。收集的固体用己烷的50％乙醚溶液洗涤三次并真空干燥整夜。肽通过HPLC使用含15％-30％乙腈的水和0.05％TFA进行纯化，从粗肽得到30％的产率。正确纯化产物通过电喷雾质谱进行确认：计算值3271.5Da，实验值3271.8Da。
合成经过肽标记的树枝状聚合物2
在N2下将25mg肽1溶解于2mL DMSO中并与2.3mg 6-马来酰亚胺基己酸2-硝基-4-磺酸基苯酯钠盐和20μL N-甲基吗啉反应。在室温下搅拌3小时后，反应混合物的LC-MS分析指示完成超过90％。将反应混合物冷却至0°，添加150mg PAMAM树枝状聚合物和2mL 1M Hepes缓冲液(pH 7.8)并在5°下搅拌2天(下文称为反应混合物2)。
合成经过Cy5和肽标记的树枝状聚合物3。
向反应混合物2中添加1.2mg Cy5单(N-羟基琥珀酰亚胺)并在5°下搅拌整夜(下文称为反应混合物3)。
合成加帽的经过Cy5和肽标记的树枝状聚合物4。
在5°下向反应混合物中添加166mgMeO(CH2CH2O)3CH2CH2CO-(N-羟基琥珀酰亚胺)酯并在此温度下搅拌3小时。粗产物用10mL水稀释，并通过用具有10kDa截止值的膜过滤8次移除低分子量污染物。使用尺寸排阻管柱进行的HPLC指示纯度为99％，产率72％。通过将已知重量的纯化终产物溶解于水中并在假定消光系数为250,000M-1cm-1的情况下在650nm下测量Cy5吸光度，测得每个树枝状聚合物3个荧光团的平均值。785nm下的静态多角度光散射指示表观分子量为72.9kDa。785nm下的动态光散射指示水力学半径为4.6nm。
合成经过DOTA、Cy5和肽标记的树枝状聚合物5。
使30当量DOTA单N-羟基琥珀酰亚胺酯在HEPES缓冲液中与反应混合物3反应并在5°下搅拌整夜(下文称为反应混合物5)。
合成加帽的经过DOTA、Cy5和肽标记的树枝状聚合物6。
使反应混合物5与950当量mPEG4 NHS反应并在5°下搅拌3天。粗产物如关于加帽的经过Cy5和肽标记的树枝状聚合物4所述进行纯化，接着冻干。产率为78％。
加帽的经过DOTA、Cy5和肽标记的树枝状聚合物6的Gd负载
将25mg加帽的经过DOTA、Cy5和肽标记的树枝状聚合物6溶解于1mL 0.5M乙酸铵和1mL水中。混合反应混合物与100μL 0.5GdCl3并在室温下避光搅拌3天。通过5此水性洗涤去除小分子。通过利用具有10kDa截止值的膜过滤器进行离心移除过量水。最后，将负载Gd的产物7冻干整夜得到蓝色蓬松固体。称量纯产物并再溶解于水中得到200μM溶液。测出小份等分试样与0.5mL浓硝酸混合2小时。通过感应耦合等离子质谱测定Gd定量，其指示每个树枝状聚合物15个Gd的平均值。每个树枝状聚合物Cy5标记的数目根据650nm吸光度确认为3。
实施例2：偶联白蛋白的选择性转运分子
肽合成
通过固相合成法合成具有游离n端和c端半胱氨酸的肽。合成肽序列e9-oPLGC(me)AG-r9-c-NH2作为可裂解肽(o是5-氨基-3-氧戊酰基连接子并且C(me)是S-甲基半胱氨酸)并合成e9-(Peg2)2-r9-c作为不可裂解肽。裂解并通过HPLC进行纯化后，使肽以过量与Cy5-单马来酰亚胺在含NMM的DMF中反应。反应完成后，在与前一反应相同的条件下使肽进一步与马来酰亚胺基丙酸-PFP酯反应。反应利用HPLC质谱法监测并通过HPLC进行纯化。对于经过DOTA标记的肽，通过在固相合成期间向肽的n端添加(Peg4)并在精氨酸与肽的c末端上的半胱氨酸之间添加k(Dota)来制备所述肽。这两种双重标记肽的序列是Mal-Peg4-e9-oPLG(Cme)AG-r9-k(DOTA)-c(Cy5)(可裂解肽)和mal-Peg4-e9-Peg4-r9-k(DOTA)-c(Cy5)(不可裂解肽)。
与白蛋白反应和酶裂解测定
最初使马来酰亚胺肽与40mg/mL小鼠血清白蛋白(Sigma)或新鲜冷冻小鼠血浆反应1小时。样品在用N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲的10-20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳并在UVP凝胶成像仪上针对Cy5荧光进行成像。对于酶裂解测定，使2nmol的Cy5-单马来酰亚胺和可裂解马来酰亚胺肽与40mg/mL小鼠血清白蛋白在25mM hepes缓冲液中反应。接着储备液按1∶10用50nM重组MMP-9(EMD Biosciences)稀释至5mM并消化20分钟和4小时，接着在N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上电泳并利用Cy5进行成像。
动物
向裸小鼠的左边第2个乳腺脂肪垫中注射2X06个HT1080人纤维肉瘤细胞。注射5-7天后进行实验。多瘤病毒中T抗原小鼠(PyMT)由Lesley Ellies提供并且在9-12周龄之间对其静脉内注射肽，此时各乳腺脂肪垫中存在中等至较大尺寸的肿瘤。向裸小鼠(图4和7)和Balb/c小鼠(图8和9)的左边乳腺脂肪垫中注射一百万个小鼠乳腺腺癌4T1.2细胞(来自Robyn Anderson，University of Melbourne)并且在5-20天后注射肽并进行成像。
光学成像和组织处理
当注射肿瘤细胞5-20天后肿瘤具有足够尺寸时，静脉内注射肽并在Maestro小动物成像仪(CRI)上进行成像。以过量剂量的异氟醚处死动物并进行解剖。为检查肺转移，用OCT低温保护剂使肺膨胀并在小动物成像仪上成像。通过在指定时点利用尾静脉放血进行血液测量并收集于毛细管中。接着使用小动物成像仪对管进行成像以检查Cy5荧光肽的存在。关于用于凝胶的组织的处理，将30mg组织在1％SDS Tris缓冲液中均质化，接着在80℃下加热并离心。接着将上清液按1∶10稀释并在N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上电泳且利用荧光进行成像。
荧光组织学
来自各小鼠的肿瘤和肺在冷冻切片包埋模具(cryo mold)中在OCT介质中冷冻，并且接着在冷冻下切成10μm切片。组织接着在荧光解剖显微镜上利用Cy5荧光进行成像。接着用苏木精和曙红(H&E)对同一切片和系列切片进行染色。
111In放射性同位素实验
使3.6nmol可裂解和不可裂解马来酰亚胺选择性转运分子与1.2mCi 111In在40℃下在10mM NaOAc pH 7.0中反应1小时。反应后，加入100nmol冷InCl3，并再孵育1小时以便与未反应DOTA螯合。孵育后，使肽储备反应液离心通过5kDa超滤管柱以洗脱未反应的冷In和热In。反应混合物凝胶进行电泳并使用磷光体成像仪进行曝光，以验证全部111In均与肽反应。管柱过滤后，回收到三分之一的放射性。接着对三只小鼠静脉内注射0.3nmol具有约50μCi的肽。小鼠接着通过平面γ成像和光学成像(Optix，GE heathcare)进行成像持续长达48小时，并接着实施安乐死。采集小鼠组织，置入闪烁小瓶中，称重并计数以测定ID/g％。为进行比较，计算ID/g％的比率并与来自利用由合作者Edmund Wong制备的树枝状聚合物进行的类似实验的范围进行比较。
合成白蛋白反应性马来酰亚胺选择性转运分子
合成白蛋白反应性选择性转运分子需要一步反应和超过标准游离肽合成的纯化。相对于加有琥珀酰基帽的e8N端，肽合成为NH2-e9-cleavagesite-r9-c(Cy5)-NH2。接下来，可使杂双官能连接子与呈马来酰亚胺和NHS酯形式的N端上的游离胺反应。连接子可含有短亲水性peg链或者更具疏水性的碳链。最初的合成后，同时制备出马来酰亚胺基丙酸PFP酯、马来酰亚胺Peg8琥珀酰亚胺基酯和马来酰亚胺Peg24琥珀酰亚胺基酯。与经典的Peg琥珀酰亚胺基酯相比，PFP酯具有显著较快的反应时间和较高的产率。Peg8和Peg24难以纯化并且反应效率低下，因此我们关注丙酸连接子。示意图和肽结构在图1A和1B中示出，产生的最终序列为mal-e9-oPLG(Cme)AG-r9-c(cy5)。肽制备成具有裂解位点oPLG(Cme)AG，因为其更具亲水性并且对载体的作用比xPLGLAG.53好。
在试管中验证马来酰亚胺选择性转运分子和酶裂解
使马来酰亚胺选择性转运分子与小鼠血清白蛋白和血浆在含水条件下反应以确定肽与白蛋白在试管中反应。这些数据表明，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，在将肽与白蛋白混合的1小时内，大部分肽与MSA或血浆白蛋白反应(图1C)。血浆似乎得到在一定程度上更完全的反应。马来酰亚胺Cy5和马来酰亚胺选择性转运分子与白蛋白预反应后，将偶联物用MMP-9处理以证实r9-c(Cy5)肽与白蛋白有效裂解开，表明选择性转运分子不仅可与白蛋白反应，而且在生理条件下，其还可被MMP裂解(图1D)。
将马来酰亚胺-选择性转运分子注射至携带肿瘤的小鼠中揭示在HT1080小鼠中优于不可裂解肽和游离肽的优良对比度。
利用经过验证的体内机制，将肽注射至携带HT1080人纤维肉瘤肿瘤的小鼠中以判定是否存在与选择性转运分子的先前型式相比优良的肿瘤靶向。因为马来酰亚胺肽在结构上与游离选择性转运分子类似，因此初始实验使用10nmol的剂量。发现此肽与游离肽相比在动物中具有长得多的半衰期并且具有高得多的吸收，因此将剂量降至3nmol(数据未显示)。两只小鼠各自注射可裂解马来酰亚胺肽，并且两只小鼠注射不可裂解选择性转运分子Mal-e9-(Peg2)2-r9-c(Cy5)。两只小鼠成像长达24小时，并且带有皮肤和移除皮肤后的两只小鼠的各肽的影像在图2A中示出。与不可裂解肽相比，可裂解肽的吸收高得多。随后将肿瘤和肌肉均质化并将其上清液在凝胶上电泳以判定肽是裂解、未裂解还是与白蛋白结合未裂解(图2B)。如所预期，在注射了可裂解肽的小鼠的肿瘤中存在裂解肽和白蛋白结合肽，并且在注射了不可裂解肽的小鼠中存在未裂解游离肽和白蛋白结合肽。在肌肉中不存在可检测到的肽。白蛋白反应性游离肽在低剂量下的此吸收水平明显高于游离肽。当动物注射3nmol的Suc-e8-xPLGLAG-r9-c(Cy5)时，肿瘤吸收在注射后24小时难以检测(图2C)。当向两只PyMT转基因小鼠同时注射可裂解肽和不可裂解肽时，吸收明显并且不同，不过此实验仅在两只小鼠中进行，因为可获得PyMT小鼠的来源有限(图2D)。
从注射了可裂解和不可裂解马来酰亚胺肽的小鼠收集HT1080肿瘤并进行处理以供进行荧光组织学分析。冷却切片进行Cy5荧光成像并且对系列切片进行H&E染色以便获得微观层面吸收的差异性质的较佳感知。如之前利用HT1080肿瘤所见，肿瘤的无血管核心中存在极少吸收，相反，肽在肿瘤基质边界的周边附近吸收，其中在组织的较深处吸收有一点增强(图3A)。此吸收分布与利用游离肽所见极其类似。不可裂解肽在边缘或肿瘤实质内部较深处并不具有与利用可裂解肽所见几乎同样高的吸收(图3B)。
在转移性同源乳腺腺癌肿瘤中，在大肿瘤和小肿瘤中存在差异吸收，而分布与HT1080中类似。
接着将白蛋白反应性肽注射至4T1.2同源乳腺腺癌肿瘤模型中。此肿瘤模型因多种原因而为有利的，所述原因包括事实上4T1.2天然转移至包括肺和骨在内的远端组织，其潜在地适用于判定选择性转运分子靶向转移灶的程度如何。最初向三只小鼠注射3nmol可裂解肽并向三只小鼠注射不可裂解肽。当肿瘤大得多时对一组小鼠进行实验，以确定对比度在大肿瘤中是否得到保留和我们是否能检测肺或其它地方的转移。24小时后，处死小鼠，并且在可裂解与不可裂解肿瘤荧光之间存在明显差异(图4)。与图3中的HT1080肿瘤所做相同对肿瘤进行冷冻切片，以揭示差异在此4T1.2模型中甚至更大。在注射了可裂解肽的小鼠中，存在与HT1080不同的在整个肿瘤中的明亮荧光吸收，并且在基质入侵区域中存在甚至更亮的吸收(图5A)。不同于游离肽，如在较低放大倍率影像中所标记，在坏死肿瘤细胞中存在少得多的吸收，此不同于经典游离肽。在具有不可裂解肽的肿瘤中，存在低于可裂解肽但与可裂解肽并无不同的扩散吸收(7.5B)。
将肺从图3中所示的具有大肿瘤的小鼠剖离。通过肺叶的荧光成像可见，似乎在整个肺中具有小转移灶(图6A)。肺接着进行冷冻切片并进行荧光成像以检测Cy5肽。此成像揭示，与不可裂解肽相比，注射了可裂解肽的小鼠的转移灶中的选择性转运分子的吸收增加(图6B)。吸收在转移灶的边缘处更多并且似乎并未如同游离肽一般渗透至病灶深处。然而，当鉴别较小微型转移灶时，似乎具有较大选择性转运分子吸收，表明与致密核心相比，白蛋白肽可能更适于标记暴露的边缘和较小转移灶(图6C)。
将肺从图3中所示的具有大肿瘤的小鼠剖离。通过肺叶的荧光成像可见，似乎在整个肺中具有小转移灶(图6A)。肺接着进行冷冻切片并进行荧光成像以检测Cy5肽。此成像揭示，与不可裂解肽相比，注射了可裂解肽的小鼠的转移灶中的选择性转运分子的吸收增加(图6B)。吸收在转移灶的边缘处更多并且似乎并未如同游离肽一般渗透至病灶深处。然而，当鉴别较小微型转移灶时，似乎具有较大选择性转运分子吸收，表明与致密核心相比，白蛋白肽可能更适于标记暴露的边缘和较小转移灶(图6C)。
白蛋白反应性选择性转运分子即使不能在肿瘤中产生更好的对比度，也与其它选择性转运一样好
为确定白蛋白反应性肽是否等同于或优于先前描述的选择性转运分子设计，在最佳时间和剂量下平行测试一组小鼠。将4T1.2细胞注射至裸小鼠中，并在肿瘤尺寸为约6mm时，向动物注射Suc-e8-xPLGLAG-r9-c(Cy5)游离肽(10nmol)、G5-PAMAM(选择性转运分子)6(Cy5)3树枝状聚合物(2nmol)、53和Mal-e9-oPLG(Cme)AG-r9-c(Cy5)(3nmol)。对注射了游离肽的小鼠进行成像并在6小时后实施安乐死，树枝状聚合物在48小时实施安乐死并且马来酰亚胺在24小时实施安乐死。带有皮肤和去除皮肤的各小鼠的影像缩放至图7中所见的最大亮度，揭示各种组织中的相对对比度和背景吸收。这些数据揭示，白蛋白反应性肽和马来酰亚胺肽均特别有效地起作用，而游离肽良好，但在其它组织中具有明显吸收。
马来酰亚胺肽的进一步优化和分布特征
当审视马来酰亚胺肽的生物分布时，揭示大部分肽在将其作为用于与血浆在原位反应的游离肽注射时在注射后进入肾脏。考虑到预反应将增加血浆半衰期并且可能增加肿瘤吸收，我们最初尝试与小鼠血清白蛋白预反应。直观上与此相反，发现引起较短血浆半衰期和较低肿瘤吸收。我们假设市售小鼠血清白蛋白可能含有寡聚物，如在一些化学状态下关于所结合的其它分子进行凝胶电泳所证明，其更快地从小鼠血液清除。观察到新鲜冷冻小鼠血浆与肽的反应比小鼠血清白蛋白快后(图1C)，我们决定注射与新鲜冷冻血浆预反应的肽。向两只小鼠各自注射未反应肽或与血浆预反应的肽，并在3、24和48小时后抽取血液。意外的是，在所有时点，在注射预反应肽的小鼠体内的肽的血浆水平都比注射马来酰亚胺的小鼠体内的水平高(图8A)。当在48小时后对动物进行成像并处死时，在预反应小鼠的肿瘤中存在明显较大量的吸收(图8B)。对于此组实验，我们注射Cy5-单马来酰亚胺作为荧光非选择性转运分子白蛋白的对照。对小鼠进行荧光成像后，肿瘤具有明显较少的荧光，表明对比度不是因为EPR效应，而是因为存在选择性转运分子(图8C)。
具有足以获得稳固对比度的肿瘤靶向生物分布的Dota(111In)选择性转运分子肽变得有临床价值。
为确定利用白蛋白反应性选择性转运分子获得的对比度水平是否足以进行临床成像，合成经过DOTA标记的马来酰亚胺肽以便肽可以螯合111In。肽含有Cy5和DOTA两者以便能够进行双重模态成像。将肽用111In在含水条件下标记并将50μCi肽在未与血浆反应下以0.3nmol剂量注射至各动物中(肽与光学成像所用的肽相比少10倍)。接着小鼠用平面γ相机和光学成像仪进行成像以检测各时点直至48小时后的放射性和荧光。图9A是注射了可裂解肽和不可裂解肽48小时后的小鼠。黑色箭头指向肿瘤，所述肿瘤显示具有明显对比度，并且蓝色箭头指向肾脏，所述器官具有最大量的吸收。光学成像时，唯一可检测到的器官是肿瘤，肾脏和肝脏在完整小鼠中因荧光穿透能力的限制而不可见(图9B)。每次处理从3只小鼠切除的组织的生物分布在图9C中示出，其示出在利用可裂解肽时有多达8％ID/g的选择性转运分子递送至肿瘤。未预料到的是，不可裂解肽的吸收并不显著低于可裂解肽，但存在差异。为了解肿瘤对比度与过去测试的其它选择性转运分子构筑体相比有多好，我们计算这些选择性转运分子和PAMAM树枝状聚合物的与重要邻近组织相比肿瘤的对比度吸收配量。白蛋白反应性马来酰亚胺肽的肿瘤与血液、皮肤和肌肉比率优于全部我们已在过去通过放射性标记所测试的树枝状聚合物(图9D)。然而，可裂解与不可裂解对比度配量并不非常显著。这可能主要归因于马来酰亚胺和树枝状聚合物配置的EPR效应。
实施例3：偶联树枝状聚合物的选择性转运分子
鬼臼毒素动物实验
选择性转运分子-鬼臼毒素(选择性转运分子-podo)通过使podo-ss-吡啶与Suc-e8-xPLGLAG-r9-c反应进行偶联，通过HPLC纯化并利用质谱法进行确认。肽以TFA盐形式储存并利用质量测定产率。对于动物实验，将1X06个HT1080人纤维肉瘤细胞注射至无胸腺裸小鼠的乳腺脂肪垫中。一周后，当肿瘤为30-50mm3时，每隔一日一次总共三次向小鼠腹膜内注射10μmol/kg鬼臼毒素、仅选择性转运分子或选择性转运分子-podo。每个治疗组3只小鼠，定期称重和测量肿瘤。10日后，在选择性转运分子和选择性转运分子-podo治疗组中因明显体重降低而对小鼠实时安乐死。
阿霉素PAMAM树枝状聚合物品质控制
利用表面上偶联有阿霉素的PAMAM树枝状聚合物。简单地说，合成连接子并与G5PAMAM树枝状聚合物的表面反应。最后，使阿霉素与树枝状聚合物反应并通过Amicon离心管柱进行纯化。通过重量测定产率并使用11,500/(M*cm)作为消光系数计算阿霉素浓度。硫醚和3种不同腙树枝状聚合物连接子在图11中示出，标记为硫醚、芳香族、脲或Peg连接子。所有测试了阿霉素从树枝状聚合物的水解的树枝状聚合物在PBS pH 7.4或50mM乙酸钠pH 5中稀释18-22小时并在N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲的SDS凝胶上电泳。随后将凝胶在UVP成像仪上在488nm激发和600nm发射下进行成像。选择性转运分子阿霉素树枝状聚合物合成为每个树枝状聚合物具有6个阿霉素和6个选择性转运分子。选择性转运分子结构是Suc-e8-oPLGC(me)AG-r9-c，因其是较快裂解MMP底物并通过硫醇与树枝状聚合物反应。对于进一步纯化，树枝状聚合物在冻干后再悬浮于50％丙二醇和50％20mM Tris缓冲液中。树枝状聚合物通过0.2μm尼龙过滤器离心以去除任何聚集体。经过过滤和未过滤的样品两者都在凝胶上电泳以确认纯化，并意外发现较大量的游离阿霉素和高分子量聚集体通过此纯化移除。
合成pDox树枝状聚合物意图以一个pDox和三个Cy5包覆树枝状聚合物，从而制得在远红外中具有明亮荧光的树枝状聚合物。将如先前所述在pH 7.4和pH 5缓冲液中孵育整夜的pDox树枝状聚合物注射至HPLC/质谱上。使用含0.5％TFA的水中30-60％乙腈的梯度在逆向管柱上进行HPLC。监视阿霉素(470-490)和Cy5(645-655)吸光度峰以揭示pH 5样品中的新阿霉素峰。此峰根据质谱法证明为游离pDox。对于定量，使用不同C18逆向管柱用含0.14％TFA的10-90％CAN梯度管柱在具有荧光探测器的另一HPLC上对树枝状聚合物进行电泳。树枝状聚合物的迁移在两个管柱之间不同，我们将其归因于不同管柱和不同条件。为对从树枝状聚合物水解的pDox的量进行定量，注射200pmol样品并与12、36和60pmol仅pDox的标准曲线进行比较。然而如图14中所见，在此实验中，pDox标准物明显降解。
用阿霉素树枝状聚合物进行的动物实验
在多个实验中，向携带HT1080的裸小鼠注射单一特定剂量的阿霉素树枝状聚合物。这些实验各自的注射、剂量、阿霉素/树枝状聚合物的数量和治疗/对照％在表4中示出。定期测量小鼠体重和肿瘤体积。对于脲和Peg腙树枝状聚合物，小鼠在注射7天后进行光谱成像。使用Maestro(CRI)光谱去卷积系统和软件，将阿霉素荧光(红色)从自发荧光(绿色)中分离出来。移除肿瘤并利用光谱去卷积和亮视野进行成像。对于芳香族和硫醚树枝状聚合物，每个治疗组有4只小鼠，而脲和Peg腙树枝状聚合物因树枝状聚合物合成产率有限而仅有2只小鼠。对于选择性转运分子树枝状聚合物实验，向每个治疗组4只小鼠的各小鼠注射单一剂量的2mg/kg阿霉素。这些实验的各小鼠具有两个肿瘤，每个治疗组具有总共8个肿瘤。对于pDox-树枝状聚合物实验，向每个治疗3只小鼠注射单一剂量并且各小鼠具有2个肿瘤。在注射后11天在maestro小动物成像仪中对pDox树枝状聚合物小鼠进行成像以检测树枝状聚合物中的Cy5标记，揭示有大量荧光保留在小鼠体内。小鼠全身分布有如此多的Cy5，致使可见皮肤变为蓝色。
游离选择性转运分子-鬼臼毒素偶联物揭示因肽而使活性高于药物
尽管成功游离肽药物偶联物的概率微小，但我们决定值得研究至少一种偶联物。因此，我们合成Suc-e8-xPLGLAG-r9-c(ss-鬼臼毒素)在细胞培养物中进行测试。因为发现肽对细胞具有低于微摩尔浓度的毒性，因为我们决定值得在动物中进行尝试，因为肽合成并不非常困难。因此，如图10A中所描绘合成选择性转运分子并且最终结构在图10B中示出。为决定起始剂量，我们测试鬼臼毒素自身以确定有效使肿瘤收缩的剂量。我们发现，每隔一天44μmol/kg注射3次足以明显减缓肿瘤生长，但不能治愈。并无由鬼臼毒素所致的毒性的明显征象(数据未显示)。这些结果与文献中的结果类似，其中在多次剂量后在48-100μmol/kg鬼臼毒素时发现极低毒性。对于初始选择性转运分子实验，我们决定尝试44μmol/kg选择性转运分子-podo剂量，但发现此剂量极具毒性。确定仅选择性转运分子在这些剂量下可导致明显毒性(如第4章中所论述)。因此我们必须将剂量降至对小鼠无毒的剂量。
因为重复毒性问题，因此将剂量降至向带有HT1080肿瘤的小鼠腹膜内注射施用10μmol/kg选择性转运分子-podo。向各治疗组的三只小鼠注射3次剂量，每隔一日一剂。治疗组为仅鬼臼毒素(podo)、选择性转运分子-podo、仅选择性转运分子和H2O媒介物。发现此治疗剂量的鬼臼毒素并不有效，不过两种选择性转运分子肽引起生长适度减缓(10.1C)。基于这些结果，似乎肿瘤生长减缓并不与鬼臼毒素相关，而是与选择性转运分子的存在有关，我们知道其是以最大耐受静脉内剂量腹膜内施用。除肿瘤生长曲线外，发现注射了选择性转运分子与选择性转运分子-Podo的小鼠在实验期间体重均明显降低，表明肽导致全身性毒性(图10D)。这些数据进一步表明，由于选择性转运分子毒性，不能考虑呈游离肽形式的诸如鬼臼毒素等药物偶联物。最终，我们尝试选择性转运分子-GFLG-阿霉素肽，并且我们未能在任一安全性剂量下见到任何治疗活性(数据未显示)。
通过腙键联偶联阿霉素与PAMAM树枝状聚合物揭示抗肿瘤作用
我们感觉最有前景的用于治疗递送的选择性转运分子配置是药物直接与G5PAMAM树枝状聚合物偶联。由于r9-药物偶联物的难题和肼可能有效的提示，我们决定最初关注具有稳定硫醚连接子或各种酸不稳定性腙连接子连接于阿霉素的偶联物。此允许我们判定这些类型的偶联物在动物中是否具有治疗活性。如先前所论述的腙连接子的益处为天然药物在连接子水解后释放。所合成的四种连接子的结构在图11A中以稳定硫醚连接子和以下三种腙连接子示出。使这些连接子与G5PAMAM树枝状聚合物反应，并且作为最终步骤，使阿霉素与连接子反应。为测试纯度和酸敏感性，将树枝状聚合物偶联物在乙酸钠pH 5或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4中孵育预定时点。尽管这些实验不是同时完成，但定性差异是明显的，揭示peg对水解最敏感。脲和芳香族连接子对酸处理并不非常敏感，而脲连接子可能稍微更稳定。硫醚明显最稳定且具有最少量的游离阿霉素污染物(图11B)。不幸的是，我们不能获得任何完全不含游离阿霉素污染物的这些分子，但因为其所占百分比较小，所以我们在小鼠体内连续测试这些分子。
所有四种偶联阿霉素的树枝状聚合物在携带HT1080肿瘤的小鼠中以单次剂量注射进行测试，并且结果概述于表4中。所述表记录实验结束时，与对照组相比治疗组的质量％，表明药物具有多少抗肿瘤活性。发现具有最高酸敏感性的连接peg的树枝状聚合物产生最佳结果，其肿瘤治疗比媒介物对照为27％，相比之下其它两种腙树枝状聚合物为62％和65％，并且与硫醚连接子无差异。图12A-D示出脲和peg腙连接子的小鼠影像、肿瘤生长曲线和小鼠质量变化。意外的是，这两种peg和脲连接子dox树枝状聚合物在注射七天后都能使用光谱去卷积通过荧光成像进行检测(图12A、B)。当绘出肿瘤生长曲线时，揭示peg-腙肿瘤在注射后的过程中具有明显的肿瘤尺寸消退(图12C)。这两只小鼠在仅注射2.5(小鼠1)和6.5mg/kg(小鼠2)阿霉素后具有明显的抗肿瘤作用。这些实验中未发现毒性迹象(图12D)。此实验揭示，peg连接子优于所有其它所测试的阿霉素树枝状聚合物，具有显著量的肿瘤生长抑制。然而，在全部实验中，对照药物阿霉素和脂质体阿霉素(Doxil)在抗肿瘤活性方面连续击败树枝状聚合物。此可能归因于实际上使用了较高剂量的这些对照并且还因为其为极有效的药物。这些数据不能确定树枝状聚合物药物偶联物是否优于对照，直至利用更多小鼠使用递增剂量获得更多数据以确定毒性并因此确定治疗指数。
表4
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向偶联阿霉素的树枝状聚合物添加选择性转运分子显著降低溶解度
筛选对树枝状聚合物最有效的腙连接子后，我们合成了新一批表面偶联有选择性转运分子的树枝状聚合物。我们合成了具有6个选择性转运分子和6个阿霉素的G5PAMAM树枝状聚合物，预期这些适中数量将不会产生我们过去在含Cy5树枝状聚合物中所遇到的溶解度问题。原则上，在表面上可负载100个药物，但我们避免预期会导致如在MRI研究中利用具有30个钆分子的树枝状聚合物所见到的明显溶解度问题的这些选择我们合成了具有Peg8或Peg4-OH帽的2种不同树枝状聚合物以对PAMAM树枝状聚合物上的未反应氨基进行加帽以增强溶解度，其也不同于使用Peg4作为加帽试剂的光学和MRI树枝状聚合物。利用Peg8和Peg4-OH测出与其它研究中的Peg4相比较低的聚集(数据未显示)。最初在冻干后将树枝状聚合物悬浮于丙二醇中。所述部分具有大量游离阿霉素和聚集体，因此将其通过0.2μm过滤器过滤并且聚集体和游离阿霉素均减少，不过不完全(10.4A)。我们接着通过将各树枝状聚合物(单独Peg8dox树枝状聚合物、Peg8选择性转运分子dox树枝状聚合物和Peg4-OH选择性转运分子dox树枝状聚合物)在pH 5和pH 7.4中孵育整夜对其进行处理以检测阿霉素的水解。这些树枝状聚合物当处于低pH值下时阿霉素水解增加，但数据并不明显(10.4B)。我们想到我们在添加Tris缓冲液之前再悬浮于丙二醇中期间因发现条件极具酸性而损失了一批阿霉素。不过我们没有气馁，由于供应和溶解度有限，我们决定将1mg/kg阿霉素当量注射至小鼠体内。发现这些树枝状聚合物对肿瘤生长没有明显作用，可能是因为低剂量不如游离阿霉素般非常有效(图13C)。
更有效的2-吡咯啉基阿霉素增强选择性转运分子树枝状聚合物效力，但药物不稳定
认识到包覆有选择性转运分子的树枝状聚合物的溶解度和聚集问题是主要问题。存在可能引起聚集的多种变量，最重要的两个可能是表面上选择性转运分子的数量和偶联药物的数量。因此我们决定将每个树枝状聚合物上选择性转运分子的数量减少至约四个。此外，我们还决定取消阿霉素，而是使用效力强500倍的2-吡咯啉基阿霉素(pDox)。这些偶联物将会将获得治疗活性所需要注射的树枝状聚合物的量，其使得能用较少药物包覆树枝状聚合物或者无需所述高浓度，最终减少溶解度问题。最后，我们发现树枝状聚合物表面上带负电荷的Cy5有助于减少树枝状聚合物的聚集，因此我们向pDox树枝状聚合物添加Cy5。因此，我们制备了具有三个Cy5、一个pDox并且存在或不存在四个选择性转运分子的G5树枝状聚合物。
测试这些树枝状聚合物前，我们发现携带HT1080的小鼠中pDox的最大耐受剂量是0.1mg/kg，其是显著减缓肿瘤生长的剂量。两只小鼠各在注射0.3和1mg/kg的pDox后24小时内死亡。此剂量比这些小鼠中阿霉素的最大耐受剂量低约50-100倍。
合成pDox并如同利用先前所论述的阿霉素树枝状聚合物所进行使其与树枝状聚合物通过腙连接子进行反应。难以确认pDox与树枝状聚合物反应。标记过低以致于吸光度不可通过UV光谱法进行检测。仅在盘读取器上通过荧光光谱测得pDox明显偶联于树枝状聚合物，但不能对其进行定量。树枝状聚合物接着在pH 5缓冲液中孵育，并且我们尝试通过LC/MS检测pDox。水解后，pDox的吸光度可以用HPLC吸光度探测器检测，并且通过质谱法确认峰(图14A)。然而，我们不能确认浓度。我们接着通过使用HPLC利用荧光探测器并与荧光标准物进行比较来测定pDox的浓度(图14B)。这些数据使我们有信心在一倍差异内定量pDox，但由于降解问题，所以这些测量值可能不非常准确。使用灵敏的分析型HPLC和质谱，我们发现pDox具有严重稳定性问题，分裂成多重峰(图14C)。稳定性可能是足以使标记产率低于每个树枝状聚合物1个pDox的大问题。然而，向数只小鼠注射无选择性转运分子包覆的树枝状聚合物以确定是否存在至少一定程度的抗肿瘤活性。这些实验表明低于0.1mg/kg剂量的pDox树枝状聚合物具有明显抗肿瘤作用，但实验因pDox稳定性和低标记效率而被放弃(图15A)。注射11天后对小鼠成像时，在肿瘤中存在大量pDox Cy5树枝状聚合物，表明如果能确实合成稳定的树枝状聚合物药物组合，则此方法仍有实质性前景(图15B)。含有选择性转运分子的pDox树枝状聚合物因低标记效率并且因为几乎不可能可靠地注射与选择性转运分子pDox树枝状聚合物相同剂量的pDox树枝状聚合物而从未测试。
实施例4：偶联于脂质体的选择性转运分子
用于纳米粒子的选择性转运分子肽合成
为使选择性转运分子与Abraxane反应，通过如先前章节中所述的固相合成法合成以下肽：c-e9-oPLG(Cme)AG-r9-k。接着使粗肽的n端半胱氨酸与Cy5-单马来酰亚胺在DMF和NMM中反应。肽通过HPLC进行纯化并与马来酰亚胺丙酸PFP酯在DMF和NMM中反应。纯化后，最终肽结构为c(Cy5)-e9-oPLG(Cme)AG-r9-k(CO(CH2)2-马来酰亚胺)。对于DSPE-选择性转运分子-Cy5，通过固相化学合成e9-oPLG(Cme)AG-r9-c和e9-(Peg2)2-r9-c肽并通过HPLC进行纯化。使肽与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](DSPE-Peg(2000)-马来酰亚胺)(Avanti Polar Lipids)在DMF和NMM中反应，接着反应通过HPLC进行监测。当接近完成时，将Cy5-NHS酯添加至反应中并通过HPLC监测所述反应。合成完成后，通过HPLC纯化DSPE-选择性转运分子-Cy5。
选择性转运分子与Abraxane的反应和肽的裂解
将Cy5-选择性转运分子-马来酰亚胺肽按1％和10％摩尔百分比与白蛋白在再悬浮于生理盐水的Abraxane中混合。反应管在槽式超声波发生器中超声波处理30秒3次，或在室温下原样放置30分钟或24小时。在最后时点时，通过添加N-三(羟甲基)甲基甘氨酸样品缓冲液并加热至90℃维持10分钟使反应停止。样品接着在10-20％N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲的凝胶上电泳并在UVP凝胶成像仪上针对Cy5荧光进行成像。对于酶裂解测定，将选择性转运分子脂质体和Abraxane与50nM重组MMP-9(EMD)在20mM Tris 150mM NaCl中一起孵育特定时点，通过添加N-三(羟甲基)甲基甘氨酸样品缓冲液进行淬灭并在90℃下加热10分钟。样品接着在10-20％N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲的凝胶上电泳并在UVP凝胶成像仪上通过荧光进行成像。
通过动态光散射表征选择性转运分子纳米粒子
将所制备的脂质体和Abraxane的样品按1-100从合成浓度稀释至用2mg/mL组氨酸pH 6.5缓冲的300mM蔗糖溶液中。接着在Zetasizer(Malvern)上通过动态光散射测量样品。从10次操作的平均值获取2-3个测量值以确定作为强度和体积的函数的尺寸。接着将结果利用体积％和尺寸(nm)进行绘图以示出样品的尺寸为单分散性高斯分布或者样品聚集。
合成含选择性转运分子的脂质体
通过制备氢化大豆磷脂酰胆碱∶胆固醇∶1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-Peg(2000))(Avanti Polar lipids)的比例为11∶7∶1脂质块来合成与先前研究类似总脂质为30pmol的脂质体。对于含选择性转运分子的脂质体，在脂质块形成前混合不同摩尔比的DSPE-选择性转运分子-Cy5与DSPE-Peg(2000)。脂质块通过加热和槽式超声波处理用250mM硫酸铵和50mM蔗糖组氨酸缓冲液水合成0.33mg/mL。将多层囊泡加热至60℃并使用探头式超声波发生器超声波处理2分钟以制备小单层囊泡(SUV)。SUV接着在60℃下在热块小型挤压机(Avanti PolarLipids)上相继挤压穿过0.2μm和0.1μm膜过滤器(Whatman)20分钟。挤压后，使用sephadex G25(Sigma-Aldrich)管柱在pH 6.5下将脂质体缓冲液交换至300mM蔗糖2mg/mL蔗糖缓冲液中以清除所有脂质体外硫酸铵。脂质体接着在60℃下与15mg阿霉素一起孵育1小时并接着过滤通过Sepharose CL-4B管柱(Sigma-Aldrich)并且在4℃下储存。对于浓度测量，用1.5％曲通-X溶液使脂质体分解，在槽式超声波发生器中超声波处理并且使用11,500M-1cm-1作为消光系数通过吸光度测量总阿霉素浓度。
选择性转运分子阿霉素脂质体中的阿霉素的细胞成像
将HT1080细胞涂铺于96孔盖玻片底盘中并在无血清条件下用各种脂质体制剂处理25分钟。接着细胞历经30分钟洗涤3次并用共焦显微镜(Zeiss，LSM 5Live)使用488nm激光和550LP发射滤光片针对阿霉素荧光进行成像。处理后，细胞成像长达72小时，同时在成像之间处于正常生长培养基和恒温箱中。
用于测试选择性转运分子脂质体的动物研究
向裸小鼠的右侧和左侧乳腺脂肪垫中皮下注射1X06个细胞以产生异种移植物。一周后，在肿瘤变成50-250mm3后，对小鼠静脉内(IV)注射媒介物、阿霉素脂质体或阿霉素为约3mg/kg的包覆有选择性转运分子的阿霉素脂质体。以定期时间间隔获取小鼠肿瘤测量值和体重。对于一些实验，向小鼠注射第二剂量。当肿瘤体积达到接近最大值时，处死动物，对肿瘤进行称重和成像。所有动物方案由UCSDIACUC批准。图20中的实验因治疗组数量增加和较大n需要较大资源而由Explora Biolabs执行。
包覆有选择性转运分子的Abraxane的合成和验证
一种使用选择性转运分子来使纳米粒子靶向的方法是用肽包覆白蛋白紫杉醇悬浮液的表面。合成可与章节7中所论述的分子类似与白蛋白反应的选择性转运分子。此设计的序列是(Cy5)c-e9-oPLG(Cme)AG-r9-k-马来酰亚胺(图Figure 16A)，意图是马来酰亚胺将与白蛋白上的C34反应并接着在裂解时Cy5c-e9将从Abraxane裂解掉。合成和纯化后，将1％和10％摩尔当量的选择性转运分子与白蛋白分子同新鲜悬浮的Abraxane以适于动物注射的高浓度混合。在有或无超声波处理下在30分钟和24小时后停止平行反应。意外的是，我们发现与超声波处理无关，在生理盐水(注射缓冲液)中反应在短于30分钟内完成，如凝胶电泳所示(图16B)。确定在1％和10％反应中分别有84％与70％的选择性转运分子与白蛋白反应。与白蛋白反应和保留为游离肽的此分子通过荧光的积分强度测量。在肽与Abraxane反应后，动态光散射揭示纳米粒子未聚集，其中含有0.3％、1％、3％选择性转运分子和无选择性转运分子的反应混合物的z-平均值为约130nm(图16C)。当与选择性转运分子反应的Abraxane与MMP-9酶一起孵育时，Cy5c-e9容易地从纳米粒子裂解掉，如通过凝胶电泳所检测(图16D)。根据这些明显且简单的结果，下一系列实验将由测试这些偶联物在动物中的治疗活性所组成。
包覆有选择性转运分子的脂质体的合成和验证
为合成如图17A所描绘在表面上具有选择性转运分子的脂质体，我们首先得合成连接有选择性转运分子的磷脂。因此，合成以下肽Cy5-e9-oPLG(Cme)AG-r9-c。在此序列中，肽上的游离硫醇可与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](DSPE-Peg(2000)马来酰亚胺)反应。使Cy5与n端反应，因为随后裂解可在体内确认通过合成钆树枝状聚合物的方式不可能发生的事情。53反应后，肽纯化为DSPE-选择性转运分子-Cy5(结构图17B)且用于并入脂质体中(图17A)。最初我们尝试将DSPE-选择性转运分子-Cy5并入预先制备的医药级Doxil中，然而与仅Doxil相比未能成功缩小肿瘤。在我们尚没有确认选择性转运分子并入的方法时并且如我们后来所发现，我们将太多的选择性转运分子并入到脂质体中。
在实验室中以11∶7∶1氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)∶胆固醇∶DSPE-Peg(2000)的组成制备脂质体以尽可能接近地反应药物Doxil的配方。通过混合各种摩尔比的选择性转运分子随后水合并挤压脂质通过100nm制备具有不同浓度的DSPE-选择性转运分子-Cy5的脂质体。浓度范围为0.1-3摩尔％DSPE-Peg(2000)，其范围为每个脂质体约9-270个选择性转运分子。动态光散射确认，脂质体具有约130nm的平均尺寸(z-平均值)，代表性体积％与尺寸曲线在图17C中示出。为确保选择性转运分子存在于表面上，使脂质体在试管中与MMP-9反应以验证酶可接近选择性转运分子并且肽由所述酶裂解(图17D)。
选择性转运分子增强阿霉素的细胞吸收
在验证了并有选择性转运分子的脂质体后，我们希望知道选择性转运分子在培养物中是否增加阿霉素的细胞吸收。为确定这一点，我们将HT1080人纤维肉瘤细胞与含有不同量的选择性转运分子的脂质体一起孵育。1小时时长孵育后细胞内部阿霉素的量随脂质体表面上选择性转运分子的量增加而增加(图18A)。尽管有大量阿霉素吸收，但所有处理中的大部分药物似乎主要在内体凹陷中。然而，当使影像增亮时，阿霉素可明显在细胞核内部检测到(图18A插图)。
包覆有选择性转运分子的脂质体的抗肿瘤功效取决于包覆脂质体的选择性转运分子的数量
根据这些鼓舞人心的数据，将选择性转运分子脂质体注射至携带肿瘤的小鼠体内以确定包覆有选择性转运分子的脂质体是否具有比非靶向脂质体高的抗肿瘤作用。向携带HT1080肿瘤的小鼠每治疗组4只小鼠注射3mg/kg阿霉素当量的脂质体。各小鼠具有2个肿瘤以增加每个治疗组的肿瘤数目。当肿瘤处于50与200mm3之间时，以单次静脉内注射向小鼠注射0.3、1和3摩尔％的选择性转运分子与DSPE-Peg(2000)脂质体、非靶向阿霉素脂质体和仅媒介物(蔗糖缓冲液)。注射后连续17天定期测量小鼠体重和肿瘤体积。将肿瘤体积随时间的变化％绘图，揭示最大抗肿瘤活性出现在0.3％选择性转运分子阿霉素脂质体。1％与非靶向脂质体的抗肿瘤活性类似而3％低得多。这些数据表明，脂质体表面上较低数量的选择性转运分子增强治疗活性，此与组织培养物中吸收形成对比(图18A、B)。从第10天至第17天0.3％与非靶向脂质体之间存在统计学显著性，其中如双尾t检验所测定，p值＜0.02。小鼠在整个实验期间保持健康并且在整个实验持续期间没有因脂质体毒性导致的明显体重降低(数据未显示)。
聚集消除包覆有选择性转运分子的脂质体的作用
发现有时在脂质体通过使用Amicon管柱离心进行浓缩时存在脂质体聚集的问题。当发生聚集时，治疗作用消失。已知此问题可能为多种类型靶向纳米粒子的问题，此问题需要清楚定义和避免。因此通过动态光散射测量两批0.3％选择性转运分子脂质体的尺寸和分散度。已证实聚集的离心批料和新鲜未浓缩批料正常分散(图19A)。不使用光散射测量的情况下，可通过在室温下将脂质体挤压通过0.2μm膜过滤器以确定是否存在明显阻力来定性测定聚集。如果不存在聚集问题，那么脂质体可容易地挤压，而存在聚集体将明显增加阻力。为测试聚集是否影响肿瘤生长抑制，将两个批料注射至HT1080异种移植小鼠体内。具有两个肿瘤的小鼠各自注射分散有0.3％选择性转运分子脂质体的3mg/kg阿霉素当量(4只小鼠)，其余为聚集的0.3％选择性转运分子脂质体(3只小鼠)、非靶向脂质体(4只小鼠)和媒介物对照(3只小鼠)。此实验确认，如先前所见，分散的脂质体极有效，而在脂质体聚集时所有治疗活性均消失(图19B)。这些结果强调测量任何纳米粒子制剂和确保不存在聚集有多重要，因为作用可能完全消失。
靶向选择性转运分子脂质体具有比不可裂解选择性转运分子和非靶向脂质体高的治疗作用
利用选择性转运分子靶向的脂质体获得的有前景的结果导致再测试2个变量。第一个为进一步减少表面上选择性转运分子的数量，而第二个为确定增强的治疗活性是否与选择性转运分子裂解有关。接着再制备表面上具有0.1％和0.3％选择性转运分子的脂质体(表面上分别具有约9个和27个选择性转运分子)作为MMP可裂解肽和不可裂解肽(Cy5-e9-(Peg2)2-r9-c)。实验组增至每个治疗8只小鼠并且实验由独立承包商执行以消除任何可能的偏差。向各具有一个肿瘤的八只携带HT1080肿瘤的小鼠注射3mg/kg当量的阿霉素脂质体两次(第8天和第22天)以便进一步突出药物制剂之间的差异(图20A)。意外的是，0.1％选择性转运分子治疗最有效，此组显示与非靶向脂质体相比，平均肿瘤体积缩减超过4倍(第21天和第28天)。除可裂解选择性转运分子优于非靶向脂质体外，可裂解选择性转运分子也比不可裂解选择性转运分子有效。与类似负载量的选择性转运分子相比，两组可裂解选择性转运分子脂质体均在小鼠中产生比可裂解肽小的肿瘤体积，并且这些差异在实验期间在多个时点均明显(p值＜0.05)(图20B)。实验结束时，所有治疗组中小鼠均呈现病态并且体重降低，但并无证据表明这是由于药物治疗或者含有选择性转运分子的小鼠比未治疗和媒介物对照小鼠有任何程度的恶化(图20C)。血液学分析显示各组之间并入显著差异，除了0.1％可裂解和不可裂解小鼠的血小板计数低于仅媒介物治疗组以外(数据未显示)。
实施例5：筛选载体
构筑体合成。
简单地说，合成具有N端硫代乙酰亚胺和C端赖氨酸的肽。赖氨酸用于通过NHS酯与Cy5偶联，而半胱氨酸用于与指定大分量载体通过马来酰亚胺连接子偶联。对于偶联抗生蛋白链菌素的分子，肽合成为在C端具有生物素，其用于直接将四个选择性转运分子偶联至抗生蛋白链菌素。除基于PAMAM树枝状聚合物的构筑体外，通过尺寸排阻HPLC纯化构筑体，并且纯度通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶电泳独立地进行评估。在两种技术之间观察到一些差异，可能是因为游离肽与大分子量载体的非特异性黏着并且可能因为马来酰亚胺连接子的断裂。进行了使用电泳技术进一步纯化的努力，但其根本不起作用。通过离心通过具有10kD分子量截止值的膜对基于PAMAM树枝状聚合物的构筑体进行纯化。
成像。
由MMTV启动子驱动表达多瘤病毒中T抗原转基因(PyMT)的动物是获自Lesley Ellies。带有HT-1080异种移植物的裸动物是内部产生或从Explora Biosciences获得。不管怎样，肿瘤在其达到3-5cm的直径后即使用。动物用克他命(ketamine)/咪达唑仑(midazolam)(80mg/kg，40mg/kg)麻醉并通过尾静脉注射指定构筑体。通常动物在其从麻醉苏醒后的整个第一个小时内均进行观察。需要时，在6小时、12小时、24小时和48小时时对其再进行麻醉并成像。最后一次成像期后，利用过量剂量的三氟溴氯乙烷(halothane)处死动物。所用成像系统随时间演变。对于大部分聚乙二醇化偶联物，使用简单灯箱，不过所示影像为利用Maestro光谱去卷积成像仪首先获取的影像之一。使用620/20激发滤光片并在680nm下收集影像测试白蛋白、葡聚糖和PAMAM树枝状聚合物偶联物。使用640/48激发滤光片测试抗生蛋白链菌素偶联物，其中影像在700nm下收集。
标准化吸收值
标准化吸收值最初在没有组织特异性校正下测量，并且最后再调整以考虑组织特异性和光源改变。简单地说，如前文所述将30mg组织在SDS缓冲液(20mM Tris pH 7.6，1％SDS)中均质化。将管冷冻并使用Maestro小鼠成像仪(ex＝620/20或640/48，em＝680nm或700nm)进行成像。对于两组滤光片都分别进行校正。使用AdobePhotoshop进行影像分析。
组织学。
冷冻切片切成10μm并使用荧光解剖显微镜进行分析(cy5：ex620/60，em 640/48)。抗体染色对在冰冷丙酮中固定10分钟的组织使用经过FITC标记的F-480抗体(用1N山羊血清阻断15分钟，在含1％山羊血清的PBS中按1∶50稀释，Caltag，整夜4℃)进行。磁共振成像
动物用异氟醚麻醉(诱导3％，维持1-1.5％)并同时在磁体中使用呼吸监测系统进行监测。使用UCSD的7T磁体使用GE界面进行成像。每只动物进行若干次扫描：T1加权自旋回波与脂肪饱和(Tr＝400ms，Te＝8ms，切片厚度0.3mm，矩阵512x512，10NEX)，T2解剖(Tr＝3000ms，Te＝20ms，切片厚度0.3mm，矩阵512x512)，1NEX和T1系列(Tr＝150ms，250ms，500ms，1000ms，4000ms，Te＝12ms)。
血液半衰期随载体分子量增加
如所预期，血液半衰期随载体尺寸而不同，范围为数分钟(游离肽与5kD PEG偶联物)至10小时(与加有PEG-4帽的第5代PAMAM树枝状聚合物偶联的选择性转运分子)。葡聚糖和白蛋白偶联物在中间，血液半衰期分别为2-3小时和6-7小时。因为大分子量偶联物通常含有游离肽作为主要杂质，所以血浆半衰期测量通常在注射后约30分钟开始(图21)。
在连接于相同载体的可裂解与不可裂解选择性转运分子之间观察到至少两倍的肿瘤吸收差异。
白蛋白和葡聚糖偶联物都使用可裂解和不可裂解选择性转运分子两者合成。对于两种载体，在48小时时见到约两倍吸收差异(表3)，表明连接于载体的选择性转运分子确实裂解。此外，凝胶电泳表明在48小时时保留于肿瘤中的主要荧光物质是裂解产物。
表3
Figure BPA00001525247001011
Figure BPA00001525247001021
Figure BPA00001525247001031
进行组织学检查时，连接有载体的可裂解选择性转运分子似乎主要由产生MMP-2的肿瘤基质吸收。
类似于游离肽，基于弹片的肽偶联物的吸收在带有由MMTV启动子驱动的多瘤病毒中T抗原的转基因小鼠中定位于基质。抗体染色显示，此基质吸收与MMP-2的存在共定位。在一些动物中，特别是iNOS-/-基因型，鳞状细胞化生中表达MMP-9的区域被突显，特别是在利用偶联白蛋白的探针时。通过原位酶谱法确认这些区域含有活性MMP。
可裂解选择性转运分子在前哨淋巴结中由巨噬细胞裂解。
早先利用通过聚谷氨酸连接于大分子量载体的选择性转运分子观察到，在免疫活性小鼠中在48小时后在淋巴结中存在吸收。迄今为止，其已利用第5代PAMAM树枝状聚合物以及70kD葡聚糖、抗生蛋白链菌素和白蛋白观察到。PyMT小鼠中的肿瘤吸收在注射全d-氨基酸对照肽的动物中减少(图22)。其也以低得多的程度在非肿瘤携带动物中发生，表明其是肿瘤依赖性过程。肽的裂解可能在淋巴结自身中发生，因为皮下共注射r9-FITC和e9-XPLGLAG-r9-cy5并未导致在淋巴结中共染色。因预先注射弗式完全佐剂(Freund′s completeadjuvant)而患上全身性活动性炎症的动物以与具有肿瘤的动物类似的方式吸收肽，表明吸收必定与淋巴结中活化选择性转运分子的活化型巨噬细胞有关。最后，有淋巴结入侵的动物中前哨淋巴结中的总体吸收高于无入侵的动物，但吸收共定位于表达F-480的巨噬细胞，因此有可能这仅仅是因为巨噬细胞在入侵肿瘤存在下的活化(图23)。
PEG(5kD和12kD)
将与5kD PEG和12kD PEG偶联的肽以每只动物6nmol的剂量注射至带有HT-1080异种移植物的裸小鼠中(图24)。一般来说，5kDPEG偶联物的特性与游离肽类似，其中血液半衰期为约5分钟，而12kD PEG偶联物具有约20分钟的较长半衰期。作为对照，还注射PLGLAG可裂解序列的混杂型式(称为LALGPG)和PLGLAG序列的d-氨基酸型式(称为plglag)。两种阴性对照在HT-1080异种移植物中得到类似标准化吸收值，但我们决定在未来的实验中使用d-氨基酸型式。因为在当时可获得，所以多瘤病毒转基因小鼠在野生型和iNOS-/-背景下进行测试。下文示出PyMT小鼠池两种类型动物的吸收值，因为所获得的值并无明显不同。这些数据最初使用仅来自肝脏和肾脏组织的校正进行处理，因为当时我们并未认识到需要进行组织特异性校正。表3中所示的聚乙二醇化肽的数据已进行事后组织特异性校正，肿瘤值降低两倍而脾脏值升高两倍，使这些数据或多或少可与使用Maestro收集的其它数据进行比较。肝脏和肾脏两者均显示吸收相对于游离肽降低；此有可能归因于所注射的肽的约50％经历了1小时的尿液排泄。
利用聚乙二醇化肽进行最初实验后，测试了若干次变形。通过噬菌体展现鉴别的MMP-2的ESPAYYTA裂解序列未使肿瘤吸收提高，但导致肝脏吸收增加。PLGWAG序列也使肿瘤吸收降低和肝脏吸收增加，uPA的XSGRSAX序列也是如此。给予所述分子，总体负电荷引起从所有器官(包括肿瘤)较快速洗脱。预先注射金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂(如塞奥芬(thiorphan)和放线酰胺素(actinonin))使肾脏吸收减少多达50％，表明在这些器官中吸收具裂解依赖性。这些其它器官中明胶裂解实体的存在得到酶谱凝胶的确认。如所预期，肿瘤吸收也在注射抑制剂后减少。
白蛋白
接着使MMP可裂解选择性转运分子和其全d-氨基酸对照肽与白蛋白偶联(图25)，白蛋白是在正常生理条件下从肾小球过滤物中排除的蛋白质。尽管肽由HPLC显示似乎为纯的，但凝胶电泳指示，可能有多达50％的cy5连接于杂质。然而，仅在多瘤小鼠中在nNOS-/-背景下测试这些肽。遗传背景是根据当时就可获得的背景进行选择的，当稍后将nNOS-/-和野生型小鼠的肿瘤在酶谱凝胶上进行比较时，肿瘤MMP活化并无显著不同。注射4至6nmol肽48小时后处死动物，不过最大肿瘤与皮肤对比度出现在约36小时。类似于聚乙二醇化肽，白蛋白肽的校正最初仅使用肝脏和肾脏标准来进行，并且不得不进行事后调整以供与其它肽进行比较。白蛋白为所测试的较佳载体之一；然而当时的化学合成程序需要加热步骤以将钆插入DOTA螯合剂中。因为白蛋白是蛋白质，所以此加热步骤将使其变性，限制其用于设计T1 MRI剂的潜能。
葡聚糖
接着使MMP可裂解和全d-氨基酸对照肽与70kD葡聚糖偶联并在PyMT小鼠中在野生型背景下进行测试。尽管在合成葡聚糖时进行了若干次尝试，但纯化是通过滞留时间截止值在HPLC上进行。当通过电泳分析样品时，不清楚合成是否可靠。通常在凝胶顶部存在污迹(紫色箭头)、在凝胶底部存在与游离肽类似地迁移的物质(绿色箭头)并且存在约为游离肽两倍大的物质(粉红色箭头)。各合成似乎含有相同的三种组分，尽管比率不同。最佳小鼠影像来自高分子量物质占主导的批次，如图26中所示。主要含蓝绿色物质的后续铟标记型式在体外未被MMP-9充分裂解，并且较低分子量物质可能为未连接游离肽。利用第一批的PLGLAG和plglag获得表3中所示的吸收值。
抗生蛋白链菌素。
所测试的第三种载体是抗生蛋白链菌素。在此方案中，生物素化肽可容易地连接至抗生蛋白链菌素，由此大大促进构筑体合成。然而SUV是令人失望的，并且注射液中的沉淀极其成问题，此可能归因于生物素化肽选择性转运分子的沉淀。
第5代PAMAM树枝状聚合物。
作为大分子量系列中的最后一种分子，1725是偶联于两个MMP可裂解选择性转运分子的第5代PAMAM树枝状聚合物。其余126个连接位点用琥珀酰基加帽。比其大部分前身纯(根据凝胶电泳为60％，主要杂质同游离肽一样迁移)，似乎具有双相血液半衰期，第一相为约10分钟以下，而第二相为约10-15小时。肽似乎在肿瘤累积长达72个小时(图27)，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶电泳表明此时存在于肿瘤中的大部分肽裂解。由于相对容易合成和有前景的体内特征，合成第5代PAMAM-(e9-XPLGLAX-r9-k(cy5))2(succ)126。照例，HPLC分析表明分子是纯的，不过凝胶电泳揭示在注射液中存在游离肽。使用各种电泳技术和盐浓度进一步纯化样品的努力未获得成功。将此分子以不同浓度注射至带有HT-1080肿瘤的裸转基因PyMT小鼠体内。尽管SUV在较低浓度下提高，但我们检测到分子的能力下降。最佳使用浓度似乎为3nmol注射液或1.5nmol注射液，并且动物在24小时后处死。凝胶电泳表明，存在于肿瘤和器官中的大部分肽裂解，无可鉴别的起始材料存在于任何器官中。
测试琥珀酰化PAMAM树枝状聚合物上的较快裂解序列
为测试使用较快裂解序列的作用，合成两种具有琥珀酸帽的树枝状聚合物。首先使用标准MMP序列PLGLAX，并且第二种含有类似序列，其中P1位点中的L置换为噻吩基丙氨酸(ThA)残基。此变化导致肝脏吸收增加两倍，并且肿瘤吸收减少2.5倍。
测试聚乙二醇化PAMAM树枝状聚合物和其变体。
在另一实验中，将PLGLAX与PLGLAG和具有PEG-4帽的PLG-C(me)-AG进行比较。这些分子根据凝胶电泳为约90％纯。使用PLGLAG似乎引起肿瘤吸收相对于PLGLAX降低，而肝脏吸收类似。用甲基半胱氨酸(MeC)置换亮氨酸引起肝脏吸收降低两倍，而肿瘤吸收与PLGLAX的吸收类似。肿瘤吸收在PLGLAX与PLG-C(me)-AG之间保持相同，但肝脏吸收降低两倍。因此采用PLG-C(me)-AG为优良底物供在大分子量载体上使用(图28)。
使用T1-MRI测试偶联葡聚糖的选择性转运分子。
最后，为测试当以大剂量注射时连接载体的选择性转运分子是否可递送使用MRI可见的足量货物，合成偶联葡聚糖的经过钆标记的选择性转运分子的若干种型式。选择葡聚糖是因为其是具有最高吸收的载体，能够耐受将钆插入DOTA螯合基团中所必需的加热步骤。接着将这些分子注射至动物体内并使用7T MRI扫描仪进行成像。通过获取若干弛豫时间的影像同时保持回波时间恒定来计算若干组织的T1值。通过使用Amira软件根据肿瘤体积取强度的平均值确定肿瘤和肌肉的平均信号。使用此策略，我们发现7T下水假影的T1值为2.6±0.4s(n＝21)，相较而言文献值为约3s。此差异可能归因于在水中存在离子，此可能是因为此水未进行双重蒸馏并且主要用于测定磁体随时间的稳定性。因为扫描仪在一定程度上随时间变化而不一致，常在实验中途崩溃，因为我们每天都针对水假影的T1值对肿瘤的T1值进行归一化。类似地根据脂肪饱和影像计算强度值。
测试四个批次葡聚糖偶联物的MR成像，得到四个不同结果。第一批(1746)几乎不被肿瘤吸收，但似乎被前哨淋巴结吸收。在数量上，48小时后在肿瘤中通常存在少于1nmol/g的探针，但由于淋巴结中明显存在探针(图29)，因此再合成具有4个选择性转运分子连接于各葡聚糖的探针。将此肽(1810)注射至小鼠体内并且得到3nmol/g的最大肿瘤吸收。由于扫描仪的技术难题而未获得这些分子任一者的T 1。不同于前述肽，此肽还用铟-111进行放射性标记。第三种基于葡聚糖的光学构筑体1921在注射显影剂之前和之后均利用T1进行检查。根据此分析，肿瘤中钆的存在应与T1加权影像上肿瘤强度的增加和肿瘤T1的降低相关。不幸的是，肿瘤中的钆吸收少于1nmol/g，并且与肿瘤T1的极少(若有的话)改变相关。最后，制备第四种葡聚糖偶联物，称为2024。未收集成像数据，肿瘤吸收再次为约1nmol/g，不过淋巴结吸收高于10nmol/g的检测极限。尽管在此点上此结果在一定程度上验证了我们的原始观测结果，但基于葡聚糖的弹头肽因低肿瘤吸收和高批次间不一致性而放弃不作为MR成像的候选物。
实施例6：载体的加帽
此实施例研究加帽基团对树枝状聚合物的药物动力学的影响。此处，我们在小鼠中测试了使用若干种不同加帽基团进行加帽对血浆半衰期、肿瘤吸收和肿瘤渗透的影响。
动物。
在这些实验中使用两种类型的动物。在注射时带有尺寸为约5-7mm的HT-1080异种移植物的无胸腺裸小鼠和(b)PyMT小鼠。
测定血浆半衰期
为获得近似血浆半衰期，在30分钟和1、2和6小时时点在肝素化毛细管中收集约10μL血液。在Maestro上对血液进行成像，并使用Image J计算强度。强度通过取自然对数进行线性化；血浆半衰期＝0.693/m，其中m为直线的斜率。
结果和讨论
我们首先测试了具有“纯”帽(包括乙酰基、琥珀酰基、3-羟基丙酰基、2-磺酸基苯甲酰基、缩水甘油基、PEG-2、PEG-4、PEG-8和PEG-12)的分子。所述分子使用HPLC进行纯化并且通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶电泳验证纯度(图30)。注射至动物体内后，探针遵照若干模式之一。一些(包括3-羟基丙酰基、2-磺酸基苯甲酰基和缩水甘油基)在注射后的前5分钟期间从血流快速清除(图31)。对于这些分子，吸收主要是肝脏吸收，并且其在48小时内以不同程度清除。在较低程度上，其还由肾脏、唾液腺和在有限程度上由肿瘤吸收。
对于加有琥珀酰基和乙酰基帽的化合物观察到第二种模式。这些分子足够小使得其仍由肾脏排泄。在生理pH值下，加有琥珀酰基帽的树枝状聚合物带大量负电荷，在动物体内的血浆半衰期是3.2±0.9小时。注射48小时后，主要在关节、肝脏和肾脏中积累。相反，加有乙酰基帽的树枝状聚合物是电中性并且具有更有利的药物动力学性质，平均血浆半衰期是5.6±2.5小时。48小时时，加有乙酰基帽的树枝状聚合物并未显示任何明显的组织特异性积累。加有琥珀酰基和乙酰基帽的树枝状聚合物部分是由肝胆排泄而部分是由肾脏排泄。这些树枝状聚合物各自在注射后立即、注射后24小时和注射后48小时的影像在图32中示出。
第三种吸收模式发生于包覆有不同长度聚乙二醇部分的树枝状聚合物。PEG-2和PEG-4树枝状聚合物排泄的血浆半衰期分别是8.4±1.3小时和13.9±2.9小时，但在早期时点观察到一些膀胱荧光，因此可能具有有限的肾脏排泄。包覆有PEG-8和PEG-12的树枝状聚合物分别具有13.9±2.9小时、11.6±1.6小时和18.1±3.7小时的血液半衰期。所有这些树枝状聚合物与加有琥珀酰基和乙酰基帽的分子相比都具有更本质的肿瘤靶向，在肿瘤中的标准化吸收值对于肝脏来说是肿瘤中的约两倍(表5)。这在影像中显而易见，其中肿瘤积累随时间缓慢增加(图33)。
表5
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大分子载体的第二个问题是缺乏渗透进肿瘤的能力。此证明并非是加帽PAMAM树枝状聚合物的问题，其中对于所有在HT-1080异种移植物中测试的树枝状聚合物在进行总体组织学分析时观察到弥散性肿瘤渗透。其它器官显示在利用不同帽时吸收具有极具特征性的模式。例如，包覆有乙酰基的树枝状聚合物由肾脏吸收，包覆有琥珀酸的树枝状聚合物由肝脏、肾脏和脾吸收，而包覆有PEG的树枝状聚合物显示弥散性吸收至所有器官(包括肿瘤)中(图34)。
实施例7：连接选择性转运分子与树枝状聚合物纳米粒子
在此实施例中，我们通过将若干选择性转运分子连接至树枝状聚合物设计了可在体内感知和靶向蛋白酶活性的靶向双重标记探针，并且测试了其使用全动物光学、MRI和组织学技术突显小鼠体内的浸润肿瘤的能力。
合成
简单地说，合成具有C端半胱氨酸并且通过马来酰亚胺键联连接至PAMAM树枝状聚合物的肽。肽连接后，将约三个cy5分子或15-20个DOTA通过酰胺键连接至树枝状聚合物。最后，剩余氨基用PEG-4加帽。对于不具有cy5的构筑体，钆的螯合在甘氨酸缓冲液(pH 6)中在80℃下进行3小时。对于具有双重标记的构筑体，需要钆的冷螯合(乙酸铵缓冲液，pH 6整夜)。在所有三种情况下，通过离心通过具有10kD分子量截止值的膜进行纯化。对于经过cy5标记的构筑体，利用化合物的总重量评估树枝状聚合物的浓度。每个树枝状聚合物上Cy5的数量通过比较树枝状聚合物的浓度与Cy5的吸光度进行评估。对于经过钆标记的构筑体，通过重量评估树枝状聚合物的浓度并且通过感应耦合等离子质谱法评估钆浓度，两者都在合成后立即和在注射时进行。可能时，纯度独立地通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶电泳进行评估并且发现接近100％。
动物。
使用带有HT-1080肿瘤(3-8mm)的裸小鼠和转基因PyMT小鼠。
光学成像。
动物用80mg/kg克他命和40mg/kg咪达唑仑麻醉。静脉内注射1至3nmol的各探针。在1s和3s时使用Maestro光学去卷积成像仪(700nm)使用640/48激发滤光片(CRI，Boston，MA)对动物进行成像历时最初注射后的一小时。成像后，动物返回至其笼中并使用三角形垫进行取暖。在6h、24h和48h时，将动物再麻醉并进行成像。48小时后，处死动物，采集器官并将组织冷冻。
光学标准化吸收值。
将冷冻组织解冻并在荧光导引不存在下切下代表性30mg样品。对于一些已知为异质的肿瘤，如PyMT肿瘤，分别处理两个至三个所述30mg样品并取平均值。接着将各30mg组织切片添加至100μLSDS溶解缓冲液(1％SDS，20mM Tris缓冲液，pH 7.6)中，使用一次性研杵研磨并加热至80℃保持10分钟。为确保细胞溶解，接着将样品微波处理两次4秒。为确保样品等同处理，将管离心10分钟，冷冻并在冷冻时使用Maestro光谱去卷积成像仪进行成像。使用ImageJ计算积分强度。由于每个树枝状聚合物上cy5标记数目的变化，因此对于各偶联物分别进行两点校正。通过从来自未注射动物的肿瘤、肝脏、肾脏和肌肉切下30mg样品，向其中添加100nM最终浓度的注射肽并如前所述对其进行处理来制备标准物。基于由一种偶联物得到的浓度曲线，假设信号与浓度的直线性。标准化吸收值(SUV)定义为(nmol cy5/30mg组织)/(总注射nmol数/总动物体重)。
荧光组织学。
切下20μm的HT1080和PyMT肿瘤切片和25mm的PyMT转移灶切片，接着使用Zeiss Lumar解剖显微镜进行检查(曝光时间5-15s，ex 620/60，em 700/75)。对于原位酶谱分析，从EMD获得DQ明胶并按制造商的说明进行处理。使用标准苏木精和曙红程序对系列切片进行染色。
MR成像
如关于光学成像所述对动物进行麻醉和注射。48小时时，将动物带至UCSD的7T磁体，使用异氟醚麻醉(3％加载剂量，1％维持剂量)并使用T1加权RARE(Tr＝2595ms，Te＝7.5ms，NEX＝10，切片厚度0.3mm，撷取矩阵256x256)、T1加权MSME(Tr＝498ms，Te＝8ms，10NEX，切片厚度0.3mm，撷取矩阵128x256)和Tru-FISP(单切片，切片厚度0.5mm，Tr＝3，Te＝1.5ms，4NEX，撷取矩阵128x128)进行成像以获得T1。使用Paravision(Brucker)或Amira 4.1.1(Mercury)处理MR成像数据。
钆标准化吸收值。
48小时成像期后，处死动物并移除组织，并进行冷冻。接着将其解冻，称重，溶解于硝酸中并送至西海岸分析中心(West CoastAnalytical Services)(Santa Fe Springs，California)以供使用ICP-MS进行定量钆分析。类似地处理2微升注射液，并且也送出进行定量分析。标准化吸收值(SUV)定义为(nmol钆/组织重量)/(总注射nmol数/总动物体重)。
偶联于树枝状聚合物纳米粒子的选择性转运分子在裸动物中具有比游离选择性转运分子有利的生物分布。
为确定与载体连接的选择性转运分子是否保留在肿瘤中选择性裂解的能力，合成两个构筑体并使用HPLC和荧光凝胶电泳测试纯度。第一种为树枝状聚合物通过位于肽C末端的马来酰亚胺连接子连接至可裂解肽。第二种为具有全d-氨基酸肽的类似化合物以用作对照(图35a)。当将偶联于树枝状聚合物纳米粒子的新选择性转运分子注射至异种移植裸动物体内时，皮肤荧光大为减弱，关节吸收大部分消失并且肿瘤比胸部比率显著增加，有时达到高达6倍(图35b-d)。此外，荧光保持存在长达48个小时，而到那时，大部分游离选择性转运分子已洗脱(图35d)。新分子的血浆半衰期增至约9小时，相比之下基于游离肽的探针短于10分钟。定量分析和与d-氨基酸对照肽的比较指示，约一半所存在的信号仅仅是因为增强的渗透性和滞留(肿瘤SUV为1.8±0.6，n＝8(可裂解肽)相对于0.9+0.3，n＝5(不可裂解肽))。相比之下，在两种情况下，六小时后可裂解游离肽(suc-e8-OPLG-C(me)-AG-r9-c(cy5))在第六小时的肿瘤SUV已降至0.2±0.0(n＝3)，p＜0.05(图35f)。
与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子在自发性乳癌模型中由残余肿瘤的小区域吸收。
我们接着在PyMT乳癌模型中测试与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子。虽然带有HT-1080异种移植物的裸动物具有充分囊封的肿瘤，但更具侵袭性的PyMT模型使我们有机会确定我们的探针是否能检测肿瘤压实后入侵肌肉的残余肿瘤的更微小的区域(图36a-c)。图36d示出对与胸肌直接相邻的残余肿瘤的单个200μm小块的组织学分析。如同先前的实验，大部分吸收发生在肿瘤与肌肉之间的基质界面。最后，我们能够使用标准化吸收值表明，约33％的吸收是归因于裂解，而另66％是归因于增强的渗透性和滞留(1.5±0.3，n＝6(可裂解探针)相对于1.0±0.3，n＝5(不可裂解探针)，p＜0.05)(图36e)。MMP-2与MMP-9均纯合子缺失的单个MMTV-PyMT动物得到0.9的肿瘤标准化吸收值，表明MMP-2和MMP-9可能负责裂解(数据未显示)。
与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子代表对当前可获得的光学去淬灭技术的改良。
为测试我们的新光学探针是否代表对当前使用的技术的改良，我们在相同PyMT动物模型中比较我们的与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子的吸收与常用去淬灭探针(Prosense，VisEnMedical)的吸收和去淬灭。我们的探针不仅在肝脏荧光较少的情况下得到较强的总体信号(图37a-c)，而且我们还能够显示PyMT小鼠中的肿瘤与肌肉比率得到非常显著的提高(图37d)。此外，当对肺中的转移进行成像时，我们的探针能够容易地检测小(＜200μm)转移灶，约一半的信号是来自微转移灶周围的明亮巨噬细胞而另一半信号是来自微转移灶本身(图37e-g)。相比之下，Prosense主要使转移灶中部染色，留下边缘大部分未染色并且较小转移灶根本未染色(图37h-j)。肺部的定量在图37H和L中示出。因为Prosense靶向组织蛋白酶，所以我们还审视靶向细胞外MMP的类似探针。尽管我们能够再现文献中关于MMP-sense报导的结果，但我们发现曝光时间是Prosense或与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子的五倍长，并且在PyMT模型中产生的对比度比Prosense差(数据未显示)。
与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子可将足以进行T1 MRI的量的钆递送至肿瘤。
与树枝状聚合物纳米粒子偶联的选择性转运分子的一个理论优势是能够将其与不同有效载荷分子连接。为解决关于溶解度的潜在问题，我们在每个树枝状聚合物上仅连接15-30个钆分子并且添加更可溶的聚乙二醇部分。为解决PyMT小鼠中肿瘤高度可变的问题，我们换回HT-1080异种移植物。添加一系列假影以顾及扫描间变化；为进行定量，所有强度根据相邻水假影进行归一化。在组织中存在钆的情况下，我们预期可见到相对于未注射对照，与来自注射钆的小鼠的肿瘤中的强度增加相关的T1降低。实际上，在第48小时，肿瘤的T1下降22％，而强度升高15％(图38a-d)。此与在肿瘤中存在30-40μM钆一致，如独立地使用感应耦合等离子质谱法所测量。相比之下，注射全d-氨基酸阴性对照的动物中钆的浓度显著较低(图38e，p＜0.05)。尽管这些变化不是太大，但信号强度的统计上显著的增加与T1降低和钆存在的相关性确认差异是实实在在的，并且探针是如先前所假设靶向肿瘤。
双重标记探针证实吸收集中于肿瘤/基质界面处炎症的产生MMP的区域中。
来注射可裂解探针的动物的MRI影像的一个偶然但明显的特征是在肿瘤周围存在明亮边缘，有时穿至相邻实质中。为确定这些明亮边缘是否重要，合成兼具钆和cy5的双重标记探针并注射至带有HT-1080肿瘤的动物体内。动物同时利用MRI和荧光进行成像(图39a和b)，处死并移除一小片明亮区域并进行冷冻以供组织学分析。组织学分析时，明显存在两种类型的吸收。如所预期，弥散性吸收发生在整个肿瘤实质中。然而，大部分此吸收因在肿瘤侵入肌肉的区域中存在极为明亮的点而被掩盖，使得组织学与在MR上所见到的情形相关联(图39c)。使用原位酶谱分析和苏木精曙红染色来研究这些亮点的产生原因，并且如所预期，其与存在产生MMP的巨噬细胞相关联(图39d-f)。在囊封较好并且浸润较少的肿瘤中，使用荧光成像和T1加权MRI，这些亮点均不存在。
实施例8：观测肿瘤边缘
在此实施例中，我们研究肿瘤边缘是否可在手术期间利用选择性转运分子更客观地观测。我们比较在有与没有选择性转运分子指引下手术时手术床上的残余肿瘤细胞和无肿瘤存活率。
动物
使用具有HT1080人纤维肉瘤细胞(ATCC)或MDA-MB 435人黑素瘤细胞的异种移植物。同种异体移植物在实验室中用8119鼠类乳腺腺癌细胞和B16F10鼠类黑素瘤细胞产生。将1x106个细胞(8119或B16F10)肌肉内注射至albino C57BL/6小鼠的左侧肋中。监测肿瘤同种异体移植物，直至肿瘤尺寸的最大直径为约1cm(约7-10天)。
荧光光学成像
利用荧光解剖显微镜(Lumar，Zeiss(GFP：曝光时间0.5-1s，ex470/40nm；em525/50nm；Cy5：曝光时间0.5-1s，ex620/60nm；em700/75nm))或用OV100小动物成像系统(Olympus(GFP：曝光时间0.5-1s，ex475/40；em 530/50；Cy5：曝光时间1.5-3s，ex620/60nm；em700/75nm))进行荧光光学成像。
荧光吸收
简单地说，将30mg组织均质化并在SDS缓冲液中加热，冷冻并接着利用荧光进行成像。通过将实验荧光与利用添加肽的类似处理组织得到的标准曲线进行比较，测定SUV((摩尔数/组织克数)/(注射摩尔数/动物体重))值。
存活手术
对如上所述产生的具有8110细胞或B16F10细胞的同种异体移植物进行存活手术。动物用80mg/kg克他命和40mg/kg咪达唑仑麻醉。利用脱毛膏移除毛发后，将动物以无菌方式准备并遮盖。切开肿瘤上方的皮肤后，以钝物揭开皮瓣并且皮瓣缩回。利用显微外科仪器在解剖显微镜(Lumar，Zeiss)下在白光照明下进行肿瘤切除。止血利用手持烙铁(Accu-Temp，Medtronic)达成。如在光照下所评估肿瘤移除完成后，将动物随机化至Cy5荧光指引组或无分子指引的标准手术组中。开始肿瘤切除前48小时，向选择性转运分子指引组中的动物体内注射经过Cy5标记的树枝状聚合物选择性转运分子(2nmol)。为试图说明最初手术期间的偏差，主刀外科医生对动物在最初肿瘤移除后接受的治疗不完全知情。在此情况下不完全知情意谓主刀外科医生有意识努力不根据其随后所处理的哪个治疗组认出动物。然而，偶尔利用选择性转运分子通过尾静脉注射治疗动物的人与执行肿瘤切除的人相同，因此通过个别动物的视觉特征认出动物有时不可避免。
如根据白光照明所评估完成肿瘤切除后，接着通过解剖镜根据Cy5的激发和发射参数对手术范围进行评估。荧光信号的影像呈现于相邻监视器上并且所有Cy5阳性组织灶被切除。在有或无荧光指引下完成肿瘤移除后，用不连续简单缝合(6-0 Silk，Ethicon)修复皮肤切口并使动物返回至其笼中以自麻醉苏醒。
每周3次检查动物的肿瘤复发。在手术后六个月，与存在或不存在肿瘤复发无关，处死所有动物。定量残余肿瘤细胞
对如上所述产生的HT1080细胞的异种移植物进行手术后使用动物进行残余肿瘤细胞的定量。动物用80mg/kg克他命和40mg/kg咪达唑仑麻醉。皮肤切开和缩回后，利用显微外科技术使用解剖显微镜(Zeiss，Lumar)移除肿瘤。
如上文关于存活研究所述利用GFP、游离选择性转运分子(10nmol；手术前6小时)或树枝状聚合物选择性转运分子(2nmol；手术前48小时)执行肿瘤切除的荧光指引。对于GFP指引组中的动物，通过解剖镜根据GFP的激发和发射参数评估手术范围。荧光信号的影像呈现于相邻监视器上并且所有GFP阳性组织灶被切除。如上述存活手术进行选择性转运分子组中的动物的治疗。肿瘤切除完成后，在所有邻接维度上加深至少5mm切除剩余手术床并分析Alu序列。针对残余肿瘤细胞对剩余手术床执行Alu PCR分析。因为PCR测定测量达到可检测性必需的循环数，其与源DNA量的对数成比例，因此残余肿瘤DNA以对数单位表示。
利用双重标记ACPP进行的荧光和MR成像
如上文所述产生HT1080异种移植物。对小鼠进行术前MR成像。接着麻醉小鼠并如上所述在荧光指引下移除肿瘤。完成肿瘤移除后，将小鼠带至MR成像套房并获得术后MR扫描。使用Amira软件(Mercury，Carlsbad，CA)在三个维度上手动定量肿瘤体积。由相应人员以不知情方式使用术前和术后影像进行肿瘤体积定量。
用经过Cy5标记的ACPP进行肿瘤成像
为测试选择性转运分子在肿瘤与正常组织之间的吸收是否不同，在静脉内注射经过Cy5标记的选择性转运分子并历时足以消除未裂解选择性转运分子的时间之后对转基因小鼠(品系8119，MMTV-PyMT)中来源于自发性乳腺腺癌肿瘤的异种移植物、移植至免疫活性小鼠体内的鼠类黑素瘤细胞系B16F10和异种移植至裸小鼠体内的人癌细胞系(MDA-MB 435黑素瘤和HT1080纤维肉瘤)进行成像。选择Cy5作为标记用标志，因为其在近红外范围内的组织吸收较少。我们测试了分离的选择性转运分子肽(游离选择性转运分子)和与PAMAM树枝状聚合物偶联的选择性转运分子肽(树枝状聚合物选择性转运分子)。我们发现，所有肿瘤都以比正常组织或用未裂解肽处理的组织高的程度保留经过Cy5标记的游离选择性转运分子和树枝状聚合物选择性转运分子。此外，我们发现所有肿瘤类型的肿瘤与正常组织比率在利用树枝状聚合物选择性转运分子时都比利用游离选择性转运分子时高(表2)。
表2
Figure BPA00001525247001191
Figure BPA00001525247001201
选择性转运分子勾画出肿瘤的切除边缘
为评估选择性转运分子勾画正常与肿瘤组织之间的边缘的能力，我们在手术切除肿瘤之前，先向经过以GFP转染的细胞系MDA-MB435异种移植的裸小鼠体内注射经过Cy5标记的游离选择性转运分子。我们发现，如果肿瘤被良好囊封，那么没有选择性转运分子指引的标准手术技术产生完全肿瘤移除(如通过GFP荧光和组织学分析所证实)，而选择性转运分子指引未提高手术切除功效(数据未显示)。然而，如果肿瘤浸润至周围组织中，那么选择性转运分子指引使得能够观测在白光下不明显的肿瘤区域(因嵌埋在其它组织下方或在肿瘤外观不容易与周围正常组织区分的情况下)。
比较用于荧光成像指引的游离选择性转运分子与树枝状聚合物选择性转运分子
为评估游离选择性转运分子与树枝状聚合物选择性转运分子在肿瘤切除手术期间用于荧光成像指引的效用，我们将任一型式的以Cy5荧光标记的肽注射至经过以GFP转染的MDA-MB 435异种移植的小鼠体内。我们比较了游离选择性转运分子与树枝状聚合物选择性转运分子在体内手术期间的肿瘤比背景可见荧光对比度和易使用性(各条件下n＝16)。我们发现与游离选择性转运分子相比，树枝状聚合物选择性转运分子具有较高的肿瘤比背景荧光对比度，并且当根据所注射荧光团的量进行归一化时，树枝状聚合物选择性转运分子的绝对肿瘤荧光较高。已显示，用树枝状聚合物选择性转运分子进行处理得到较高的肿瘤荧光吸收(表2)，同时皮肤和软骨的非特异性吸收较少。我们注意到游离选择性转运分子与树枝状聚合物选择性转运分子两者在淋巴结以及脂肪组织中具有有限的不依赖于癌细胞存在的荧光吸收。此可能是因为由巨噬细胞造成的非特异性吸收，巨噬细胞在这些组织中都大量存在。
利用Alu PCR进行残余肿瘤细胞定量
为定量在利用选择性转运分子指引下进行肿瘤切除的功效，我们使用Alu PCR来测量手术切除后在肿瘤床中剩余的残余人(癌)细胞。已显示人Alu序列的定量能够检测1x106个鼠类细胞中一个人类肿瘤细胞的当量。因此可使用人Alu PCR灵敏地检测肿瘤边缘。我们发现与使用标准技术进行的未指引手术(log[DNA]＝4.63±0.82，n＝10，双尾学生t检验，p＝0.005)相比，树枝状聚合物转运分子指引使得手术部位的残余肿瘤细胞少10倍(即，残余癌细胞减少90％)(log[DNA]＝3.67±0.47，n＝10)。相比之下，使用癌细胞固有的GFP荧光指引切除来进行手术(log[DNA]＝4.0±1.4，n＝7)或用游离选择性转运分子进行手术(log[DNA]＝4.67±0.33，n＝6)与标准未指引手术(log[DNA]＝4.63±0.82，n＝10，分别p＝0.26和0.91)相比未显示功效改良。我们假设异种移植物内的细胞因选择压力而丧失GFP表达并且因此一些癌细胞可能在肿瘤床的GFP荧光检查期间遗漏，从而导致肿瘤不完全切除。此外，因为GFP荧光被活动物体内的组织和血红素吸收，因此可能遗漏不在手术床表面上的肿瘤。利用游离选择性转运分子指引时癌症移除功效缺乏改良可能反映肿瘤组织的游离选择性转运分子吸收较少，并且因此在肿瘤与相邻正常组织之间利用游离选择性转运分子获得对比度(2.45倍)与树枝状聚合物选择性转运分子获得的对比度(4.46倍)相比较低。与此观测结果一致，使用树枝状聚合物选择性转运分子指引与游离选择性转运分子指引相比，残余肿瘤细胞显著减少(双尾学生t检验，p＝0.0005)。
由ACPP指引下的手术获得的手术样本的组织学分析
为定量高荧光吸收与恶性细胞存在之间的相关性，我们对个别ACPP指引切除样品进行组织学分析。我们发现树枝状聚合物选择性转运分子探针具有93.33％的特异性比率(即，H&E组织学分析显示15份由树枝状聚合物选择性转运分子指引的切除获得的样本中的14份)。
根据MRI，树枝状聚合物转运分子指引的手术产生较小残余肿瘤体积
为比较树枝状聚合物选择性转运分子指引的手术与标准未指引手术后的残余肿瘤体积的体积，我们对以含有Cy5和钆螯合物两者的树枝状聚合物选择性转运分子处理的经过HT1080细胞异种移植的小鼠进行MR成像。以不知情方式对肿瘤进行荧光指引的选择性转运分子切除之前和之后使用MR影像对肿瘤体积进行定量。我们发现，根据MRI扫描的体积分析，在Cy5选择性转运分子荧光指引下进行手术使残余肿瘤与标准未指引手术相比降低5倍(0.003±0.002mm3(n＝2)与0.016±0.008mm3(n＝2))。尽管此结果未达到统计显著性(学生t检验，单尾，p＝0.08)，可能是因为样本规模小，但其与以上由Alu PCR定量显示残余肿瘤细胞减少的结果一致。
利用选择性转运分子指引的手术提高无肿瘤存活率
为测试在选择性转运分子指引下进行手术时是否影响肿瘤复发，我们将以Cy5标记的树枝状聚合物选择性转运分子注射至经过由转基因小鼠(品系8119，MMTV-PyMT)体内的自发性肿瘤或由黑素瘤细胞系(B16F10)获得的细胞同种异体移植的免疫活性小鼠体内。当肿瘤被良好囊封时，在有和没有选择性转运分子指引下实现完全肿瘤切除并且因此选择性转运分子指引并未赋予任何附加存活效益(数据未显示)。然而，当肿瘤浸润至周围组织中时，我们发现在树枝状聚合物转运分子指引下切除肿瘤的小鼠显示与未在树枝状聚合物选择性转运分子指引下切除肿瘤的小鼠相比，无肿瘤存活率提高。在经过黑素瘤细胞系B16F10同种异体移植的小鼠中，在树枝状聚合物转运分子指引下手术使得短期无肿瘤存活率提高加倍(手术后8周，40％相比于20％)，并且长期无肿瘤存活率提高50％(24周，33％相比于22％，威尔科克森检验(Wilcoxon test)，p＝0.05)。在经过转基因8119乳癌细胞系同种异体移植的小鼠中，在树枝状聚合物选择性转运分子指引下手术使得长期(24周)无肿瘤存活率相比于标准手术提高至5倍(手术后20周，50％相比于10％，威尔科克森检验，p＝0.03)。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员来说将显而易见，所述实施方案仅作为实例提供。本领域的技术人员现将在不悖离本发明的情况下进行众多变化、改变和取代。应了解，实施本发明时可采用本文所述本发明实施方案的各种替代。意欲以下权利要求书界定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求和其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (76)

1.一种具有结构(A-X-B-C)-M的分子，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
2.根据权利要求1所述的分子，其中A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。
3.根据权利要求1所述的分子，其中B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。
4.根据权利要求1所述的分子，其中B具有包含9个连续精氨酸的序列。
5.根据权利要求1所述的分子，其中(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。
6.根据权利要求1所述的分子，其中A和B包含D-氨基酸。
7.根据权利要求1所述的分子，其中X是可裂解连接子。
8.根据权利要求1所述的分子，其中X包含肽键。
9.根据权利要求1所述的分子，其中X包含6-氨基己酰基、5-氨基-3-氧戊酰基或其组合。
10.根据权利要求1所述的分子，其中X包含二硫键。
11.根据权利要求1所述的分子，其中X长约6至约30个原子。
12.根据权利要求1所述的分子，其中X是pH值敏感性连接子。
13.根据权利要求1所述的分子，其中X在细胞外空间中裂解。
14.根据权利要求1所述的分子，其中X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。
15.根据权利要求1所述的分子，其中X由还原剂裂解。
16.根据权利要求1所述的分子，其中所述X选自：PLGLAG；PLGLAx，其中X是任何氨基酸；PLG-C(me)-AG；ESPAYYTA；和RLQLKL；以及RLQLK(AC)。
17.根据权利要求1所述的分子，其中M是选自树枝状聚合物、葡聚糖、PEG聚合物或白蛋白的大分子载体。
18.根据权利要求1所述的分子，其中M是PEG聚合物。
19.根据权利要求1所述的分子，其中C包含成像剂、治疗剂或其组合。
20.根据权利要求1所述的分子，其中C包含选自以下的成像剂：荧光部分、发光部分、磷光部分、荧光淬灭部分、放射性部分、不透射线部分、顺磁性部分、造影剂或其组合。
21.根据权利要求1所述的分子，其中C包含选自以下的治疗剂：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。
22.根据权利要求1所述的分子，其中所述货物是吲哚羰花青染料。
23.根据权利要求1所述的分子，其中所述货物是吲哚羰花青染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRDYE 800CW、ALEXA647或其组合。
24.根据权利要求1所述的分子，其中所述货物是MRI造影剂。
25.根据权利要求1所述的分子，其中所述货物是[4，7，10-三(羰甲基)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。
26.一种具有结构(A-X-B)n-L的分子，其中
L包含脂质或被脂质包覆的治疗剂或成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
N是1与20之间的整数；并且
其中L通过与B所成的键连接至(A-X-B)部分。
27.根据权利要求26所述的分子，其中A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。
28.根据权利要求26所述的分子，其中B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。
29.根据权利要求26所述的分子，其中B具有包含9个连续精氨酸的序列。
30.根据权利要求26所述的分子，其中(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。
31.根据权利要求26所述的分子，其中A和B包含D-氨基酸。
32.根据权利要求26所述的分子，其中X是可裂解连接子。
33.根据权利要求26所述的分子，其中X包含肽键。
34.根据权利要求26所述的分子，其中X包含6-氨基己酰基、5-(氨基)-3-氧戊酰基或其组合。
35.根据权利要求26所述的分子，其中X包含二硫键。
36.根据权利要求26所述的分子，其中X长约6至约30个原子。
37.根据权利要求26所述的分子，其中X是pH值敏感性连接子。
38.根据权利要求26所述的分子，其中X在细胞外空间中裂解。
39.根据权利要求26所述的分子，其中X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。
40.根据权利要求26所述的分子，其中X由还原剂裂解。
41.根据权利要求26所述的分子，其中所述X选自：PLGLAG；PLGLAx，其中x是任何氨基酸；PLG-C(me)-AG；ESPAYYTA；和RLQLKL；以及RLQLK(AC)。
42.根据权利要求26所述的分子，其中所述脂质经过聚乙二醇化。
43.根据权利要求26所述的分子，其中所述脂质是PEG(2K)-磷脂酰乙醇胺。
44.根据权利要求26所述的分子，其中所述治疗剂是疏水性的。
45.根据权利要求26所述的分子，其中所述治疗剂选自：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。
46.根据权利要求26所述的分子，其中所述治疗剂是阿霉素或紫杉醇。
47.一种具有结构(A-X-B)n-D的分子，其中
D是树枝状聚合物；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
n是1与20之间的整数；并且
其中D通过与B所成的键连接至(A-X-B)部分。
48.根据权利要求47所述的分子，其中D包含至少一种货物部分。
49.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是成像剂、治疗剂或其组合。
50.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是选自以下的成像剂：荧光部分、发光部分、磷光部分、荧光淬灭部分、放射性部分、不透射线部分、顺磁性部分、造影剂或其组合。
51.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是选自以下的治疗剂：化学治疗剂、辐射致敏剂、调节细胞凋亡的药剂和调节细胞周期的药剂、调节信号转导级联的药剂或其组合。
52.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是吲哚羰花青染料。
53.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是吲哚羰花青染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa647、IRDYE 800CW或其组合。
54.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是MRI造影剂。
55.根据权利要求47所述的分子，其中所述至少一种货物部分是[4，7，10-三(羰甲基)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。
56.根据权利要求47所述的分子，其中A具有包含5至9个连续谷氨酸的序列。
57.根据权利要求47所述的分子，其中B具有包含5至12个连续精氨酸的序列。
58.根据权利要求47所述的分子，其中B具有包含9个连续精氨酸的序列。
59.根据权利要求47所述的分子，其中(a)A具有包含8至9个连续谷氨酸的序列并且(b)B具有包含9个连续精氨酸的序列。
60.根据权利要求47所述的分子，其中A和B包含D-氨基酸。
61.根据权利要求47所述的分子，其中X是可裂解连接子。
62.根据权利要求47所述的分子，其中X包含肽键。
63.根据权利要求47所述的分子，其中X包含6-氨基己酰基、5-(氨基)-3-氧戊酰基或其组合。
64.根据权利要求47所述的分子，其中X包含二硫键。
65.根据权利要求47所述的分子，其中X长约6至约30个原子。
66.根据权利要求47所述的分子，其中X是pH值敏感性连接子。
67.根据权利要求47所述的分子，其中X在细胞外空间中裂解。
68.根据权利要求47所述的分子，其中X由蛋白酶、基质金属蛋白酶或其组合裂解。
69.根据权利要求47所述的分子，其中X由还原剂裂解。
70.根据权利要求47所述的分子，其中所述X选自：PLGLAG；PLGLAx，其中x是任何氨基酸；PLG-C(me)-AG；ESPAYYTA；和RLQLKL；以及RLQLK(AC)。
71.一种对受试者的肿瘤进行成像的方法，其包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后对所述肿瘤进行成像，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
72.具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于对有需要的受试者的肿瘤进行成像的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
73.一种对受试者的肿瘤或组织切除术的手术边缘进行成像的方法，其包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后对所述手术边缘进行成像，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
74.具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于对有需要的受试者的肿瘤或组织切除术的手术边缘进行成像的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
75.一种移除受试者的肿瘤的方法，其包括在向所述受试者施用具有结构(A-X-B-C)-M的分子后移除所述肿瘤，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；并且
其中M结合于A或B。
76.具有结构(A-X-B-C)-M的分子用于移除有需要的受试者的肿瘤的用途，其中
C是至少一种成像剂；
A是具有包含5至9个连续酸性氨基酸的序列的肽，其中所述氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸；
B是具有包含5至20个连续碱性氨基酸的序列的肽；
X是连接子；并且
M是大分子载体；
其中M结合于A或B。
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