KR20080015866A - 세포 흡수 제어형 펩티드 - Google Patents

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에밀리아 에스 올슨
마이클 휘트니
토드 아길레라
쿠엔 은구엔
에드문드 옹
로저 와이 티시엔
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Abstract

본 발명의 펩티드에 대한 제네릭 구조는 A-X-B-C를 포함하며, 여기서 C는 카고 부분이고, 영역 B는 염기성 아미노산을 포함하며, X는 절단형 링커 서열이고, 영역 A는 산성 아미노산을 포함한다. 상기의 완전한 구조물은 세포에 의해서 유의하게 흡수되지 않지만, X의 세포외 절단 시에는, 영역 B-C이 세포로 흡수되어, 표적 세포에 카고가 전달된다. 카고는 예를 들어, 진단 영상용 조영제, 화학요법 약물 또는 치료용 방사선 감광제 등이다. X는 세포외에서 또는 세포내에서 절단가능하다. 본 발명의 분자는 선형, 환형, 분지형이거나 혼합 구조를 가질 수 있다.

Description

세포 흡수 제어형 펩티드{PEPTIDES WHOSE UPTAKE BY CELLS IS CONTROLLABLE}
- 관련 출원의 교차 참조 -
본 출원은 미국 2003년 10월 31일 출원한 미국 특허 출원 제10/699,562호의 일부 계속 출원으로 2005년 5월 19일에 출원한 미국 특허 출원 제11/133,804호의 일부 계속 출원이며, 이를 35 U.S.C.§120에 의거하여 우선권으로 주장하는 바이며, 상기 출원의 개시 내용을 전체로서 본 발명에서 참조로 인용한다.
- 연방 정부 지원 연구에 관한 진술 -
본 연구는 부분적으로 에너지국의 연구 보조금, DE-FG03-01ER63276 및 국립 보건원의 보조금 DK54441, GM54038 및 NS27177(NINCDS)의 지원을 받았다. 미정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
- 기술 분야 -
본 발명은 세포막을 가로질러서 물질을 수송하기 위한 방법 및 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
- 서론 -
세포막은 세포의 외부 경계를 한정하고, 세포 내부 및 외부로의 수송을 조절한다. 세포막은 주로 지질과 단백질로 이루어지며, 물질이 세포로 들어가기 전에 반드시 통과하게 되는 소수성 내부를 둘러싼 친수성 표면을 제공한다. 비록 많은 친지성 소화합물이 세포막을 수동적으로 관통할 수 있지만, 대부분의 화합물, 입자 및 물질이 살아있는 세포로 들어가기 위해서는 활성 기전에 의존해야만 한다.
막관통 수송(Transmembrane Transport)
세포 내부 및 외부로의 수송 제어는 세포의 지속적인 생존력에 필수 불가결하다. 예를 들어, 세포막은 수많은 중요한 물질들의 막관통 통행을 촉진할 수 있는 교환 인자, 이온 채널 및 펌프를 포함한다. 그러나, 막관통 수송은 선택적이며; 바람직한 물질의 세포 내로 진입을 촉진하는 것 이외에도, 다른 것들의 배출을 촉진시키는데 있어서, 세포막의 주요 역할은 세포 내부로 물질의 비제어적으로 진입하는 것을 방지하는 것이다. 세포막의 방벽 기능은 세포 내로 마커, 약물, 핵산 및 기타 외인성 물질의 전달을 어렵게 만든다.
지난 십여년간, 세포내로 용이하게 들어갈 수 있는 펩티드 서열이 동정되었다. 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV1)의 Tat 단백질은 세포외 환경에서 세포 내부로 들어갈 수 있다(예를 들어, Fawell 등, P.N.A.S. 91:664-668 (1994)). 안텐나페디아(Antennapedia)의 호메오박스 단백질 유래의 도메인도 세포내로 들어갈 수 있다(Vives, E. 등, J. Biol . Chem. 272, 16010-16017 (1997)). 이러한 흡수능은 예컨대 문헌 [Richard 등, J. Biol . Chem . 278(1):585- 590 (2003)] 등을 참고한다.
세포내로 용이하게 흡수되는 이러한 분자들은 또한 이들과 함께 다른 분자를 세포 내로 운반하기 위하여 사용할 수 있다. 세포 내로 물질의 수송을 촉진시킬 수 있는 분자를 "세포 침투성 펩티드(cell-penetrating peptides)"(CPPs), 단백질 형질 도입(transduction) 도메인, 및 "막 전좌(translocation) 신호"(MTS)라고 한다(예를 들어, 문헌 [Tung 등, Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294 (2003)] 참조). 가장 중요한 MTS는 예컨대 양전하 측쇄를 갖는 아르기닌 등의 아미노산이 풍부하다. 이러한 양이온성 펩티드에 의해 세포 내로 수송되는 분자들을 "카고(cargo)"라고 하며 양이온성 펩티드에 가역적으로 또는 비가역적으로 연결될 수 있다. 가역적 연결의 예는 Zhang 등의 문헌 [P.N.A.S. 95:9184-9189 (1994)]에서 확인할 수 있다.
MTS 분자는 예를 들어, 다음의 문헌 [Wender 등, P.N.A.S. 97:13003-13008 (2000); Hallbrink 등, Biochim . Biophys . Acta 1515:101-109 (2001); Derossi 등, Trends in Cell Biology 8:84-87 (1998); Rothbard 등, J. Med . Chem. 45:3612-3618 (2002); Rothbard 등, Nature Medicine 6(11): 1253-1247 (2000); Wadia 등, Curr . Opinion Biotech . 13:52-56 (2002); Futaki 등, Bioconj. Chem . 12:1005-1011 (2001); Rothbard 등, 미국 특허 제6,306,993호; Frankel 등, 미국 특허 제6,316,003호; Rothbard 등, 미국 특허 제6,495,663호; 및 Monahan 등, 미국 특허 제6,630,351호]에 기술되어 있다. 상기 및 하기의 모든 특허 및 출판물들을 전체로 본 발명에서 참조로 인용한다.
MTS 분자에 의해 촉진되는 흡수는 통상 비특이적으로 대부분 또는 모든 세포 흡수를 증가시킨다. 따라서, MTS 분자가 세포로 들어갈 수 있고, MTS 분자와 연결된 다른 분자의 세포내로의 수송을 증가시킬 수 있을지라도, 이러한 수송의 제어 및 조절은 용이하지 않은 상태로 남아 있다. 그러나, 카고를 전달하는 데 있어서 세포 유형, 또는 조직, 또는 동물의 신체 내 영역 또는 위치를 표적화할 수 있는 능력을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 당 분야에서는 MTS 분자에 의한 카고 분자의 전달을 조절하고 제어하여 표적화하고자 하는 요구가 존재한다.
- 본 발명의 요약 -
수송 분자를 통하여 세포로의 물질의 전달을 제어하기 위한 방법, 조성물 및 분자를 제공한다. 본 발명의 특징을 갖는 분자는 펩티드일 수 있는 절단형 링커로 연결된 펩티드 영역을 포함한다. 본 발명자들은 생리적 pH에서 다수의 음전하를 갖는 영역, 예컨대 복수의 산성 아미노산을 갖는 펩티드 영역을 부가하여 복수의 염기성 아미노산을 포함하는 MTS 분자의 세포 흡수를 억제 또는 방지할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서는 펩티드 영역 A가 펩티드 영역 B와 연결된 한편, 이 분자의 세포내로의 흡수가 억제되거나 방지되도록, 절단형 링커 X를 통해서 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산으로 이루어진 펩티드 영역 B에 연결된 약 2∼약 20개의 산성 아미노산으로 이루어진 펩티드 영역 A을 포함하는 화합물을 제공한다. 산성 영역 A는 산성 아미노산이 아닌 일부 아미노산, 또는 다른 부분을 포함할 수 있으며, 유사하게, 염기성 영역 B는 염기성 아미노산이 아닌 일부 아미노산, 또는 다른 부분을 포함할 수 있다. 산성 영역 A에 의한 염기성 영역 B의 흡수 억제 또는 방지를 B 흡수 "거부(veto)"라고 한다. 링커 X가 절단된 후 펩티드 영역 A가 펩티드 영역 B와 분리되고, 영역 A에 의한 거부성이 제거되어, 영역 B가 세포로 들어갈 수 있다. 절단형 링커 X는 바람직하게 생리적 조건하에서 절단가능 하다.
다른 구체예에서, 카고 부분을 포함하는 카고 영역 C를 염기성 영역 B에 부착시켜서 영역 C와 함께 카고 영역 C를 세포로 수송할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산의 펩티드 영역 B에 절단형 링커 X를 통하여 순서대로 연결된 약 2∼약 20개의 산성 아미노산의 펩티드 영역 A를 포함하는 화합물을 제공하며, 여기서 펩티드 영역 B는 카고 영역 C와 공유적으로 부착되어서 B-C 구조를 형성하는데, 이는 펩티드 영역 A가 영역 B에 연결되어 있으면서, MTS 화합물의 세포내 흡수를 억제하거나 방지하는데 효과적이다. 산성 영역 A는 B-C의 흡수를 거부할 수 있다. 영역 B에 연결된 카고 영역 C의 세포막을 관통하는 수송도 또한 산성 영역 A를 통해 억제 또는 방지된다. 링커 X가 절단된 후, 펩티드 영역 A와 펩티드 영역 B가 분리되고, 펩티드 영역 A에 의한 흡수 거부가 제거되어 펩티드 영역 B에 연결된 카고 영역 C가 세포로 들어갈 수 있다. 절단형 링커 X는 바람직하게 생리적 조건하에서 절단가능하여, 살아있는 세포로 카고 영역 C의 수송을 가능하게 한다. 카고 영역 C는 또한 염기성 영역 B에 절단가능하게 부착되어서 카고 영역 C가 세포 내에서 영역 B와 분리된다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에서는 복수의 아미노산, 예컨대 약 2∼약 20, 바람직하게 약 5∼약 20개의 산성 아미노산을 갖는 펩티드 영역 A를 포함하는 분자를 제공하며, 이때 펩티드 영역 A는 복수의 염기성 아미노산, 예컨대 약 5∼약 20, 바람직하게는 약 9∼약 16개의 염기성 아미노산을 갖는 펩티드 영역 B로 구성된 MTS 분자의 흡수를 방지하는데 효과적이다. 따라서 펩티드 영역 A는 또한 복수의 염기성 아미노산을 갖는 펩티드 영역 B에 의한 세포막을 관통하는 카고 C의 수송 증가를 방지하는데도 효과적이다. 펩티드 부분 B를 갖는 분자로부터 펩티드 영역 A를 절단하는 것은 영역 B를 포함하는 분자의 잔류 부분의 세포에 의해 흡수되는 능력을 회복시키는 데 효과적이다. 펩티드 영역 B에 공유적으로 부착되어 B-C 구조를 형성하는 카고 영역 C를 갖는 분자로부터 펩티드 영역 A를 절단하는 것은 상기 B-C 구조물이 세포에 의해 흡수되는 능력을 회복시키는데 효과적이다.
일 구체예에서, 세포막을 가로질러서 카고 부분을 제어가능하게 수송하기 위한 분자는 A-X-B-C 구조를 갖는 분자 또는 물질을 포함하며, 여기서 C는 카고 부분을 포함하고, B는 복수의 염기성 아미노산(예를 들어, 약 5∼약 20개, 바람직하게는 약 9∼약 16개 염기성 아미노산)을 갖는 펩티드 영역을 포함하며, B와 C는 공유적으로 연결되어 있고, A는 복수의 산성 아미노산(예를 들어, 바람직하게 약 2∼약 20개, 바람직하게는 약 4∼약 20개의 산성 아미노산)을 갖는 펩티드 영역을 포함하며, X는 A와 B를 연결하는 절단형 링커를 포함한다. B-C와 연결된 경우, 펩티드 영역 A는 세포막을 가로지르는 카고 C의 수송 증가를 방지하는데 효과적이다. 절단형 링커가 절단된 경우, 상기 펩티드 영역 A는 영역 B 및 카고 영역 C로부터 유리되는 것을 비롯하여 분자의 나머지 부분으로부터 자유로워진다. 카고 영역 C는 절단형 링커 X의 절단후에도 영역 B와 연결되어 남아 있는다. 영역 B는 영역 A 부재하에서 세포막을 관통하는 카고 영역 C의 수송을 증가시키는데 효과적이다.
개략적인 구조 A-X-B를 갖는 분자 및 개략적인 구조 A-X-B-C를 갖는 분자를 포함하는 본 발명의 일 구체예에서, 영역 A의 산성 아미노산은 글루타메이트, 아스 파르테이트 또는 포스포세린이다. 산성 아미노산은 pH 6.0에서 음전하를 갖는 측쇄를 가지는 것으로서, 글루탐산, 아스파르트산 또는 다른 산성 아미노산일 수 있다. 복수의 산성 아미노산을 갖는 산성 영역 A는 약 2∼약 20, 또는 약 5∼약 20, 또는 바람직하게 약 5∼약 9개의 산성 아미노산을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 영역 A는 5∼9개의 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 포함하며, 5∼9개의 연속적인 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 포함할 수 있다. 구체예에서, 영역 A의 산성 아미노산은 D 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 산성 아미노산은 D-글루타메이트, D-아스파르테이트이거나 둘 다 일 수 있다.
염기성 아미노산은 pH 6.0에서 양전하를 갖는 측쇄를 가지는 것으로서, 아르기닌, 히스티딘, 리신 또는 다른 염기성 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 영역 B의 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이다. 복수의 염기성 아미노산을 갖는 염기성 영역 B는 약 5∼약 20, 또는 약 9∼16개의 염기성 아미노산을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 영역 B는 약 9∼약 16개의 아르기닌을 포함할 수 있고, 약 9∼약 16개의 연속적인 아르기닌을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 영역 B의 염기성 아미노산은 D 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 영역 B의 염기성 아미노산은 D-아르기닌, D-리신, D-히스티딘 또는 이들의 조합일 수 있다.
카고 부분은 MTS에 연결되어 세포로 수송될 수 있는 임의 구성체, 분자, 물질 또는 기질일 수 있다. 카고 영역 C는 하나 이상의 카고 부분을 포함한다. 카고 부분은 예컨대, 형광 부분, 형광-켄칭 부분, 방사성 부분, 방사선 비투과성 부분, 상자성 부분, 나노입자, 소포, 분자 비콘, 표지, 표지화 효소(예를 들어, 홀스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 베타-갈락토시다제 또는 기타 세포를 표지화하는데 적절한 효소), 조영제(예를 들어, 진단 영상화용), 화학치료제, 방사선 감광제(예를 들어, 방사선 치료용), 세포 주기에 작용하는 펩티드 또는 단백질, 단백질 독소, 또는 기타 세포 내로의 수송에 적절한 카고 등일 수 있다. C가 형광 부분인 일 구체예에서, 링커 X의 절단 전에 형광 부분 C의 형광성을 켄칭하는데 효과가 있도록 영역 A에 형광-켄칭 부분을 부착시키고, 링커 X의 절단 이후 형광 부분 C의 켄칭부를 제거한다.
절단형 X는 산성 영역 A와 염기성 영역 B를 연결하는 역할을 한다. 절단형 링커 X는 예를 들어, 약 2∼약 100 원자, 또는 약 6∼약 30 원자를 포함한다. 절단형 링커 영역 X는 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 약 1∼약 30 또는 약 2∼약 10개 아미노산 잔기의 펩티드 결합일 수 있다. 본 발명의 실시에 적합한 절단형 링커 X는 연성 링커이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 실시에 적합한 절단형 링커 X는 연성 링커이고, 약 6∼약 24 원자의 길이일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, X는 펩티드 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 절단형 링커 X는 아미노카프로산(아미노헥산산이라고도 함) 결합을 포함한다.
절단형 X는 세포 외부에서 절단되도록 구성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 절단형 링커 X는 세포와 회합된 상태 또는 조직 손상 또는 질병 등의 상태에서 절단되도록 구성될 수 있다. 이러한 상태는 예를 들어, 산과다증; 괴저 상태(예를 들어, 괴사 세포에서 방출되는 기타 프로테아제 또는 칼파인에 의한 절 단 등)를 포함하는, 세포내 효소(정상적으로 세포 내부에 있는 것)의 존재; 저산소 상태 예컨대 환원성 환경; 혈전증 상태(예를 들어, 링커 X가 트롬빈에 의해 절단될 수 있거나 기타 혈액 응고 캐스케이드와 관련된 효소에 의해 절단될 수 있는 상태); 면역계 활성화 상태(예를 들어, 링커 X가 활성화된 보체 단백질의 작용으로 절단될 수 있는 상태); 또는 다른 손상 또는 질병과 관련된 상태를 포함한다.
예를 들어, 절단형 링커 X는 효소, 예컨대 메트릭스 메탈로프로테아제에 의해 절단되도록 구성할 수 있다. 절단형 링커를 절단할 수 있는 다른 효소로는, 예컨대 유로키나제 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 리소좀 효소, 카텝신, 전립선 특이적 항원, 헤르페스 심플렉스 바이러스 프로테아제, 사이토메갈로바이러스 프로테아제, 트롬빈, 카스파제 및 인터루킨 1β 전환 효소 등이 포함된다. 본 발명의 구체예에서, 절단형 링커 X는 아미노산 서열 PLGLAG(서열 번호 1)를 포함하거나 아미노산 서열 EDDDDKA(서열 번호 2)를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 절단형 링커 X는 S-S 결합을 포함하거나, 금속이 환원될때 떨어지는 전이 금속 착체를 포함할 수 있다. 본 발명의 특징이 구체화된 분자는 산성 아미노산을 갖는 다수의 영역 A를 B-C 구조물에 연결하는 복수의 링커 X를 가질 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 펩티드 영역 A는 B-C를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 말단에 위치하거나, B-C를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단을 포함한다. A는 B-C를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 또는 이의 근처에서 연결되거나, A는 B-C를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 카르복시 말단에 또는 이의 근처에 연결될 수 있다. 상기 폴리펩티드 사슬 B-C는 B측 말단 및 C측 말단으로 지칭되는 말 단부를 가진다. 절단형 링커 X는 B측 말단에 또는 그 근처에 배치되거나, C측 말단 또는 그 근처에 배치될 수 있다. 다른 구체예에서, 영역 또는 영역들은 선형이거나 환형일 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 환형 분자는 단독 링커 X를 갖거나 복수의 링커 X를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 세포로의 카고 전달을 제어할 수 있는 펩티드를 갖는 본 발명의 화합물 및 적절한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함하는, 조성물 및 용액제를 제공한다. 세포로의 카고 전달을 제어할 수 있는 이러한 펩티드의 제조 방법, 및 이들을 함유하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 본 발명의 구체예에서, 산성 영역 및 염기성 영역 사이의 절단형 연결부과 함께, 펩토이드, 카르바메이트, 비닐 중합체 및 기타 분자 등도 제공할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 특징이 구체화된 분자, 조성물 및 방법은 세포 내로 염기성 아미노산 함유 분자의 흡수를 제어하는 장점, 및 세포내로 카고의 전달을 제어할 수 있는 장점을 제공한다. 이러한 세포로의 카고 전달의 제어형 전달 및 제어형 흡수는 예컨대 병에 걸린 세포나 조직을 갖는 환자의 치료에 유용하다. 예를 들어, 카고로서 영상 조영제 또는 항증식제가 환자의 모든 세포가 아닌 암세포에 직접 전달되어, 치료에 의해 발생가능한 부작용을 줄이고, 효율을 증가시키거나 비침습성 영상화를 가능하도록 병이 있는 세포에 표적 전달하는 장점이 있다.
본 출원 또는 특허는 채색되어 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 채색 도면을 포함하는 공개 출원서 또는 공개 특허의 사본은 규정된 수수료를 납부하고 요청시에 국제 사무국을 통해 입수할 있다.
도 1a는 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 1b는 염기성 영역 B, 2 링커 영역 X, 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 환형 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2a는 카고 영역 C, 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2b는 카고 영역 C, 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하고, 상기 링커 영역 X는 카고 영역 C에 연결된 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2c는 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 각각 포함하는 MTS 분자의 복수 카피들에 연결된 카고 C를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2d는 카고 영역 C, 염기성 영역 B, 복수(2개) 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2e는 카고 영역 C, 염기성 영역 B를 포함하고, 여기서 2개의 링커 영역 X는 산성 영역 A에 측접해 있는 본 발명의 특징을 갖는 환형 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 2f는 형광성 카고 영역 C, 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 켄칭제 Q가 부착된 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도 이다.
도 3은 카고 영역 C가 조영제 또는 약물이고, 염기성 영역 B는 8 내지 10개의 D-아르기닌 잔기 서열이며, 링커 영역 X는 암성 세포 주변에서 발견되는 환원성 환경 또는 단백질 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있는 절단형 링커이고, 산성 영역 A는 D-아미노산을 포함하는 억제성 도메인인 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도이다.
도 4는 정상 조직 주변에서는 절단형 링커가 절단되지 않은 본 발명의 특징을 갖는 도 3에 도시한 MTS 분자의 개략 구성도로서, 여기서 도 3의 분자는 정상 조직내로 카고 진입을 촉진시키는 능력을 나타내지 않는다.
도 5는 암 세포 주변에서 발견되는 환원성 환경 또는 단백질 가수분해 효소에 의해 절단형 링커가 절단된 본 발명의 특징을 갖는 도 3의 MTS 분자의 개략적인 구성도로서, 여기서 도 3의 분자는 병이 있는 조직으로 카고 진입을 촉진시키는 능력을 나타낸다.
도 6a는 본 발명의 특징을 갖는 펩티드에서 엔테로키나제의 기질인 링커 영역 X가 절단되기 전 이 펩티드의 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6b는 엔테로키나제로 링커 영역 X를 절단한 후 도 6a 펩티드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 7a는 본 발명의 특징을 갖는 펩티드에서 메트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2)의 기질인 링커 영역 X가 절단되기 전 이 펩티드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 7b는 MMP-2에 의해 링커 영역 X가 절단된 후 도 7a의 펩티드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 형광성 카고 부분을 포함하는, 본 발명의 특징을 갖는 MTS와 10분간 항온 반응시킨 저캣 세포 집단을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter) 분석하여 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 형광성 카고 부분을 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자와 10분간 항온 반응시킨 저캣 세포 집단을 FACS 분석하여 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 형광성 카고 부분을 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자와 10분간 항온 반응시킨 저캣 세포 집단을 FACS 분석하여 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 11은 형광성 카고 부분을 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자와 10분간 항온 반응시킨 저캣 세포 집단을 FACS 분석하여 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 도 11의 MTS 분자와 1시간 동안 항온 반응시킨 저캣 세포에서 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 13은 형광 표지된 염기성 영역과 산성 영역을 연결하는 이황화 링커를 갖는 MTS 분자, 또는 형광 표지된 염기성 영역 단독과 10분간 항온 반응시킨 저캣 세포에서 측정한 평균 형광도를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 카고 영역 전체 또는 일부로서 적합한 부분의 예를 나타낸다.
도 15는 산성 영역 A 전체 또는 일부로 사용하기 적합한 부분의 예를 나타낸다.
도 16은 링커 X 전체 또는 일부로 사용하기 적합한 부분의 예를 나타낸다.
도 17은 염기성 영역 B 전체 또는 일부로 사용하기 적합한 부분의 예를 나타낸다.
도 18은 산성 영역 A 전체 또는 일부로 사용하기 적합한 중합체 부분의 예를 나타낸다.
도 19는 활성화형 세포-침투 펩티드(ACPPs)의 개략적인 구성도이다. 양이온성 펩티드에 의해 유도된 세포 흡수는 절단형 링커를 통해 부착된 산성 잔기의 짧은 스트레치에 의해 차단된다. 링커가 절단되면, 산성 억제 도메인이 떨어져 나가, 양이온성 세포-침투 펩티드(CPP)가 자신의 카고를 세포로 운반하도록 자유로워 진다.
도 20은 MMP-2에 의한 절단에 의존적인 생존 HT-1080 세포와 ACPP의 회합을 FACS 분석(A) 및 현미경 분석(B 및 C)을 통하여 나타내는 도면이다. (A) 트레이스 1(청색)은 미처리 세포를 나타낸다. 트레이스 2(오렌지색) 및 3(녹색)는 각각 1 uM의 미절단 또는 사전절단한 펩티드와 10분간 항온 반응시킨 세포를 나타낸다. 1 uM r9k(Cy5)와 항온 반응시킨 세포는 적색(트레이스 4)으로 나타냈다. (B) HT-1080 세 포를 1 ㎍/㎖ 획스트(Hoechst) 33258(좌측) 및 1.25 uM 미절단 펩티드(중앙)와 항온 반응시키고 획스트 또는 Cy5 파장에서 영상화하였다(우측 중첩도). (C) 절단된 펩티드를 이용하여 유사한 실험을 한 결과이다. 화살촉 모양이 가능한 핵소체를 나타낸다.
도 21은 단체 ACPP, 숙시닐-e8-XPLGLAG-r9-Xk를 2차원 NMR로 관찰한 핵 오버하우저 효과를 나타내는 도면으로서, 여기서 X는 6-아미노헥사노일을 나타낸다. 적색 파선은 관찰된 핵 오버하우저 효과를 나타내며, 녹색선은 명료하게 펩티드 외형을 강조하기 위한 것이다.
도 22는 활성화형 CPP로 HT-1080 종양 이종이식편을 가시화한 도면이다. HT-1080 종양을 누드 마우스의 유방형 지방성 육지에 이식시키고 직경이 5∼7 mm에 도달할때까지 성장시켰다. (A1) 절단형 펩티드 6 nmol을 주입한 후 50분 후 마취시킨 생존 동물을 영상화한 도면이다. (A2 및 A3) 주입 후 30분 이후에 희생시킨 다른 동물의 종양 및 근육 조직 구조이다. (B1∼B3) 스크램블형 펩티드로 유사한 실험을 수행한 것이다(스케일바, 30 ㎛).
도 23은 마우스의 다양한 조직에서 절단형 및 비절단형 펩티드의 정규화 흡수값(SUV)을 나타내는 그래프이다.
도 24는 펩티드의 Hβ/γ(δ1)-HN(δ2) 영역의 NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다. D-arg과 D-glu 잔기 간의 크로스-스트랜드 상호작용을 증명하는 결과를 나타낸다. (A) NOESY 스펙트럼. 8.65 ppm에서의 청색 파선은 C에 상응한다. (B) TOCSY 스 펙트럼. 8.65 및 8.59 ppm의 청색 파선은 각각 D 및 E에 상응한다. (C) D-arg의 HN에서의 1D NOESY 벡터. (D) D-arg의 HN에서 1D TOCSY 벡터. (E) D-glu의 HN에서 1D TOCSY 벡터.
도 25는 Hβ/γ(δ1)-HN(δ2) 영역의 NOESY 스펙트럼은 링커 영역의 잔기를 통한 연속적인 HN-HN 골격 상호작용을 나타낸다. 대칭적인 관련 교차-피크를 대각선의 양면에서 한번 표지화하였다.
도 26은 TPEN가 절단형 ACPP, (5 kDa PEG)-eeeeeeeeeXPLGLAG-rrrrrrrrrXk(Cy5)(X는 6-아미노헥사노일을 나타냄)(서열 번호 52)를 통해서 편평 세포 암종 표본의 염색을 억제하는 것을 나타낸다. 조직 조각을 1 uM TPEN 부재(A) 및 존재(B) 하에서 1 uM ACPP로 염색하였다. (A)에 나타낸 조각은 정상 조직뿐만 아니라 종양 영역(상부 우측)을 포함한다. (B)에 나타낸 조각은 종양만을 함유한다.
도 27은 H2N-e6-XPLGLAG-r9-Xc(Cy5)-CONH2(X는 아미노헥산산)의 MMP-2 절단에 대한 절단 동력학을 나타내는 그래프이다.
도 28은 메트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP-2)에 의한 절단에 의존적인 흡수성을 나타내는 도면이다.
도 29는 펩티드 절단에 의존적인 카고의 흡수성을 나타낸다.
도 30은 절단형 펩티드 유래의 형광성을 영상화하여 누드 마우스에서 MMP-2- 양성 종양의 병소 부위를 나타내는 도면이다.
도 31은 생체 내에서 펩티드 절단에 의존적으로 관찰된 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 32는 절단형 펩티드를 사용하여 개선된 명암 대비(constrast)를 나타내는 누드 마우스 내 이종이식된 인간 HTl080 종양의 영상을 나타낸다.
도 33은 마우스의 자발성 유방 종양 내에서 절단형 펩티드 유래 형광에 의해 나타나는 화상을 제공하며, 종양내 절단형 펩티드의 존재를 보여주는 겔 화상을 제공한다.
도 34는 마우스의 림프절 내 전이 및 주변 마크로파지에서 절단형 펩티드 유래 형광에 의해 나타나는 화상을 제공한다.
도 35는 인간 편평 세포 암종 절제부의 화상을 나타내며, 종양에서 젤라티나제 활성이 증가한 것으로 나타났다.
도 36은 인간 편평 세포 암종의 절제부 화상을 나타낸다.
도 37은 표적 조직 및 세포에 파지를 전달하고 절단을 위한 효소 활성을 갖는 부위에 파지를 지정하는데 적합한 ACPP로 피복된 파지 입자를 생성시키기 위한 개략적인 흐름도이다.
도 38은 종양에 서열 의존적 파지를 축적시키기 위한 개략적인 흐름도를 나타내며, 표적 종양에서 파지 흡수가 증가된 결과를 나타낸다.
도 39는 표적 세포에 방사성 부분을 전달하기 위한 ACPP에 방사성 화합물을 부착시키기 위한 개략적인 흐름도를 나타낸다.
도 40은 효소적 절단으로 표적 세포에 방사성 카고의 전달이 증가된 것을 검증한 결과를 나타낸다.
도 41은 표적 세포에 방사성 카고의 전달이 효소에 의한 절단-의존적으로 증가하는 것을 검증한 결과를 나타낸다.
도 42는 자기 공명 영상법(MRI)의 영상을 개선시키기 위해 MMP 기질을 제공하기 위한 개략적인 흐름도를 나타낸다.
도 43은 조영제를 포함하는 ACPP의 효소에 의한 절단시 MRI 조영제의 흡수가 증가하였음을 보여주는 그래프이다.
도 44는 환형 ACPP를 나타내는 도면이다.
도 45는 환형 ACPP를 합성하기 위한 개략적인 흐름도이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 환형 ACPP에 부착하여 PEG화 환형 ACPP를 제공한다.
도 46은 합성된 MMP 절단형 환형 ACPP를 나타내고, 여기에 PEG 및 형광 표지를 부가하여 변형시키는 개략적인 흐름도를 나타낸다.
도 47은 효소적 절단 전에 환형 ACPP에 의한 자가 켄칭을 검증한 결과를 나타낸다.
도 48은 활성화를 위하여 2 부위에 절단이 필요한 환형 ACPP 펩티드의 개략적인 구성도이다.
도 49는 99 mTc-표지된 알부민-ACPP, (마우스의 혈청 알부민)-e9-XPLGLAG-r9- [DPK-99mTc(CO)3]를 이용한 HT1080 이종이식편의 평면 감마 영상화 결과를 나타낸다. 3마리의 개별 누드 마우스를 사용하였으며, 각각 다른 시간점을 나타낸다. 상단부: 마우스의 가시광 영상으로서, 이종이식된 종양이 겨드랑이에 위치하는 것을 보여준다. 중간부: 그레이 스케일의 감마 영상. 하단부: 강도차를 강조하기 위해 의사 채색한(pseudocolored) 감마 화상. "간" 표지된 고강도의 중심 영역은 또한 신장과 비장을 포함한다. 종양은 주변부에서 보인다.
도 50은 99 mTc-표지된 알부민-PLGLAG-DPK의 생체분포도를 나타낸다. 도 49에 도시한 이종이식한 마우스를 주입후 6, 24 및 48시간 후에 희생시켜서 장기를 절개하여, 무게를 재고, 2시간 이내에 방사성을 계측하여 막대 그래프에 나타낸 바와 같이 주입 용량%(%ID)/조직 g을 얻었다(평균±표준 편차, n=시간점 당 4). 삽입표에는 동물 체중×으로 한정한(%ID/조직 g) 상응하는 표준 정규화 흡수값(SUV)를 나타내었다.
도 51은 Gd3 + 표지된 ACPP의 자기 공명 영상법을 나타내며, 여기서 형질 전환 MMTV-PyMT 마우스에서 전이성 림프절을 확인하였다. 상기 ACPP는 SuC9-(70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd)이다. T1-측량 지방-포화 영상법(T1- weighted fat-saturated imaging)을 7 Tesla 소동물 스캐너를 이용하여 본문에 기술된 바와 같이 수행하였다. 꼬리 정맥에 510 nmoles ACPP 주입후 표시한 시간점 전 및 후에 6종의 영상을 얻었다. 황색 화살표는 원발성 종양을 가리키고, 청색은 간, 적색은 림프절, 녹색은 장을 가리킨다. 2시경에 밝은 림프절 형상이 나타나기 시작하는 것을 주목할 수 있다. 이하 설명하는 1.b 부분을 참조한다.
도 52는 원적외 Cy5 카고 및 알부민 또는 덱스트란 골격을 갖는 ACPP를 이용하여 MMTV-PyMT 형질 전환 마우스에서 동시 형광 현미경법으로 종양을 확인한 것을 나타낸다. 완전한 마우스의 복부에서 얻은 영상(625∼645 nm에서 여기,665∼695 nm에서 발광)으로서, 자가 형광 배경값을 측정하기 위한 미주입군, 또는 4종의 상이한 ACPP 주입 후 36시간에 얻은 것이며, ACPP의 양 및 조성은 표시한 바와 같다. ACPP ("Albc, Dexc") 중 2종은 시험용 ACPP("Alb, Dex")와 비교하여 단백질 가수분해를 방해하기 위하여 D-아미노산을 사용한 대조군이다. 적색 화살표는 종양을 가리킨다. Alb 및 Dex-주입한 마우스의 종양에서 보이는 밝은 형광에 주목할 수 있다. 하단 좌측 그래프는 종양 영역의 시간 경과에 따른 형광성 대 흉부 편자 중심부의 정상 조직의 시간 경과에 따른 형광도를 나타내는데, 주입 후 36시에 약 4의 최고 광학차를 얻었다. 하단 우측 막대 그래프는 48시에 최종 희생시킨 후 얻은 정규화 흡수값(SUV)을 나타내는데; 종양만이 시험용 ACPP와 대조군 ACPP 간에 두드러진 차이를 나타내었다. 신장 및 간에 대한 SUV가 종양에 비하여 높거나 유사하지만, 신장 및 간이 보다 깊이 묻혀 위치하기 때문에 광학 영상에서 신장 및 간을 구별할 수 있다.
도 53은 70 KDa 덱스트란 골격의 ACPP 역시 종양 근방의 림프절에 축적됨을 나타내는 도면이다. 상단부는 도 2와 같은 동시 형광 현미경법에 의한 영상을 나타내지만 림프절을 노출시키기 위하여 체강을 드러내었는데, 이중 일부는 신장 및 요 추부로 개별적으로 확인되었다. 최우측 패널에서 대동맥 주변부 군집으로 보이는 바와 같이, 모든 림프절이 밝지는 않았다. 하단 영상은 d-아미노산, 즉 plglag를 갖는 대조군 ACPP와 절단형 PLGLAG 링커를 갖는 시험용 ACPP를 비교하여, 림프절을 통한 조직 절개부의 형광도이다. 형광차를 정량하여 하단 우측에 막대 그래프로 나타내었다.
도 54는 이종이식한 종양에서 서열 의존적 파지 축적을 나타내는 도면이다. HT1080 이종이식편을 갖는 마우스에 가수분해성 PLGLAG 링커(갈색 막대) 또는 가수분해성이 적은 스크램블형 서열 LALGPG(청색 막대)을 포함하는 ACPP로 코팅된 파지를 주입하였다. 이 막대 그래프에 따르면 혈액에 비하여 종양에서 회수한 파지의 역가가 LALGPG보다 PLGLAG에 대하여 약 4배 높은 반면, 간과 신장에서 회수한 파지는 보다 적었고 두 서열간에 유의한 차이가 없었다.
도 55는 마트리겔의 3D 배양물의 형광 영상을 나타낸다. 방법론에 대한 일반적인 흐름도를 나타내었다.
도 56은 24시간 동안 ACPP를 흡수하기에 충분한 MMP가 3D 배양한 MDA-MB-231 세포에서 생성됨을 나타내는 도면이다. 좌측 2 컬럼은 MMP의 일반적인 억제제인 0.1 mM GM6001의 존재 또는 부재하에서 e9-XPLGLAG-r9-k(Cy5)를 사용한 결과를 나타낸다. GM6001은 또한 세포의 침습성을 감소시키는데, 이것으로 세포 군집이 보다 작은 이유를 설명할 수 있다. 우측의 2 컬럼은 비가수분해성 음성 대조군으로 e9-Xplglag-r9-k(Cy5)을 사용하고 양성 대조군으로 r9-k(Cy5)을 사용한 결과를 나타낸 다. 상단부는 획스트 염색한 핵으로, 의사 채색 녹색을 나타내며, 하단부는 Cy5 형광을 나타낸다. 주목할 것은 이들 ACPP는 거대 분자 담체를 갖지 않는데, 신장 배출을 막을 필요가 없기 때문이고 거대분자 담체가 마트리겔을 통해서 활성 순환이 결여된 이들 유기관으로 확산되는 것을 방지하는 듯하기 때문이다.
도 57은 종양이 없는 림프절에 명암 대비가 없거나 거의 나타나지 않는 것을 보여주는 도면이다. 종양이 없는 마우스(영상의 하단부)에서, 도 51에서 사용한 것과 동일한 Gd 함유 ACPP를 종양이 없는 마우스에 투여시 림프절이 표지화되지 않았다. 영상의 상단부는 종양 함유 마우스의 림프절 내 표지 분포를 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 펩티드의 제너릭 구조는 A-X-B이며, 여기서 펩티드 영역 B는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산을 포함하고, X는 절단형 링커 영역으로서, 바람직하게는 생리적 조건하에서 절단가능하고, 펩티드 영역 A는 약 2∼약 20개의 산성 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특징을 갖는 분자의 일 구체예에서, 펩티드 영역 B는 약 5∼약 20개, 또는 약 9∼약 16개의 염기성 아미노산을 포함하며, 일련의 연속적인 염기성 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 리신 또는 다른 염기성 아미노산)일 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 분자의 일 구체예에서, 펩티드 영역 A는 약 2∼약 20개, 또는 약 5∼약 20개의 산성 아미노산을 포함하고, 일련의 연속적인 산성 아미노산(예를 들어, 글루타메이트 및 아스파르테이트 또는 다른 산성 아미노산)일 수 있다. 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도를 도 1a에 도시하였다. 일 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 도 1b에 개략적으로 도시한 바와 같이 환형 분자일 수 있다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 선형 분자, 환형 분자 또는 환형 영역을 포함하는 선형 분자일 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 복수의 염기성 아미노산, 예컨대 일련의 염기성 아미노산을 포함하는 분자는 대체로 세포에 의해 흡수된다. 그러나, 본 발명자들은 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A을 포함하는 구조를 갖는 분자는 세포에 의해 흡수되지 않는다는 것을 발견하였다. 산성 영역 A는 산성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 산성 영역 A는 다른 부분, 예컨대 음으로 하전된 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 일 구체예에서, 산성 영역 A는, 바람직하게 생리적 pH에서 약 2∼약 20의 음전하를 갖고, 아미노산을 포함하지 않는 음으로 하전된 영역일 수 있다. 염기성 영역 B는 염기성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 염기성 영역 B는 다른 부분, 예컨대 양으로 하전된 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 일 구체예에서, 염기성 영역 B는, 바람직하게 생리적 pH에서 약 5∼약 20의 양전하를 갖고, 아미노산을 포함하지 않는 양으로 하전된 영역일 수 있다. 산성 영역 A를 포함하는 것은 세포로 영역 B가 흡수되는 것을 억제하거나 방지하는데 효과적이다. 이러한 흡수의 차단, 달리 말하면 영역 B의 염기성 아미노산이 받는 영향을 산성 영역 A에 의한 흡수 "거부(veto)"라고 할 수 있다. 본 발명자들은 또한 영역 B에서 영역 A를 분리할 수 있는 링커 X의 절단이 영역 B가 세포로 흡수될 수 있는데 효과적임을 발견하였다.
다른 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 펩티드의 제너릭 구조는 A-X-B-C이며, 여기서 C는 카고 부분이고, X는 링커, A는 산성 영역이며 B는 염기성 영역이다. 산성 영역 A는 산성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 산성 영역 A는 다른 부분, 예컨대 음으로 하전된 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 일 구체예에서, 산성 영역 A는, 바람직하게 생리적 pH에서 약 2∼약 20의 음전하를 가지며, 아미노산을 포함하지 않는 음으로 하전된 영역일 수도 있다. 염기성 영역 B는 염기성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 염기성 영역 B는 다른 부분, 예컨대 음으로 하전된 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 일 구체예에서, 염기성 영역 B는 바람직하게 생리적 pH에서 약 5∼약 20의 양전하를 가지며, 아미노산을 포함하지 않는 양으로 하전된 영역일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 영역 A내 음전하의 양은 영역 B의 양 전하의 양과 대략 동일하다.
카고 부분 C는 예를 들어, 진단용 영상화를 위한 조영제(contrast agent), 화학치료제 또는 치료용 방사선 감광제일 수 있다. B는 예를 들어, 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산, 예컨대 일련의 염기성 아미노산(아르기닌이 바람직하지만, 히스티틴도 적당하며 리신 또는 다른 염기성 아미노산도 적합하다)을 갖는 펩티드 영역일 수 있다. X는 생리적 조건하에서 바람직하게 절단가능한 절단형 링커이다. 영역 A는 약 2∼약 20개의 산성 아미노산, 예컨대 일련의 산성 아미노산을 갖는 펩티드 영역일 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 분자의 일 구체예에서, 글루타메이트 및 아스파르테이트가 펩티드 영역 A를 위해 바람직한 산성 아미노산이다. 카고 영역 C, 염기성 영역 B, 링커 영역 X 및 산성 영역 A를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도를 도 2a에 도시하였다.
본 발명자들은 산성 영역 A를 포함하는 것이 또한 영역 B와 영역 C를 조합한 분자가 세포로 흡수되는 것을 억제 또는 방지하는데 효과적임을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 영역 B로부터 영역 A가 분리되도록 링커 X를 절단하는 것이 영역 B와 영역 C가 세포로 흡수되는데 효과적임을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 분자를 통해서 카고 C의 전달을 제어할 수 있고 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 펩티드 영역 A가 약 5∼약 9개의 연속적인 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 포함하고, X가 약 2∼약 100개 원자 길이, 또는 약 6∼약 30개 원자 길이인 연성 링커일 때, 세포로 흡수될 수 있는 펩티드 영역 B(예를 들어, 9개의 연속적인 아르기닌 잔기 서열)의 정상적인 능력이 차단된다. 링커 X의 절단으로 영역 B와 영역 C로부터 영역 A의 분리가 분리되면, 영역 A에 의한 거부성이 경감된다. 따라서, A로부터 분리된 경우, 카고 C가 세포로 흡수되도록 작용하는 영역 B의 정상적인 능력이 회복된다. 이러한 세포 흡수는 통상 절단 사건이 일어난 위치 근처에서 발생한다. 따라서, 표적 세포에서 또는 표적 세포 근방에서 절단되도록 절단형 링커 X를 설계하는 것이 표적 세포로 카고 C가 직접 흡수되는데 효과적이다. X의 세포외 절단으로 분자의 나머지 부분에서 A의 분리가 가능하고 A 이외 부분이 세포로 흡수되도록 한다.
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 임의 길이일 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 일 구체예에서, MTS 분자는 링커 X와 카고 영역 C의 길이를 포함하지 않고, 약 7∼약 40 아미노산 길이일 수 있다. 다른 구체예에서, 특히 다수의 비산성(영역 A에서) 또는 비염기성(영역 B에서) 아미노산을 영역 A 및 영역 B 중 하나 또는 둘 다에서 포함하는 경우, MTS 분자의 영역 A 및 영역 B는 함께 약 50, 또는 약 60, 또는 약 70개의 아미노산 길이일 수 있다. MTS의 환형 영역은 링커 X 및 카고 영역 C의 길이를 포함하지 않고 약 12∼약 60개의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특징을 갖는 선형 MTS 분자는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산(바람직하게는 약 9∼약 16개의 염기성 아미노산)을 갖는 염기성 영역 B, 및 약 2∼약 20개의 산성 아미노산(예컨대, 약 5∼약 20, 바람직하게 약 5∼약 9개의 산성 아미노산)을 갖는 산성 영역 A를 가질 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 약 9∼약 16개의 염기성 아미노산을 갖는 염기성 영역 B와 약 5∼약 9개의 산성 아미노산을 가질 수 있다.
건강한 세포에서, A-X-B 또는 A-X-B-C 구조의 완전한 화합물은 영역 A가 존재하기 때문에 세포로 들어갈 수 없다. 따라서, 세포로의 흡수를 방지하는 영역 A가 세포로 흡수되지 않아서 세포내 효소가 접근할 수 없기 때문에 건강한 세포내 효소에 의해 효율적으로 절단되지 않으므로, X의 절단을 위해 완전히 세포내의 프로세스로 건강한 세포에서 X를 절단하는 것은 비효율적이다. 그러나, 세포가 손상되거나 병에 걸리면, 세포내 효소가 세포 밖으로 누출되므로, A의 절단이 발생하여 영역 B 또는 영역 B-C가 세포로 진입할 수 있어서, 이웃 세포에 영역 B 또는 카고 영역 C의 표적 전달이 일어나게 된다.
영역 A와 B는 L-아미노산 또는 D-아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 면역원성 및 배경 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 비특이적 절단을 최소화하기 위하여 D-아미노산이 A 영역 및 B 영역에 바람직하다. 올리고-D-아르기닌 서열의 세포 흡수는 올리고-L-아르기닌의 흡수보다 우수하거나 양호한 것으로 알려져 있다. 제너릭 구조물 A-X-B 및 A-X-B-C는 A가 아미노 말단에 존재하는 경우 및 A가 카르복시 말단에 존재하는 경우, 즉 펩티드 결합의 양 방향성이 허용가능한 경우 효과적일 수 있다. 그러나, X가 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드인 경우, X의 절단으로 생성된 새로운 아미노 말단이 영역 B에 이미 존재하는 양전하에 부가되는 추가의 양전하를 부여하도록 X의 C 말단이 B의 N 말단과 연결된 것이 바람직하다.
카고 영역 C는 임의 위치 또는 방향성으로 B에 부착할 수 있다. 카고 영역 C는 링커 X와는 영역 B의 반대 말단에 위치할 필요가 없다. X가 절단된 후에 부착되어 남아 있는 한 B의 어떠한 위치에 C가 부착되어도 된다. 예를 들어, 도 2a 및 2b에 도시한 바와 같이 영역 B의 반대 말단에 링커 X가 부착되어 있고 영역 B의 말단 또는 말단 근처에 카고 영역 C가 부착될 수도 있다. 카고 영역 C는 또한, 영역 B의 동일 말단 또는 그 근처에 링커 X가 부착되어 있으면서 영역 B의 말단 또는 그 근처에 부착될 수도 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 도 2b에 도시한 바와 같이, 염기성 영역 B에 연결된 카고 영역 C에 링커 X가 연결될 수 있다. 도 2c에는 복수의 염기성 영역 B에 연결된 카고 영역 C를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 개략적인 구성도가 도시되어 있는데, 여기서 각각의 염기성 영역 B는 링커 영역 X에 연결되어 있으며, 이 링커를 통해서 산성 영역 A에 연결되어 있다.
링커 X는 특정 환경 또는 특정 조건의 존재하에서 절단되도록 설계할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 링커 X는 생리적 조건 하에서 절단가능하다. 이러한 링커 X의 절단은 예를 들어, 카고 전달이 요구되는 세포와 관련된 특정 환경 또는 특정 병적 신호에 의해 실시되거나 증가될 수 있다. 특정 조건, 예컨대 특정 효소에 의해 절단되도록 링커 X를 설계하는 것은 이러한 조건에 있는 특정 위치에서의 세포에 의한 흡수를 표적화할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자가 목적하는 세포, 조직 또는 영역에서의 세포내로 흡수되도록 특이적으로 표적화할 수 있게 제공되기 위한 중요한 방식 중 하나는 이러한 표적 세포, 조직 또는 영역 주변의 조건에서 링커 영역 X가 절단되도록 설계하는 것이다. 링커 X가 절단된 후, 링커 X의 나머지 영역의 잔류로 비교적 작고 불활성인 일부가 어느 정도 잔존하면서, 분자의 영역 B-C는 간단하게 접합된다.
링커 영역 X는 세포외 환경에서 발견되는 조건, 예컨대 저산소성 또는 허혈성 세포 및 조직 근방에서 발견되는 바와 같은 환원성 환경이나 암성 세포 및 조직 근방에서 발견되는 산성 조건 등; 예컨대 아폽토시스 또는 괴사 세포 및 조직 등 치료되어야 하는 병태를 갖는 세포 근방에서 방출되거나 세포의 표면에서 발견되는 기타 효소 또는 프로테아제; 또는 기타 조건 또는 인자들에 의해 절단될 수 있다. 산-불안정성 링커, 예컨대 시스-아코니트산 링커일 수 있다. 다른 pH 감응성 연결부의 예로는 아세탈, 케탈, 활성화 아미드 예컨대 2,3-디메틸말레아민산의 아미드, 비닐 에테르, 기타 활성화 에테르 및 에스테르 예컨대 에놀 또는 실릴 에테르 또는 에스테르, 이민, 이미늄, 에나민, 카르바메이트, 하이드라존 및 기타 연결부 등을 포함한다. 링커 X는 아미노산이나 펩티드일 수도 있다. 펩티드 링커는 임의의 적절한 길이, 예컨대 약 3∼약 30, 또는 바람직하게 약 6∼약 24 원자의 서열(예컨대, 약 1∼10, 또는 바람직하게 약 2∼8의 아미노산 길이의 선형 펩티드)일 수 있다. 절단형 펩티드 링커는 프로테아제의 단백질 가수분해 작용으로 링커 X를 절단하도록 프로테아제가 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
중요한 신호 클래스 중 하나는 메트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 가수분해 활성인데, 이는 전이성 종양 세포의 침습적 이동에서 매우 중요하다. MMP는 또한 염증 및 발작에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. MMP는 문헌 [Visse 등, Circ . Res. 92:827-839 (2003)]에 잘 정리되어 있다. MMP를 링커 X를 절단하는 데 사용할 수 있는데, MMP의 작용으로 C의 세포내로의 흡수가 촉발되도록 MMP로 링커 X를 절단하여서 영역 B와 C로부터 산성 영역 A를 분리하여 카고 C가 세포로 흡수되도록 한다. 이러한 흡수는 통상 X의 절단을 촉발하는 MMP의 근방에서 존재한다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 분자는 세포외 환경에 활성 MMP를 갖는 특정 세포, 조직 또는 영역에서 카고 C를 세포가 흡수하도록 지정할 수 있다.
예를 들어, 아미노산 서열 PLGLAG(서열 번호 1)를 포함하는 링커 X는 메탈로프로테아제 효소 MMP-2 (암 및 염증에서 주요 MMP)에 의해 절단될 수 있다. 이러한 링커 X의 절단은 중심 G 및 L 잔기 사이에서 발생하며, 이를 통해서 세포내로의 흡수가 10∼20배 만큼 증가하게 된다(실시예 4 참조). 다양한 MMP의 기질 선호도에 대하여 잘 알려져 있으므로, MMP의 특정 서브클래스, 또는 거대 MMP 패밀리의 프로테아제의 개별 구성원에 우선적으로 감응하도록 X를 편중시킬 수 있게 링커 X를 설계할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 세포막에 앵커된 MMP에 의해 절단되도록 설계된 링커 X가 특히 바람직한데 이들 효소 활성은 이를 발현하는 세포의 외표면에 위치하여 존재하기 때문이다. 다른 대안적인 구체예에서, 절단된 정확한 위치로부터 카고 C를 확산시켜서 카고의 공간 분포도를 증가시키고자 하는 경우에는 링커 X가 가용성 분비형 MMP로 절단되도록 설계하는 것이 바람직하다. 다른 MMP로 절단가능한 다른 링커 X는 실시예 9에 기술하였다.
저산소증은 중요한 병적 신호이다. 예를 들어, 저산소증으로 인하여 암세포가 방사선 및 화학 치료에 보다 내성을 갖게 되고, 또한 혈관형성을 개시시키는 것으로 여겨지고 있다. 저산소증을 앓고 있는 조직내 또는 조직 근방에 적합한 링커 X는 암 세포 및 암성 조직, 경색부 및 기타 저산소 영역을 영역 B와 C의 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 이황화 결합을 포함하는 링커 X는 저산소 영역에서 우선적으로 절단되어서 이러한 영역 내 세포를 카고 전달의 표적으로 하게 된다. 예컨대 누수 또는 괴사 세포 존재하에서 저산소 환경에서, 유리 티올 및 기타 환원제를 세포외에서 이용가능하게 되며, 한편 정상적으로는 세포외 환경이 산화되도록 유지시키는 O2가 정의상 고갈된다. 산화환원 균형성의 변화는 환원을 촉진시켜서 링커 X 내 이황화 결합의 절단을 촉진시키게 된다. 티올-이황화 평형성을 이용하는 이황화 결합이외에도, 히드로퀴논으로 환원될 때 분해되는 퀴논을 포함하는 연결부도 저산소 환경에서 링커 X가 절단되도록 설계하는데 이용할 수 있다.
괴사로 인하여 종종 효소 또는 다른 세포 내용물이 방출되는데 이들을 링커 X의 절단을 촉발하는데 이용할 수 있다. 저산소증이 없는 괴사 영역에서 절단되도록 설계된 링커 X는 예컨대 괴사 세포에서 방출되는 칼파인 또는 기타 프로테아제로 절단되는 것이다. 칼파인에 의한 링커 X의 절단으로 영역 A로부터 연결된 영역 B-C가 방출되어서, 병이 있는 세포 및 아직 완전하게 누수되지 않은 이웃 세포가 카고를 흡수할 수 있게 된다.
산독증은 또한 산화적 인산화로부터 무산소 해당 및 젖산 생성으로의 바르부르크(Warburg) 변화에 의하여 손상된 조직 또는 저산소성 조직의 부위에서 통상적으로 관찰된다. 이러한 국소적 산성은 산 불안정성 링커 X를 제조함으로써 (예컨대, X에 아세탈 또는 비닐 에테르 결합을 포함시킴으로써) 감지될 수 있다. 이와는 다르게, 또는 덧붙여, 산독증은 pH 7 이하에서 양이온성만 되는 B내에 있는 아르기닌의 일부를 히스티딘으로 치환하는 것에 의하여 카고 흡수의 유발 요소로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특징을 갖는 분자는 세포내 흡수를 위한 상이한 유형의 카고 및 동일한 유형의 카고의 상이한 종을 비롯한 상이한 카고를 담지하는 데 적당하다. 예컨대, 상이한 유형의 카고는 마커 카고 (예컨대, 형광성 또는 방사성 라벨 부분) 및 치료 카고 (예컨대, 메토트렉세이트 또는 독소루비신과 같은 화학요법적 분자), 또는 다른 카고를 포함할 수 있다. 변종 세포 또는 병든 세포의 감소가 치료적으로 요구될 경우, 치료 카고는 "세포독 제제," 즉, 세포의 기능을 억제 또는 방해하고 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 단일 분자는 염기성 영역 B가 다중 카고 C에 연결될 수 있도록 1 이상의 카고 영역 C를 포함할 수 있다. 이러한 다중 카고 C는 마커 카고, 치료 카고, 또는 다른 카고를 포함할 수 있다. 다중 카고 영역은 예컨대 방사성 마커 및 초음파제 또는 조영제를 둘다 전달되게 하여 상이한 영역에 의한 조영을 가능하게 한다. 이와는 다르게, 예컨대, 항암제와 더불어 방사성 카고의 전달로 증대된 항암 활성을 제공하거나 또는 방사성 카고와 형광성 카고의 전달로 카고를 흡수한 세포를 편재화하고 동정할 수 있는 다중 수단을 허용한다.
형광성 분자와 같은 카고의 전달은 특정 조건을 나타내는 영역에 있는 세포 또는 일정 조건을 갖는 세포를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 혈전증(응혈 형성)은 형광성 마커 또는 다른 마커를 비롯한 카고를 영역으로 전달하기 위한 응혈 형성 캐스케이드에서 링커 X가 임의의 다수의 프로테아제에 의하여 절단되도록 설계함으로써 시각화될 수 있다. 마찬가지로, 보체 활성은 형광성 마커 또는 다른 마커를 영역으로 전달하기 위한 보체 활성 캐스케이드에서 링커 X가 임의의 1 이상의 프로테아제에 의하여 절단되도록 설계함으로써 시각화될 수 있다. 따라서, 형광성 분자는 링커 X의 절단시 부분 A가 방출될 때 표적 세포 및 영역에 전달될 수 있는 마커의 한 예이다.
본 발명의 특징을 갖는 분자는 1 이상의 결합에 의하여 산성 영역 A가 영역 B 및 C에 결합될 수 있도록 1 이상의 링커 X를 포함할 수 있다. 영역 A에 대한 이러한 결합은 영역 B, 영역 C, 또는 영역 B 및 C 둘다에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 분자가 다중 결합 X를 포함할 경우, 분자의 다른 영역으로부터 영역 A의 분리는 모든 결합 X의 절단을 요한다. 다중 결합 X의 절단은 동시적 또는 순차적일 수 있다. 분자의 다른 영역으로부터 영역 A를 분리하는 데 분자가 하나 이상의 조건 또는 환경("세포외 신호")에 노출될 것이 요구되도록, 다중 결합 X는 상이한 특이성들을 갖는 결합 X를 포함할 수 있다. 따라서, 다중 링커 X의 절단은 세포외 신호 조합의 탐색기로서 작용한다. 도 2D는 염기성 영역 B 및 산성 영역 A를 연결하는 두 링커 영역 Xa 및 Xb를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자를 도시한다. 도 2E는 염기성 영역 B 및 산성 영역 A를 연결하는 두 링커 영역 Xa 및 Xb를 포함하는 본 발명의 특징을 갖는 고리형 MTS 분자를 도시한다. 도 2D 및 2E에 개략적으로 도시된 MTS 분자에서, 두 링커 Xa 및 Xb는 영역 B 및 카고 영역 C(존재할 경우)가 세포로 유입될 수 있도록 산성 영역 A가 염기성 영역 B로부터 분리되기 전에 절단되어야 한다. 링커 영역은 존재할 수 있는 다른 링커와 무관하게 염기성 영역 B 또는 카고 영역 C에 연결될 수 있으며 바람직할 경우 2 이상의 링커 영역 X를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
2 이상의 링커 X의 조합은 소정 세포, 조직 또는 영역으로의 분자의 전달 및 표적화를 더 조절하기 위해 사용될 수 있다. 세포외 신호의 불 조합(Boolean combination)을 검출하여 필요에 따라 링커 X의 절단 특이성을 넓히거나 좁힐 수 있다. 다중 링커 X가 평행으로 연결될 경우, 각 링커 X는 영역 A가 분자의 나머지로부터 분리될 수 있기 전에 절단되어야 하므로, 절단 특이성은 좁아진다. 다중 링커 X가 직렬로 연결될 경우, 임의의 하나의 링커 X 상에서의 절단으로 영역 A가 분자의 나머지로부터 분리될 수 있으므로, 절단 특이성은 넓어진다. 예컨대, 프로테아제 OR 저산소증을 검출하기 위하여 (즉, 저산소증 또는 프로테아제의 존재하에 X를 절단하기 위하여), 링커 X는 프로테아제 감지 및 환원 감지 부위를 일렬로 배치하여 산성 영역 A를 분리할 수 있기에 충분하도록 설계된다. 이와는 다르게, 프로테아제 및 저산소증 둘다의 존재를 검출하기 위하여 (즉, 프로테아제 및 저산소증이 둘다 존재하지만 하나만 존재하지는 않는 경우 X를 절단하기 위하여), 링커 X는 서로 이황화물 결합되는 한 쌍 이상의 시스테인 사이에 프로테아제 감지 부위가 배치되도록 설계한다. 그 경우, 영역 A를 분리할 수 있기 위해서는 프로테아제 절단 및 이황화물 환원이 요구된다.
모세혈관이 종종 종양 및 다른 외상 부위 주위에서 누수되므로 간질 분획에 도달하는 고분자량(예컨대, 약 40 kDa 이상의 분자량) 분자의 능력을 증대시켜야 한다. 링커 X의 절단은 일반적으로 세포외적이며, 일부 인접 표지화가 예상된다. 즉, 적절한 프로테아제를 발현하지 않으나 발현 세포에 직접 인접하는 세포는 일부 카고를 흡수하는 것으로 생각된다. 종양의 경우, 이러한 인접 표적화는 세포 표현형의 불균일성 및 의심되는 세포를 높은 퍼센트로 제거하고자 하는 의도 때문에 유리하다고 고려된다.
무해한 소량으로 조영하여 차후의 치료 용량을 정확하게 표적 조직에 농축시킬 수 있는지를 시험하기 때문에 하나의 메카니즘으로 조영 카고 및 치료 카고 둘다의 흡수를 매개할 수 있다는 사실은 특히 중요하다.
D 아미노산은 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자에서 사용될 수 있다. 예컨대, A 및 B 영역의 일부 또는 모든 펩티드는 본 발명의 일부 바람직한 구체예에서 D 아미노산일 수 있다. 표적 세포에 검출 마커를 전달하기에 적당한 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS는 8∼10개의 D-아르기닌을 포함하는 염기성 영역 B에 부착된 카고 C로서 조영제를 포함한다. 산성 영역 A는 D-아미노산도 포함할 수 있다. 마찬가지로, 약물은 8∼10개의 D-아르기닌을 포함하는 염기성 영역 B 및 산성 D-아미노산을 포함하는 산성 영역 A를 갖는 이러한 분자에 의하여 세포에 전달될 수 있다. 이러한 MTS 분자는 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 비표준 아미노산, 예컨대 히드록시리신, 데스모신, 이소데스모신 또는 다른 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 번역후 개질된 아미노산을 비롯한 개질된 아미노산, 예컨대 메틸화된 아미노산 (예컨대, 메틸 히스티딘, 메틸화된 형태의 리신 등), 아세틸화된 아미노산, 아미드화된 아미노산, 포르밀화된 아미노산, 히드록실화된 아미노산, 포스포릴화된 아미노산, 또는 다른 개질된 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 비아미노산 영역에 의하여 또는 비아미노산 영역에 결합된 아미노산 및 비펩티드 결합에 의하여 결합된 영역을 비롯한 펩티드 모방 영역을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 펩토이드, 카르바메이트, 비닐 중합체 또는 다른 비펩티드 결합을 갖지만 카고 영역을 갖는 염기성 영역에 절단 가능하게 결합된 산성 영역을 갖는 분자를 포함할 수 있다.
링커 영역 X는 암 세포 근처에서 발견될 수 있는 것과 같이 예컨대 단백질 분해 효소 또는 환원 환경에 의하여 절단되도록 설계될 수 있다. 이러한 환경 또는 이러한 효소는 일반적으로 정상 세포 근처에서는 발견되지 않는다. 도 4는, 절단 가능한 링커 X가 암 세포 근처에서 절단되도록 설계된, 도 3에 도시된 것과 같은 MTS 분자를 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 절단 가능한 링커는 정상 조직 근처에서 절단되지 않는다. 도 4는 영역 B 및 영역 B-C의 세포 흡수를 막아 카고가 정상 조직 안으로 유입되는 것을 차단할 수 있는 영역 A를 갖는 MTS의 능력을 나타낸다.
그러나, 도 5에 도시된 바와 같이, 링커 영역 X를 예컨대 암 세포 근처에서 발견되는 단백질 분해 효소 또는 환원 환경에 의하여 절단하여 암 세포에 마커 또는 약물을 전달할 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 암 세포 근처의 환원 환경 또는 단백질 분해 효소에 의하여 절단되는 절단 가능한 링커 X를 갖는 도 3의 MTS 분자는 병든 조직으로 카고가 유입되는 것을 촉진할 수 있다. 따라서, 링커 X의 선택적 절단 및 그 결과 산성 영역 A로부터 염기성 영역 B 및 카고 C의 분리는 특정 환경 또는 특정 환경 근처에 위치된 선택된 특징을 갖는 세포(예컨대, 효소) 내로 카고의 표적 흡수를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 분자는 카고를 정상 세포 또는 비표적 세포에 전달하는 일 없이 표적 세포에 선택적으로 전달할 수 있다.
일부 구체예에서, 카고 C는 플루오레세인과 같은 형광 분자일 수 있다. 형광 카고 부분은 비고정 배양 세포에서 형광 현미경 또는 유세포 분석에 의하여 용이한 측정을 가능하게 한다. 그러나, 구성 영역 B와 같은 올리고아르기닌 서열은 소분자로부터 나노입자 및 소낭에 이르는 매우 다양한 카고 C를 내포하는 것으로 입증되었다 (Tung & Weissleder (2003) Advanced Drug Delivery Reviews 55: 281-294). 따라서, 본 발명의 구체예에서, 카고 영역 C는 염기성 영역 B에 연결되어 세포에 의해 흡수될 수 있는 임의의 적당한 카고 부분일 수 있다.
예컨대, 생체내 조영 과정에서, C는 양자 방출 단층 촬영(PET)을 위한 양자 방출 방사성 동위체(예컨대, 18F), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)를 위한 감마선 방사성 동위체(예컨대, 99 mTc), 자기 공명 조영(MRI)을 위한 상자성 분자 및 나노입자(예컨대, Gd3 + 킬레이트 또는 코팅된 자철광 나노입자), 근적외선(근-IR) 조영을 위한 근적외선 형광발색단, 생물 발광 조영을 위한 루시퍼라제(반딧불, 박테리아 또는 강장 동물) 또는 다른 발광 분자, 또는 초음파 처리를 위한 과불화탄소로 충전된 소포로 표지될 수 있다. 예컨대 치료 목적을 적당한 부류의 카고는 a) 화학요법제, 예컨대 독소루비신, 미토마이신, 파클리탁셀, 질소 머스타드, 에토포시드, 캄토테신, 5-플루오로우라실 등; b) 방사선 감지제, 예컨대 광역학 치료를 위한 포르피린, 또는 중성자 포획 치료를 위한 10B 클러스터 또는 또는 157Gd; 또는 c) 아폽토시스, 세포 주기 또는 다른 중요한 신호 전달 캐스케이드를 조절하는 단백질 또는 펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 존재하는 화학요법 약물을 사용할 수 있으나, 이들은 그 자체로 약간의 세포 유입력 때문에 이미 선택되었으므로 이상적일 수 없다. 본 발명 분자의 구체예에서, 다중 염기성 영역 B의 도움 없이 세포로 유입되거나 세포로부터 유출되는 카고가 바람직할 수 있다.
카고 C는 방사성 부분, 예컨대 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, Lu의 방사성 동위체 등과 같은 방사성 동위체를 포함할 수 있다.
카고 영역 C는 형광성 단백질, 펩티드 또는 형광성 염료 분자와 같은 형광성 부분을 포함할 수 있다. 통상의 부류의 형광성 염료는 크산텐, 예컨대 로다민, 로돌 및 플루오레세인, 및 이들의 유도체; 비만; 쿠마린 및 이의 유도체, 예컨대 움벨리페론 및 아미노메틸 쿠마린; 방향족 아민, 예컨대 덴실; 스쿠아레이트 염료; 벤조푸란; 형광성 시아닌; 카르바졸; 디시아노메틸렌 피란, 폴리메틴, 옥사벤즈안트란, 크산텐, 피릴륨, 카르보스틸, 페릴렌, 아크리돈, 퀴나크리돈, 루브렌, 안트라센, 코로넨, 페난트레센, 피렌, 부타디엔, 스틸벤, 란탄 계열 금속 킬레이트 착물, 희토류 금속 킬레이트 착물, 및 이러한 염료의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 형광성 염료는 예컨대 미국 특허 4,452,720호, 미국 특허 5,227,487호 및 미국 특허 5,543,295호에 개시된다.
카고 영역 C는 플루오레세인 염료를 포함할 수 있다. 일반적인 플루오레세인 염료는 5-카르복시플루오레세인, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트 및 6-카르복시플루오레세인을 포함하지만 이에 한정되지 않으며 다른 플루오레세인 염료의 예는 예컨대 미국 특허 6,008,379호, 미국 특허 5,750,409호, 미국 특허 5,066,580호, 및 미국 특허 4,439,356호에서 찾아볼 수 있다. 카고 영역 C는 로다민 염료, 예컨대 테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트, 5-카르복시테트라메틸로다민, 5-카르복시 로돌 유도체, 테트라메틸 및 테트라에틸 로다민, 디페닐디메틸 및 디페닐디에틸 로다민, 디나프틸 로다민, 로다민 101 설포닐 클로라이드 (상표명 TEXAS RED®로 시판됨), 및 다른 로다민 염료를 포함할 수 있다. 다른 로다민 염료는 예컨대 미국 특허 6,080,852호, 미국 특허 6,025,505호, 미국 특허 5,936,087호, 미국 특허 5,750,409호에서 발견될 수 있다. 카고 영역 C는 시아닌 염료, 예컨대 Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy 7을 포함할 수 있다.
상기 화합물 또는 이들의 유도체의 일부는 형광 외에 인광을 생성하거나 또는 오직 인광성이다. 일부 인광성 화합물은 포르피린, 프탈로시아닌, 다중방향족 화합물, 예컨대 피렌, 안트라센 및 아세나프텐 등을 포함하며, 카고 영역 C이거나 이것에 포함될 수 있다. 카고 영역 C는 또한 형광 켄칭제, 예컨대 (4-디메틸아미노-페닐아조)벤조산(DABCYL)기이거나 또는 이것을 포함할 수 있다.
한 쌍의 화합물을 연결하여, 함께 회합된 형광발색단 및 형광성 켄처를 갖는 상보 영역을 포함하는 분자 비콘을 형성하여 형광발색단의 형광성이 켄체에 의하여 중단되도록 한다. 상보 영역 중 하나 또는 둘 모두 카고 영역 C의 일부일 수 있다. 상보 영역(예컨대, 형광 부분)의 하나만이 카고 영역 C의 일부일 경우, 그리고 켄칭제 부분이 링커 X 또는 산성 영역 A의 일부일 경우, 링커 X의 절단은 형광 영역의 형광성 및 절단의 검출을 가능하게 한다. 세포 흡수시, 분자 비콘의 형광 부분은 세포의 검출을 가능하게 한다. 예컨대, 도 2F에 도시된 바와 같이, 켄칭제 Q는 산성 영역 A에 부착되어 본 발명의 특징 Q-A-X-B-C를 갖는 MTS 분자를 형성하는데, 여기서 카고 C는 형광성이며 Q에 의하여 켄칭된다. Q에 의한 C의 켄칭은 X의 절단시 해제되어, 영역 B-C를 차지하는 세포의 형광 마킹을 허용한다. 형광성 켄칭 및 선택성 흡수의 조합은 X를 절단할 수 없는 것들에 비하여 X를 절단할 수 있는 조직 사이에서 콘트라스를 증가시켜야 한다.
카고 C는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물과 같은 화학요법 성분 또는 허혈 조직 또는 괴저 조직의 치료에 유용한 제제 또는 다른 치료 제제와 같은 다른 치료 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 예컨대 고상 펩티드 합성을 비롯한 고상 합성과 같은 표준 합성 기술에 의하여 합성할 수 있다. Fmoc를 사용하는 펩티드 합성의 예는 아래 실시예 1에 기재되어 있다. 예컨대, 펩티드 합성을 위한 종래의 고상 방법은 결정형으로 제조되거나 용액으로 새로 제조된 N-α-보호된 아미노산 무수물로 개시될 수 있으며, N-말단에서 연속적인 아미노산 첨가에 사용된다. 각 잔기 첨가에서, (고체 지지체 상에서) 성장하는 펩티드는 N-α-보호기를 제거하기 위하여 산처리되고, 잔여 산을 제거하고 반응 매질에 대한 펩티드 말단의 접근성을 촉진하기 위하여 여러번 세정된다. 이후 펩티드를 활성화된 N-보호된 아미노산 대칭 무수물과 반응시키고, 고체 지지체는 세정한다. 각 잔기 첨가 단계에서, 아미노산 첨가 반응을 2 또는 3회 별도의 첨가 반응 동안 반복하여 반응되는 성장 펩티드 분자의 백분율을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 제1의 12개 잔기 첨가에 대하여 1∼2회의 반응 사이클이, 나머지 잔기에 대하여 2∼3회의 반응 사이클이 사용된다.
성장 펩티드 사슬을 완성하기 위하여, 보호된 펩티드 잔기를 액체 불화수소산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 강산으로 처리하여 지지체로부터 펩티드를 탈블록 및 방출한다. 아미드화 펩티드의 제조를 위해서, 합성에 사용되는 수지 지지체를 선택하여 수지로부터 펩티드 절단 후 C-말단 아미드를 공급한다. 강산의 제거 후, 펩티드는 IM 아세트산 용액내로 추출하여 동결 건조시킬 수 있다. 펩티드를 겔 여과에 의한 초기 분리에 의하여 분리하여 펩티드 이량체 및 고분자량 중합체를 제거하고 의도하지 않는 염을 더 제거할 수 있다. 부분 정제된 펩티드는 분취용 HPLC 크로마토그래피에 의하여 더 정제할 수 있고, 펩티드의 순도 및 정체는 아미노산 조성 분석, 질량 분석 및 분석용 HPLC(예컨대, 두 상이한 용매 시스템에서)에 의하여 확인된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 MTS 분자를 인코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 용어 "폴리누클레오티드"는 길이가 10개 이상의 염기로 된 누클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 누클레오티드는 리보누클레오티드, 데옥시누클레오티드 또는 이들 중 어느 형태의 누클레오티드의 개질된 형태일 수 있다. 이 용어는 DNA의 일본쇄 또는 이본쇄 형태를 포함한다. 따라서, 이 용어는 예컨대, 벡터, 예컨대 발현 벡터, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA에 포함되거나 또는 다른 서열과 무관한 별개의 분자(예컨대, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다.
이들 폴리누클레오티드는 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자 또는 이의 부분을 인코딩하는 DNA, cDNA, 및 RNA 서열을 포함한다. 펩티드 영역은 소정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리누클레오티드에 의한 합성을 포함하여 재조합 수단에 의하여 생성될 수 있다. 이러한 폴리누클레오티드는 촉진유전자 및 다른 서열도 포함할 수 있으며 숙주 세포내의 (안정형 또는 전이형일 수 있는) 형질감염 벡터에 혼입될 수 있다.
발현 벡터의 구축 및 형질감염된 세포내 유전자의 발현은 업계에 널리 공지된 분자 클로닝 기술의 사용을 포함한다. 예컨대 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) 및 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., (Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc사 및 John Wiley & Sons사 공동 사업, 최근 추록)]을 참조하시오. 목적 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 서열을 갖는 형질감염 세포에 사용되는 핵산은 일반적으로 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 누클레오티드 서열에 작동 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 발현 벡터의 형태이다. 본원에 사용되는 "작동 연결된"은 개시된 성분들이 의도되는 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 병렬 배치를 의미한다. 조절 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 코딩 서열의 발현이 이루어지도록 코딩 서열에 작동 연결된 제어 서열은 결찰된다. "조절 서열"은 자신이 결찰된 코딩 및 비코딩 서열의 발현을 실현하기에 필요한 폴리누클레오티드 서열을 의미한다. 조절 서열은 일반적으로 촉진유전자, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 존재함으로써 발현에 영향을 줄 수 있는 성분을 최소로 포함하도록 의도되며 예컨대 리더 서열 및 융합 파트너 서열과 같은 그 존재가 유리한 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "폴리펩티드의 발현을 코딩하는 누클레오티드 서열"은 mRNA의 전사 및 번역시 폴리펩티드를 생성시키는 서열을 의미한다. 이것은 예컨대 인트론을 함유하는 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "발현 조절 서열"은 작동 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열이 핵산의 전사 및 적절할 경우 핵산의 번역을 제어 및 조절할 때 발현 조절 서열은 핵산 서열에 작동 연결된다. 따라서, 발현 조절 서열은 적절한 촉진유전자, 인핸서, 전사 종결유전자, 단백질 인코딩 유전자 앞의 출발 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
당업자에 널리 공지된 방법을 사용하여 형광성 인디케이터 코딩 서열을 갖는 발현 벡터 및 적절한 전사/번역 조절 신호를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. [예컨대 문헌(Maniatis, et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989)에 개시된 기술 참조]. 재조합 DNA를 이용한 숙주 세포의 형질 전환은 당업자에 널리 공지된 종래의 기술에 의하여 실시할 수 있다. 숙주가 E. coli와 같은 원핵 생물일 경우, DNA를 흡수할 수 있는 경쟁 세포는 지수적 성장 단계 후 수확된 후 업계에 널리 공지된 절차에 의하여 CaCl2로 처리한 세포로부터 제조할 수 있다. 이와는 다르게, MgCl2 또는 RbCl을 사용할 수 있다. 형질 전환은 전기 천공법에 의하여 또는 숙주 세포의 원형질체를 형성한 후 실시될 수도 있다.
숙주가 진핵 생물일 경우, 인산칼슘 공침전물로서 DNA의 이러한 형질 감염 방법, 미량 주사, 전기 영동, 리포솜에 함유된 원형질의 삽입 또는 바이러스 벡터와 같은 종래의 기계적 절차를 이러한 을 사용할 수 있다. 진핵 생물 세포는 또한 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열 및 선택적 표현형을 인코딩하는 제2 외부 DNA 분자, 예컨대 단순 포진 티미딘 키나제 유전자로 동시 형질전환될 수 있다. 또다른 방법은 진핵 생물 바이러스 벡터, 예컨대원숭이 바이러스 40(S V40) 또는 소의 파필로마 바이러스를 사용하여 진핵 생물 세포를 일시적으로 감염시키거나 형질전환시키고 단백질을 발현시키는 것이다 (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). 원핵 생물 또는 진핵 생물에서 발현되는 본 발명 폴리펩티드의 분리 및 정제 기술은 예컨대 단클론 또는 다클론 항체 또는 항원을 사용을 포함하는 분취용 크로마토그래피 분리 및 면역 분리와 같은 임의의 종래 수단에 의할 수 있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 유용한 조성물로 조제될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 약학 조성물은 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 특징 및 카고 영역 C, 예컨대 치료 부분을 갖는 MTS 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체 비히클과 혼합하여 조합할 수 있다. 인간 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민을 포함하는 적당한 비히클 및 이의 조성은 예컨대 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있는 E. W. Martin의 Remington's Pharmaceutical Sciences에 개시되어 있다. 이러한 조성물은 유효량의 화합물과 함께 효과적인 투여에 적당한 약학적으로 허용가능한 조성물을 제조하는 데 적당한 양의 비히클을 함유한다. 실험 동물에 용량 범위를 제공하여 그 반응을 봄으로써, (예컨대, 실험 동물에서) 치료 대상의 반이 치료(EDs0)에 반응하도록 하는 유효 용량을 결정하는 것을 비롯한, 용량 및 투약 계획은 업계에 공지된 방법으로 화합물 및 지시에 따라 결정할 수 있다.
실시예 1
펩티드 합성
세포 흡수를 조절할 수 있는 다수의 펩티드를 합성하였다. 이하에서는, 사용될 경우 이하의 기호를 지시된 의미로 사용한다: Fl = 플루오레세인; aca = 아미노카프로산 링커 (-HN-(CH2)5-CO-), C = L-시스테인, E = L-글루타메이트, R = L-아르기닌, D = L-아스파르테이트, K = L-리신, A = L-알라닌, r = D-아르기닌, c = D-시스테인, e = D-글루타메이트, P = L-프롤린, L = L-류신, G = 글리신, V = 발린, I = 이소류신, M = 메티오닌, F = 페닐알라닌, Y = 티로신, W = 트립토판, H = 히스티딘, Q = 글루타민, N = 아르기닌, S = 세린, 및 T = 트레오닌. 이하에 개시된 서열에서, 소문자는 아미노산의 D 이성체를 지시한다.
고상 합성 방법 빛 시판되는 Fmoc 아미노산, 수지 및 다른 시약을 사용하여 펩티드 합성기(Applied Biosystems사의 파이오니어 펩티드 합성 시스템)에서 펩티드를 합성하였다. 펩티드는 TFA/티오아니솔/트리이소프로필실란 또는 TFA/티오아니솔/트리이소프로필실란/에탄디티올로 절단하였다. 펩티드는 펩티드 상의 아미노기에서 5-(및-6)카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 또는 펩티드 상의 티올기에서 5-요오도아세트아미도플루오레세인으로 표지되었다. 미정제 펩티드를 HPLC에서 정제하고 밤새 동결 건조하였다. 각 펩티드 조성물을 질량 분석법으로 확인하였다.
실시예 2
엔테로키나제에 의한 펩티드 절단
수계 표준 원액에 용해시킨 10 ㎕의 0.38 mM 펩티드를 10 ㎕ 1 U/㎕ 엔테로키나제(Invitrogen, EKmax)에 첨가하고 440 nm에서 모니터링되는 HPLC에 5 ㎕의 반응 혼합물을 주입함으로써 절단 과정을 모니터링하였다. 펩티드는 엔테로키나제의 기재로 설계되었고, 엔테로키나제에 의한 절단은 K 및 A 잔기 사이에서 예상되었다. EDDDDKA-aca-R9-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 3) (K 및 A 사이의 링커 영역의 절단 전)의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 크로마토그램은 도 6A에 도시되어 있다. (용어 "R9"는 9개의 아르기닌의 서열을 지시한다.) HPLC 크로마토그램은 펩티드가 15분의 반응 시간 후 거의 완전히 절단되었음을 나타내었다. 도 6B는 엔테로키나제에 의한 절단 후 도 6A의 펩티드의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 새로운 피크를 모아서 질량 분석기에서 측정하였다. 측정된 질량은 (예상된 바와 같이) EDDDDKA-aca-R9-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 3)의 서열에서 K 및 A 사이의 절단에 상응하였다.
실시예 3
흡수를 막는 산성 영역을 갖는 펩티드
형광성 카고 부분이 염기성 영역(다중 아르기닌 잔기를 가짐)에 결합되고 염기성 영역은 산성 영역(다중 글루타메이트 잔기를 가짐)에 절단 가능한 링커에 의하여 연결된, 본 발명의 특징을 갖는 펩티드 분자를 합성하고 카고를 세포내로 전달하는 능력에 대하여 시험하였다. 올리고아르기닌 매개된 세포 흡수를 막는 올리고글루타메이트의 능력을 갖는 펩티드는 다음을 포함한다:
Fl-aca-CRRRRRRRRR-aca-EEEEEEEEEC-CONH2 (선형 또는 고리형, 5-47) (서열 번호: 5)
Fl-aca-CEEEE-aca-RRRRRRRRRC-CONH2 (선형 또는 고리형, 6-10) (서열 번호: 6)
절단 의존 흡수를 보이는 펩티드는 다음을 포함한다:
H2N-EEEEEDDDDKA-aca-RRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 7) (6-14, 엔테로키나제 기재, DDDDK후 절단됨)
H2N-EDDDDKA-aca-RRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 8) (6- 16, 엔테로키나제 기재)
H2N-EEEEEDDDDKARRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 9) (6-27, 엔테로키나제 기재)
H2N-EEDDDDKA-aca-rrrrrrrrr-aca-C(Fl)-CON-H2 (서열 번호: 10) (6-29, 엔테로키나제 기재)
H2N-DDDDDDKARRRRRRRRR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 11) (7-2, 엔테로키나제 기재)
H2N-EEDDDDKAR-aca-RR-aca-RR-aca-RR-aca-RR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 12) (7-4, 엔테로키나제 기재)
H2N-eeeeee-aca-PLGLAG-rrrrrrrrr-aca-c(Fl)-CONH2 (서열 번호: 13) (7-6, MMP-2 기재, PLG 및 LAG 사이에서 절단됨)
실시예 4
매트릭스 메탈로프로테이나제 -2( MMP -2)에 의해 절단된 펩티드:
MMP-2 (88 ㎕ 중 5 ㎍)를 문헌[Stricklin et al (1983) Biochemistry 22: 61 및 Marcy et al (1991) Biochemistry 30: 6476]에 개시된 바와 같이 Tris-HCl 완충액 중에서 인간 류머티스성 활액 섬유모세포 프로엔자임(Invitrogen)으로부터 활성화시킨 다음 32 ㎕ 0.5 mM 펩티드 표준 원액으로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 도 7A는 MMP-2에 의한 절단 전 기재 펩티드의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 효소 절단 과정을 215 nm 흡수에서 HPLC로 모니터링하였다. 도 7B는 MMP-2에 의한 절단 후의 펩티드의 HPLC 크로마토그램인데, 새로운 종으로의 완전한 전환을 나타낸다.
실시예 5
세포 흡수의 FACS 분석
인간 T 세포주 - 야생형 Jurkat 세포를 10% (v/v) 비활성화된 태아 소 혈청 (FBS)을 갖는 RPMI 1640 매질 중에서 배양하고 밀도가 약 1 x 106 세포/ml가 되게 하였다. 배지를 사용하기 전에 하루 재생시켰다. 실험 전, Jurkat 세포를 HBSS 완충액으로 3회 세정하고 (0.5 - 1) x 106 세포/ml 밀도에서 HBSS에 재현탁시켰다. 세포 흡수 실험에서, 세포를 실온에서 10분 동안 1 μM 펩티드 또는 화합물로 염색한 다음 저온의 HBSS로 2회 세정하고 FACS 분석하였다. FACS에서 530 nm에서의 형광성에 의하여 세포 흡수를 모니터링하고 전방 산란 및 측방 산란에 의하여 건강하다고 판단되는 세포로부터 5,000∼10,000 증례를 기록하였다. 데이터는 형광 표지된 화합물의 흡수를 나타내는 기록된 세포 군집의 평균 형광성을 나타낸다. 대부분의 실험에서, Fl-GGR10-CONH2 (그래프에서는 "R1O"으로 약칭함; 서열 번호: 49)는 흡수의 양성 대조군으로서 포함되었다.
(각각 형광성 카고 부분을 갖는) 지시된 펩티드로 10분 동안 항온처리한 Jurkat 세포 중에서 측정한 평균 형광성은 도 8, 9 및 10에 도시되어 있다.
도 9에 도시된 바와 같이, 화합물 6-14 (서열 번호: 7) 및 6-16 (서열 번호: 8)은 크게 증대된 형광성을 보여, 본래의 펩티드보다 절단형 펩티드의 흡수가 훨씬 더 큼을 시사하였다. 마찬가지로, 도 10에 도시된 바와 같이, 화합물 7-2 (서열 번호: 11) 및 7-6 (서열 번호: 13)도 절단되지 않은 화합물의 형광성에 비하여 절단 후에 형광성이 크게 증대됨을 보였다. 따라서, 이들 결과는 산성 영역으로의 결합에 의하여 염기성 아미노산을 갖는 화합물의 세포 흡수가 방해됨을 입증한다. 또한, 이들 결과는 산성 영역의 절단 후 (염기성 아미노산을 갖는) 이들 펩티드의 형광성 영역의 세포 흡수가 증대됨을 입증한다.
이러한 세포 흡수는 항온처리 시간이 증가함에 따라 증가한다. 도 11은 형광성 카고 부분, 염기성 및 산성 영역 및 절단 가능한 링커 영역을 갖는 지시된 펩티드로 10분 동안 항온처리한 Jurkat 세포에서 측정한 평균 형광성을 도시한다. 도 12에 도시된 바와 같이, 1시간 동안 항온처리된 Jurkat 세포에서 측정한 평균 형광성은 도 11에 도시된 바와 같이 측정한 형광성에 비하여 증가하였다.
카고 영역의 제어된 전달을 제공하는, 이황화물 링커 X를 갖는 MTS 분자의 능력을 하기 구조를 갖는 펩티드 7-45 (서열 번호: 14)를 사용하여 시험하였다:
Figure 112007091576740-PCT00001
여기서 두 시스테인 사이의 이황화물 결합은 산성 영역 H2N-eeeeeec-CONH2 (서열 번호: 15)과 염기성 영역 Fl-rrrrrrrrrc-CONH2 (서열 번호: 16)을 연결한다. 염기성 영역은 카고 영역, 형광성 부분 F1 (플루오레세인)을 포함한다. 도 13에 도시된 바와 같이, 온전한 7-45 펩티드 (서열 번호: 14)로 10분 동안 항온처리한 Jurkat 세포에서 측정한 평균 형광성은 Jurkat 세포만으로 측정한 배경 형광성보다 소량 높음을 나타내었다. 그러나, 펩티드를 15분 동안 25 mM의 트리스(카르복시에틸)포스핀 및 250 mM의 2-머캅토에탄설포네이트로 환원시켜 이황화물 링커 X를 절단한 다음 10분 동안 Jurkat 세포로 항온처리할 경우, 세포에 의하여 흡수되는 형광성은 R1O의 존재하에 10분 동안 항온처리한 세포의 형광성에 필적하였다. 따라서, 이황화물 링커 X를 갖는, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 세포에 카고 영역을 제어 전달할 수 있다.
실시예 6
다양한 길이를 갖는 MTS 분자
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자는 상이한 수의 염기성 아미노산, 상이한 수의 산성 아미노산 및 상이한 링커를 가질 수 있다. 본 발명의 특징을 나타내는 상이한 MTS 분자의 몇가지 예를 본 실시예에 나타내며, 여기서 형광성 카고 부분은 플루오레세인(Fl)으로 예시되고, 방사성 카고 부분은 125I로 예시되며, 치료 카고는 독소루비신(DOX)으로 예시된다.
EDA-aca-R5-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 17):
EDDDDKA-aca-R6-aca-C(DOX)-CONH2 (서열 번호: 18)
EEEDDDEEED A-aca-R9-aca-Y(125I)-CONH2 (서열 번호: 19)
ededdAAeeeDDDDKA-aca-R11-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 20)
eddedededDDDDKA-aca-R6-AGA-R6-aca-C(DOX)-CONH2 (서열 번호: 21)
Ggedgddeeeeeeddeed-aca-PLGLAG-aca-R8-AAA-R12-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 22)
eeddeeddKA-aca-R7-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 23)
eDDDDKA-aca-RGRGRRR-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 24)
eddddeeeeeee-aca-PLGLAGKA-aca-R10-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 25)
eeeeeeeeeeeeeeee-aca-DDDDKA-aca-R20-aca-C(Fl)-CONH2 (서열 번호: 26)
eeeeeeeeeddddd-aca-DDDDKA-aca-R17-aca-Y(125I)-CONH2 (서열 번호: 27)
dddddddddddddddd-aca-PLGLAG-aca-R14-aca-C(DOX)-CONH2 (서열 번호: 28)
실시예 7
카고 부분으로서 사용하기에 적당한 분자의 예
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 염기성 영역 B에 카고 부분으로서 부착하기 적당한 분자의 예는 도 14에 도시되어 있다. 도 14에 도시된 상이한 예시적 분자는 각각 괄호 안의 식별 문자로 표지되어 있다. 점으로 종결된 하나의 결합을 갖는 분자들이 도시되어 있으며, 점으로 종결되는 결합은 염기성 영역 B에 카고 분자를 부착시키는 데 사용될 수 있다. 점선 결합 근처의 꺾쇠 괄호 안의 문자는 카고 분자가 결합하는 적당한 원자를 지시하는 것으로, 예컨대 [N]은 카고 분자가 MTS 분자의 펩티드 주쇄의 알파 아미노기의 질소 또는 리신 엡실론 아미노기의 질소와 같은 질소에 결합할 수 있음을 나타낸다. [S]는 시스테인 황 원자와 같은 황 원자에의 결합을 나타낸다.
1 이상의 이들 예시적 카고 분자는 염기성 영역 B에 부착될 수 있으며, 다중 카고 분자를 포함하는 염기성 영역 B는 1 이상의 유형의 카고 분자가 부착되어 있을 수 있다. 카고 분자는 또한 더 복잡한 구조의 일부를 형성할 수 있다. 예컨대, (k)로 표지된 카고 부분에서 진하게 표시된 원은 가교결합된 아민화된 덱스트린에 의하여 감싸인 초상자성 산화철 코어를 포함하는 입자(이러한 입자는 일반적으로 약 22 nm의 반경을 가짐)를 나타낸다. 오직 하나의 현수기가 도시되어 있으나, 이 러한 입자는 여러개(일반적으로 약 4개 ∼ 약 20개)의 현수기를 가질 수 있다.
실시예 8
산성 영역 A에 포함시키기 적당한 산성 부분의 예
산성 영역 A는 도 15에 도시된 것과 같은 산성 부분을 포함할 수 있다. 이러한 부분은 펩티드 결합, 이황화물 결합 또는 다른 결합에 의하여 링커 X 및 산성 영역 A에 결합될 수 있다. 도면에서 대시선은 가능한 부착 포인트를 나타낸다. 이 도면 및 후속 도면에서, 꺾쇠 괄호 안의 부분은 반복될 수 있는 모티프를 나타내며, 문자 (예컨대, "x")는 모티프가 반복될 수 있는 회수(가능한 값의 수치에서 일반적으로 약 1 ∼ 약 100, 바람직하게는 약 1 ∼ 약 20을 취할 수 있음)를 나타낸다. 이러한 산성 부분은 임의의 적당한 방식으로 산성 영역 A에 부착될 수 있음을 이해할 것이다. 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 산성 영역 A는 부분적으로 또는 주로 또는 실질적으로 완전히 도 15에 도시된 것과 같은 산성 부분으로 구성된다.
실시예 9
링커 부분의 예
본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자에서 사용하기 적당한 링커는 생리학적 조건하에 효소로 절단할 수 있는 펩티드 또는 다른 분자일 수 있다. 예컨대, 링커는 메탈로프로테아제와 같은 효소로 절단할 수 있다. MMP-2로 절단할 수 있는 링커는 위에서 논하였다. 또한, 예컨대, MMP-9, MMP-11 및 MMP-14와 같은 다른 메탈로프로테아제로 절단할 수 있는 링커도 적당하다. 예컨대, MMP-9로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기의 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
PR(S/T)(L/I)(S/T) (서열 번호: 29)
여기서, 괄호 안의 문자는 지시된 아미노산 중 어느 하나가 서열에서 그 위치에 있을 수 있음을 나타낸다. MMP-11로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열
GGAANLVRGG (서열 번호: 30)
을 포함할 수 있고 MMP-14(MT1-MMP)로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
SGRIGFLRTA (서열 번호: 31).
우로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA)로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
SGRSA (서열 번호: 32)
리소솜 효소로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 1 이상의 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
GFLG (서열 번호: 33),
ALAL (서열 번호: 34), 및 FK.
펩티드 링커는 카텝신으로 절단할 수 있다. 예컨대, 카텝신 B로 절단할 수 있는 링커는 KK 또는 RR 서열을 포함하거나, 또는 절단이 일반적으로 리신 또는 아르기닌 사이에서 발생할 경우 둘다를 포함할 수 있다. 카텝신 D로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
PIC(Et)F-F (서열 번호: 35)
여기서, C(Et)는 S-에틸시스테인(티올에 부착된 에틸기를 갖는 시스테인)을 나타내고 "-"는 이것과 후속 서열에서 일반적인 절단 부위를 나타낸다. 카텝신 K로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
GGPRGLPG (서열 번호: 36).
전립선 특이 항원으로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
HSSKLQ- (서열 번호: 37).
단순 포진 바이러스로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
LVLA-SSSFGY (서열 번호: 38).
HIV 프로테아제로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
GVSQNY-PIVG (서열 번호: 39).
거대세포바이러스로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
GVVQA-SCRLA (서열 번호: 40)
트로빈으로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
f(Pip)R-S (서열 번호: 41)
여기서, "P"는 D-페닐알라닌을 나타내고 "Pip"는 피페리딘-2-카르복실산(피페콜린산, 6-원 고리를 갖는 프롤린 유사체)을 나타낸다.
카스파제-3으로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
DEVD- (서열 번호: 42).
효소를 전환시키는 인터류킨 1β로 절단할 수 있는 펩티드 링커는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
GWEHD-G (서열 번호: 43).
또한, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자에서 사용하기 적당한 링커는 생리학적 조건하에 프로테아제 이외의 제제로 절단할 수 있다. 링커는 또한 비펩티드 분자일 수도 있다. 링커로서 적당한 효소적 및 비효소적으로 절단 가능한 부분의 일부 예가 도 16에 도시되어 있다. 상이한 절단 가능한 링커의 예가 절단을 유도하는 조건의 지시와 더불어 도시되어 있다. 예컨대, (a)로 표지된 링커의 절단은 β-락타마제로 실시할 수 있다. (b)로 표지된 링커의 절단은 빛, 예컨대 자외선의 하나의 광자 또는 적외선의 두 광자에 노출하여 실시할 수 있다. (c)로 표지된 링커의 절단은 환원 조건하에서 일어날 수 있다. (d) 및 (e)로 표지된 링커의 절단은 산성 조건에서 일어날 수 있다. 에스테라제는 (f)로 표지된 링커를 절단할 수 있고, 포스파타제는 (g)로 표지된 링커를 절단할 수 있다.
실시예 10
염기성 영역 B에 포함시키기 적당한 염기성 부분의 예
염기성 영역 B는 도 17에 도시된 바와 같은 염기성 부분을 포함할 수 있다. 이러한 부분 B는 펩티드 결합, 이황화물 결합 또는 다른 결합에 의하여 링커 X, 카고 C, 또는 염기성 영역 B의 또다른 부분에 결합될 수 있다. 점은 가능한 부착 포인트를 나타내며, 꺾쇠 괄호 안의 문자는 이러한 부착이 일어날 수 있는 가능한 원자를 나타낸다(예컨대, [S]는 이황화물 결합과 같은 결합이 황 원자에 대하여 일어날 수 있음을 나타내고, [N]은 질소에 대해 결합이 일어날 수 있음을 나타냄). 이러한 염기성 부분은 임의의 적당한 방식으로 MTS 분자의 염기성 영역 B 또는 다른 영역에 부착될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, 도 17의 화합물 (c)에 도시된 "X"는 D-리신 잔기의 측쇄에 링커 X가 부착됨을 나타낸다. 도 17의 화합물 (c)의 아미노산 영역은 서열 번호 44이고, 도 17의 화합물 (d)의 아미노산 영역은 서열 번호 45이며, 도 17의 화합물 (e)의 아미노산 영역은 서열 번호 46이고, 도 17의 화합물 (f)의 아미노산 영역은 서열 번호 47이다. 구체예에서, 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 염기성 영역 B는 부분적으로 또는 주로 또는 실질적으로 완전히 도 17에 도시된 것들과 같은 염기성 부분으로 구성된다.
A 및 B의 몇몇 조합이 다른 것들보다 더 적당할 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, A 및 B 둘다 펩티드 또는 A 및 B 둘다 펩토이드 또는 A 및 B 둘다 카바메이트가 되도록 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자에서 A 및 B 영역 둘다에 동일한 주쇄 구조가 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 A가 B의 양전하와 대략 동일한 수의 음전하를 갖도록 한 영역의 전하 총합의 절대값이 다른 영역의 전하 총합의 절대값과 비슷하거나 동일한 것이 바람직하다.
실시예 1l
중합체 산성 영역의 예
또다른 구체예에서, 산성 영역 A는 중합체를 포함하거나 또는 중합체의 일부일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중합체의 평균 분자량은 약 50 kDa 이상이다. 이러한 고분자량은 배출을 느리게 하거나 혈류내 체류 시간을 연장시킴으로써 면역원을 감소시키고 약동학을 개선시킨다. 또한, 이러한 크기의 중합체는 모세혈관이 정상 조직보다 훨씬 새기 쉽고 림프계 배출이 종종 손상되는 종양에서의 "투과성 및 체류성 증대(EPR)"로 유리하다. 이들 특성은 중합체가 종양 조직 대 정상 조직에서 저분자량 약물보다 더 높은 농도 비율을 갖도록 한다. 중합체 담체의 이점에 대한 최근 논의에 대해서는, 문헌[Kopecek et al (2001) J. Controlled Release 74: 147-158; Luo & Prestwich (2002) Current Cancer Drug Targets 2: 209-226; Maeda et al (2003) International Immunopharmacology 3: 319- 328; 및 Torchilin & Lukyanov (2003) Drug Discovery Today 8: 259-266]을 참조하라. 정상 조직에 비하여 종양 조직에서 농도의 증대를 이끄는 이러한 EPR 효과는 종양 근처에서 발견되는 조건하에 또는 효소에 의하여 본 발명의 특징을 갖는 MTS 분자의 링커 X가 우선적으로 절단되는 것으로부터 결과하는 종양 선택성을 더 보강한다. X의 절단은 중합체 산성 영역 A로부터 염기성 영역 B 및 B에 부착된 카고 C를 방출하여 B 및 C의 세포내 흡수를 가능하게 하는 데 효과적이다. 바람직한 구체예에서, 중합체는 B 및 C의 흡수를 막기에 충분한 수의 음전하를 가지는 반면 링커 X는 온전하게 유지된다. 이러한 중합체의 예는 도 18에 도시되어 있다. 도 18의 화합물 (c)의 아미노 산 영역은 서열 번호 48이다.
실시예 12
종양 조영의 예
본원에 개시된 방법, 조성물 및 시스템은 종양 세포에 분자를 선택적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 폴리아르기닌계 세포 침투 펩티드(CPP)는 음으로 하전된 잔기로 구성된 억제 도메인에 융합될 때 세포 회합이 효과적으로 차단된다. 이 실시예에서, 일반적으로 프로테아제에 의한 다중 양이온 및 다중 음이온 도메인 사이의 링커의 절단으로 CPP 영역 및 이의 부착 카고를 방출하여 세포에 결합 및 세포로 유입시키므로, 이러한 융합은 "활성화 가능한 CPP"(ACPP)로 칭해진다. 배양된 세포와의 회합은 일반적으로 링커 절단시 10배 이상 증가시킨다. 매트릭스 메탈로프로테아제 2 및 9를 분비하는 인간 종양 세포로 이종 이식된 마우스에서, 근적외 형광성 카고를 갖는 ACPP는 스크램플 링커를 갖는 대조군 펩티드 및 대측성 정상 조직에 대하여 종양의 표준 흡수에서 2-3 및 3.1배 증가의 생체내 콘트라스트 비를 나타낸다. 새로 잘라낸 인간 비늘 세포 암종의 생체외 슬라이스는 유사하거나 더 양호한 콘트라스트 비를 보인다. CPP는 매우 다양한 비광학적 조영제 및 치료제를 수용하는 것으로 공지되어 있으므로, ACPP는 세포외 프로테아제와 같은 링커 절단 활성과 관련된 질병 진행을 조영하고 치료하는 일반적인 방안을 제공한다. 이 실시예에 인용된 문헌에는 참조 번호를 부여하며, 본 실시예 말미에 각각 번호를 붙인 문헌의 전체를 제공한다.
환자에서 분자 조영 및 치료는 병든 조직, 특히 종양에 치료제 및 조영제를 향하게 하는 일반적이고 합리적인 메카니즘 때문에 매우 이롭다 (1). 현재, 주요 방안은 표적 조직에서 우선적으로 발현되는 수용체에 대한 리간드 또는 표면 마커에 대한 항체를 기초로 한다 (2). 항체는 표적 종양에서 때때로 성공적이었으나 (3), 부피를 감소시킬 수 없어 고형 종양의 침투 및 비결합 시약의 배출을 방해하며 (4), 면역원을 최소화하기 위하여 정교한 조작을 요한다 (5, 6). 내인성 수용체를 위한 소수의 소분자 리간드(2 kDa 이하)가 주로 탐구되었으나, 확실한 종양 특이성은 드물거나 존재하지 않는다 (4). 간단한 항체 또는 리간드 결합의 중요한 제한은 증폭의 부족이며, (일반적으로 적게 존재하는) 각 표적 분자는 기껏해야 하나의 프로브에 결합할 수 있다. 일부 증폭은 프로브를 중합체 또는 나노입자에 도입함으로써 수행할 수 있으나, 부피 증가로 병든 조직으로의 접근 및 건강한 조직으로부터의 제거가 악화된다. 이들 접근 방법 중 어느 것도 신호 전달을 개선하거나 세포사를 유발하기 위한 가장 바람직한 유전자 좌를 원형질 막을 거쳐 병든 세포의 세포질 및 핵으로 끌어들이는 것을 돕지 못한다. 어떤 다중 양이온 서열[다양하게 복제된 세포 침투 펩티드(CPP), 막-전위 서열(MTS), 또는 단백질 형질 도입 도메인]은 특정 수용체를 필요로 하지 않고 포유동물 세포로 공유 결합된 하중물을 가져올 수 있다. CPP는 HIV-I로부터의 타트 단백질(tat protein) 및 안테나페디아 호메오박스 단백질(Antennapedia homeobox protein)로부터의 도메인에서 최초로 발견되었다 HIV-I (7, 8). 6∼12의 연속 아르기닌만큼 단순한 VP-22 및 구아니디늄 풍부 서열을 포함하는 다양한 다중 양이온 올리고머가 현재 동일한 효과이거나 더 효과적인 것으로 공지되어 있다 (9-11). D-아미노산은 비천연 이성체가 단백질 분해 에 견디므로 적어도 천연 L-아미노산만큼 양호하며 더 양호할 수도 있다 (10-12). 그 상세한 메카니즘 및 세포 이하의 편재화는 아직 이해가 부족하고 카고 크기, 세포 유형, CPP 서열 및 기타 실험 변수(17, 18)에 따라 달라질 수 있으나, 금속 킬레이트 및 형광성 염료(13, 14)로부터 산화철 나노입자(15) 및 리포솜(16)에 이르는 크기 범위의 카고가 개입될 수 있다. 세포 표면에 다중 양이온의 초기 부착은 강력하고 신속하며 아마도 음이온성 인지질 및 글리코스아미노글리칸에 대한 정전기적 유입에 의하여 매개된다. 생활성 카고의 시토졸 및 핵으로의 전달은 엔도솜(19, 20)의 산성화 의존 분열에 대해 공지된 서열의 포함으로 증대될 수 있으므로, 후속되는 내재화의 다수는 아마도 세포 이물 흡수에 의하여 일어난다.
본 발명자들은 도 19에 도식화된 바와 같이 CPP의 선택적 국부 유리화(selective local unleashing)에 기초한 일반 표적화 메카니즘을 입증한다. 세포의 CPP 흡수는 주로,
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2-3 kDa의 분자내 헤어핀을 형성하여 다가양이온을 중화시키는 다가음이온 서열에 절단형 링커를 이용하여 CPP를 융합시켜 차단할 수 있다. 본 발명자들은, 링커의 절단으로 억제성 다가음이온이 해리되고, 다가양이온 펩티드 및 이의 카고는 세포에 부착하여 진입하도록 방출되기 때문에, 그러한 구성체를 활성화가능한 CPP(ACPP)라고 한다. 그 메카니즘(도 19)은 종양 내 메트릭스 메탈로프로테아제(MMP)와 같이, 세포외 절단 활성에 근접하여 세포상 그리고 세포 내에서 영상화 및 치료 제제를 농축하는 유연한 모듈의 증폭 방법이다. 본 발명자들은 MMP-2 및 MMP-9를 1차 초기 표적으로 선택하였는데, 그 이유는 MMP-2 및 MMP-9가 종양이 과발현하고 그 특성이 최상으로 규명된 프레토아제이기 때문이다(21). 현 재, MMP 패밀리 중 26종 이상의 구성원이 동정되어 있다. 이들은 세포외 기질 분해, 조직 침입 및 전이에서 중요한 역할을 한다(21-26).
재료 및 방법: 펩티드 합성 및 형광발광단 표지화
플루오레닐메톡시카르보닐 고상 합성의 표준 프로토콜을 사용하여 자동 펩티드 합성기에서 펩티드를 합성하였다. 펩티드 합성, 형광발색단 표지화 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 부착(PEG화)에 관한 추가의 상세한 설명 및 추가의 정보는 실시예 13에 제시되어 있다.
MMP -2에 의해 절단된 펩티드( PLGLAG )
MMP-2 전구효소(80 ㎕의 50 mM 트리스_HCl 완충액 중 5 ㎍)를 2 시간 동안 37℃에서 2.5 mM 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트로 활성화하였다. 이후, 0.5 mM 펩티드 원액 32 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 혼합물을 항온처리하였다. HPLC에 의해 효소 절단 과정을 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램 결과 항온처리 30분 후에 거의 완전히 절단되었음을 확인하였다. 새로운 피크를 모으고, 그 질량을 질량분광법으로 측정하였다. 질량 스펙트럼 결과 상기 효소가 예상한 대로 MMP-2 기질의 글리신과 류신 잔기 사이를 절단하여, NH2-eeeeee-ahx-PLG(서열 번호 50) 및 LAG-rrrrrrrrr-ahx-c(Fl)-CONH2(서열 번호 51)[여기서 "ahx"는 아미노헥산산("아미노카프로산"이라고도 함)을 나타냄] 등의 생성물을 생성하였음을 확인하였다.
FACS 분석 및 현미경 분석
RPMI 배지 1640 + 10%(vol_vol) FBS에서 저캣 세포를 0.5∼1 X 106 세포/㎖ 의 밀도로 배양하였다. ACPP 분석 1일 전에 이 배지를 보충하였다. 세포를 행크 균형 염용액(HBSS) 완충액으로 3회 세척하고, 0.5∼1 X 106 세포/㎖로 HBSS 중에 재현탁시키고, 실온에서 10분간 HBSS 중 1 μM 펩티드로 염색하고, 차가운 HBSS로 3회 세척하고, 플루오레세인 표지된 펩티드의 경우 530 nm에서 또는 Cy5-표지된 펩티드의 경우 675 nm에서 유세포 분석법으로 분석하였다. FSC(forward scatter) 및 SSC(side scatter)에 의해 건강한 것으로 판정된 세포로부터 10,000개를 수거하였다. HT-1080 세포와의 펩티드 회합은 트립신을 이용하여 부착으로부터 방출된 후에 유세포 분석으로 유사하게 정량화하였다. 현미경 영상화를 위해서 70% 융합성(confluency)로 증식시킨 HT-1080 세포를 HBSS로 3회 세척하고, 1.25 μM 펩티드 및 1 ㎍/㎖ 훽스트 33258(핵 염색)으로 염색하고, 2회 헹구고, 트립신 처리하고, 폴리리신코팅된 접시 상에 다시 평판배양하고, Cy5 내용물(여기, 625-645 nm; 방출, 665-695 nm) 및 훽스트 33258(여기, 375-385 nm; 방출, 420-460 nm)에 대해 영상화하였다.
마우스에서의 이종이식
누드 마우스(4-6 주령)를
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106 HT-1080 세포로 피하 주사하였다. 종양의 크기가
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5∼7 mm가 되면(통상적으로 1∼2주 후), 100 ㎎/kg 케타민 및 5 ㎎/kg 미다졸람)으로 동물을 마취시키고, 체중을 재고, 꼬리 정맥으로 60 μM 펩티드
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100 ㎕를 주사하였다. 전자 결합 소자(cooled charge-coupled device) 카메라(SenSys, Photometrics, Tucson, AZ)의 니콘 f/1.2 카메라 렌즈를 사용하여 여러 시점에서 동물을 영상화하였다. 더욱 오랫동안 지속적으로 영상 연구를 실시하기 위해서, 마취 2 시간 후에 동물을 깨어나게 하고, 추가의 데이타 수집을 위해서
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4 및 6 시간에 다시 마취시켰다. 헤파린 처리된 모세관으로 주기적으로 빼낸 혈액 샘플
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5 ㎕의 형광 강도 감소로 혈장 반감기를 측정하였다. 영상화 종료 후에, 할로탄을 이용하여 동물을 죽인 후 관심 장기를 수거하여 무게를 측정하였다. 냉동 절편화를 위해서, 조직을 OCT 냉동 보존제에 첨가하고 드라이 아이스 및 헥산 상에서 냉동시켰다. 샘플을 -80℃에서 보관하고 냉동조직절편기를 사용하여 -20℃에서 5 ㎛ 절편으로 절단하였다. Cy5 형광을 상기한 바와 같이 영상화하였다. 표준화 흡수값(SUV)을 측정하기 위해서, 각 조직 30 ㎎을 완충된 1% SDS 혼합물(pH 7.6) 및 프로테아제 억제제 혼합물(Roche Diagnostics) 100 ㎕에 첨가하였다. 이어서, 조직을 균질화하고, 15분 동안 70℃로 가열하고, 15초간 초단파 처리하고, 15분간 20,000 X g에서 원심분리한 다음, 전체 마우스에 대해 사용된 동일한 시스템에서 영상화하였다. 2개의 표준 세트(간 및 신장)를 사용하여 펩티드 농도에 대해 형광 강도를 보정하였다. 이러한 보정으로부터, 각 장기에 대해 조직 30 ㎎ 중의 펩티드 양을 계산하였다. SUV는 조직 중 펩티드의 몰 농도를 mol/kg 체중의 주사된 총량으로 나누어 계산하였다.
편평 세포 암종 표본
계획한 신생물 절제술로부터의 인간 편평 세포 암종 표본은, 임상시험 심사위원회 승인을 받은 프로토콜에 따라서 수술 후에 수거하였다. 실험실로 재수송하는 과정에서 30 분 동안 얼음 냉각한 생리 식염수 중에 상기 표본을 두고, 실험실 에서 표본을
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1 mm 두께의 슬라이스로 수동 절단하고, 실온에서 15분간 1 μM 펩티드 1 ㎖에 첨가하고, 1 ㎖ HBSS 중에서 2분간 5회 헹구고, 냉동절편화하고, 상기한 바와 같이 영상화하였다.
결과
절단될 때까지, 다가음이온 서열은 CPP 와 세포의 회합을 억제한다.
CPP의 세포에의 초기 결합이 정전기적인 것일 수 있다고 가정하고, 다가음이온 서열을 부가하여 다가양이온 분자내 전환을 제공하여 세포와의 회합을 방지할 수 있는 지를 조사하였다. 형광 표지된 펩티드는, 절단형 링커에 의해 6∼9개의 연속 산성 잔기, 일반적으로 글루타메이트에 융합된 9개의 아르기닌 잔기를 이용하여 합성하였다. 완전한 펩티드 또는 미리절단한 링커를 포함하는 펩티드를 저캣 림프구 또는 HT-1080 섬유육종 세포와 함께 항온배양하고, 미결합 펩티드를 세척해낸 후에 고정되지 않은 생세포의 세포 형광도를 유세포 분석 및 형광 현미경 분석으로 평가하였다. 도 20은 HT-1080 세포 및 MMP-2에 의해 절단이능한 ACPP를 이용한 결과를 도시한다. 완전한 펩티드는 링커 절단으로 생긴 2개의 단편의 등몰 혼합물보다 18배 적은 흡수량을 나타내었으며, 이는 다가양이온만을 포함하는 대조군 CPP와 유사하였다. 유세포 분석 히스토그램 결과 건강한 세포 상 또는 세포 내의 형광도는 단일 모드이고 상당히 균일하였다(도 20A). 단세포 현미경(도 20B) 결과 카고 흡수가 링커 절단 후에 휠씬 커졌음을 확인하였으며, 이는 다가양이온 매개 형질도입에 대해 이전에 보고된 결과(17)와 유사하게, 핵인에서의 형광 축적에 의해 판단되는 바와 같이 유의적인 비율이 핵에 도달한다는 것을 나타낸다. 상이한 수의 아 르기닌 잔기, 상이한 다가음이온 서열과, 엔테로키나제, MMP-2, MMP-9 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자를 비롯한 각종 프로테아제에 의해 또는 이황화 결합의 단순 환원에 의해서도 절단 가능한 링커를 포함하는 각종 ACPP를 이용하여 유사한 세포와의 절단 의존성 회합을 관찰할 수 있었다(표 1). 최상의 경우, 다가양이온으로부터 다가음이온을 절단해낸 후에 세포 표지화가 >100배 증가하였다. 아르기닌 잔기와 산성 잔기는 모두, 생체내 단백질 절단을 2개의 도메인 사이의 중심 링커로 제한하는 것이 바람직하므로 D-아미노산일 수 있다. 다가음이온이 아니라 다가양이온 영역이 C 말단에 더욱 근접한 경우에는 콘트라스트가 더욱 높아졌다. 본 발명자들은, 이러한 선호성은 단백질분해에 의한 절단으로 형성된 새로운 아미노 말단이 다가양이온 전하를 보강하는 반면, 다가양이온이 N 말단에 있는 경우 단백질분해로 음하전 카르복실레이트가 다가양이온에 부가되기 때문이라는 가설을 세웠다. 절단 의존성 콘트라스트는, 카고로서 원적외 형광발색단 Cy5 또는 플루오레세인을 이용하여 PEG 꼬리의 존재 또는 부재 하에 동등하게 관찰가능하였다(표 1). 그러한 PEG화는 용해성을 증가시키며, 생체내 배출을 나타내지만, CPP 활성을 차단하는 데 필요한 것은 아니다.
[표 1]
유세포 분석법에 의해 분석한 저캣 및 HT-1030 세포와의 ACPP 회합에 대한 상이한 링커 및 산성 억제 도메인의 효과
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서열에 있어서, 소문자는 D 아미노산을 나타낸다. 모든 펩티드는 C 말단에서 아미드화되어 있었다. 값들은 동일한 날에 수행된 삼중 실험의 결과를 나타낸다. 일부 항목에서는 삼중 실험을 다른 날에 반복하였기 때문에 2개의 값으로 나타나있다.
* 절단 부위: U, 숙시노일; X, 6-아미노헥사노일; Fl, 플루오레세인. 절단 전후의 흡수는 FACS로 측정하고, Fl-GGRRRRRRRRRR(서열 번호 68)또는 rrrrrrrrrk(Cy5)(서열 번호 69)로 표준화하였고, 다만 일부 측정값을 기준 펩티드 에 대해 보정하지 않았다(nc). EK, 엔테로키나제; uPA, 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자.
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이 스크램블 대조군은 비절단형이어야 하며, 따라서 가장 오른쪽의 컬럼은 절단보다는 효소 노출에 의한 증가를 나타내는 것이다.
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이황화 결합됨. "ceeeeee"에서 N 말단은 D-glu이고 아미드화된 C 말단은 D-cys이다.
ACPP 는 절단 이전의 헤어핀 구조를 채택한다.
다가음이온의 다가양이온 흡수 억제는, 반대로 하전된 분절이 도 19에 도시된 바와 같이 함께 지퍼를 형성하다고 하면 가장 쉽게 이해될 것이다. 그러한 헤어핀 구조에 대한 직접적인 증거는, 동종핵 2차원 NMR 분석(방법에 대한 정보 자료 참조)으로 얻었다. 도 21은 간단한 ACPP인 숙시닐-e8-XPLGLAG-r9-Xk(이 때, X는 6-아미노헥사노일임)의 2차원 NMR에서 관찰된 핵 오버하우저 효과를 도시한다. (절단형 펩티드는 [11 kDa PEG]-X-e9-XPLG*LAG-r9이고 스크램블 펩티드는 [11 kDaPEG]-X- e9-XLALGPG-r9였다). 도 21에 도시된 핵 오버하우저 효과 상관관계 관찰 결과는 양성자-양성자 근접 효과를 반영한다. 적색 파선은 관찰된 핵 오버하우저 효과를 도시하며, 녹색선은 명확하게 하기 위해서 펩티드 윤곽을 강조한 것이다. PLGLAG(서열 번호 1) 링커 내에서 관찰된 단범위 커플링은 턴 구조를 나타낸다(더욱 상세한 설명은 실시예 13 참조). 또한, 일련의 D-아르기닌과 D-글루타메이트 간의 다수의 핵 오버하우저 효과는 명백하게 헤어핀 턴을 안정화시키는 쌍형성을 제시한다. 함 께 취해진 데이타는, 화학적 이동 중복으로 인한 완전한 원자 수준의 구조를 정의하기에는 충분하지 않지만 헤어핀 구조가 존재한다는 것을 나타낸다.
MMP -2 절단형 ACPP 는 마우스로 이종이식된 인간 종양에서 농축된다.
이어서 ACPP가 전체 마우스 내에서 프로테아제 발현 인간 종양 이종이식편을 밝혀내는지를 테스트하였다. 누드 마우스의 액와의 HT-1080 종양은 MMP-2 및 MMP-9를 모두 발현하고 다른 MMP-2 절단형 콘트라스트제를 테스트하기 위해 사용되어왔기 때문에 이들 종양을 선택하였다(22,26). PEG 꼬리를 펩티드에 부가하면 과도하게 빠른 분비를 방지하는데 도움이 되는 것으로 판명되었다; 5, 11 및 21 kDa의 PEG는 각각
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5, 15 및 38 분의 혈장 반감기를 나타내는데, 이것은 참조 문헌 27에 보고된 경향과 일치한다. 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해서 MMP-2 절단형 ACPP, MMP-2 또는 MMP-9에 대한 기질이 아닌 것으로 입증된 이성체 스크램블 형태 또는 모든 D-아미노산 형태를 주사하였다. 모든 펩티드에는 피부를 통해 적외선 형광의 생체내 영상화가 가능하도록 부착된 Cy5가 있다. 도 22A1에서는 이 종양이 MMP-2 절단형 ACPP로 주사한 살아있는 동물에서 볼 수 있는 최고의 형광도를 나타내며, 도 22B1은 스크램블 유사체를 주사한 상이한 동물로부터 얻은 종양은 콘트라스트가 휠씬 적다는 것을 보여준다. 유사한 절단 의존성 콘트라스트가 더 높은 확대배율의 냉동 절편에서 관찰되었다(도 22 A2, A3, B2, 및 B3). 결과를 정량화하기 위해서, 본 발명자들은 (종양의 형광강도 - 자가형광)/(정상 대측부 형광 - 자가형광)으로 정의되는 콘트라스트 지수를 측정하였다. 이 지수는 절단형 ACPP의 경우 2.1 ± 0.17 (평균 ± SE, n = 6)이었으며, 이 값은 스크램블 이성체(1.3 ± 0.16, n = 2) 및 모든 D-아미노산 대조군(1.5 ± 0.11, n = 4)에 대해 얻은 값보다 보통이지만 유의적으로 높은 것이었다(P < 0.02, 양측 t 검정법). 나중 값들은 투과성 및 보유성 증가 현상으로 인해 1.0 다를 수 있으며, 따라서 종양의 혈관구조는 건강한 조직의 혈관구조보다 누출성이 크기 때문에 거대분자가 수동적으로 종양내에 축적된다(28). 그럼에도 불구하고, 종양 중에 축적되는 절단형 ACPP의 양은 투과성-및-보유성 증가 효과에 의해 설명될 수 있는 것보다 유의적으로 많은데, 이것은 종양이 분비하는 효소에 의한 CPP의 국부 노출을 입증하는 것이다.
도 22A1은 살아있는 완전한 동물에서 종양이 가시화되는 것을 도시하지만, 그러한 형광 영상은 표면 조직 쪽으로, 즉 피부 > 피하 종양 > 심부 장기 쪽으로 대단히 편중되어 있다. 해부학적 깊이에 의해 편중되지 않은 펩티드의 진정한 분포를 측정하기 위해서, 상이한 장기로부터 얻은 사후 조직 샘플을 세제 중에서 균질화하여 표지된 프로브를 방출시키고, 원심분리로 정화하고, 기지량의 염료가 스파이킹된 조직 표준물에 대한 Cy5 형광도로 정량화하였다. (회수된 펩티드의 몰수/조직 샘플 중량)/(동물에게 주사된 몰수/총 체중)으로 정의된 표준화 흡수값(SUV)은, 절단형 ACPP를 이의 모든 D-아미노산 대조군과 비교하여, 마우스에게 펩티드를 주사한 지 1 시간 후에 SUV(평균 ± SD)로서 도 23에 도시되어 있다. 도 23에 도시된 데이타는 용해된 조직으로부터 얻은 형광 측정값이다. 절단형 펩티드는 [11-kDa PEG]-X-e9-XPLG*LAG-r9-Xk(Cy5)이고, 비절단형 펩티드는 [11-kDa PEG]-X-e9-Xplglag-r9-Xk(Cy5)이다. 신장 및 간은 펩티드에 대해 특징적인 최대의 절대값 SUV 를 나타내지만, 절단형 펩티드와 대조군 펩티드 간의 SUV 비율은 종양에서 더욱 높다(3:1). 또한, 감지가능한 흡수를 나타내는 조직 중에서, 유일하게 종양에서만 2 펩티드 간의 차이가 통계적 유의수준에 도달하였다(P < 0.05, 양측 t 검정법). 절단형 펩티드에 대한 표준 편차는 근육, 뇌 및 비장의 경우 < 0.05이고, 비절단형 펩티드에 대한 표준 편차는 근육, 비장, 심장 및 췌장의 경우 < 0.05이다.
ACPP 는 인간 편평 세포 암종을 밝혀낸다.
면역결핍 마우스로 이종이식된 인간 종양 세포주가 일반적인 암 모델이지만, 이들 모델은 실제 인간 종양의 여러 양상을 모방하지는 못한다. ACPP가 임상적으로 관련된 신생물에서 작용하는지 여부를 예비적으로 조사하기 위해서, 호흡소화관의 편평 세포 암종의 수술을 받고 있는 환자로부터 새로 절제한 조직에서 절단한 미처리(coarse) 절편에 ACPP를 적용하였다. 이들 수술 샘플에는 세포 형태와 조직학적 염색으로 구별가능한 신생 조직과 정상 조직이 포함되어 있다. PEG에 공유 결합된 ACPP는 확산 촉진을 위해서 5 kDa으로 감소되었으며, 정상 조직보다 더욱 밝게 종양 조직을 일정하게 염색한 반면에, N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에틸렌디아민(Zn2+ 킬레이터 및 광범위 MMP 억제제)과 동시투여한 ACPP 또는 스크래블 펩티드는 그러한 일관된 페턴을 나타내지 않았다. 도 23에서, A Upper-D Upper는 균일한 증가량에서 나타나는 Cy5 형광 영상이며, A Lower-D Lower는 동일한 장에서의 투과광이다. 절단형 펩티드에 노출된 편평 세포 암종 종양 조직(도 23A)은 절단형 펩티드에 노출된 정상 조직(도 23B) 또는 스크램블 펩티드에 노출된 조직(도 23C 및 D)보다 형광도가 휠씬 크다. 본 실시예에서 (종양 조직 형광 - 자가형광)/(정상 조직 형광 - 자가형광)으로 정의되는 콘트라스트는 거의 8이었다. 종양 조직이 악성 종양의 최대 조직학적 등급을 가질 때 콘트라스트를 최대로 하였다. 도 23A의 예에서는, 분화된 편평 상피의 특징(29)인 각질 진주의 형광도가 주변 종양보다 낮았다. 상대적으로 분화된 구강-구강인두 종양(조직학적 악성도가 낮은 내지는 중간 등급)을 가지는 2명의 환자로부터 얻은 콘트라스트는 평균 2.7 ± 0.2인 반면에, 2개의 높은 등급의 후두 종양의 콘트라스트는 6.5 ± 3.4로 더 높았다. 또한, 림프구 과립화 조직은 종양 자체와 거의 동일하게 밝았는데, 아마도 그 이유는 림프구로부터의 MMP의 방출 때문일 것이다. 종양 조직에 바로 인접한 정상 조직은 더 원거리의 정상 조직보다 현저히 밝았는데, 아마도 그 이유는 면역 세포의 존재 또는 용해성 프로테아제의 확산 때문일 것이다.
토의
본 명세서에 개시된 바와 같은 CPP의 선택적 활성화는 하기 장점을 비롯하여 여러가지 장점을 제공하는 것으로 생각된다: (i) 탑재물 또는 카고는 어떤 특별한 분광분석적 특징도 보유할 필요가 없기 때문에, 방사성을 비롯한 각종 영상화 및 치료 양식에 적용할 수 있다. CPP 매개의 흡수는 유효 치료제뿐 아니라 MRI 조영제 및 감마선 방출자로 이미 입증되었다(30). 따라서 영상화와 치료 간의 긴밀한 통합이 용이하다; 예를 들어, 비광학 카고를 보유한 ACPP를 제공하는 것은 본 발명의 방법 및 조성물의 유용한 적용예이다. (ii) 촉매적 증폭은 본원에 개시된 방법에서 고유한 것이다. 즉, 각 프로테아제 분자는 복수의 기질 분자를 절단할 수 있지만, 항체, 예를 들어 각 에피토프는 한번에 하나의 항체에만 결합할 수 있다. (iii) ACPP는 표적 세포의 표면에만이 아니라 그 내부에서 핵에 카고를 전달하는 것을 돕는데, 이것은 치료 탑재물와 다른 탑재물 및 적용예에 중요하다. (iv) 분자 질량은 매우 작은 값(
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18 aa 또는
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2 kDa, 여기서 "aa"는 아미노산(들)을 나타내고 "kDa"은 킬로달톤을 의미함)에서부터 최대 수 nm 직경의 나노입자에 이르기까지 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다(15, 16, 31). 중합체가 다가양이온 부분에 대한 다가음이온 부분에 부속되는지 여부에 따라서, 링커 절단 후에 이들의 제거 또는 유지를 선택할 수 있다. 통상적으로 과도한 분자량은, 특히 간질액 압력이 높은 경우 고형 종양으로의 침투를 감소시키는 단점을 나타낸다(29). (v) 발효 또는 다량 발현계를 요하지 않고 펩티드 합성 및 생물분자접합(bioconjugation)의 표준 방법으로 높은 모듈의 기질을 합성할 수 있으며, 합리적인 또는 조합의 광범위한 변화 범위를 포함한다. (vi) 고 함량의 D-아미노산은 면역원성을 감소시킬 것으로 예상된다. 다른 구아니디늄이 부가된 비펩티드성 골격, 예컨대 카바메이트 및 펩토이드는 세포 흡수력을 가지는 것으로 알려져 있으며(32), 상기 토의된 펩티드와 유사하게 조정할 수 있다. (vii) 미지 기능의 여러 종양 항원과 달리, 세포외 프로테아제는 암(33), 특히 혈관형성 및 전이에서 기계작용적으로 중요하다. 원칙적으로, 프로테아제를 하향조절하여 내성이 되려는 종양 세포는 공격성과 전이성이 더 적을 것이다. 또한, 복수의 암 아형은 비교적 제한된 프로테아제 레퍼토리를 상향조절하는 유사한 성질들을 공유하여, 각 성공적인 기질을 광범위한 임상 적응증에 제공할 수 있다. (viii) 세포외이거나 또는 세포외가 될 수 있는 프로테아제는 혈전증, 울혈 성 심부전, 염증, 신경변성 및 감염성 병원체를 비롯하여 여러가지 다른 질병 과정에 중요하다(34-37). 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 시스템의 사용은 프로테아제에 국한되지 않는다: 거부성(vetoing) 다가음이온을 다가양이온으로부터 절단하는 임의의 조건(예, 이황화 결합을 환원시키는 제제)를 사용하여 국재화 메카니즘으로 이용할 수 있다.
본 발명의 생체내 실시예는 MMP-2 및 MMP-9 등의 가용성 프로테아제에 대한 기질을 포함하는데, 그 이유는 주로 이들 MMP에 대해서는 암전이 및 혈관형성에서의 역할, 명백한 기질 선호성 및 시험관내 시험을 위한 상업적 공급원이 잘 확립되어 있기 때문이다. 그러나, 가용성 프로테아제는 종양으로부터 배경 신호 및 콘트라스트 감소의 원인이 되는 일반 순환계로 점차 누출되는 잠재적인 단점을 가질 수 있다. 혈액에 대해 종양에서의 상대적인 효소 활성은 알려지지 않았지만, MMP는 암환자의 혈장 및 뇨에서 전이성 질병의 경중과 정관계를 나타내는 수준으로 검출되고 있다(23). 가용성 MMP의 확산을 피하기 위해서, MT1-MMP와 같은 막 결합된 MMP에 대한 기질(24, 25)을 사용할 수 있다. ADAM(디스인테그린 및 메탈로프로테아제) 패밀리의 구성원을 비롯한 다른 막 결합된 프로테아제(38)도 가용성 MMP의 대안으로 적당하며, 이들 및 기타 프로테아제에 대한 기질도 본 명세서에 개시된 방법의 실시에 사용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 실시예에는 누출성 혈관구조를 가지는 종양 내에서, 형광도 신호증가(dequenching)(22,26) 또는 적당하게 큰 중합체의 투과성 및 보유성 증가(28)와 같은 추가의 콘트라스트 메카니즘의 통합이 포함되어 있지 않지만, 그 러한 추가의 콘트라스트 메카니즘을 이들 방법에서 또는 이들 방법과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 최대 콘트라스트 및 감수성이 필요한 경우, ACPP를 나노입자 또는 거대 중합체에 부착하여 그러한 카고의 투과성 및 보유성 향상 효과를 이용할 수 있다. 또한, 예를 들어 형광도의 경우 중합체 또는 나노입자 상에 함께 형광발색단을 밀집시키거나(22, 26, 39, 40) 또는 다가음이온 단부에 소광제(quencher)를 포함시켜, 비절단 기질의 형광 억제에 의해 콘트라스트를 향상시킬 수 있다.
실시예에서 적외선 형광을 영상화 양상으로서 이용하여 적어도 다음 장점을 제공한다: 시아닌 염료는 안정하고 접합시키기가 용이하며, 영상화 장비는 비교적 사용이 간단하고 저렴하며, 공간적 절단능은 세포 이하에서부터 전체 동물에 이르기까지 전범위에 걸쳐있다. 마우스에서, 특히 x선 단층촬영 기법을 보조로 사용할 때의 형광 영상화는 완전한 동물의 유의적인 부분에 이를 수 있다(40). 더욱 큰 동물과 환자에서, 수 밀리미터 깊이의 침투는 형광의 유용성을 (i) 가장 표피의 피부 종양, (ii) 망막, (iii) 내시경 검사로 접근할 수 있는 체강 표면 근처의 종양(41), 및 (iv) 외과적 절제 경계부로 제한할 수 있다. 본 발명의 방법의 예시적인 용례는 환자가 수술대에 있는 동안 절제 경계부의 실시간 분자 영상화이다. 그러한 사용은 외과의가 제거된 조직 또는 그 바로 외부에 임의의 침입성 암종 조직이 잠복되어 있는지를 결정하는 데 매우 중요하다. 적외선 영상 안내 외과수술용 기기 사용법은 개시된 바 있으며(42) 그러한 방법에 유용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물을 포함하는 조영제는 국소 적용, 정맥내 주입 또는 다른 수단에 의해 표적 조직으로 제공될 수 있다.
다가음이온 펩티드 도메인이 밀접하게 나란히 위치하는 다가양이온 CPP의 결합 및 진입을 억제하는 능력은, 수용체 발색단이 인접 공여 형광발색단의 형광을 소광하는 분자내 형광 공명 에너지 전달을 기능적으로 암시한다. 각 경우에, 링커가 절단되고 억제성 부분이 방산되면, 활성 파트너(CPP 또는 공여 형광발색단)이 노출된다. CPP의 노출은 완전히 다른 기초 메카니즘과 분자내 형광 공명 에너지 전달보다 더욱 느린 시간 규모를 가지지만, 형광 공명 에너지 전달에서보다 휠씬 넓은 범위의 유용한 영상화 양상 및 카고를 제공한다.
실시예 12에 대한 참고 문헌
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실시예 13
세포 침투 펩티드의 단백질분해 활성화를 통한 종양 영상화와 관련된 추가의 예시적 재료
시약:
Fmoc 보호된 아미노산 및 합성 수지는 EMD Chemicals Inc로부터 구입하였다. 디메틸포름아미드(DMF), 피페리딘, 및 2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)는 Applied Biosystems로부터 입수하였다. 트리플루오로아세트산(TFA), 티오아니솔, 트리이소프로필실란, 에탄디티올 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)은 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. 5(6)-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 및 5-요오도아세트아미도플루오레세인은 Molecular Probes로부터 입수하였다. Cy5 단일반응성 NHS 에스테르 및 Cy5 모노말레이미드는 Amersham Biosciences로부터 입수하였다. MMP-2 전구효소 및 MMP-9는 EMD로부터 입수하였다. 엔테로키나제 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자(uPA)는 각각 Invitrogen 및 Alexis로부터 입수하였다. 메톡시 PEG-말레이미드(5 KDa, 21 KDa)는 Nektar로부터 구입하였고, 메톡시 PEG말레이미드(11 KDa)는 한국의 SunBio PEG-SHOP이 공급하였다. 모든 시약은 추가의 정제 없이 입수한 대로 사용하였다.
펩티드 합성 및 형광발색단 표지화
Fmoc 고상 합성에 대한 표준 프로토콜을 이용하여 자동 펩티드 합성기(Applied Biosystems의 Pioneer Peptide Synthesis System)에서 펩티드를 합성하였다. 펩티드를 합성한 후에, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 메탄올로 각 3회 수지를 세척하고 3 시간 동안 진공 건조하였다. 설프히드릴기를 포함하지 않는 펩티드의 경우에는 CF3COOH/티오아니솔/트리이소프로필실란(96/2/2, v/v) 또는 설프히드릴기를 포함하는 펩티드의 경우에는 CF3COOH/티오아니솔/트리이소프로필실란/에탄디티올(94/2/2/2, v/v)을 사용하여 밤새 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 절단액을 증발시켜 거의 건조시키고, 미정제 펩티드를 에테르로 분쇄한 다음 3 시간 동안 진공 건조하였다. 수지로부터 절단 전 또는 후에 형광발색단을 펩티드에 부착시켰다; 5(6)-카르복시플루오레세인 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 Cy5 단일반응성 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 표지된 아미노기, 반면 설프히드릴기와 반응한 5-요오도아세트아미도플루오레세인 및 Cy5 모노말레이미드. 마지막으로, 형광발색단 표지된 펩티드를 HPLC(0.1% CF3COOH와 수중 10∼40% 아세토니트릴로 용출시킨 C18 역상 컬럼)에서 정제하고 밤새 동결건조하였다. 모든 펩티드의 분자량은 질 량분광기로 확인하였고, 각 펩티드 원액의 농도는 UVvis 흡광도로 입증하였다.
펩티드 이황화 결합 형성 및 환원
시스테인 잔기를 가지는 펩티드를 표준 절차에 따라 수지로부터 절단하였다. 환형 이황화물을 형성하기 위해서 진공 건조된 미정제 펩티드를 5 mM NH4HCO3 중에 1 ㎎/㎖로 희석하고, 3 시간 동안 공기 중에서 격렬히 교반하였다. 미정제 환형 펩티드를 HPLC(0.1% TFA와 수중 10-40% 아세토니트릴로 용출시킨 C18 역상 컬럼)에서 정제하고 밤새 동결건조하였다. 전술한 바와 같이, 각 펩티드의 분자량을 질량분광법으로 확인하였고, 원액 농도는 UVvis 흡광도로 입증하였다. 선형 펩티드를 얻기 위해서, PBS 중 100 μM 환형 펩티드, 10 mM TCEP[트리스(2-카르복시에틸)포스핀], 및 100 mM MES[2-머캅토에탄설폰산, 나트륨염]의 동일 부피를 혼합하고 실온에서 30분간 항온처리하여 이황화 결합을 환원시켰다. HPLC 및 질량분광기로 환원을 확인하였다. 세포 흡수 분석 과정에서 배지 중 TCEP 및 MES의 최종 농도는 각각 0.5 및 5 mM였다.
PEG 화 펩티드 합성 및 Cy5 표지화
N 말단에 유리 티올기를 가지는 펩티드는, 수지에 커플링된 최종 아미노산이 트리틸머캅토아세트산이라는 것 외에는 표준 Fmoc 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성하였다. 전술한 표준 절차에 따라 펩티드를 수지로부터 절단하고, DMF 중 0.5∼0.8 당량의 메톡시 PEG 말레이미드 및 염기로서의 100배 과량의 4-메톡시모르폴린과 실온에서 12 시간에 걸쳐 반응시켰다. 용매 및 과량의 염기를 진공 하에 증발시켰다. 퍼길화 펩티드는, 실온에서 밤새 50 mM 중탄산나트륨 용액 중 2∼3 당량의 Cy5 모노 NHS 에스테르와 반응시켜 Cy5로 표지하였다. 미정제 생성물을 HPLC에서 정제한 다음 동결건조하였다.
엔테로키나제에 의한 ACPP 절단
물에 용해된 0.38 mM 펩티드 원액 10 ㎕를 10 ㎕ 1 U/㎕ 엔테로키나제(Invitrogen)와 혼합하고 37℃에서 항온처리하였다. 반응 혼합물 5 ㎕를 HPLC에 주입하고 플루오레세인 표지 펩티드의 경우 440 nm에서 또는 Cy5 표지 펩티드의 경우 650 nm에서 UVvis 흡광도를 관찰하여 효소 절단을 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램 결과 엔테로키나제에 의한 절단은 항온처리 15분 후에 거의 완료됨을 확인하였다. 새로운 피크를 모으고 그 실체를 질량 분광법으로 결정하였다. 질량 분광분석 결과, 효소가 예상한 바와 같이 엔테로키나제 기질의 리신과 알라닌 잔기 사이를 절단함을 확인하였다.
유로키나제 플라스미노겐 활성화인자(uPA)에 의해 절단된 ACPP
400 ㎕ PBS(인산염 완충 염수, pH 7.4) 중 100 μM 펩티드를 6 ㎍ uPA와 함께 3 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 절단 진행은 HPLC로 모니터링하였다. HPLC 분획에 대한 질량 분광분석 결과, 3 시간 후에 절단이 거의 완료되었으며 효소 절단 부위는 예측한 바와 같이 펩티드 내 아르기닌과 세린 잔기 사이였음을 확인하였다(1)(MS: 2688.6 실측치, 2688.2 계산치).
2차원 NMR 에 의한 구조 분석
자연적인 전체의 구조적 특성을 평가하기 위해서 동종핵 2차원 NMR 스펙트럼을 사용하여 펩티드를 연구하였다. 90% H2O, 50 mM 인산칼륨을 함유하는 10% D2O 완충액, pH 6.5에서 NMR 샘플을 준비하였다. 펩티드 농도는 2.69 mM이었고, 5℃에서 스펙트럼을 기록하였다. Bruker DMX 500 MHz 분광계 및 Varian UnityPlus 800 MHz 분광계를 이용하여 NMR 스펙트럼을 수집하였다. DQF-COSY, TOCSY, 및 NOESY 스펙트럼은 표준 펄스열(standard pulse sequences)을 사용하여 수집하였다((2) 및 그 내부의 참조 문헌 참고). 모든 스펙트럼은 물분자 억제에 대한 구배를 가지는 3-9-19 펄스열을 사용하여 수집하였다(3). NOE 혼합 시간은 500 ms였고 TOCSY 혼합 시간은 60 ms였다.
Felix(Molecular Simulations Inc., San Diego, CA)를 사용하여 분광 처리를 실시하였다. t2 및 t1 디멘젼의 아포디제이션(apodization)은 코사인 제곱 윈도우 함수를 이용한 것이고, 사인 벨 함수와 시간 영역 회선법(time domain convolution method)(4)을 이용하여 스펙트럼으로부터 용매 스펙트럼을 절단하였다.
예상한 바와 같이, D-glu 및 D-arg 잔기열에 의해 도입되는 화학적 이동 축퇴 및 스펙트럼 중복이 존재한다(DQF-COSY 데이타는 존재하지 않음). 유형별 D-glu 및 D-arg 잔기의 공명을 분명히하고, 링커 영역, 즉 XPLGLAG(서열 번호 70)의 공명을 서열 특이적으로 할당한다. 도 24 및 25에서, β-턴에 대해 예상되는 순차적인 중간 범위 NOE 및 교차가닥(cross-strand) 상호작용에 대한 장범위 NOES와 비교하여 관찰된 NOE의 일관성을 평가한다.
도 24A는 NOESY 스펙트럼의 Hβ/Hγ/측쇄(δ1)-HN(δ2) 영역을 도시하고, 도 24B는 TOCSY 스펙트럼에 대한 동일 영역을 도시한다. D-glu 및 D-arg 공명의 Hβ 및 Hγ 이동을 TOCSY에서 표지화한다. Hβ 및 Hγ 공명 중에서 유의적인 화학적 이동 중복이 존재하지만, 아미노산 유형별 공명은 분리된다. 도 24A 및 24B 모두에서, D-arg에 대해 각각 1.7/1.78 및 1.55/1.66에서의 Hβ 및 Hγ 이동 및 D-glu에 대해 각각 1.95/2.03 및 2.25/2.3에서의 Hβ 및 Hγ 이동 클러스터가 존재한다. NOESY 스펙트럼(도 24A)에서, D-arg 열 및 D-glu 잔기의 열 사이의 교차가닥 상호작용의 증거를 확인하였다. 1.92, 2.03, 2.25, 및 2.29(δ1) 및 8.65(δ2)에서의 NOE 크로스 피크는 하나 이상의 D-glu의 Hβ 및 Hγ 측쇄와 하나 이상의 D-arg 중 HN 골격 사이의 전체 공간 상호작용과 일치한다.
명확히 하기 위해서, 선택된 D-arg 및 D-glu 골격 HN 공명(δ2)으로부터 작성된 1D 벡터(도 24A 및 24B의 청색 파선 참조)를 도 24C-24E에 도시한다. 도 24C는 D-arg의 HN 공명인 8.65 ppm(δ2)에서의 NOESY 스펙트럼으로 작성된 것으로서, D-glu 및 D-arg의 Hβ 및 Hγ 신호를 가진다. 도 24D는 동일한 δ2 이동 및 HN 공명에서의 TOCSY 스펙트럼으로부터 작성된 것으로서, D-arg의 Hβ 및 Hγ 신호만을 가진다. 도 24D는 D-glu의 HN 공명인 8.59 ppm(δ2)을 제외한 TOCSY 스펙트럼으로 작성된 것으로서, D-glu의 Hβ 및 Hγ 신호만을 가진다.
도 25는 NOESY 스펙트럼의 HN(δ1)-HN(δ2) 영역을 도시한다. 서열 특이적 확인자로 표지된 5개의 크로스 피크가 존재하는데, 이것은 링커 영역의 잔기와 어느 한쪽에 이웃하는 D-glu 및 D-ala 간의 순차 HN-HN 골격 상호작용을 나타내는 것이다. 이러한 유형의 단범위 NOE는 턴 또는 나선형 2차 구조와 일치한다(5).
퓨린( furin )과의 유효 상호작용
지금까지는, 부분적으로는 간략화를 위해서 그리고 부분적으로는 가장 효과적인 흡수 서열이기 때문에 일반적으로 D형인 연속 9개의 아르기닌만을 거의 독점적으로 신뢰하여 왔다. 그러나, 아주 최근에 노나-D-아르기닌 아미드가, 잘 알려진 프로세싱 프로테아제인 퓨린의 유효 억제제인 것으로 보고되었다(8). 결합이 고도의 정전기적 특성을 가진다면, 부착되어 있는 다가음이온 도메인을 가지는 완전한 기질은 휠씬 불량한 퓨린 억제제일 것 같다. 이러한 예측이 실험적으로 입증된다면, 퓨린 억제는 중요하지 않거나 이로울 수 있는데, 그 이유는 주로 종양과 같은 표적 조직에서 퓨린이 단시간에 억제되기 때문이다.
MMP 억제제의 투여 후에 ACPP 를 이용한 SCCA 샘플의 영상화
MMP가 활성화를 위해 아연에 의존하기 때문에, 지용성의 고친화도 Zn2 + 킬레이터 TPEN (N,N,N',N'-테트라키스-(2-피리딜메틸)에틸렌디아민)(9)을 광범위 MMP 억제제로서 사용하여 SCCA 종양에서 펩티드의 절단 및 유지가 MMP 의존성인지 여부를 예비 평가하였다. 새로운 SCCA 슬라이스를 HBSS(도 26A) 또는 HBSS 중 1 μM TPEN(도 26B)에서 15분간 실온에서 항온처리하였다. 그 다음 슬라이스를 1 μM 절단형 펩티드 단독(도 26A) 또는 1 μM 절단형 펩티드 + 1 μM TPEN(도 26B)으로 염색한 후, 새로운 HBSS에서 5회 세척하고 냉동절편화하였다. 10x 대물 렌즈를 사용하여 도 26A 및 26B에 도시된 영상을 얻었으며, 헤마톡실린/에오신 염색을 이용하여 조직형을 입증하였다.
실시예 13에 대한 참조 문헌 목록
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실시예 14
H2N-e6-XPLGLAG-r9-Xc(Cy5)-CONH2(여기서, X ≡ 아미노헥산산임)의 MMP-2 절단에 대한 절단 동력학은 도 27에 도시되어 있다. 이 도면에 도시된 바와 같이, 절단에 대한 Km은 534 μM이고; kcat는 15.0 s-1이며, kcat/Km 비율은 28,037 M-1s-1이다.
실시예 15
MMP-2 기질 ACPP의 절단은 도 27에 예시되어 있다. ACPP 펩티드 H2N-e6- XPLGLAG-r9-Xc(Cy5)-CONH2(서열 번호 71)(여기서, X≡아미노카프로산이라고도 하는 아미노헥산산임)의 절단 동력학은 Km 534 μM, kcat 15.0 s-l 및 kcat/Km 28,037 M-ls-l이다. 도 28에 도시된 바와 같이, 비고정된 생세포로의 흡수는 MMP-2에 의한 ACPP 펩티드의 효소 절단에 따라 달라진다. 절단 부위는 도면에 도시된 바와 같이 서열 PLGLAG의 제1 G와 제2 L 사이이다. ACPP 펩티드는 Cy5 염료(서열 번호 71), 플루오레세인(Fluor)(예, H2N-eeeeee-(ahx)-PLG LAG-rrrrrrrrr-(ahx)-c(Fluor)-CONH2(서열 번호 72) 또는 기타 표지로 표지할 수 있다. 도 29는 11 kDa PEG 부분으로 PEG화된 Cy5-표지된 ACPP 펩티드 XeeeeeeeeeXPLGLAGrrrrrrrrXk(서열 번호 52)로 처리한 HT-1080 세포의 형광 영상을 도시한다. 도 29에 도시된 영상은 비절단 펩티드와 비교하여 절단 펩티드의 흡수 증가를 입증하며, 절단된 펩티드가 세포질 구획뿐 아니라 이들 세포의 핵으로 국재화된다는 것도 보여준다.
실시예 16
MMP-2 양성 종양을 보유하는 누드 마우스로부터 취한 영상은, 절단 결과 종양 조직 중 ACPP 펩티드 단편의 흡수 및 국재화가 유도된다는 것을 보여준다(도 30). MMP-2 절단 부위가 결여된 대조군 "스크램블" 펩티드(eeeeeeeeeXLALGPG-rrrrrrrrrXk(Cy5)(서열 번호 73)는 종양 조직 중에 농축되지 않는 반면, MMP-2 절단 부위를 포함하는 절단형 펩티드 유래의 형광도는 다른 조직에서보다 종양 조직에서 휠씬 높았고 대조군 펩티드를 수용한 마우스의 종양 조직에서보다 높았다. 꼬 리 정맥으로 Cy5 표지된 펩티드를 주사한 지 17분 후에 영상을 얻었다. 방광 및 타액선도 형광을 나타내었고, 소화관 또한 약간의 자가형광을 나타낸다는 점에 주목한다. 도 31에 도시된 바와 같이, 최대 Cy5 형광 강도가 절단형 펩티드로 처리된 종양 조직에서 발견되었다. 도 32에 도시된 영상은 비절단 펩티드와 비교하여 절단 펩티드에 의해 콘트라스트가 증가됨을 보여준다. 마우스로 이종이식된 인간 HT-1080 종양은 비절단 펩티드를 이용했을 때보다 절단 펩티드를 이용하였을 때 간 및 조직학적 영상에서 더욱 용이하게 식별가능하다. 절단 펩티드가 MMTV-폴리오마 미들 T, iNOS -/- 마우스의 자발성 유방 종양의 영상을 개선한다는 것을 보여주는 유사한 영상이 도 33에 도시되어 있다. 종양이 있는 마우스에게 꼬리 정맥 주사한지 55분 후에 얻은 영상은 종양에 대한 유의적인 강도를 보여준다. 유사한 종양 조직 구조는 종양 중심부보다 기질 체환에서의 축적을 제안한다. 겔 영상으로부터 그러한 종양이 절단 펩티드를 포함한다는 것이 확인된다. 이 도면은 비절단 및 비절단형(모든 D-아미노산 형태) 펩티드가 종양 내로 유의적으로 흡수되지 않는다는 것을 제시한다. 도 34에서 도시된 바와 같이, RGD를 포함하는 PEG화된 절단형 펩티드는 MMTV-폴리오마 미들 T, iNOS -/- 마우스의 림프절에서 종양 전이를 표지하고, 주변 마크로파지를 표지한다.
실시예 17
도 35는 대조군으로서 인접한 정상 혀 조직을 포함하는 환자로부터 절제한 인간 편평 세포 암종 조직을 도시한다. 절단형 펩티드로 처리한 종양 조직으로부터 얻은 영상은 "스크램블" 비절단형 펩티드로 처리한 유사한 종양 조직으로부터 얻은 영상보다 휠씬 선명하고, 절단형 펩티드로 처리한 정상 혀 조직으로부터 얻은 영상보다 휠씬 선명하다. 종양 조직은 정상 혀 조직보다 휠씬 많은 젤라티나제를 포함한다. 도 36의 유사한 영상은 종양 조직의 영상화를 위한 절단형 펩티드의 유용성을 추가로 입증한다. 새로운 종양 조직을 1 mm 슬라이스로 잘라내고, 절단형 또는 비절단형 펩티드에서 15분간 항원처리하고, 세척하고, 냉동하였다. 저배율 대물렌즈를 사용한 형광 현미경분석을 위해 절편을 얻고, 조직을 염색하여 조직형을 입증하였다. 좌측 사진의 화살표는 분화된 각질 진주를 나타낸다. 대조군으로서, 동일한 환자로부터 얻은 조직학적으로 정상인 조직을 MMP-2 절단형 펩티드 또는 스크램블 펩티드로 유사하게 처리하였다. 좌측으로부터 세번째 도면의 화살표는 종양 세포를 나타낸다.
실시예 18
파지는 ACPP 펩티드에 의해 세포로 수송될 수 있다. ACPP로 사상 M13 파지를 코팅하는 방법이 제시된 도 37 및 추가의 방법을 제시하며 종양 조직에서 코팅된 파지의 흡수 증가를 보여주는 도 38에 도시된 바와 같이, 절단형 펩티드 또는 불활성화 부분의 절단시 세포로 직접 전달을 위해 절단형 펩티드로 파지 입자를 코팅할 수 있다. 파지당 ACPP 약 30-50 카피를 도입할 수 있으며, 제시된 예에 나타낸 바와 같이 ACPP를 pIII 코트 단백질 또는 다른 부착 부분에 부착시킬 수 있다. 절단형 펩티드는, 예를 들어 PLGLAG를 포함할 수 있지만, 비절단형 펩티드는 스크램블 펩티드 LALGPG를 포함할 수 있다. 차폐된 M13 파지는 절단 이전의 ACPP 입자를 포함하는 것이다. 효소 활성화시, 양으로 하전된 외부를 가지는 파지가 활성화되어 종양 세포 결합 파지가 된다. 코팅 및 활성화용의 M13 파지가 도 37에 도시되어 있으며, 그러한 활성화가능한 파지는 도 38의 종양에 의해 흡수되는 것으로 확인된다. 도 38에 도시된 바와 같이 이종이식된 종양에서의 서열 의존성 파지 축적이 입증되었다. 이종이식된 종양을 보유하는 마우스의 꼬리 정맥으로 파지를 주사하였다; 3 시간 후에, 장기 및 종양 이종이식편을 마우스로부터 분리하여 분쇄하였다. 분쇄 조직을 박테리아에 첨가하였다. 그 다음 얻어지는 파지 역가를 계산하기 위해서 박테리아를 평판배양하였다. 종양은 절단형 펩티드를 보유하는 파지를 비절단형 펩티드를 보유하는 파지보다 휠씬 더 용이하게 흡수하였다. 또한, 간 및 신장의 배경 표지화는 염료 카고를 이용한 경우보다 파지를 이용한 경우 덜 심한 것 같다. 하전된 아미노산이 D-아미노산이어야 하는 것은 아니다. 따라서, 선택적 흡수 기전이 입증되고, 파지처럼 큰 카고에 대해 작용할 수 있는데, 이는 거대한 파지 라이브러리를 구축하여 최적의 종양 특이적 서열을 찾을 수 있다는 것을 입증하는 것이다. T7 파지, λ 파지, P4 파지, T4 파지, MS2 파지 등의 다른 파지도 사용될 수 있다. 예를 들어, T7 파지 타입 10-3b, T7 파지 타입 415-1b와 Pcomb 타입 M13 파지를 사용하여 파지 및 기타 카고를 표적 세포 및 조직에 전달하기 위한 활성화가능한 코팅된 파지를 제공할 수 있다.
실시예 19
ACPP를 사용하여 방사성 카고를 표적 세포 및 조직으로 전달할 수 있다. ACPP를 방사성 부분과 (직접적으로 또는 간접적으로, 공유 결합에 의해 또는 비공 유 결합에 의해) 연결할 수 있다. 도 39는 탑재물로서 99 mTc 킬레이터를 이용한 MMP 기질의 생산 방법을 제공한다. 도 39에 예시된 바와 같이, 세포 흡수 분석에 사용하기 위해 방사성 테크네튬 원자와 PEG화 MMP 기질 펩티드 mPEG(11 kd)-S-CH2-CONH-ahx-e9-ahx-PLGLAG-r9-ahx-k-CONH2(서열 번호 74)를 연결할 수 있다. 그러한 ACPP를 제조하고 저캣 세포를 이용하여 카고-전달 효과에 대해 테스트하였다. 도 40에 요약된 실험에서, 메트릭스 메탈로프로테아제 MMP-9에 의해 절단시킨 후에 또는 완전한 상태로 2 μM 펩티드를 항원처리하였다. 0.25 mCi Tc 표지로 스파이킹된, 25 mM의 완전한 또는 절단된 기질. 표적 저캣 세포를 37℃에서 30분 동안 펩티드와 항원처리한 후, HBSS(HEPES-완충 식염수)로 실온(RT)에서 3회 세척하였다. 20 시간 후에, 감마 계수기로 세포를 계수하였다. 도 40에 도시된 바와 같이, 절단 전 저캣 세포와 관련된 방사성은 거의 없었지만, 카고 전달을 활성화하기 위한 ACPP 절단 후 표적 세포와 관련된 방사성은 38배 증가하였다.
테크네튬 킬레이트화 부분을 가지는 방사성 카고의 표적 세포로의 전달을 입증하는 추가의 실험은 도 41에 도시되어 있다. 60 μCi 99 mTc-표지된 펩티드를 스파이킹하고(4%), 표적 저캣 세포에 37℃에서 30분 동안 2 μM의 완전한 펩티드 또는 MMP-9 절단된 펩티드를 부가하였다. 이어서, RT HBSS로 세포를 3회 세척하고, 20시간 후에 (감마 계수기로) 계수하였다. 도 41에 예시된 실험에서, ACPP의 절단 결과 표적 세포와 관련된 방사성이 57배 증가하였다. 이들 연구에 사용된 테크네튬 킬레 이트 부분은 도면에 도시되어 있다. 이들 실험은 특히 99mTc가 표적 세포 중에 선택적으로 축적될 수 있음을 입증한다.
실시예 20
ACPP를 사용하여 영상화를 위한 콘트라스트를 증가시키는 물질과 같은 콘트라스트 물질을 표적 조직 및 세포에 전달할 수 있다. ACPP를 콘트라스트 증강제와 직접 또는 간접적으로, 공유결합 또는 비공유결합으로 연결할 수 있다. 그러한 영상은 자기 공명(MRI), x-선(예, 컴퓨터 단층촬영(CAT), 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 중성자 컴퓨터 단층촬영(NCT), 초음파, 근적외선(NIR) 영상화, 또는 다른 영상화 장치 및 방법과, 표적 조직 및 세포의 치료, 연구 및 동정용 또는 기타 목적의 방사선 감작제(10B, 157Gd) 및 화학요법제(예, 독소루비신)로 영상화할 수 있다. 예를 들어, 이들 방법은 다른 콘트라스트 메카니즘, 예컨대 EPR(투과성 및 보유성 증가), 세포내 효소에 의한 보유, 형광 신호증가, 회전 고정화와 연속하여 실시가능하다. 157Gd은 MRI 및 NCT 복합형에 특히 바람직하다. 도 42는 결합된 콘트라스트 증강제(본 예에서는 가돌리늄)를 포함하는 MMP 기질의 제조 방법을 제공한다.
가돌리늄 클로라이드(GdCl3)를 사용하여 가돌리늄(Gd)을 첨가하여 콘트라스트를 증가시키는 PEG화된 ACPP mPEG-S-CH2CONH-e9-ahx-PLGLAG-r9-K[DOTA(Gd)]-CONH2(서열 번호 75)를 제공한다. 다른 구체예에서 ACPP는 PEG 부분을 포함해야 하 는 것은 아니며, 다른 부분을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 도 43에 도시된 바와 같이, ACPP의 절단으로 MRI 영상화 시약의 흡수가 거의 mM 농도로 활성화된다. 저캣 세포를 30분 동안 37℃에서 절단된 기질 또는 완전한 기질 8 μM과 항온처리한 후; RT HBSS로 세포를 4회 세척하였다. Gd 농도는 ICP-MS(유도 결합 플라스마 질량 분광분석)로 측정하였다. 절단으로 표적 세포에 의한 흡수가 19배 증가하였다.
실시예 21
MMP에 대한 환형 기질이 도 44에 도시되어 있다. 환형 ACPP 분자는 카고에 결합되거나, PEG화되거나, 또는 도면에 나타난 바와 같이 다른 방식으로 변형될 수 있다. 환형 ACPP 분자는 세포 흡수를 활성화시키기 위하여 두 부위에서의 절단을 요한다는 장점을 제공한다(예를 들어, 도 44에 도시된 바와 같이 MMP에 의한 효소적 절단). 두 부위에서의 절단을 요한다는 것은, 그 절단이 1개의 절단 부위를 갖는 분자보다 효소 농도에 더 민감하다는 점에서 장점이다. 이러한 요건은 콘트라스트를 향상시키는 데 유용하다. 도 45 및 46은 환형 ACPP를 제조하기 위한 대표적인 합성 계획도를 예시한다. 이러한 분자들은 PEG화될 수 있음을 주목해야 한다.
도 47에 나타낸 바와 같이, 환형 ACPP의 또 다른 장점은 이들이 자체 켄칭성일 수 있다는 것이다. 도 47에 도시된 바와 같이, 예로서 나타낸 환형 ACPP로부터의 형광은 효소에 의한 절단시 증가한다. 생체내 실험은, 상기 펩티드가 간 및 신장에 의해 흡수, 축적, 절단 및 분비됨을 입증한다. 따라서, 상기 분자는 생체내에 투여되어 생체내에서 절단될 수 있다.
도 48은 환형 ACPP 및 분지형 ACPP를 비롯하여 다중 부위에서의 효소 작용을 요하는 ACPP를 추가로 예시한다. 양 절단 부위가 단일 효소에 대한 기질인 경우, 흡수는 프로테아제 농도의 제곱에 비례할 것이다. 그러나, 다중 효소 부위가 있으면, ACPP 분자는 1 초과의 효소에 대한 기질인 절단 부위를 포함할 수 있다. ACPP가 각각 상이한 효소의 기질인 2개의 절단 부위를 갖는다면, 흡수는 제1 효소의 농도와 제2 효소의 농도의 곱에 비례할 것이다. ACPP는 2개보다 많은 절단 부위를 포함할 수 있으며, 흡수 동력학(kinetic)은 대체로 절단 부위의 수를 따른다(예를 들어, 3개의 동일한 절단 부위가 있을 경우, 흡수는 효소 농도의 세제곱에 거의 비례할 것이다).
따라서, ACPP는 선형, 환형, 분지형이거나 다른 형태 또는 혼합 형태일 수 있다. ACPP는 형광성, 방사성 또는 기타 표지를 전달하거나, 조영제, 치료제 또는 다중 제제를 전달할 수 있다. 링커는 프로테아제에 의해, 디설파이드 결합의 환원에 의해, 또는 산성 또는 다른 조건에 의해 절단될 수 있다. 적절한 효소 및 이러한 효소와 관련된 대표적 표적으로는 매트릭스 메탈로프로테인아제(예를 들어, 암, 졸중 및 기타 병태의 경우); 유로키나제 플라스미노겐 활성제(uPA)(예를 들어, 암 및 기타 병태의 경우); 전립선 특이 항원(예를 들어, 암 및 기타 병태의 경우); 트롬빈 및 응고 캐스캐이드(예를 들어, 혈전증 및 기타 혈액 관련 병태의 경우); 저산소 상태 하에 누출 티올에 의한 환원(예를 들어, 암, 경색증 및 저산소 상태를 초래하거나 이에 의해 유발되는 기타 병태의 경우), 포스파타제(예를 들어, 골관절염 또는 기타 병태의 경우); 칼페인(예를 들어, 괴사 세포 또는 기타 병태의 경우 ); 빛(예를 들어, 광역학적 요법 및 기타 용도의 특이성을 개량하는 경우)을 들 수 있다.
ACPP에 의한 카고의 전달은 다른 수송 또는 치료 시스템의 장점을 제공한다. 항체 또는 항원을 필요로 하지 않고 표적화가 이루어진다. ACPP 표적화는 표적 세포의 핵으로의 카고의 수송 및 효소 증폭을 제공한다. ACPP 펩티드는 합성 및 조합을 다양하게 하는 것이 비교적 용이하게 때문에 그 제조 용이성이 장점이 된다. 프로테아제 활성은 기계적으로 중요하고 흥미로우며, 그 활성의 이용은 절단 경로에 대한 연구가 충분히 이루어지고 연구 및 특성 분석이 계속 이루어지는 것을 비롯한 장점을 제공한다. 막 결합형 프로테아제는 ACPP를 절단하여 가용성 분비형 프로테아제보다 더 높은 콘트라스트를 제공하는 데 이용될 수 있다. 절단 가능한 ACPP는 생체내에서 활성을 나타낸다. 국소 방관자 세포가 약간 표지되는 것이 예측되며 바람직하다. 본 명세서에 개시된 절단 가능한 ACPP는, 적어도, ACPP의 음이온 부분이 전달 전에 양이온 부분을 중화시킬 수 있다는 점에서, 형광 공명 방출 전이(FRET)의 세포외 유사체를 제공한다. ACPP는 형광 및 기타 영상화 양태를 비롯하여 모든 영상화 양태에 적용될 수 있다.
실시예 22
테크네튬-99m으로 표지된 ACPP 를 이용한 영상화
실시예 19에 기재된 바와 같이 테크네튬-99m(99 mTc)으로 표지된 ACPP를 사용하는 것은 마우스 암 모델을 위한 영상화제로서의 사용으로 확장될 수 있다. 형광 영상화와 비교하여 감마 신티그래피의 명백한 장점 중 하나는 감마 영상화는 조직의 훨씬 더 깊은 곳까지 도달한다는 것이다. 전술한 바와 같이, 테크네튬 트리카르보닐, 즉, Tc(CO)3에 대한 고친화성 킬레이트제인 N-엡실론-비스(2-피리딜메틸)리신(DPK)을 통합한 다양한 캐리어 접합 ACPP를 제조하였다. DPK는 고체상 합성 과정에서 펩티드 사슬로 부위 특이적으로 통합될 수 있고 생성된 Tc(CO)3와의 킬레이트는 매우 안정하며 음전하가 노출되어 있지 않기 때문에, DPK는 종래의 Tc 킬레이트제보다 우수한 것으로 보인다. 이러한 화합물들 중 가장 단순한 것, 즉 (11 KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3]가 분리된 배양 세포에 대해 최초로 테스트되었다(주: X는 6-아미노헥사노일 스페이서를 나타내고, 소문자는 D-아미노산을 나타낸다). 절단 전, Jurkat 림프구로의 상기 CPP의 흡수는 양성 대조군 CPP인 r9-[DPK-99mTc(CO)3]의 단 1.9%에 불과하였다. 서열 내의 PLG와 LAG 사이를 절단하기 위해 펩티드를 MMP-9로 처리한 후, 방사능 흡수는 양성 대조군의 107%까지 57배 증가하였다.
조직 배양 세포에서 관찰된 이러한 결과에 기초하여, HT1080 인간 섬유육종 세포의 피부 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에 상기 펩티드 및 유사 ACPP를 정맥 주사하였다. Biospace 소형 동물용 2차원 신티그래픽 영상기를 사용하여 연속 스캔을 행하였다. 사후에 적출한 조직의 신틸레이션 카운팅으로 % ID/g(조직 그램당 보유된 주사량 %)을 측정하였다. 본 발명자들은 상기 ACPP 및 3개의 다른 99 mTc 표지 ACPP: (70 KDa-덱스트란)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3], (쥐과 동물 혈청 알부민)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3] 및 (PAMAM 제너레이션 5 덴드리머)-e9-XPLGLAX-r9-[DPK-99mTc(CO)3]를 테스트하였다. 이로써, 종양 부위보다 간, 신장 및 비장에서 훨씬 더 많은 정도로 방사능이 축적되었음이 관찰되었다. 그러나 종양 가장자리는 이른 시점에 비교적 잘 구별되는 것으로 나타난다(도 48 참조). 알부민 접합 ACPP는, 간 흡수율이 12∼18% ID/g인데 비해 종양 흡수율이 1∼3% ID/g이라는 점에서, 가장 강력한 것으로 나타났다(도 50 참조).
형광 표지로 얻은 결과와 자성 표지로 얻은 결과에 있어서 간 흡수율에 대한 종양 흡수율의 비에 편차가 있고, DPK의 사용에 관한 문헌이 한정되어 있었기 때문에, 본 발명자들은 DPK 킬레이트제가 정상 조직에 대한 친화력의 원인이 될 수 있는지를 테스트하였다. 따라서, 본 발명자들은 (70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAX-r9-(DOTA-111In)을 합성하여 테스트하였다. 그러나. 이 화합물은 (70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAG-r9-[DPK-99mTc(CO)3]와 유사하게 간, 비장 및 신장에 편향된 생체 분포 패턴을 나타내었으며, 이는 DPK-Tc(CO)3가 관찰된 분포의 원인이 아님을 제시한다.
실시예 23
Gd 3 + 카고를 함유하는 MRI 조영제의 개발
Gd3 +를 보유하는 3개의 ACPP를 합성하였다: (11-KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd), Suc9-(70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd) 및 Suc9-(70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAX-r9-K(DOTA-Gd). 이들 ACCP 중 첫 번째 것을 분리된 Jurkat 림프구에 대해 8 μM로 테스트하였다. 유도 결합 플라즈마 질량 분광분석법으로 Gd3+ 흡수를 측정하였다. 온전한 펩티드는 39 μM로 축적되었고, MMP-9에 의해 절단된 펩티드는 737 μM로 축적된 반면, 양성 대조군 CPP인 r9-K(DOTA-Gd)는 504 μM에 달하였다. 따라서, 테스트 펩티드의 MMP 매개 절단은 양성 대조군에 비해 흡수율을 19배 증가시켰다. 상기 실험에서 관찰된 큰 흡수율 절대값은 MRI 및 중성자 포획 치료법에 적합한 Gd3 + 농도에 도달될 수 있음을 제시한다.
7 Tesla 소형 동물용 영상기를 이용하여 동물에 대한 생체내 MRI 영상을 얻었다. 동물을 약 1.5%의 이소플루란으로 마취시키고, 약 2 시간 분량의 길이에 달하는 연속 스캔을 행하였다. 제1 스캔은 20분짜리의 해부학적 T1 강조 스캔이다. 제2 스캔은 지방 포화 시퀀스로서 이 역시 T1 강조 스캔이다. 제3 스캔 세트는 조직 T1을 결정하기 위해 이용되며, 총 약 1 시간에 달한다. 마지막으로, 종양이 고형체인지를 확인하기 위해 짧은 3분 간의 T2 강조 스캔을 수행한다. 연속된 스캔 과정 전반에 걸쳐 동물들이 정상적인 호흡을 하는지 모니터하였다.
예비 스캔에 이어, 동물들을 약 1.5%의 이소플루란으로 마취시키고, 그 후 약 0.2 ml의 Gd3 + 로딩 ACPP[제시된 실험에 있어서 Suc9-(70 KDa 덱스트란)-e9-XPLGLAG-r9-K(DOTA-Gd)]를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 동일한 일련을 스캔을 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 및 48 시간째 행하였다. 스캔 회차 사이에 동물들을 각성시켰다. 어떤 경우에는, 동일한 시점에 꼬리 정맥으로부터 소량을 혈액을 채혈하였다. 스캔 48 시간 후, 동물들을 희생시키고, 해부하거나 완충 파라포름알데히드로 관류하였다. 고정된 동물에 대해 고해상도 해부 스캔 및 파라핀 절편 제작을 행하였다. 비고정 동물은 해부하여 그 장기로 정량적 가돌리늄 분석을 행하였다. Amira 소프트웨어를 이용하여 시간 경과 및 T1 시퀀스를 체적 측정으로 분석하였다.
도 51은 유방 종양에서 배액되는 림프절로부터의 현저한 양성 콘트라스트(적색 화살표로 표시됨)를 보여준다. 그 후 액와 및 서혜 림프절은 동결 절편으로 종양에 대해 양성인지를 확인하였다. 타액선 림프절은 테스트하지 않았으나, 확대된 크기로 보아 이들 역시 전이에 대해 양성일 가능성이 있다. 비장내 강도의 상응하는 증가와 함께 림프절 신호는 48 시간째 약간 감소하였으며, 이는 밀집된 펩티드를 함유하는 대식 세포의 재순환에 기인한 것일 수 있다. 1차 종양 및 간으로부터의 신호(청색 화살표)는 약간 더 증가하였다. 담낭으로부터의 밝은 신호 및 장내 신호(도시되지 않음)는, 대형 캐리어에 결합된 형광 및 Tc 표지 펩티드와 유사하게, 상기 펩티드가 간담도 분비를 통해 제거되었음을 나타낸다. 몇몇 영상의 오른쪽 하측의 밝은 대형 스팟은 조영제 첨가 전에 존재하였고 위내 내용물(자홍색 화 살표)을 반영하는 것일 가능성이 크다. 하복부의 밝은 스팟은 장내 내용물과 혼합된 담즙에 기인한 콘트라스트에 의한 것일 가능성이 크다. 상기 동물의 양 옆구리에 있는 큰 물체는 영상을 표준화하는 데 사용된 물 팬텀(phantom)이다.
전술한 실험의 주된 촛점은 MRI에 Gd3 + 로딩 ACPP를 사용하는 것에 맞추어졌기 때문에, 상기 방법은 중성자 감작제로서 카보란 또는 157Gd를 사용하는 것으로 확장될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 157Gd 농후 물질을 사용하여 Jurkat 세포에서의 ACPP의 펩티드 흡수를 조사하였다. 당업자라면 종양 관련 조직으로의 생체내 흡수가 MRI 모니터링에 의해 최적화된다면, 동일한 조건을 중성자 포획 치료법에 대해 테스트할 수 있음을 알 것이다. 중성자 감작화를 위한 추가 제제를 생성하기 위해, 10B 농후 설프히드릴 보란 Na2 10B12H11SH를 티올기를 통해 ACPP에 결합시킬 수 있다.
실시예 24
종양 대 배경값 콘트라스트 비의 최적화
간 및 신장으로의 ACPP의 유의적인 흡수는 본 발명자들에게 그러한 조직 내의 비-MMP 프로테아제 역시 ACPP 기질을 절단할 수 있음을 시사하였다. 따라서, 본 발명자들은 MMP와 명백히 관련되어 있고 신장에서 과발현되는 메탈로프로테아제인 메프린에 대한 서열 PLGLAG 함유 기질의 감수성을 테스트하였다. 메프린(펜실베니아주 Judith Bond 교수가 제공)으로 Cy5 표지 기질을 처리하였다. 단백질 분해 단 편을 LC-MS로 분석하였으며, 이것은 절단이 P 다음에서 발생하는 한편, MMP-2 및 MMP-9는 G와 L 사이에서 절단됨을 보여주었다. 절단 부위에 있어서의 이러한 차이는, 예를 들어 종양 세포 내에 농축된 프로테아제에 감수성이 있는 서열은 유지하는 한편 비종양 세포 절단 부위는 제거함으로써, 메프린 감수성을 감소시키는 한편 MMP 감수성을 유지하도록 펩티드 서열을 재디자인하는 것을 용이하게 한다.
트리신 구배 겔에서의 전기영동은, 조직으로부터 회수된 비절단 펩티드로부터 절단된 펩티드를 구별하기 위한 현재로서 가장 최적의 기법이다. 이 분석에 의하면, 주사한 지 2 시간 후, 종양이 절단된 펩티드와 비절단된 펩티드의 혼합물을 함유하는 것으로 나타났다. 주사한 지 6 시간 경에, 종양, 간 및 신장 내에 남아있던 모든 펩티드가 절단되었다. 피부, 췌장, 근육 또는 폐 등의 다른 정상 조직 내의 펩티드는 상기 겔의 검출 한계 이하였다.
질량 분광분석법은 절단 부위를 확인할 수 있고 형광 표지 펩티드에 제한되지 않기 때문에 유익한 기법이다. 이러한 기법은 복잡한 조직 매트릭스로부터 고하전 펩티드를 진공으로 이온화하는 것이다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 질량 분광분석기의 샘플 플레이트 상에 조직 박편을 마운팅하고자 시도하였다. 매우 약한 신호가 검출되었는데, 이것은 질량이 너무 커서 주사된 ACPP 펩티드와 연관시킬 수 없었다. 매우 과잉량의 절단된 펩티드를 갖는 마운팅된 샘플의 스파이킹(spiking)에 의하면, 검출 한계가 너무 커서 이러한 방식으로는 조직 샘플을 분석할 수 없는 것으로 나타났다.
대안으로, 조직 세포의 파괴 및 용해는 펩티드의 폴리아르기닌 부분과 강하 게 상호작용하는 것으로 생각되는 화합물의 복잡한 배경 매트릭스를 방출한다. 그로 인한 신호 억제는 샘플 제조 방법이 세포 추출 부산물로부터 펩티드를 정제하도록 개발될 것을 요한다. 폴리아스파르트산으로 구성된 정지상을 이용하는 약한 양이온 교환(WCX)이 상기 정제를 수행하기에 효과적인 것으로 확인되었다. 상기 펩티드를 로딩하여, 후속 역상 분리 및 질량 분광분석과 상용성인 휘발성 용매를 사용하여 WCX로 추출할 수 있다. 검출 한계를 향상시키기 위해 추가 연구가 진행중에 있으며, 이는 정제된 펩티드가 최초 조직 샘플의 보충을 나타낸다는 것을 확실히 한다.
실시예 25
환형 펩티드
본 발명자들은, 환형 펩티드를 생성하기 위해, 2개의 절단 부위를 포함하는 환형 [숙시노일-PLGLAG-c(11 KDa-mPEG)-e9-XPLGLAG-r9-K]-k(Cy5)를 합성하였다. 상기 환형 ACCP를 이종이식 마우스에서 테스트하였다. 본 발명자들은, 단일 절단 부위를 갖는 선형 펩티드와 비교하여, 종양 유래의 신호가 2배 감소한 한편, 신장 유래의 신호는 거의 동일하게 유지되었으며, 간 유래의 신호는 거의 10배 증가하였음을 확인하였다. 11 KDa 지지체 상의 단일 PLGLAG를 절단함에 있어서 간이 종양보다 훨씬 더 빠르다는 것을 가정하면, 상기 결과는 예상하지 못했던 것이다. 따라서, 2개의 절단 부위가 필요한 환형 기질은 간을 더 큰 정도로 선호한다. 당업자라면, 각각이 간에 비해 종양에서 우선적으로 절단되는 펩티드 서열(바람직하게는 2개의 상이한 것)이 얻어진다면, 절단 부위가 2개인 ACPP가 본 발명을 실시함에 있어서 유익할 것임을 알 것이다.
실시예 26
자체 켄칭성 형광체 또는 FRET 쌍을 갖는 ACPP
자체 켄칭성 형광체 [Cy5-X-e6-XPLGLAG-r9-Xk(Cy5)] 또는 FRET 쌍 [Cy7-X-e6-XPLGLAG-r9-Xk(Cy5)]을 갖는 ACPP를 합성하였다. 제1 기질은 MMP-9에 의해 절단시 형광 강도를 3.9배 증가시킨 반면, FRET 기질은 650∼770 nm 발광의 비를 6.6배 증가시킨 것으로 나타났다. 본 발명자들이 분자가 더 많은 순전하를 보유하도록 글루타메이트 잔기의 수를 9개에서 6개로 감소시켰음에도 불구하고, 본 발명자들은 상기 2개의 기질이 생리학적 배지에서 난용성이라는 것을 확인하였다. 당업자라면 상기 결과를 근거로 상기 ACPP의 수용성이 더 큰 유사체를 합성할 수 있다는 장점을 인식할 것이다.
실시예 27
캐리어의 분자 크기를 증가시킴
본 발명자들은, 거대 분자 캐리어의 크기를 11 KDa mPEG에서 70 KDa 덱스트란, 60 KDa 혈청 알부민 또는 35 KDa PAMAM 덴드리머(제너레이션 5)로 증가시키면, 형질전환 MMTV-PyMT 마우스에서 광학 콘트라스트가 크게 향상된다는 것을 발견하였다(도 52). 임의의 특정 이론 또는 메카니즘에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자들은 기질의 사구체 여과를 감소시키고 신장의 근위세뇨관에서 메프린 등의 프로테 아제에의 노출을 감소시키는 것에 의해 상기 효과가 얻어진다고 생각한다. 순환계에서의 반감기 증가 역시 종양 효소가 ACPP의 상당 부분을 절단할 수 있는 시간을 더 많이 허용한다. 당업자라면, 더 큰 거대 분자 캐리어의 사용은, 비절단 ACPP가 제거되어 최대 콘트라스트가 얻어지기까지, 주사 후 더 많은 시간(24∼48 시간)이 경과되어야 한다는 것을 알 것이다. 본 발명자들은, 중합체 지지체가 충분한 총 음전하를 보유한다고 가정할 때, 간 흡수율은 비교적 일정하게 유지된다는 것을 알게 되었다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자들은 증가된 투과율 및 보유율(Enhanced Permeability and Retention; EPR)이, 기여는 하겠지만, 전적으로 향상된 콘트라스트의 원인인 것은 아니라고 생각한다. 본 발명자들은, PLAGLAG 대신에 절단성이 불량한 plglag를 갖는 대조군 ACPP는, 양 펩티드가 동일한 EPR 효과를 나타냄에도 불구하고, 매우 약한 콘트라스트를 나타내었음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 더 큰 중합체가 더 큰 EPR 효과를 보유함에도 불구하고, 덱스트란의 크기를 250 KDa까지 증가시키는 것이 종양 콘트라스트를 대부분 파괴하였음을 확인하였다.
실시예 28
전이성 종양 세포를 포함한 림프절을 검출하기 위한 형광성 ACPP 의 사용
도 53에 도시된 바와 같이, 형광성 ACPP는 또한 전술한 MR 영상과 유사하게 현저한 림프절 흡수를 나타낸다. 그러나, 림프절이 너무 작고 너무 깊이 매립되어 있어서 마우스 외부에서는 관찰할 수 없다. 그 대신, 체강이 개방되었을 때 림프절이 뚜렷하게 보인다. 상기 도면의 최우측 패널의 대동맥 주변 클러스터에서 알 수 있듯이, 모든 림프절이 보이는 것은 아니다. 본 발명자들은 이것이 아직 전이를 포함하지 않은 정상 림프절인 것으로 생각한다. 또한, PLGLAG 대신에 plglag를 포함하는 대조군 펩티드를 사용한 경우에 훨씬 더 약한 콘트라스트가 관찰된다. 당업라자면, 그러한 광학 콘트라스트가 림프절 내의 전이성 종양 세포의 존재를 신뢰할만하게 나타낼 수 있다면, 이것이 수술시 매우 유용한 가이드가 될 수 있음을 알 것이다.
실시예 29
정상 조직에 비해 종양 내 축적을 최대화하는 펩티드 서열에 대하여 합성 또는 파지 디스플레이 펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 조합적 접근법
종양 세포에 특이적으로 흡수되는 ACPP를 동정하기 위해, 시험관내 및 생체내 선별 전략법을 조합 파지 디스플레이 라이브러리와 병용하여 이용하였다. 최초 실험은, 대조군 ACPP 펩티드를 M13 파지의 pIII 코트 단백질의 N-말단, 또는 T7 파지(T7select 10-3, Novagen)의 10B 캡시드 단백질의 C-말단에 연결하여 수행하였다. 상기 라이브러리는 H6-E9-Z6-R9-(M13 파지) 또는 (T7 파지)-R9-Z6-E9-H6(Z는 절단 부위의 라이브러리를 생성하기 위한 무작위 아미노산을 나타냄)이었다. 따라서 절단에 의하면, 이들이 N-말단(M13)에 위치하든지 C-말단(T7)에 위치하든지 간에 폴리글루타메이트 및 헥사히스티딘 도메인이 유리된다. T7 파지와 M13 파지 양자에 대한 대조군은 Z6 대신에 His-태그 단독, 또는 MMP에 의해 절단 가능한 PLGLAG 또는 MMP 저항성 LALGPG를 포함한다. PLGLAG를 갖는 파지는 LALGPG를 갖는 것보다 약 4 배 높은 역가로 HT1080 종양 이종이식편에 축적된 반면, 간 및 신장으로의 흡수는 상기 2개 서열에 대하여 낮았고 크게 다르지 않았다(도 37 및 52). 이러한 예비 결과는 폴리글루타메이트 및 폴리아르기닌 도메인에 L-아미노산을 사용함에도 불구하고 적당한 콘트라스트를 얻을 수 있음을 제시하였다. T7 파지에 대해서는, 소형 테스트 라이브러리(104 다양성)가 생성되는 한편, M13 파지 라이브러리는 2.5 x 106개의 특유의 서열을 갖는 다양성을 보유하였다.
형질전환 마우스(MMTV-PyMT)의 유방 종양 또는 종양 이종이식편(HT1080 세포)을 포함하는 마우스에 파지 라이브러리를 주사하여 생체내 선별을 수행하였다. 주사한 지 3∼24 시간 후에 종양 조직을 적출하였다. 회수한 파지는 박테리아에서 재증폭시키고 다른 마우스에 재주사하여 최대 7회의 반복되는 선별 사이클을 수행하였다. 각 회차에서 대표 파지를 분리하여 서열을 분석하여 선별 과정을 모니터하였다. 여러 차례 분리된 서열은 추가 분석을 위한 것이었다.
시험관내 선별법은 종양 조직과 관련된 정제된 효소 또는 조직 추출물에 의해 특이적으로 절단되는 파지를 스크리닝하는 것과, 또한 정상 조직과 관련된 효소 및 추출물에 의한 절단에 대해 선별하는 것을 포함하였다. 이러한 유형의 선별법의 장점은, 생체내 선별법에서 요구되는 것과 같이 절단된 파지를 종양에 결합시켜 유지할 필요가 없다는 것이다. 본 발명자들은 2개의 상이한 시험관내 선별 패러다임을 이용하였다. 최초 선별에서, 2.5 x 106개의 다양성을 갖는 M13 라이브러리를 신장 프로테아제 메프린 및 네프릴리신으로 3 시간 동안 처리하였다. 그 후, Ni-NTA 아가로스(Qiagen)를 첨가하여 파지가 5∼15분 동안 결합되게 한 다음, 파지를 보유하는 Ni-NTA 아가로스를 MMP-9로 재현탁시키고 37℃에서 2∼3 시간 동안 항온처리하였다. 원심분리에 의해 비드를 제거한 후, 상청액으로 방출된 파지를 새로운 박테리아와 함께 도말하였다. 이 과정은 신장 프로테아제에 의해 절단되지 않은 상태로 남아 있으나 MMP-9에 의해 방출되는 파지를 선별한다. 이 과정은 6 회차 정도 반복하였으며, 대표 파지를 분리하여 그 서열을 분석함으로써 선별 과정을 모니터하였다. 또한, 메프린/네프릴리신 대신에 간/신장 추출물을 사용하고 MMP-9 대신에 종양 추출물을 사용하여 동일한 선별 과정을 수행하였다. 분석된 서열은 하기 표에 제시하였다. 가장 가능성 있는 펩티드를, 측접하는 e9 및 r9 서열 및 C-말단 플루오레신 태그를 갖도록 화학적으로 재합성하였다. 그 후, 트리신 겔 전기영동으로 이들을 종양, 간, 신장 추출물 및 MMP-9에 의한 절단에 대해 분석하였다.
펩티드 서열 (X6) 총 분리 횟수 생체내 스크린 에서 확인된 횟수 Nep/Mep/NMP-9 스크린에서 확인된 횟수 간/신장/종양 스크린에서 확인된 횟수 종양/신장/간/ MMP-9에 의한 최초 미정제 e9-Z6-r9 펩티드의 절단
RLQLKL 12 1 11 T+/K+/L+/M-
GLWQGP 7 7
QCTGRF 6 1 1 4 이량체?
LPGMMG 5 5
DVGTTE 5 5 비절단
TDLGAM 5 5 비절단
GMMYRS 4 1 3 T+/K+/L+/M+/-
DSNAES 4 3 1 비절단
ITDMAA 4 1 3
RWRTNF 4 4 T+/K+/L+/M-
WRPCES 3 1 2
WRNTIA 3 3
IDKQLE 3 3
FMEIET 3 3
HEVVAG 2 2
TSAVRT 2 2
GGHTRQ 2 2
INGKVT 2 2
ARKRSQ 2 2
주: 합성 펩티드는 Z6 부위에 측접한 D-아미노산을 갖기 때문에, 그 절단이 파지 데이터와 일치하지 않을 수 있다.
본 발명자들은 원하는 T+/K-/L- 프로필을 갖는 어떠한 펩티드도 확인하지 못하였음을 언급한다. 당업자라면, 시험관내 분석을 향상시키기 위한 가능한 방법 중 하나가 세망내피계에 의한 비특이적 여과가 감소된 돌연변이 파지(E. Ruoslahti의 연구실에서 개발됨)를 이용하는 것이 될 수 있음을 인식할 것이다. 순환계 내에서의 반감기 증가는 비특이적 흡착의 배경값을 감소시키며 프로테아제에 기초한 식별이 이루어지는 데 더 많은 시간을 제공한다. 또한, 종양으로부터 회수된 파지는 Ni-NTA 아가로스로 흡착시켜 비절단 파지를 제거할 수 있다.
실시예 30
ACPP 를 테스트하기 위한 추가 모델
본 발명자들은 형질전환 MMTV-PyMT 유방암 모델이 몇 가지 이유에서 유익한 쥐과 동물 모델이라는 것을 알게 되었다: (1) 이 모델은 이종이식편보다 유방암에 대해 더욱 현실적인 종양 모델이고, (2) 이 모델에 의해 종양과 간질 간의 상호작용을 관찰할 수 있으며, (3) 이 동물은 면역적격성이기 때문에, 이를 이용하여 대형 캐리어에 대한 림프절 내 흡수율을 연구할 수 있고, (4) 마우스 한 마리가 여러 단계에 있는 몇 종의 종양을 보유할 수 있기 때문에, 연구자들이 환자의 암 진행에 대한 보다 적절한 모델에서 테스트 펩티드의 효능을 측정할 수 있게끔 한다. 종양 내 염색 패턴은 간질 내에서 균일한 염색으로서 시작되는 것으로 관찰되었다. 이러한 발견은, 폴리오마 마우스로부터 종양을 미세 절개하여, 종양 상피 조직에 비해 종양 간질에 MMP가 농후하다는 것을 발견한 Pedersen 연구진(2005)에 의해 수행된 정량적 PCR 분석과 일치한다. 몇 시간 동안, 표지가 혈관 부근 및 종양 가장자리의 수지상 세포 또는 대식 세포에 흡수됨에 따라, 균일한 염색에 반점이 생겼다. 이러한 식작용 세포의 실체는 F4/80을 이용한 항체 염색에 의해, 또 헤마톡실린/에오신 염색에 의해 확인하였다. 흥미롭게도, 림프절은 장시간이 경과한 시점에 형광을 크게 발하였다. 이것이 형광성 종양 잔해물의 식작용을 행하여 림프절로 이송한 종양 관련 대식 세포에 기인한 것인지, 반응성 림프절 내의 활성화된 대식 세포가 혈액을 통해 수송되는 색소를 흡수한 것에 기인한 것인지는 현재로서는 알 수 없다. 본 발명자들은 이러한 늦은 시점에(24 시간 및 48 시간) 종양 내의 검출 가능한 모든 펩티드가 절단되었음을 확인하였다. MMTV-neu 등의 다른 형질전환 마우스 모델도 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
매트리겔(matrigel)에서의 3D 조직 배양물(도 53) 역시 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 이러한 3D 배양물은 분리된 종양 세포보다 더 현실적인 모델이며, 생존 동물에서 가능한 것보다 더 높은 해상도의 분석을 제공한다. 분리된 세포와 관련된 한계점은, 이들이 ACPP를 절단할 수 있을만큼 충분히 세포외 MMP를 축적하지 않아서, 예비 활성화된 외인성 MMP를 공급해야 한다는 것이다. 이와는 대조적으로, 3D 배양물은 외인성 효소의 도움 없이 절단 의존성 메카니즘에 의해 ACPP를 흡수한다(도 55). 3D 겔의 사용은 개개 세포에서의 흡수 및 세포내 분포가 3D 배양물에서 분해될 수 있도록 한다. 이러한 분해능은 동물로부터 얻은 조직 절편을 이용해서는 현재로서는 얻을 수 없다. 본 발명의 이러한 양태의 실시에 이용될 수 있는 세포주로는 MDA-MB-231 및 MCF-7 인간 유방 선암종 및 HT1080 인간 섬유육종 세포주를 들 수 있다. PyMT 형질전환 마우스로부터 얻은 1차 기관양 및 그 밖의 침입성이 적은 세포주 역시 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다.
이러한 연구를 위해, 트리신 겔, 형광 영상화 및 유세포 측정 프로토콜을 이용하여 ACPP의 절단 및 3D 배양물로의 흡수를 정량하였다. 형광 영상화는 표면 및 세포내 펩티드의 총 형광을 검출하는 한편, 유세포 측정법은, 클러스터를 단일 세포로 분해하고 트립신 처리를 통해 표면 결합을 제거한 후 세포 내에 잔류한 형광을 측정하였다. 항온처리 24 시간 후 MDA-MB-231 세포에서는, PLGLAG 절단 서열을 갖는 ACPP가 D-아미노산, 즉 plglag를 갖는 대조군보다 흡수율이 최대 5배 더 큰 것으로 나타났다. 또한, 본 발명자들은 광범위 MMP 억제제인 0.1 mM GM6001을 사용 하여 PLGLAG 함유 ACPP의 흡수율을 약 50% 억제할 수 있었다. 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제, 아스파틱 프로테아제 및 카텝신 D의 억제제 혼합물은 기질 절단/활성화를 억제할 수 없는 것으로 확인되었다. HT1080 세포는 유사한 결과를 산출한 반면, MCF-7 세포는 D-아미노산 대조군에 비해 검출 가능한 흡수를 나타내지 못하였는데, 이는 침입성이 상대적으로 부족한 것과 상관성이 있다. 다른 세포, 예컨대 침입성이 적은 세포주 및/또는 정상 세포주 및 MMP2/MMP9 이중 넉아웃 PyMT 세포도 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다. 본 발명에 개시된 3D 모델은 새로운 프로테아제 기질을 합성할 수 있다는 점에서 프로테아제 특이성에 대한 스크리닝 분석으로서 이용될 수 있다. 또한, 상기 3D 배양물 모델은 시스플라틴 또는 독소루비신 등의 치료용 카고를 보유하는 ACPP의 전달 및 흡수를 평가하기 위한 모델로서 사용될 수 있을 것이다.
실시예 31
ACPP 와 관련된 잠재적 부작용의 테스트
ACPP 의 면역원성 테스트
대표적 ACPP, 즉, 11 KDa mPEG-e9-PLGLAG-r9의 면역원성을, 양성 대조군으로서 사용된 강력한 면역원성 캐리어인 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 e9-PLGLAG-r9와 비교하여 테스트하였다. KLH 및 mPEG 접합 항원을 완충액에 현탁시키고(1 mg/ml), 동량의 완전 프로인트 보조제와 총량이 1.0 ml가 되도록 혼합하여 유화시켰다. 그 후, 이 샘플을 1차 면역화를 위해 등쪽 피하 부위에 3∼4 군데 주사하였 다. 후속 면역화는 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 토끼당 0.5 mg의 용량으로 행하였다. 1일, 7일, 28일 및 42일째 토끼에 주사하였다. 21일, 35일, 49일 및 56일째 각 토끼로부터 귀 동맥을 통해 채혈하였다. 혈액이 응고되도록 하여 원심분리로 혈청을 수집하였다. 혈청은 56일 후 모든 테스트가 함께 이루어질 때까지 -20℃에서 보관하였다. 항-펩티드 항체 역가는 항원으로서 웰당 5 ㎍의 BSA 접합 e9-PLGLAG-r9를 사용하여 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)으로 측정하였다. 하기 표의 결과는 492 nm에서의 OD 0.1을 산출하는 혈청 희석률의 역수로서 나타내었다(HRP-항 토끼 IgG 접합체 및 OPD를 사용하여 검출).
토끼 번호 채혈 전 역가 21일째 채혈 35일째 채혈 49일째 채혈 56일째 채혈
ml 역가 ml 역가 ml 역가 ml 역가
mPEG 접합체-1 <1:200 24.0 <1:200 24.0 <1:200 24.0 <1:200 23.0 <1:200
mPEG 접합체-2 <1:200 20.0 <1:200 23.0 <1:200 23.0 <1:200 21.0 <1:200
KLH- 접합체-1 <1:200 29.0 1:300 25.0 1:600 27.0 1:1000 24.0 1:800
KLH- 접합체-2 <1:200 24.0 1:1300 25.0 1:4800 25.0 1:10000 24.0 1:11300
mPEG-접합 펩티드의 경우, 면역 반응을 검출할 수 없었는데, 즉, 56일째의 마지막 샘플 채취까지 채혈 전 음성 대조군과 구별할 수 없었다. 이와는 대조적으로, KLH-접합 펩티드는 양 토끼에서 중간 내지 강력한 항체 반응을 유발하였다. 이러한 결과들은 비활성 캐리어 상에서 제시될 때 펩티드 자체가 면역원성을 나타내는 것이 아님을 입증한다. 당업자라면 물론, 항원성이 종 및 개체마다 달라질 수 있으므로, 상기 ACPP 및 새로 개발된 ACPP의 인체에서의 사용이 고려된다면 이의 인체 테스트가 필요하다는 것을 알 것이다.
퓨린 억제에 대한 테스트
1 mM CaCl2를 함유하는 100 mM MES/NaOH(pH 7.0) 100 ㎕ 중 최종 농도 200 μM로 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-MCA 기질(Bachem)을 사용하여 퓨린 분석을 수행하였다. 억제성 펩티드를 1 유닛의 퓨린 효소(NEB)와 30분 동안 사전 항온처리한 후 기질을 첨가하였다. 96웰의 투명 바닥 흑색 벽 코스타(Costar) 플레이트에서 37℃로 4 시간 동안 삼중으로 항온처리하여 분석을 수행하였다. MCA의 방출은 380 nm에서의 여기 및 460 nm에서의 발광으로 측정하였다. IC50은 무효소 대조군에 비해 460 nm에서의 발광 증가를 50% 억제하는 데 필요한 억제제의 농도로서 결정하였다. 대조군 억제제인 데카노일-RVKR-클로로메틸케톤(Calbiochem)은 공개된 값과 일치하는 값인 IC50 27 nM을 나타내었으며, 이로써 분석의 유효성이 입증된다. 실험에 의한 IC50은 다음과 같았다:
구조 IC50(μM)
Ac-r9-k-NH2 3.4
mPEG(11 kd)-e9-XPLGLAG-r9-Xk-NH2 >50
비절단 e9-XPLGLAG-r9-Xk-NH2 27
절단된 e9-XPLGLAG-r9-Xk-NH2 (MMP-9를 이용하여 2.5 시간) 42
따라서, 절단 전 또는 후, 거대 분자 캐리어를 갖는 ACPP의 경우 퓨린 억제를 검출할 수 없었고 단순한 구조의 ACPP의 경우 매우 약하였다.
실시예 32
Figure 112007091576740-PCT00019
Figure 112007091576740-PCT00020

Claims (56)

  1. A-X1-B-X2 구조의 환형 분자로서,
    여기서 B는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 세포내로의 흡수에 적합하고,
    A는 약 2∼약 20개의 산성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 영역 B와 연결시 영역 B의 세포내로의 흡수를 억제 또는 방지하는 효과가 있으며,
    A와 B는 링커 X1 및 X2를 통해 함께 연결되어 환형 화합물을 형성하는데, 이때 X1 및 X2는 각각 약 2∼약 100개 원자의 절단형 링커로서 A와 B를 연결하여 각각의 X1 및 X2가 A 및 B 둘 다에 연결된 환형 화합물을 형성하는 환형 분자.
  2. 제1항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 세포 외부에서 절단되도록 구성된 분자.
  3. 제1항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 세포 내부에서 절단되도록 구성된 분자.
  4. 제2항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 효소에 의해 절단되도록 구성된 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효소는 메트릭스 메탈로프로테아제인 분자.
  6. 제5항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 아미노산 서열 PLGLAG (서열 번호 1)를 포함하는 분자.
  7. 제5항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 아미노산 서열 EDDDDKA (서열 번호 2)를 포함하는 분자.
  8. 제1항에 있어서, 절단형 링커 Xl 또는 X2 중 하나 이상은 S-S 결합을 포함하는 분자.
  9. 제1항에 있어서, 펩티드 영역 B와 연결된 카고 부분 C를 더 포함하는 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 표지를 포함하는 분자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 표지는 형광 표지, 발광 표시, 방사성 표지, 조영제, 방사선 감광제, 항체 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지를 포함하는 분자.
  12. 제9항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 파지를 포함하는 분자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 방사성 테크네튬 표지를 포함하는 분자.
  14. 제9항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 조영제를 포함하는 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 가돌리늄 조영제를 포함하는 분자.
  16. A-Xl-B-X2 구조의 환형 분자 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
    여기서 B는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 세포내로의 흡수에 적합하고,
    A는 약 2∼약 20개의 산성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 영역 B와 연결시 영역 B의 세포내로의 흡수를 억제 또는 방지하는 효과가 있으며,
    A와 B는 링커 X1 및 X2를 통해 함께 연결되어 환형 화합물을 형성하는데, 이때 X1 및 X2는 각각 약 2∼약 100개 원자의 절단형 링커로서 A와 B를 연결하여 각각의 X1 및 X2가 A 및 B 둘 다에 연결된 환형 화합물을 형성하는 것인 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 펩티드 영역 B와 연결된 카고 부분 C를 더 포함하는 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 치료제를 포함하는 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 카고 부분 C는 방사성 제제를 포함하는 약학 조성물.
  20. 카고 부분 C의 세포내로의 흡수를 조절하는 방법으로서,
    약 5∼약 20개의 염기성 아미노산 잔기의 펩티드 B와 카고 부분 C를 공유적으로 부착시켜서 분자 BC를 형성하는 단계,
    약 3∼약 30개 원자의 절단형 링커 X1 및 X2를 이용하여 상기 분자 BC를 약 2∼약 20개의 산성 아미노산 잔기의 펩티드 A와 연결시켜 A-X1-BC-X2 구조의 환형 분자를 형성하는 단계로서, 이때 각각의 X1 및 X2는 A 및 BC 둘 다에 연결된 것인 단계, 및
    상기 펩티드 A에서 BC를 분리하는데 유효하도록 상기 절단형 링커 X1 및 X2를 절단하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 세포막을 가로질러 카고 부분을 수송하기 위한 A-X-B-C 구조의 분자로서,
    여기서 C는 카고 부분을 포함하는 영역이고,
    B는 약 5∼약 20개의 염기성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 세포내로의 흡수에 적합하며, 영역 C와 공유적으로 연결되어 있고, 세포막을 가로질러 카고 영역 C의 수송을 증가시키는 효과가 있으며,
    A는 약 2∼약 20개의 산성 아미노산 잔기의 펩티드 영역으로서, 영역 B와 연결시 B-C의 세포내로의 흡수를 억제 또는 방지하는 효과가 있고,
    X는 약 2∼약 100개 원자의 절단형 링커로서 A를 B-C와 연결시키며, 표적 세포 내 또는 표적 세포 근처의 조건하에서 절단될 수 있는 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 카고 부분 C를 포함하는 영역은 파지를 포함하는 분자.
  23. 제21항에 있어서, 상기 카고 부분 C를 포함하는 영역은 표지를 포함하는 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표지는 형광 표지, 발광 표지, 방사성 표지, 조영제, 방사선 감광제, 항체 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지를 포함하는 분자.
  25. 제21항에 있어서, 상기 카고 부분 C를 포함하는 영역은 방사성 테크네튬 표지를 포함하는 분자.
  26. 제21항에 있어서, 상기 카고 부분 C를 포함하는 영역은 조영제를 포함하는 분자.
  27. 제21항에 있어서, 상기 카고 부분 C를 포함하는 영역은 가돌리늄 조영제를 포함하는 분자.
  28. 카고가 형광 분자인 제21항의 분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 외과적 절제를 안내하는(guiding) 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암은 외과 수술 동안 절제되는 림프절로 전이된 것인 방법.
  30. 생체 내 영상화를 통한 림프절내 전이성 암의 진단 방법으로서,
    카고가 감마선 방출 방사성 핵종인 제21항의 분자를 개체에게 투여하는 단계, 및 SPECT 또는 평면 감마 카메라 영상화를 사용하여 림프절을 영상화하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 감마선 방출 방사성 핵종은 64Cu, 99 mTc, 111In, 123I, 124I 또는 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 생체 내 영상화를 통한 림프절내 전이성 암의 진단 방법으로서,
    카고가 조영제인 제21항의 분자를 개체에게 투여하는 단계, 및 MRI를 사용하여 림프절을 영상화하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 조영제는 Gd3 +인 방법.
  34. 링커 X의 프로테아제 절단 부위를 생체 내에서 선별하는 방법으로서,
    (a) 제21항의 분자를 제공하는 단계로서, 이때 카고는 파지이고, 상기 분자는 영역 B에서 부착된 코트 단백질을 통해 파지에 부착되며, X는 무작위 아미노산 라이브러리 유래의 시험용 절단형 링커인 단계;
    (b) 상기 파지를 인간 이외의 개체에게 투여하는 단계;
    (c) 상기 파지를 포함하는 종양 조직을 분리하는 단계;
    (d) 상기 종양 조직으로부터 파지를 단리하는 단계;
    (e) 상기 파지를 인간 이외의 개체에게 재투여하여 파지를 증폭시키는 단계; 및
    (f) 파지를 단리하고 서열 분석하여 프로테아제 절단 부위를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 파지를 총 7 주기 동안 인간 이외의 개체에게 투여하는 방 법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 분자는
    B가 M13 파지의 pIII 코트 단백질의 N 말단에서 C와 연결된 A-X-B-C 구조, 또는 B가 T7 파지의 10B 캡시드 단백질의 C 말단에서 C와 연결된 C-B-X-A 구조를 갖는 것인 방법.
  37. 링커 X의 프로테아제 절단 부위를 시험관 내에서 선별하는 방법으로서,
    (a) 제21항의 분자를 제공하는 단계로서, 이때 카고는 파지이고, 상기 분자는 영역 B에 부착된 코트 단백질을 통해 파지에 부착되며, X는 무작위 아미노산 라이브러리 유래의 시험용 절단형 링커인 단계;
    (b) 상기 파지를 비암성 세포 유래 프로테아제와 항온 반응시키는 단계;
    (c) 세포로 들어가지 않은 파지를 단리하는 단계;
    (d) 상기 파지를 암성 세포 유래 프로테아제와 항온 반응시키는 단계;
    (e) 암성 세포 유래 프로테아제로 절단된 파지를 단리하는 단계; 및
    (f) 상기 파지를 서열 분석하여 프로테아제 절단 부위를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 파지를 총 6 주기 동안 증폭시키는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 프로테아제는 정제된 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 프로테아제는 조직 추출물 유래인 것인 방법.
  41. 생체 내에서 종양을 영상화하는 방법으로서,
    카고가 조영제인 제21항의 분자를 개체에게 투여하는 단계, 및 MRI를 사용하여 종양을 영상화하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 조영제는 Gd3+인 방법.
  43. 생체 내에서 종양을 영상화하는 방법으로서,
    카고가 감마선 방출 방사성 핵종인 제21항의 분자를 개체에게 투여하는 단계, 및 SPECT 또는 평면 감마 카메라 영상화를 사용하여 종양을 영상화하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 감마선 방출 방사성 핵종은 64Cu, 99 mTc, 111In, 123I, 124I 또는 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 개체에 제21항의 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 이때 카고는 치료적 방사성 핵종인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 치료적 방사성 핵종은 90Y 또는 131I, 32P, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 111In, 117mSn, 153Sm, 177Lu, 186Re 및 188Re로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제21항에 있어서, 펩티드 영역 A는 크기가 약 50∼70 kD인 거대 분자와 추가로 연결된 것인 분자.
  48. 제21항에 있어서, 펩티드 영역 A는 크기가 약 35∼70 kD인 거대 분자와 추가로 연결된 것인 분자.
  49. 제48항에 있어서, 상기 거대 분자는 덱스트란, 혈청 알부민, PSA, PEG 및 PAMAM 덴드라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분자.
  50. 제21항에 있어서, 상기 카고는 핵 위치 신호와 연결된 것인 분자.
  51. 제21항에 있어서, 상기 카고는 엔도솜 방출 신호와 연결된 것인 분자.
  52. 제21항에 있어서, 상기 카고는 64Cu, 99 mTc, 111In, 123I, 124I 또는 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분자.
  53. 제21항에 있어서, 상기 카고는 90Y, 32P, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 111In, 117mSn, 153Sm, 177Lu, 186Re 및 188Re로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분자.
  54. 제21항에 있어서, 상기 카고는 32P, 99mTc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 123I, 124I, 131I 및 212Bi로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분자.
  55. 제21항에 있어서, 상기 절단형 링커는 MMP-2, MMP-9, MMP-11m, MMP-13, MMP-14, uPA 또는 PSA에 의해 절단되는 것인 분자.
  56. 제21항의 분자를 포함하는 약학 조성물.
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