ES2901232T3 - Péptido diana de tumor maligno - Google Patents

Abstract

Un péptido de 7-50 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia de aminoácidos de (i), donde cada símbolo de aminoácido seguido inmediatamente por el símbolo [D] es una forma D del aminoácido: (i) la secuencia de aminoácidos de T [D] I [D] T [D] W [D] P [D] T [D] M [D].

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido diana de tumor maligno

Campo técnico

La presente invención se refiere en general al campo de la biología del cáncer, y más particularmente a péptidos que se unen a la anexina A1 y a su uso.

Antecedentes de la invención

Entre los tumores cerebrales, muchos tumores originados en las meninges, el cerebro o el nervio espinal, como los meningiomas y los schwannomas, son tumores cerebrales benignos que pueden curarse completamente si se pueden extirpar mediante cirugía. En cambio, los tumores neuroepiteliales, incluido el glioma, son tumores cerebrales básicamente malignos. Especialmente, el glioblastoma de grado 4 muestra un pronóstico extremadamente desfavorable (la tasa de supervivencia a los 5 años es aproximadamente del 10%), incluso si se realiza radioterapia y quimioterapia después de la extirpación mediante craneotomía. Una de las principales razones de la falta de quimioterapia efectiva para el tumor cerebral es la presencia de una barrera hematoencefálica. Por otro lado, la temozolomida, que es un nuevo fármaco eficaz para el glioblastoma, se aprobó en Japón en 2006. Este fármaco tiene un peso molecular muy pequeño (194 Da) y se esclareció que era capaz de atravesar la barrera hematoencefálica por difusión. Sin embargo, el fármaco solo ha podido alargar la esperanza de vida de 12 meses a 16 meses. Por lo tanto, para mejorar drásticamente los resultados del tratamiento para un tumor cerebral maligno en el futuro, es esencial desarrollar un fármaco terapéutico que se acumule en el tumor cerebral a una concentración abrumadoramente alta y pueda atravesar activamente la pared del endotelio vascular, en lugar de un método pasivo basado en la difusión de moléculas pequeñas a través de la barrera hematoencefálica.

Recientemente, la carga económica sobre los pacientes se está volviendo cada vez más pesada debido al aumento de los gastos de investigación y desarrollo y al uso generalizado de fármacos basados en anticuerpos. En el futuro, se considera que esta tendencia se acelerará aún más por la sofisticación de la atención médica, tal como el sistema de diagnóstico por información genética y similares. Además, el impacto de estos altos precios de los medicamentos en el coste nacional de la atención médica también es incalculable. Asimismo, los productos farmacéuticos a base de anticuerpos tan caros se vuelven inaccesibles para los países subdesarrollados, lo que lleva a una mayor desigualdad médica a escala mundial. Si se deben tomar medidas para los problemas mencionados anteriormente desde una perspectiva a más largo plazo, es necesario explorar en el futuro la posibilidad de biofármacos de bajo coste tales como los péptidos de cadena corta, además de buscar un mejor fármaco de siembra.

Fukuda, uno de los autores de la presente invención, dirigió un laboratorio en el Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute en los Estados Unidos durante más de 30 años hasta que fue asignado al National Institute of Advanced Industrial Science and Technology en 2014. Durante ese tiempo, Fukuda logró por primera vez en el mundo inhibir la metástasis del cáncer dependiente de la cadena de azúcar utilizando un péptido que simula la estructura de la cadena de azúcar (documento no de patente 1). Además, en el proceso de examinar los receptores endoteliales vasculares que interactúan con estos péptidos miméticos de la cadena de azúcar, descubrió que un péptido llamado IF7 se une a anexina A1 (Anxa1) (documento no de patente 2). El grupo de Jan Schnitzer et al. esclareció que Anxa1 es la más específica de las moléculas marcadoras específicas de vasos tumorales conocidas actualmente y se expresa intracelularmente en células sanas pero se expresa fuertemente en superficies luminales adyacentes al torrente sanguíneo en células tumorales endoteliales neovasculares (documento no de patente 3). Fukuda et al. esclarecieron que un fármaco (IF7-SN38) obtenido mediante la unión de un agente anticanceroso (SN38) a IF7 elimina el tumor en ratones portadores de cáncer en una dosis baja (documento no de patente 2). Si bien IF7 se une a la región N-terminal de Anxa1 de ratón, la secuencia de aminoácidos en esa región está altamente conservada entre el ratón y el ser humano. Por lo tanto, IF7-SN38 también puede ser útil en seres humanos. Este hallazgo se incluyó en el artículo “In this issue in PNAS” de la revista PNAS y el NIH presentó un artículo especial. El hallazgo acaparó mucha atención, incluidos los informes de los medios de todo el mundo.

S. Hatakeyama y col. (documento no de patente 4) describe la administración dirigida de fármacos a la vasculatura de un tumor mediante un péptido mimético de carbohidratos.

Lista de documentos

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Fukuda et al., Cancer Research, 60: 450-6, 2000.

Documento no de patente 2: Hatakeyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 108: 19587-92, 2011.

Documento no de patente 3: Oh et al., Nature 429: 629-35, 2004.

Documento no de patente 4: S. Hatakeyama et al., PNAS, 6 de diciembre de 2011, vol. 108, n° 49, 19587-19592.

Breve descripción de la invención

Problemas que se resuelven por medio de la invención

Cuando se administra IF7 por vía intravenosa a ratones con cáncer, llega a los vasos sanguíneos que rodean el tumor, después de lo cual IF7 es capturado en las vesículas desde el lado luminal de las células endoteliales vasculares y se mueve hacia el lado basal, donde se libera en el estroma, en el que hay células cancerosas presentes. También en células F2 endoteliales vasculares de ratón, IF7 unido a Anxa1 atravesó activamente las células endoteliales vasculares tumorales por medio de transcitosis. Por lo tanto, se sugirió que IF7 tiene actividad para cruzar la barrera vaso sanguíneotumor cerebral en el tumor cerebral. Sorprendentemente, la inyección intravenosa de IF7 marcado con fluorescencia en ratones modelo de tumores cerebrales en los que se trasplantaron células de glioma dio lugar a la acumulación de fluorescencia a una alta concentración en el sitio del tumor en el cerebro. La fluorescencia también cruzó los vasos sanguíneos y llegó a las células cancerosas en el estroma cerebral. Además, se crearon un tumor subcutáneo y un tumor cerebral en el mismo ratón (modelo de tumor dual) y se probó el efecto terapéutico de IF7-SN38. Como resultado, tanto el tumor cerebral como el tumor subcutáneo fueron suprimidos, y su efecto fue mayor en el tumor cerebral que en el tumor subcutáneo. Se obtuvieron resultados similares en el modelo de tumor cerebral metastásico melanoma B16, y los resultados se mantuvieron iguales incluso cuando el ratón hospedante se cambió por otro de la cepa C57BL/6 o SCID. Estos hechos indican que los DDS dirigidos a Anxa1 no solo cruzan de manera eficiente la barrera tumoral hematoencefálica, sino que también proporcionan excelentes efectos terapéuticos en el tumor cerebral.

Como se describió anteriormente, si bien IF7 tiene una excelente actividad de detección de tumores malignos, adolece de dos problemas para el desarrollo clínico: baja solubilidad y baja estabilidad. En primer lugar, el péptido IF7 es sensible a la proteasa y se degrada fácilmente. De hecho, en un experimento que incluye la administración intravenosa de A488-IF7 a ratones sanos, la señal de fluorescencia de la sangre periférica casi desapareció en aproximadamente 1 hora. Sin embargo, mediante la administración en la vena de la cola a ratones con cáncer, la fluorescencia de A488-IF7 recuperada de la sangre periférica fue significativamente menor que en ratones sanos. Este resultado sugiere que la mayoría de A488-IF7 se acumula rápidamente en el tumor mientras se está degradando. Además, IF7 es altamente hidrofóbico y causa dificultad en la forma de dosificación, por ejemplo, cuando un compuesto unido con un agente anticanceroso se administra por vía intravenosa, se debe añadir un agente tensioactivo para evitar la precipitación después de la disolución en DMSO.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un nuevo péptido que se une a anexina A1 y su uso capaz de superar al menos parcialmente los problemas mencionados anteriormente asociados con IF7.

Medios para resolver los problemas

Para resolver los problemas mencionados anteriormente, los autores de la presente invención realizaron estudios exhaustivos y tuvieron la idea de explorar un péptido de forma D capaz de unirse a la anexina A1. Para este fin, los autores de la presente invención sintetizaron un péptido de forma D (D-MC16) en relación de imagen especular con el péptido de forma L de 16 restos (L-MC16) que tiene un resto Cys modificador añadido a los 15 restos N-terminales de Anxa1 que se sabe que se une a IF7, y se analizó utilizando una biblioteca de fagos T7 para identificar una pluralidad de péptidos de forma L de 7 aminoácidos que se unen a D-MC16. Llevaron a cabo estudios adicionales de un péptido llamado péptido TIT7, que fue particularmente prometedor entre los péptidos de forma L identificados. Como predijeron los inventores, confirmaron que el péptido de forma D (péptido dTIT7), que está en relación de imagen especular con el péptido TIT7, se une a Anxa1. Además, los autores de la presente invención han demostrado mediante experimentos in vivo que los péptidos dTIT7 se acumulan en el sitio del tumor cuando se administran a ratones modelo con tumores cerebrales a través de la vena de la cola, que el péptido dTIT7 (GA-dTIT7) unido a un agente contra el cáncer (geldanamicina) inhibió marcadamente el crecimiento del tumor cuando se administró por vía intravenosa a ratones con cáncer, provocando así necrosis masiva en el sitio del tumor, y que la administración oral de GA-dTIT7 suprimió el crecimiento del tumor tanto en ratones modelo de tumor cerebral trasplantados con células C6 en el cerebro como en ratones modelo con metástasis cerebral trasplantados con las células B16 en el cerebro, y el tumor continuó reduciéndose incluso después del cese de la administración del fármaco, y finalmente se logró una curación completa en algunos animales.

Los autores de la presente invención han realizado estudios adicionales basados en los resultados anteriores y han completado la presente invención. La presente invención es la siguiente:

[1] Un péptido de 7-50 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia de aminoácidos de (i), en donde:

cada símbolo de aminoácido seguido inmediatamente por el símbolo [D] es una forma D del aminoácido:

[1] la secuencia de aminoácidos de T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D].

[2] El péptido según [1], que consiste en la secuencia de aminoácidos del (i) mencionado anteriormente.

[3] Un conjugado que comprende el péptido según [1] o [2], y uno o más componentes.

[4] El conjugado según [3], en el que uno o más componentes comprenden un agente anticanceroso, opcionalmente donde:

(a) el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico anticanceroso, un inhibidor de microtúbulos, una preparación de platino, un inhibidor de topoisomerasa, un agente de direccionamiento molecular y un agente anti-angiogénico; y/o

(b) el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en enocitabina, capecitabina, carmofour, cladribina, gemcitabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, tegafur, tegafur/uracilo, tegafur/Gimeracil/Oteracil potasio, doxifluridina, nelarabina, hidroxicarbamida, fluorouracilo, fludarabina, pemetrexed, pentostatina, mercaptopurina, metotrexato;

ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, busulfán, tiotepa, nimustina, ranimustina, dacarbazina, procarbazina, temozolomida, carmustina, estreptozotocina, bendamustina;

actinomicina D, aclarubicina, amrubicina, idarrubicina, epirrubicina, zinostatina stimalamer, daunorrubicina, doxorrubicina, pirarubicina, bleomicina, peplomicina, mitomicina C, mitoxantrona, doxorrubicina liposomal; vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, oxaliplatino, carboplatino, cisplatino, nedaplatino; camptotecina, irinotecán, nogitecán, SN-38, doxorrubicina, etopósido, levofloxacina, ciprofloxacina; legolafenib, cetuximab, panitumumab, ramsilmab, gefitinib, erlotinib, afatinib, crizotinib, alectinib, ceritinib, libertinib, trastuzumab, lapatinib, pertuzumab, sunitinib, sorafenib, axitinib, pazopanib, nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, vemurafenib, everolimus, tensirolimus, rituximab, bevacizumab, geldanamicina; angiostatina, endostatina, metastatina, anticuerpo anti-VEGF y un inhibidor de VEGFR-2.

[5] El conjugado según [3], en el que uno o más componentes comprenden una sustancia detectable, opcionalmente donde:

(a) la sustancia detectable permite la detección del conjugado in vivo por un medio seleccionado del grupo que consiste en fotografía de rayos X, tomografía computarizada (TC), resonancia magnética nuclear (IRM), ecografía, gammagrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), endoscopia y laparoscopia; y/o

(b) la sustancia detectable es un radioisótopo, un potenciador de MRI, una sustancia radiopaca, un agente de contraste o una sustancia fluorescente; y/o

(c) la sustancia detectable se selecciona del grupo que consiste en un nucleido radiactivo seleccionado de 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 89Zr, 94mTc, 110In, 120I, 124I, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru 99mTc, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 131I, 169Yb, 197Hg y 201Tl;

un ion paramagnético seleccionado entre cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II) , cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), lantano (III), oro (III), plomo (II), bismuto (III);

un compuesto de yodo, un compuesto de bario, un compuesto de galio, un compuesto de talio;

rodamina, fluoresceína, colorante Cy, Flúor Alexa (marca registrada), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), sus derivados y un reactivo fluorescente en el infrarrojo cercano.

[6] Una composición que comprende el péptido según [1] o [2] o el conjugado según uno cualquiera de [3] a [5], y un vehículo farmacológicamente aceptable.

[7] Una composición que comprende el conjugado según [4] y un vehículo farmacológicamente aceptable, para uso en un método de tratamiento del cáncer.

[8] Una composición que comprende el conjugado según [5] y un vehículo farmacológicamente aceptable, para uso en un método de tratamiento del cáncer.

[9] La composición para uso según [7] u [8], en donde el cáncer es un cáncer sólido o un cáncer líquido.

[10] La composición para uso según [9], en donde el cáncer sólido es un cáncer sólido angiogénico; y/o en donde el cáncer sólido es cáncer del cerebro o del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del tracto digestivo, cáncer del aparato urinario o reproductor, cáncer del sistema respiratorio, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de hueso o cáncer de músculo.

[11] La composición para uso de acuerdo con [9] o [10], en donde el cáncer sólido es tumor cerebral, tumor de médula espinal, cáncer de laringe, cáncer oral, cáncer de glándulas salivales, cáncer de seno paranasal, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de ano, cáncer de hígado, cáncer de vías biliares, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pelvis renal y uréter, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, testículos cáncer, cáncer de pene, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de ovario, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma maligno, osteosarcoma o rabdomiosarcoma.

[12] La composición para uso según [11], en donde el cáncer sólido es un tumor cerebral benigno o maligno, opcionalmente en donde:

(a) el tumor cerebral es un tumor cerebral primario o un tumor cerebral metastásico; y/o

(b) el tumor cerebral es meningioma, adenoma hipofisario, schwannoma, astrocitoma, oligodendroglioma, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico o glioblastoma.

[13] La composición para uso según [9], en donde el cáncer líquido es linfoma de células B.

Efecto de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un nuevo péptido que se une a anexina A1.

Como es evidente en el caso de la eritropoyetina y los anticuerpos anti-PD-1 recientes, los productos farmacéuticos clínicamente exitosos tienen una especificidad de expresión de la biomolécula dirigida por fármacos muy alta. Dado que la anexina A1 dirigida por el péptido de la presente invención es la molécula más específica entre los marcadores diana neovasculares conocidos actualmente para tumores malignos, un agente anticanceroso combinado con el péptido de la presente invención puede exhibir un efecto terapéutico superior en comparación con los agentes anticancerosos existentes.

En particular, el conjugado péptido-agente anticanceroso no solo es capaz de acumular un agente anticanceroso en un tumor maligno con alta eficiencia sino que también es resistente a la proteasa, lo que permite una reducción en el número de dosis efectivas e incluso dosis más bajas. Además, se puede esperar una curación completa del tumor maligno mediante el uso combinado de un agente anticanceroso e inmunoterapia, ya que se considera que el sistema inmunitario está conservado.

El rasgo característico de la anexina A1 es que se expresa en el lado de la sangre de las células endoteliales neovasculares formadas en un tumor, y cuando se une al lado de la sangre con un ligando como el péptido de la presente invención, el ligando es transportado al lado basal por transcitosis y se libera activamente en el estroma donde están presentes las células cancerosas. Esta propiedad también puede servir como mecanismo para atravesar activamente la barrera vascular cerebral. El péptido de la presente invención que dirige la anexina A1, a diferencia de los inhibidores de la angiogénesis convencionales (Avastin) y la temozolomida (descritos anteriormente), permite el tratamiento del tumor cerebral maligno mediante un mecanismo innovador. Es decir, actualmente, se han desarrollado agentes quimioterapéuticos que cruzan la barrera hematoencefálica, que se acumulan en el tejido tumoral, y que pueden ser estables en el cuerpo y administrarse por vía oral, pero no existe un agente quimioterapéutico que los combine a todos, excepto el péptido de la presente invención (figura 10).

Dado que el péptido de la presente invención se puede combinar con diversos agentes anticancerosos, puede proporcionar una amplia gama de actividad fisiológica.

La presente invención supone un gran avance para el tratamiento de tumores cerebrales. Además, se sabe que ANXA1 se expresa en las superficies vasculares de diversos tumores malignos, y cabe esperar que un agente anticanceroso unido a dTIT7 sea clínicamente aplicable como agente terapéutico no solo a tumores cerebrales sino también a una amplia gama de cánceres.

Además, dado que el péptido de la presente invención permite una fácil síntesis y modificación química, es altamente prometedor como biofármaco de tamaño de molécula intermedio para reemplazar a los fármacos de tipo anticuerpo. En particular, dado que el péptido de la presente invención puede ser un péptido de cadena corta (por ejemplo, 7 restos de aminoácidos), puede producirse económicamente por síntesis química.

Además, el péptido de la presente invención y un conjugado que contiene el péptido y otra parte funcional tienen una estabilidad excelente y también pueden usarse como fármacos para administración oral. Por lo tanto, los ensayos clínicos también son fáciles. Después de ser aprobado como medicamento, se puede extender como fármaco incluso en los países subdesarrollados donde las instalaciones médicas son escasas.

Además, un conjugado que contiene el péptido de la presente invención y una sustancia detectable es útil, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico de cáncer. Los autores de la presente invención intentaron realizar pruebas de PET en ratones que utilizaron IF7 en el pasado, pero no se obtuvieron imágenes específicas del tumor. Se considera que el motivo del fallo es que el IF7 unido a un reactivo radioactivo quedó enterrado dentro del compuesto debido al carácter altamente hidrofóbico de IF7. El péptido de la presente invención puede ser soluble en agua y, por lo tanto, puede superar este problema. El péptido de la presente invención permite una modificación relativamente fácil de, por ejemplo, el extremo N-terminal, puede marcarse con reactivos para generar imágenes en 3D como PET, y puede desarrollarse como un agente de diagnóstico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un efecto de direccionamiento de IF7 a tumores cerebrales. Secciones de tejido cerebral después de la administración intravenosa de IF7-A488 a ratones modelo de tumor cerebral. A488 (izquierda) y Hoechst (derecha, sitio del tumor). RQ7 es un control negativo de secuencia inversa de IF7. Barras; 5 mm.

La figura 2 muestra una imagen microscópica de fluorescencia de una sección de tejido de tumor cerebral de un ratón tratado con IF7 marcado con fluorescencia. Una vista ampliada de la sección de tejido del tumor cerebral que se muestra en la figura 1. Las células endoteliales vasculares se tiñeron con un anticuerpo específico de CD31 (rojo). IF7-A488 (verde) pasó a través de los vasos sanguíneos para llegar a las células cancerosas en el estroma. RQ7 es un control de secuencia inversa de IF7. Barras; 40 pm.

La figura 3 explica un ratón modelo con tumor dual. Para investigar la influencia sobre la barrera tumoral vascularcerebral (BBTB), en el cerebro y debajo de la piel de un ratón se trasplantaron células cancerosas que expresan luciferasa (Luc), para crear un tumor. Cuando BBTB inhibe la penetración del fármaco anticanceroso administrado a través de la vena de la cola en el tumor cerebral (BBTB+), los efectos del fármaco anticanceroso aparecen solo en el tumor subcutáneo. Por otro lado, cuando el fármaco anticanceroso penetra en el tumor cerebral (BBTB-), es efectivo tanto en el cerebro como en los tumores subcutáneos.

La figura 4 muestra los efectos terapéuticos de IF7-SN38 en un tumor cerebral. En el cerebro y debajo de la piel de un ratón SCID inmunodeficiente, se trasplantaron células C6-Luc (células que expresan de manera forzada luciferasa en glioma de rata) para crear un tumor que da un modelo de tumor dual. Se administró IF7-SN38 diariamente a través de la vena de la cola, se midió la luminiscencia debida a la actividad de luciferasa en el tumor y se determinó la viabilidad de las células C6-Luc. IF7-SN38 no solo inhibió el crecimiento del tumor cerebral, sino que también inhibió el tumor cerebral con más fuerza que el tumor subcutáneo.

La figura 5 muestra el análisis cuantitativo de la fluorescencia restante en la sangre de A488-IF7 administrado por vía intravenosa a ratones con cáncer y ratones sanos. A488-IF7 se administró a través de la vena de la cola a ratones con carcinoma subcutáneo de melanoma B16, y se extrajo sangre periférica de la vena ocular a lo largo del tiempo y se midió la fluorescencia. La fluorescencia recuperada disminuyó dependiendo del tamaño del tumor.

La figura 6 explica la selección del péptido de forma D que se une a Anxa1. (A) Método de identificación de la secuencia peptídica de la forma D mediante una pantalla de imagen especular. IF7 se une al péptido terminal Anxa1 N ((1) forma L de MC16) que consiste en 16 restos de aminoácidos. (2) Se sintetiza la forma D de MC16 y se selecciona la secuencia de unión a la misma. (3) El péptido de forma L obtenido se sintetiza con el D-aminoácido para formar un péptido de forma D que se une a Anxa1. (B) Resultados de la selección de D-MC16 que se dirige a la biblioteca de fagos. Se observó un enriquecimiento de fagos en cada ronda. (C) Análisis de secuencia de fagos T7 específicos de D-MC16 por secuenciador de próxima generación. (D) Péptidos enriquecidos y proporción de los mismos. (E) Confirmación de la unión del fago TIT7 a D-MC16 (experimento de formación de placa).

La figura 7 muestra los resultados del experimento de administración de IRDye-dTIT7. Las células de glioma de rata (C6-Luc) que expresaban luciferasa forzadamente se trasplantaron en el cerebro de un ratón desnudo para preparar un ratón modelo de tumor cerebral. Se inyectó dTIT7 (IRDye-dTIT7, producto no purificado) marcado con reactivo fluorescente de infrarrojo cercano (IRDye 800CW) en la vena de la cola, y se observó fluorescencia a lo largo del tiempo con un reproductor de imágenes IVIS. Se observó acumulación de señales de fluorescencia en el sitio del tumor cerebral y el riñón después de 24 horas. (A) Imagen general a lo largo del tiempo. (B). Fotografía ampliada. (C) Cuantificación de la señal mediante un software del reproductor de imágenes IVIS.

La figura 8 muestra la estructura del condensado GA-dTIT7. Se introduce un grupo amino en geldanamicina para unirse a un enlazador de maleimida. Se añade cisteína de antemano al extremo C-terminal de dTIT7 para realizar la síntesis. Se hace reaccionar con maleimida a través del grupo sulfhidrilo del resto de cisteína para dar el condensado GA-dTIT7.

La figura 9 muestra los resultados del experimento que incluye la administración oral de un fármaco de dTIT7 unido con un agente anticanceroso, gerdanamicina (GA) (GA-dTIT7), a un ratón modelo de tumor cerebral cada dos días. La supervivencia del tumor cerebral se cuantificó por luminiscencia por luciferasa. GA-dWIP7 que contiene WIPTTMT (péptido en donde se cambió el orden de la secuencia de D-aminoácido que constituye dTIT7) unido con geldanamicina se administró como control a un ratón. Se muestra un gráfico (arriba a la derecha) que cuantifica la señal celular viable (izquierda) del tumor maligno y la curva de supervivencia (abajo a la derecha).

La figura 10 explica conceptualmente el tratamiento dirigido del tumor cerebral maligno con IF7, un agente anticanceroso unido a dTIT7. Por conveniencia, se consideró que la barrera hematoencefálica estaba presente por encima del cuello. Los fármacos anticancerosos generales no tienen la capacidad de dirigirse al tumor. La temozolomida penetra en el tumor cerebral en cierta medida pero no se concentra. Avastin actúa sobre nuevos vasos sanguíneos, pero no actúa directamente sobre las células tumorales. En cambio, el péptido unido a Anxa1 atraviesa la barrera tumoral hematoencefálica y se acumula solo en el tumor a una concentración alta.

La figura 11 muestra los resultados de las interacciones intermoleculares de Anxa1 con los péptidos dLRF7, dSPT7, dMPT7 y dLLS7. Todos los péptidos ensayados mostraron una unión positiva a Anxa1.

La figura 12 muestra los resultados del experimento de administración de IRDye-dLRF7, IRDye-dSPT7, IRDye-dMPT7 e IRDye-dLLS7 a ratones desnudos de modelo de tumor cerebral. Todos los ratones, excepto los inyectados con dLLS7, mostraron señales fuertes en el sitio del tumor cerebral, y tres péptidos de dLRF7, dMPT7 y dSPT7, distintos de dLLS7, mostraron una capacidad de direccionamiento a tumores cerebrales a través de la vía vascular.

Descripción detallada de la invención

1. Péptido

La presente divulgación proporciona un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (I)-(III) a continuación.

(I) una secuencia de aminoácidos de (X1 )[D]P[D](X2)[D] en donde X1 es W o F, X2 es S o T,

(II) una secuencia de aminoácidos de P[D]T[D](X)ⁿF[D] en donde (X)ⁿ son cualesquier aminoácidos en número n seleccionados independientemente entre sí, n es un número entero de 0-4,

(III) una secuencia de aminoácidos que es un Retro-inverso de la secuencia de aminoácidos de cualesquiera de los (I) antes mencionados y los (II) antes mencionados.

La presente invención también proporciona un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los siguientes (i):

(i) una secuencia de aminoácidos de T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D].

También se describe aquí un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de cualesquiera de los siguientes (ii)-(vii):

(ii) una secuencia de aminoácidos de L[D] R[D] F[D] P[D] T[D] V[D] L[D],

(iii) una secuencia de aminoácidos de L[D] L[D] S[D] W[D] P[D] S[D] A[D],

(iv) una secuencia de aminoácidos de S[D] P[D] T[D] S[D] L[D] L[D] F[D],

(v) una secuencia de aminoácidos de M[D] P[D] T[D] L[D] T[D] F[D] R[D],

(vi) una secuencia de aminoácidos de cualesquiera de (i)-(v) mencionadas anteriormente, en las que se han insertado, sustituido o eliminado 1 o varios aminoácidos, o estos se han combinado,

(vii) una secuencia de aminoácidos que es un Retro-inverso de la secuencia de aminoácidos de cualesquiera de las (i)-(vi) mencionadas anteriormente.

En la presente memoria descriptiva, la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica se describe de acuerdo con la manera convencional de indicación de péptidos con la región N-terminal en el lado izquierdo y la región C-terminal en el lado derecho. Además, cada símbolo de aminoácido con el símbolo [D] inmediatamente después de la secuencia de aminoácidos indica una forma D del aminoácido, y cada símbolo de aminoácido sin el símbolo [D] inmediatamente después de la secuencia de aminoácidos indica una forma L del aminoácido, salvo indicación en contrario. En la presente memoria descriptiva, un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de (i) mencionada anteriormente se denomina péptido de la presente invención.

La secuencias de aminoácidos de (I) mencionadas antes pueden ser cualquiera de W[D] P[D] S[D], W[D] P[D] T[D], F[D] P[D] S[D] y F[D] P[D] T[D].

En la secuencia de aminoácidos de (II) mencionada anteriormente, el número entero n es de 0 a 4, preferiblemente de 2 a 3. X puede ser cualquier aminoácido seleccionado independientemente uno de otro.

El péptido de la presente invención puede consistir en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (i) mencionada anteriormente, o puede tener uno o más aminoácidos añadidos en el lado N-terminal y/o el lado C-terminal de la secuencia.

En la presente memoria descriptiva, el péptido se refiere a uno en donde dos o más aminoácidos están unidos por péptidos. La longitud del péptido de la presente invención no está particularmente limitada. El péptido de la presente invención puede contener al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 aminoácidos. El péptido de la presente invención puede consistir en hasta 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 aminoácidos. El péptido de la presente invención puede tener una longitud de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-40 o 8-50 aminoácidos. Por ejemplo, el péptido de la presente invención puede tener una longitud de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos. El péptido de la presente invención puede estar compuesto por una combinación de un aminoácido de forma D y un aminoácido de forma L. Con más detalle, todos los aminoácidos que constituyen el péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de (i) mencionada anteriormente pueden ser aminoácidos de forma D, pueden contener el aminoácido de forma L, además de los aminoácidos de forma D. El aminoácido de forma L puede ser un aminoácido de forma L de origen natural y los ejemplos incluyen glicina, alanina, leucina, prolina, fenilalanina, tirosina, metionina, serina, treonina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, lisina, arginina, hidroxilisina, histidina, triptófano, valina, todos los cuales están en la forma L. El aminoácido de forma D incluye, por ejemplo, un isómero óptico de un aminoácido de forma L como se ha descrito anteriormente. En la presente memoria descriptiva, la glicina, que es un aminoácido que no presenta actividad óptica, puede leerse como un aminoácido de forma L y de forma D, a menos que sea contrario al contexto.

El péptido de la presente invención puede contener un aminoácido modificado o inusual como los mencionados en 37 C.F.R. 1.821-1.822 y similares. En una realización, el péptido de la presente invención no contiene un aminoácido modificado o inusual. Los ejemplos de aminoácidos modificados o inusuales incluyen ácido 3-aminoadípico, p-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metililsina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina y similares.

Los extremos amino terminal y/o carboxi terminal del péptido de la presente invención pueden modificarse. La modificación del extremo amino terminal puede ser metilación (por ejemplo, -NHCH³ o -N(CH³)²), acetilación (por ejemplo, por ácido acético o su derivado halogenado del mismo), o se puede introducir cualquier grupo protector tal como grupo benciloxicarbonilo, grupo funcional carboxilato (RCOO-) o grupo funcional sulfonilo (R-SO²-) (en donde R se selecciona de alquilo, arilo, heteroarilo y alquilarilo, y similares). La modificación del extremo carboxi terminal incluye amidación (-CONH²), esterificación (-COOR) y similares. Aquí, como R en el éster se usan, por ejemplo, un grupo alquilo de C^1-6 tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo; un grupo cicloalquilo de C^3-8 tal como ciclopentilo, ciclohexilo; un grupo arilo de C^6-12 tal como fenilo, a-naftilo; un grupo fenil-alquilo de C^1-2 tal como bencilo, fenetilo; un grupo aralquilo de C^7-14 tal como un grupo a-naftil-alquilo de C^1-2; un grupo pivaloiloximetilo y similares.

El péptido de la presente invención puede sufrir varias modificaciones distintas de las del extremo N-terminal o C-terminal. La modificación química puede ser, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación y similares. Cuando el péptido de la presente invención tiene un grupo carboxilo (o carboxilato) en un sitio distinto del C-terminal, el grupo carboxilo puede estar amidado o esterificado. Como éster en este caso, por ejemplo, se usan el éster C-terminal descrito anteriormente y similares. Alternativamente, los sustituyentes en la cadena lateral del aminoácido en una molécula (por ejemplo, -OH, -SH, grupo amino, grupo imidazol, grupo indol, grupo guanidino, etc.) pueden protegerse con un grupo protector apropiado (por ejemplo, grupo acilo de C^1-6 tal como grupo alcanoílo de C^1-6 tal como formilo, acetilo, etc.).

El péptido de la presente invención que contiene la secuencia de aminoácidos de (vi) mencionada anteriormente puede contener una secuencia parcial que consiste en cuatro aminoácidos consecutivos, una secuencia parcial que consiste en cinco aminoácidos consecutivos o una secuencia parcial que consiste en seis aminoácidos consecutivos en las secuencias de aminoácidos de (i)-(v) mencionadas anteriormente. Concretamente, por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos original es la secuencia de aminoácidos de (i) mencionada anteriormente, el péptido puede contener la secuencia de aminoácidos de T[D] I[D] T[D] W[D], la secuencia de aminoácidos de I[D] T[D] W[D] P[D], la secuencia de aminoácidos de T[D] W[D] P[D] T[D], la secuencia de aminoácidos de W[D] P[D] T[D] M[D], la secuencia de aminoácidos de T[D] I[D] T[D] W[D] P[D], la secuencia de aminoácidos de I[D] T[D] W[D] P[D] T[D], la secuencia de aminoácidos de t [d ] W[D] P[D] T[D] M[D], el aminoácido secuencia de T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] o la secuencia de aminoácidos de I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D].

La posición de la mutación (es decir, la inserción, la sustitución, la eliminación y la combinación de las mismas) en la secuencia de aminoácidos de (vi) mencionada anteriormente no está particularmente limitada. La mutación puede consistir en (a) solo inserción, (b) solo sustitución, (c) solo eliminación, (d) solo inserción y sustitución, (e) solo inserción y eliminación, (f) solo sustitución y eliminación, o (g) una combinación de inserción, sustitución y eliminación. El número de mutaciones en (a)-(g) mencionadas anteriormente es, por ejemplo, 1-5, preferiblemente 1-4, más preferiblemente 1-3, aún más preferiblemente 1 o 2, incluso más preferiblemente 1.

El aminoácido insertado en la secuencia de aminoácidos de (vi) mencionada anteriormente puede ser cualquier aminoácido descrito anteriormente. El aminoácido puede ser un aminoácido de forma L o de forma D, por ejemplo, un aminoácido de forma L de origen natural descrito anteriormente, o un aminoácido de forma D que es un isómero óptico del mismo. El aminoácido también puede sufrir varias modificaciones químicas descritas anteriormente.

Preferiblemente, la sustitución en la secuencia de aminoácidos de (vi) mencionada anteriormente es una sustitución de aminoácidos conservadora. La "sustitución de aminoácidos conservadora" es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservadora se puede definir como una sustitución entre aminoácidos que tienen propiedades similares de la cadena lateral. Por lo tanto, la sustitución de aminoácidos conservadora puede ser, por ejemplo, (1) sustitución entre aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr), (2) sustitución entre aminoácidos alifáticos no polares (Gly, Ala, Val, Leu, Met , Ile, Pro), (3) sustitución entre aminoácidos polares sin carga (Ser, Thr, Cys, Asn, Gln), (4) sustitución entre aminoácidos básicos (Lys, Arg, His) o (5) sustitución entre aminoácidos ácidos (Asp, Glu). En la presente memoria descriptiva, la sustitución de aminoácidos conservadora también puede incluir la sustitución de un aminoácido de forma D por un aminoácido de forma L que es un isómero óptico del mismo. Por lo tanto, la sustitución de aminoácidos conservadora también puede ser una sustitución entre dos aminoácidos de forma L, una sustitución entre dos aminoácidos de forma D, o una sustitución entre un aminoácido de forma L y un aminoácido de forma D dentro de los grupos (1)-(5) mencionados antes.

En un aspecto, la secuencia de (vi) mencionada anteriormente puede estar incluida en la secuencia de (I) o (II) mencionada anteriormente. En este caso, la secuencia de (vii) mencionada anteriormente está incluida en la secuencia de (III) mencionada anteriormente. En tales aspectos, el cuarto aminoácido puede ser W[D] o F[D] y el quinto aminoácido puede ser P[D] y el sexto aminoácido puede ser T[D] o S[D] en la secuencia de (i) mencionada anteriormente, el tercer aminoácido puede ser W[D] o F[D] y el cuarto aminoácido puede ser P[D] y el quinto aminoácido puede ser T[D] o S[D] en la secuencia de (ii) mencionada anteriormente, el cuarto aminoácido puede ser W[D] o F[D] y el quinto aminoácido puede ser P[D] y el sexto aminoácido puede ser T[D] o S[D] en la secuencia de (iii) mencionada anteriormente, el segundo aminoácido puede ser P[D] y el tercer aminoácido puede ser T[D] y el sexto aminoácido puede ser F[D] en el secuencia de (iv) mencionada anteriormente, y, el segundo aminoácido puede ser P[D] y el tercer aminoácido puede ser T[D] y el quinto aminoácido puede ser F[D] en la secuencia de (v) mencionada anteriormente.

Isómero retro-inverso del péptido se refiere a un péptido en donde la quiralidad de cada resto de aminoácido está invertida ("inverso") y la dirección de la secuencia de aminoácidos está invertida ("Retro") con respecto al péptido original. Se sabe que el isómero retro-inverso muestra una estructura y función similares a las del péptido original (por ejemplo, Acc. Chem. Res., 1993, 26(5), pgs 266 273, y PLoS One. 2-12-2013; 8(12):e80390). Específicamente, la secuencia de aminoácidos de (vii) mencionada anteriormente incluye, por ejemplo, MTPWTIT (SEQ ID NO: 1) que es el Retro-inverso de la secuencia de (I) antes mencionada, LVTPFRL (SEQ ID NO: 2) que es el Retro-inverso de la secuencia de (ii) mencionada anteriormente, ASPWSLL (SEQ ID NO: 3) que es el Retro-inverso de la secuencia de (FL) mencionada anteriormente, FLLSTPS (SEQ ID NO: 4) que es el Retro-inverso de la secuencia de (iv) antes mencionada y RFTLTPM (SEQ ID NO: 5) que es el Retro-inverso de la secuencia de (v) mencionada anteriormente.

El péptido puede contener dos o más secuencias seleccionadas de (I)-(III) y (i)-(vii) mencionadas anteriormente. El péptido puede contener una repetición en tándem de cualquiera de las secuencias de (I)-(III) y (i)-(vii) mencionadas anteriormente (es decir, una estructura en la que porciones de secuencia idénticas están directamente enlazadas entre sí). En otro aspecto, el péptido puede contener una estructura en la que dos o más secuencias diferentes de (I)-(III) y (i)-(vii) mencionadas anteriormente están directamente enlazadas. Las estructuras de repetición específicas incluyen, por ejemplo, T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]-T[D]I[D]T[D]E[D]P[D]T[D]M[D], y T[D]I[D]T[D]-T[D]I[D]T[D]. Alternativamente, el péptido de la presente invención puede constituir un péptido multivalente con un dendrímero.

El péptido de la presente invención puede ser una forma libre o una forma de sal. Los ejemplos de la sal del péptido de la presente invención incluyen una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable y una sal de adición de base. Los ejemplos de la sal de adición de ácido incluyen sales con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y sales con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico y similares. Los ejemplos de la sal de adición de base incluyen sales con metales alcalinos tales como sodio, potasio y similares, sales con metales alcalinotérreos tales como calcio, magnesio y similares, y sales con aminas tales como amonio, trietilamina y similares.

El péptido de la presente invención puede unirse a la anexina A1. La anexina A1 (Anxa1) es una proteína conocida que pertenece a la familia de las anexinas, también conocida como lipocortina 1. La secuencia genética y la secuencia de aminoácidos de Anxa1 son conocidas para varias especies. Por ejemplo, pueden mencionarse RefSeq No. NM-^{000700.2 (SEQ ID NO: 6) del ARNm, RefSeq No. NP-000691.1} (SeQ iD ^{NO: 7) de proteína para Anxa1 humana; RefSeq No. NM-010730.2 (SEQ ID NO: 8) de ARNm, RefSeq No. NP-034860.2} [aRreGlO ^ID nO: ^{9] de proteína para} Anxa1 de ratón. El péptido de la presente invención puede unirse a la región N-terminal de Anxa1. Más particularmente, el péptido de la presente invención puede unirse a una región que consiste en los aminoácidos 1° a 15° de la SEQ ID NO: 7 en Anxa1 humana o una región que consiste en los aminoácidos 1° a 15° de la SEQ ID NO: 9 en Anxa1 murina. El péptido de la presente invención puede tener una constante de disociación (valor Kd) de preferiblemente menos de 10-6 M, más preferiblemente menos de 10-7 M, más aún más preferiblemente menos de 5 x 10-8 M cuando, por ejemplo, se miden interacciones intermoleculares con la Anxa1 de ratón o humana utilizando el método QCM (Microbalanza de cristal de cuarzo). Para la medición mencionada anteriormente, se puede usar la proteína Anxa1 recombinante humana que consiste en 346 restos de aminoácidos, que está disponible comercialmente en ATGen Corporation (Seongnam-si, Corea del Sur).

El péptido de la presente invención se puede producir de acuerdo con un método de síntesis de péptidos conocido. El método de síntesis de péptidos puede ser cualquiera de, por ejemplo, un procedimiento de síntesis en fase sólida y un procedimiento de síntesis en fase líquida. El péptido objeto puede producirse condensando un aminoácido o péptido parcial capaz de constituir el péptido de la presente invención y la porción restante y, cuando el producto tiene un grupo protector, eliminando el grupo protector.

Aquí, la condensación y eliminación de un grupo protector se puede realizar de acuerdo con un método conocido per se, por ejemplo, los métodos descritos en las siguientes citas (1)-(8).

(1) M. Bodanszky & M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)

(2) Schroeder & Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)

(3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), published by Maruzen Co. (1975)

(4) Haruaki Yajima y Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)

(5) Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, published by Hirokawa Shoten.

(6) Stewart, J.M. & Young, J.D., “Solid phase peptide synthesis (2a ed.)”, Pierce Chemical Company, Rockford (1984)

(7) Atherton, E. & Sheppard, R.C., “Solid Phase peptide synthesis: a practical approach”, IRL Press, Oxford (1989)

(8) “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Series)”, Oxford University Press (2000)

El péptido así obtenido se puede purificar y aislar mediante un método de purificación conocido. Los ejemplos del método de purificación incluyen extracción con disolventes, destilación, cromatografía en columna, cromatografía líquida, recristalización, combinaciones de los mismos y similares.

Cuando el péptido obtenido mediante el método mencionado anteriormente está en forma libre, la forma puede convertirse en una sal adecuada mediante un método conocido o un método análogo al mismo; a la inversa, cuando el péptido se obtiene en forma de una sal, la sal puede convertirse en una forma libre u otra sal mediante un método conocido o un método análogo al mismo.

Como se indicó aquí anteriormente, se sabe que la anexina A1 tiene la mayor especificidad entre las moléculas marcadoras específicas de vasos tumorales conocidas actualmente, y se expresa intracelularmente en células sanas, pero se expresa fuertemente en la superficie luminal adyacente a la corriente sanguínea en células endoteliales neovasculares tumorales (Oh et al., Nature 429: 629-35, 2004). Por lo tanto, el péptido de la presente invención puede unirse selectivamente a tumores angiogénicos in vivo. Además, Anxa1 se expresa en el lado de la sangre de las células endoteliales neovasculares formadas en tumores, y cuando se une en el lado de la sangre a ligandos como los péptidos presentes, los ligandos se transportan al lado basal mediante transcitosis y se liberan activamente en el estroma donde hay células cancerosas presentes. Por lo tanto, el péptido de la presente invención puede dirigirse a tumores malignos in vivo. Por lo tanto, el péptido de la presente invención es útil, por ejemplo, para dirigirse a tumores malignos.

2. Conjugado

La presente invención también proporciona un conjugado en donde uno o más componentes están unidos con el péptido mencionado anteriormente de la presente invención (aquí en lo sucesivo, también se le llamará conjugado de la presente invención).

El componente no está particularmente limitado siempre que pueda unirse al péptido de la presente invención, y pueda ser adecuado para la administración a un animal (por ejemplo, un ser humano), y pueda realizar alguna función en el cuerpo del animal. El componente puede ser natural o no natural. Los ejemplos del componente incluyen, pero no se limitan a, materiales biológicos (por ejemplo, células, fagos, virus, etc.), oligonucleótidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, quimera de ADN/ARN, etc.), péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, lípido, polisacárido, compuestos de moléculas pequeñas (por ejemplo, compuestos orgánicos o inorgánicos de no más de 1000 Da), partículas (por ejemplo, partículas de oro, varias nanopartículas, etc.), combinaciones de los mismos, y similares.

El componente puede realizar una funcionalidad dada en un sitio diana en el cuerpo de un animal (por ejemplo, un ser humano). El tipo de funcionalidad no está particularmente limitado. Dado que el conjugado de la presente invención puede dirigirse a un tumor maligno por la acción de la parte correspondiente al péptido de la presente invención, los ejemplos preferidos de la funcionalidad incluyen actividad anticancerosaa y provisión de detectabilidad. Por lo tanto, el componente puede ser, por ejemplo, un agente anticanceroso o una sustancia detectable.

(Agente anticanceroso)

En la presente memoria descriptiva, el agente anticanceroso se refiere a un fármaco destinado a suprimir el crecimiento de un tumor maligno (cáncer). El mecanismo de acción del agente anticanceroso no está particularmente limitado. El agente anticanceroso puede ser un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico anticanceroso, un inhibidor de microtúbulos, una preparación de platino, un inhibidor de topoisomerasa, un agente de direccionamiento molecular, o similares. El conjugado de la presente invención puede contener dos o más agentes anticancerosos iguales o diferentes.

El antagonista metabólico puede ser, por ejemplo, un antimetabolito de ácido fólico, un inhibidor de la dihidropteroato sintasa, un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (inhibidor de la DHFR), un inhibidor del metabolismo de la pirimidina, un inhibidor de la timidilato sintasa, un inhibidor del metabolismo de la purina, un inhibidor de IMPDH, un inhibidor de la ribonucleótido reductasa, un inhibidor de la ribonucleótido reductasa, un análogo de nucleótido, L-asparaginasa y similares. Los ejemplos específicos del antagonista metabólico incluyen enocitabina (SUNRABIN), capecitabina (Xeloda), carmofour (Mifurol), cladribina (Leustatin), gemcitabina (Gemzar), citarabina (kilosida), fosfato de citarabina (Starasid), tegafur (Achillon, AFTHOUR, Tefseal, Futrafur, Lunasin, etc.), tegafur/uracilo (UFT), tegafur/Gimeracil/Oterasil potásico (TS-1: T-S-One), doxifluridina (FURTURON), nelarabina (Arranon G), hidroxicarbamida (HYDREA), fluorouracil (5-FU, carzonal, Benton, Lunachol, Lunapon), fludarabina (fludara), pemetrexed (alimta), pentostatina (cofolin), mercaptopurina (leucerina), metotrexato (metotrexato) y similares.

Los ejemplos específicos del agente alquilante incluyen agentes alquilantes a base de mostaza nitrogenada como ciclofosfamida (endoxano), ifosfamida (ifomida), melfalán (alkeran), busulfan, tiotepa (tespamina) y similares, agentes alquilantes basados en nitrosourea como nimustina (nidran), ranimustina (cimerina), dacarbazina (dacarbazina), procarbazina (hidrocloruro de procarbazina), temozolomida (Temodal), carmustina (Gliadel), estreptozotocina (zanosar), bendamustina (treakisim) y similares.

Los ejemplos específicos del antibiótico anticanceroso incluyen actinomicina D (cosmegen), aclarrubicina (aclacinona), amrubicina (Calsed), idarrubicina (idamicina), epirrubicina (hidrocloruro de epirrubicina, Farmarrubicina), zinostatin stimalamer (Smancs), daunorrubicina (daunomicina), doxorrubicina (adriacina), pirarrubicina (Pinorubin, THERARUBICIN), bleomicina (Bleo) peplomicina (Peleo), mitomicina C (mitomicina), mitoxantrona (Novantrum), doxorrubicina liposomal (Doxil) y similares.

Los ejemplos del inhibidor de microtúbulos incluyen inhibidores de la polimerización de microtúbulos del tipo alcaloides de la vinca tales como vinblastina (exal), vincristina (oncovin), vindesina (Fildesin) y similares, inhibidores de la despolimerización de los microtúbulos del tipo taxano tales como paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere) y similares.

Los ejemplos de la preparación de platino incluyen oxaliplatino (E1 Prat), carboplatino (Carboplatino, Carbomerck, Paraplatino), cisplatino (IA-call, Konaburi, Cisplatino, etc.), nedaplatino (Aqupla) y similares.

Los ejemplos del inhibidor de topoisomerasa incluyen inhibidores de topoisomerasa de tipo I tales como camptotecina y un derivado de la misma (por ejemplo, irinotecán (Campto), nogitecán (HYCAMTIN), SN-38 y similares) y similares; inhibidores de la topoisomerasa de tipo II, como los medicamentos de antraciclina tales como la doxorubicina (adriacina) y similares, medicamentos de tipo epipodofilotoxina como el etopósido (Lastet, VePesid) y similares, y los medicamentos de quinolona, como levofloxacina (cravit), ciprofloxacina (ciproxano) y similares.

Los ejemplos de medicamentos de direccionamiento molecular incluyen regorafenib (Stivarga), cetuximab (Erbitux), panitumumab (Vectibix), ramsilmab (Cyramza), gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), afatinib (GIOTRIF), crizotinib (XALKORI), alectinib (ALECENSA), ceritinib, Lenvatinib (Lenvima), trastuzumab (Herceptin), lapatinib (Tykerb), pertuzumab (PERJETA), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib (Inlyta), pazopanib (Votriento), Nivolumab ^{(OPDIVO), pembrolimazab, ipilimumab} (^yE^rVOY), ^{vemurafenib (ZELBORAF), everolimus (AFINITOR), temsirolimus} (TORISEL), rituximab (Rituxan), bevacizumab (Avastin), geldanamicina y similares.

El agente anticanceroso también puede ser un agente antiangiogénico. El agente antiangiogénico puede ser uno que inhiba el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) u otro factor angiogénico, o un receptor del mismo. Los ejemplos específicos del agente antiangiogénico incluyen angiostatina, endostatina, metastatina, anticuerpo anti VEGF (por ejemplo, Avastin), inhibidor de VEGFR-2 (por ejemplo, SU5416, SU6668), y similares.

(Sustancia detectable)

En la presente memoria descriptiva, la sustancia detectable se refiere a cualquier sustancia que hace que el conjugado de la presente invención contenga la sustancia detectable. Preferiblemente, la sustancia detectable permite la detección del conjugado de la presente invención in vivo directa o indirectamente usando un medio apropiado de visualización o formación de imágenes. Los ejemplos de medios de visualización o imagen incluyen, entre otros, fotografía de rayos X, tomografía computarizada (TC), imagen de resonancia magnética nuclear (MRI), ultrasonografía, escintigrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), endoscopia, laparoscopia y similares. La sustancia detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un agente potenciador para la MRI (por ejemplo, iones paramagnéticos), una sustancia radiopaca, un agente de contraste, una sustancia fluorescente o similares.

Ejemplos del núclido radioactivo útil para el PET incluyen 18F, 51Mn, ^52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, ^82mRb, 83Sr, 86Y, 89Zr, ^94mTc, 110In, 120I, 124I, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru, ^99mTc, 111In, ^114mIn, 123I, ^{1251 1311 169Yb 197Hg y 201}t|

Los ejemplos preferibles del ion paramagnético incluyen cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III) y similares, y el gadolinio es particularmente preferible. Además, metales como el lantano (III), oro (III), plomo (II), bismuto (III) y similares también son útiles para la obtención de imágenes de rayos X y similares.

Los ejemplos de sustancia radiopaca y agente de contraste incluyen compuestos de yodo (por ejemplo, ácidos yódicos orgánicos tales como ácido yodocarboxílico, yodoformo, triyodofenol, tetrayodoetileno, etc.), compuestos de bario (por ejemplo, sulfato de bario y similares), compuestos de galio (como el citrato de galio), compuestos de talio (como el cloruro de talio) y similares.

Los ejemplos de sustancias fluorescentes incluyen rodamina, fluoresceína, colorante Cy, Alexa (marca registrada) Flúor, ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), sus derivados y similares. Reactivos fluorescentes en el infrarrojo cercano, como la indocianina, también se ejemplifican como sustancias fluorescentes preferibles.

(Unión del péptido de la presente invención al componente)

El modo de unión del péptido de la presente invención a uno o más componentes en el conjugado de la presente invención no está particularmente limitado. La unión puede ser directa o indirecta a través de un enlazador, etc. La unión puede ser por unión covalente, unión no covalente, o una combinación de las mismas. Pueden unirse uno o más componentes directa o indirectamente en la posición N-terminal, C-terminal u otra posición del péptido de la presente invención. La unión de un péptido a otro componente (o segundo péptido) es bien conocida en la técnica, y la unión puede ser por cualquier medio conocido en el conjugado de la presente invención.

Por ejemplo, cuando la unión es a través de un enlazador, se pueden usar entrelazadores conocidos tales como éster NHS, éster imida, maleimida, carbodiimida, alil azida, diazilina, isocianuro, psoraleno y similares. Dependiendo del entrelazador a usarse, el péptido de la presente invención puede modificarse según sea apropiado. Por ejemplo, se puede añadir una cisteína por adelantado al extremo C-terminal del péptido de la presente invención para unirse con enlazador maleimida.

Para unir el metal radiactivo o el ion paramagnético mencionado anteriormente al péptido de la presente invención, se puede usar un agente quelante apropiado (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido 4,7,10-tetraazaciclododano-N-N’,N” ,N’’’- tetraacético (DOTA) y similares) y/o metalotioneína y similares. Véase, por ejemplo, Culali Aktolun et al. ed., “Nuclear Medicine Therapy: Principles and Clinical Applications”, Springer, 2013 y similares.

3. Composición

La presente invención también proporciona una composición que contiene el péptido o conjugado de la presente invención y un portador farmacológicamente aceptable (en lo sucesivo, también se llamará composición de la presente invención). La composición se puede proporcionar en una forma de dosificación adecuada para administración oral o parenteral.

Los ejemplos de la composición para administración parenteral incluyen inyección, supositorio y similares. La inyección puede incluir formas de dosificación tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intravenosa por goteo y similares. Dichas inyecciones se pueden preparar de acuerdo con un método conocido. Como método para preparar una inyección, por ejemplo, el péptido o conjugado de la presente invención se puede preparar disolviendo, suspendiendo o emulsionando el péptido o conjugado de la presente invención en una solución acuosa estéril o solución oleosa generalmente usada para inyección. Como solución acuosa para inyección, por ejemplo, se puede usar solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otro adyuvante y se puede usar en combinación con agentes solubilizantes adecuados tales como alcoholes (por ejemplo, etanol), polialcoholes (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), agentes tensioactivos no iónicos (por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) con aceite de ricino hidrogenado)), y similares. Como solución oleosa, por ejemplo, se utiliza el aceite de sésamo, aceite de soja o similares, y se pueden usar en combinación benzoato de bencilo, alcohol bencílico o similares como agente solubilizante. La solución de inyección preparada se llena preferiblemente en una ampolla adecuada. Un supositorio para usarse en la administración rectal puede prepararse mezclando el péptido o conjugado de la presente invención con una base convencional para supositorio.

La composición para administración oral incluye, por ejemplo, formas de dosificación sólidas o líquidas, específicamente tabletas (incluyendo tabletas recubiertas de azúcar, tabletas recubiertas con película), píldoras, gránulos, polvo, cápsulas (incluidas las cápsulas blandas), jarabe, emulsión, suspensión, y similares. Dichas composiciones se producen por un método conocido y pueden contener un portador, diluyente o excipiente generalmente utilizado en el campo de las preparaciones. Como vehículo y excipiente para tabletas, por ejemplo, se utilizan lactosa, almidón, sacarosa, estearato de magnesio.

Cada una de las composiciones mencionadas anteriormente puede contener otro ingrediente activo siempre que la mezcla con el péptido o conjugado mencionado anteriormente no cause una interacción indeseable.

Las composiciones farmacéuticas parenterales u orales mencionadas anteriormente se formulan convenientemente en una forma de unidad de dosificación compatible con la dosificación del ingrediente activo. Los ejemplos de la forma de dosificación para dicha unidad de dosificación incluyen tableta, píldora, cápsula, inyección (ampolla) y supositorio. En general, el contenido del péptido o conjugado es preferiblemente de 1 a 500 mg por forma de unidad de dosificación, preferiblemente, en particular, de 1 a 100 mg para inyección, y de 10 a 250 mg para otras formas de dosificación.

La composición de la presente invención puede dirigirse al tumor, particularmente un tumor maligno angiogénico, y preferiblemente puede acumular el péptido o conjugado en el tumor. Por lo tanto, la composición de la presente invención que contiene un agente anticanceroso en el conjugado es útil para el tratamiento o la prevención del tumor maligno diana. La composición de la presente invención que contiene una sustancia detectable en el conjugado también es útil para el examen o diagnóstico de un tumor maligno.

El tumor maligno (cáncer) puede ser cualquier tipo de cáncer, y también puede ser cáncer sólido o líquido. Como cáncer sólido, se mencionan preferiblemente aquellos que expresan Anxa1 en la superficie celular y, por lo tanto, tumores sólidos que son angiogénicos. Los ejemplos de cáncer sólido incluyen cáncer del cerebro/sistema nervioso (por ejemplo, tumor cerebral, tumor de la médula espinal, etc.), cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cáncer de laringe, cáncer bucal, cáncer de glándula salival, cáncer de seno paranasal, cáncer de tiroides, etc.), cáncer de órganos digestivos (por ejemplo, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de ano, cáncer hepático, cáncer de tracto biliar, cáncer de páncreas, etc.), cáncer de órganos urinarios o reproductivos (por ejemplo, cáncer de riñón, cáncer de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, pelvis renal y cáncer de uréter, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de testículo, cáncer de pene, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer cervical, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de ovario, cáncer de las trompas de Falopio y similares), cáncer del sistema respiratorio (por ejemplo, cáncer de pulmón (incluido el cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón macrocítico, cáncer de pulmón metastásico), cáncer bronquial y similares), cáncer de mama, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma maligno, etc.), cáncer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma, etc.), cáncer de músculo (por ejemplo, rabdomiosarcoma, etc.) y similares.

Como cáncer líquido se pueden mencionar leucemia, linfoma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico y similares. Como leucemia, se pueden mencionar leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica y similares. El linfoma maligno se clasifica en linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin, y los ejemplos de linfoma no Hodgkin incluyen linfoma de células B, linfoma de células T en adultos, linfoma linfoblástico, linfoma de células grandes difusas, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma periférico de células T, linfoma de células del manto y similares.

Dado que el péptido o conjugado de la presente invención puede cruzar eficazmente la barrera tumoral hematoencefálica, se puede decir que el tumor cerebral es una diana particularmente preferida. El tumor cerebral puede ser un tumor cerebral primario o un tumor cerebral metastásico. El tumor cerebral también puede ser un tumor cerebral benigno (por ejemplo, meningioma, adenoma pituitario, schwannoma, etc.) o un tumor cerebral maligno, preferiblemente un tumor cerebral maligno. Los ejemplos de tumores cerebrales malignos incluyen tumores cerebrales de grado 2 tales como astrocitoma, oligodendroglioma, tumores cerebrales de grado 3 tales como astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico y tumores cerebrales de grado 4 tales como glioblastoma.

La composición de la presente invención se puede administrar a un animal, particularmente a un mamífero, que expresa anexina A1. Los ejemplos de mamíferos incluyen, entre otros, animales de laboratorio tales como roedores tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y conejos, entre otros, animales domésticos tales como cerdos, vacas, cabras, caballos, ovejas, visones y similares, mascotas tales como perros, gatos y similares, primates tales como seres humanos, monos, monos rhesus, titíes, orangutanes, chimpancés y similares.

La dosificación de la composición de la presente invención también varía dependiendo del propósito de la administración, el sujeto de administración, la enfermedad diana, la condición, la vía de administración y similares. Por ejemplo, cuando se usa para el tratamiento o la prevención del cáncer descrito anteriormente, es conveniente administrar el conjugado de la presente invención que contiene un agente anticanceroso una vez a la semana por vía intravenosa u oral, en general en una cantidad de 0,1 a 10 mg por kg de peso corporal como una dosis única. Alternativamente, cuando se usa para evaluar o diagnosticar el cáncer descrito anteriormente, es conveniente administrar el conjugado de la presente invención que contiene una sustancia detectable por vía intravenosa u oral, generalmente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal antes del ensayo.

Ejemplos

La presente invención se describe con más detalle a continuación haciendo referencia a ejemplos y similares, pero la presente invención no está limitada por los siguientes ejemplos y similares.

(Preparación del animal de experimentación)

Se cultivaron células C6 de glioma de rata en medio Eagles modificado de Dulbecco, al que se añadió suero bovino fetal al 10%, alto contenido de glucosa y antibióticos. El vector de lentivirus PGK-Luc se preparó en el Virus Core Facility del Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute. Se infectaron células C6 y células B16 con lentivirus PGK-Luc y se produjeron células positivas para luciferasa. Usando un marco estereotáctico, se inyectaron células C6-Luc (4,8 x 104 células suspendidas en 4 gl de PBS) en el cuerpo estriado del cerebro de un ratón C57BL/6. Dos días después, se tomaron imágenes del ratón para detectar tumores que expresaban luciferasa. Para este fin, se inyectaron 100 gl de luciferina (30 mg/ml de PBS) en la cavidad peritoneal, el ratón se anestesió con gas isoflurano (20 ml/min) junto con oxígeno (1 ml/min) y se colocó bajo una cámara proporcionada con el generador de imágenes Xenogen IVIS 200. El número de fotones se midió durante 1-10 segundos. Para el modelo de tumor dual, las células C6-Luc se inyectaron de manera similar en el cerebro de un ratón NOD-SCID y el crecimiento del tumor se controló mediante un generador de imágenes Xenogen.

Cuando el tumor cerebral se volvió detectable, se inyectaron subcutáneamente células C6-Luc (2x105 células suspendidas en 100 gl de PBS) en el flanco dorsal del mismo ratón. El número de fotones en el tumor cerebral y en el tumor subcutáneo se midió utilizando un generador de imágenes Xenogen. También se preparó un modelo de tumor dual del mismo ratón de cepa C57BL/6 utilizando células B16-Luc. Se inyectaron células B16-Luc (5x104 células) en el cerebro de una hembra de ratón C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad como se ha descrito aquí anteriormente para las células C6-Luc. Las células B16-Luc (2x105 células) se inyectaron por vía subcutánea cuando el tumor B16-Luc en el cerebro se volvió detectable.

Ejemplo de examen 1: Experimento de administración de IF7 a ratones portadores de tumores

IF7 (es decir, péptido de forma L que tiene la secuencia de aminoácidos de IFLLWQR (SEQ ID NO: 10)) se administró por vía intravenosa a un ratón portador de tumor. Después de alcanzar los vasos sanguíneos alrededor del tumor, el IF7 se introdujo en la vesícula desde el lado luminal de las células endoteliales vasculares, se trasladó al lado basal y se liberó al estroma donde estaban presentes las células cancerígenas.

Incluso en células F2 endoteliales vasculares de ratón, IF7 se unió a células endoteliales vasculares tumorales transeccionadas activamente con Anxa1 por medio de la transcitosis. Por lo tanto, se sugirió que el IF7 tiene una actividad para cruzar la barrera del tumor vascular-cerebral en el tumor cerebral.

Sorprendentemente, cuando se inyectó por vía intravenosa IF7 marcado con fluorescencia en un ratón modelo de tumor cerebral trasplantado con células de glioma, se observó una acumulación de fluorescencia a una alta concentración en el sitio del tumor cerebral (las figuras 1 y 2). Además, la fluorescencia cruzó el vaso sanguíneo y alcanzó las células cancerosas en el estroma cerebral.

Ejemplo de examen 2: Experimento de administración de IF7-SN38 al modelo de tumor dual

Usando un ratón en el que están presentes el tumor subcutáneo y el tumor cerebral (modelo de tumor dual), se verificó el efecto del tratamiento de IF7-SN38. El experimento se realizó de la siguiente manera.

Se inyectó IF7C (RR)-SN38 en el ratón portador del tumor a través de la vena de la cola cuando el número de fotones del tumor cerebral llegó a ser >1,0x106 (esto ocurrió generalmente 2 semanas después). Se disolvió IF7C(RR)-SN38 (14,2 mg o 6,63 mmol) en 100 pl de dimetilsulfóxido (DMSO), 1 pl de la solución (142 mg o 66,3 nmoles) se diluyó con solución etanólica al 50% (10 pl) de Cremóforo EL, y se añadieron además 90 pl de PBS. La cantidad de IF7C(RR)-SN38 por inyección fue de 142 mg/ratón o 7,1 mg/kg. La secuencia inversa de IF7 o RQ7C(RR)-SN38 preparada de manera similar se usó como control. Como controles negativo se utilizaron irinotecan disuelto en PBS y PBS solo .

Como resultado, se suprimieron tanto el tumor cerebral como el tumor subcutáneo, y su efecto fue mayor en el tumor cerebral que en el tumor subcutáneo (las figuras 3 y 4). Se obtuvieron resultados similares en el modelo de tumor cerebral metastásico del melanoma B16, y los resultados no cambiaron ni siquiera cuando el ratón hospedante se cambió por uno de la cepa C57BL/6 o SCID. Estos hechos indican que Anxa1 a dirigida a DDS no sólo cruza de manera eficiente la barrera tumoral hematoencefálica, sino que también proporciona un excelente efecto terapéutico en el tumor cerebral independientemente del tipo de célula tumoral y de la cepa del ratón.

Ejemplo de examen 3

Estudio de la farmacocinética de IF7

Como se demuestra en los ejemplos de examen 1 y 2, IF7 tiene una actividad de direccionamiento a tumores malignos superior. Sin embargo, en términos de desarrollo clínico, existen problemas en dos puntos: falta de solubilidad y baja estabilidad. Es decir, el péptido IF7 es sensible a la proteasa y es susceptible a la degradación. De hecho, en un experimento que incluye la administración intravenosa de A488-IF7 a ratones sanos, la señal de fluorescencia de la sangre periférica casi desapareció en aproximadamente 1 hora (figura 5). Sin embargo, con la administración en la vena de la cola a ratones portadores de tumor, la fluorescencia recuperada de la sangre periférica de A488-IF7 fue notablemente más baja que en ratones sanos. Este resultado sugiere que A488-IF7 se acumula principal y rápidamente en el tumor mientras se está degradando. Además, IF7 tiene una alta hidrofobia y causa dificultades en la forma de dosificación, como la necesidad de añadir un agente tensioactivo después de la disolución en DMSO, en un intento por evitar la precipitación cuando se administra por vía intravenosa un compuesto unido a un medicamento anticanceroso.

Ejemplo 1

Identificación del péptido dTIT7

Los autores de la presente invención consideraron que se podría crear un agente terapéutico muy superior una vez que se superara la debilidad antes mencionada asociada con IF7, y comenzaron a desarrollar un péptido de próxima generación que consiste en una secuencia nueva.

La técnica para ser la base de esta investigación es un método de cribado de una biblioteca de fagos que muestra en la superficie aproximadamente 1.000 millones (207 especies) de péptidos aleatorios que consisten en 7 restos de aminoácidos. Todos los aminoácidos que constituyen los organismos vivos son aminoácidos de forma L, salvo algunas excepciones. Por lo tanto, no es posible obtener la secuencia de un péptido de forma D que se une a la diana mediante cribado general de bibliotecas de fagos. Por lo tanto, se realizó nuevamente un cribado de imagen especular usando una biblioteca de fagos T7 (Funke et al., Mol. Biosystem. 2009, 783-6) (figuras 6A a 6E).

El cribado se realizó en base a los siguientes hallazgos y suposiciones para obtener un fago que tiene una alta afinidad de unión a Anxa1. Se esclareció que IF7 interactúa con los 15 restos N-terminales de Anxa1 (MAMVSEFLKQAWFIE; SEQ ID NO: 11), y que IF7 se une al péptido L con 16 restos (L-MC16) que es Axna1 a la que se ha añadido el resto Cys para la modificación de sus 15 restos N-terminales (Sasai et al., sin publicar). Primero, se sintetizó D-MC16 (todas las 16 bases son de forma D) que está en relación de imagen especular con L-MC16 y se identificaron 7 aminoácidos (péptido TIT7 de forma L) que se unen a D-MC16 mediante cribado usando la biblioteca de fagos T7. Basándose en la secuencia obtenida, se sintetizó el péptido TIT7 (dTIT7) compuesto de aminoácidos de forma D. Se espera que este péptido dTIT7 se una a Anxa1.

Al analizar la secuencia peptídica mostrada por el fago, fue una práctica general optimizar la secuencia introduciendo varias mutaciones en la secuencia peptídica. Actualmente, es posible evaluar e identificar una vez las secuencias peptídicas óptimas de las secuencias de no menos de 10,000 péptidos candidatos aplicando los grupos de fagos obtenidos al secuenciador de ADN de la siguiente generación.

Los resultados del análisis revelaron que la frecuencia de aparición de 7 aminoácidos empezando con TIT (treoninaisoleucina-treonina) es alta como secuencia de unión a la parte N-terminal de Anxa1, y entre ellas, la secuencia TIT7 "TITWPTM" (SEQ ID NO: 12) es prominente. Si bien la frecuencia de la secuencia parcial de TIT7 también apareció en la posición de clasificación superior, no se encontró ninguna secuencia de sustitución de TIT7. Además, el péptido de TIT7 estaba compuesto por una secuencia nueva completamente diferente de la secuencia de IF7 (IFLLWQR; SEQ ID NO: 10).

Los resultados anteriores mostraron que se obtuvo con éxito el péptido de cadena lineal TIT7 de siete aminoácidos que consiste en todos los aminoácidos de forma D.

Además, cuando la interacción intermolecular entre dTIT7 y Anxa1 se midió mediante el método QCM, la constante de disociación (valor Kd) fue de 4,57 x 10-8 M.

Como se muestra en la figura 6D, frecuentemente aparecieron los péptidos con las secuencias de LRFPTVL (SEQ ID NO: 13), SPTSLLF (SEQ ID NO: 14), MPTLTFR (SEQ ID NO: 15), LKGMLRI (SEQ ID NO: 16) y LLSWPSA (SEQ ID NO: 17) además de la secuencia de TIT7 (SEQ ID NO: 12), y entre la gran cantidad de 109 especies de péptidos aleatorios, estos seis péptidos ocuparon alrededor del 50% del total.

Ejemplo 2

Capacidad de direccionamiento del péptido dTIT7 al tumor cerebral

Se preparó dTIT7 (IRDye-dTIT7) marcado con reactivo fluorescente de infrarrojo cercano IRDye 800CW. Se preparó un ratón modelo desnudo de tumor cerebral en donde se trasplantó glioma de rata en el cerebro del ratón y se le inyectó IRDye-dTIT7 a través de la vena de la cola del ratón. Como resultado, se observó mediante imágenes in vivo que IRDye-dTIT7 se acumula en el sitio del tumor de un ratón modelo de tumor cerebral (figuras 7A a 7C).

Ejemplo 3

Efecto antitumoral del agente anticanceroso unido a dTIT7 en un modelo de tumor cerebral

A continuación, se examinó el efecto del conjugado de dTIT7-agente anticanceroso en un modelo de ratón de tumor cerebral.

GA-dTIT7 en donde un fármaco anticanceroso geldanamicina se unió al péptido dTIT7 (figura 8) es resistente tanto a la proteasa como a la esterasa y se considera que es más estable in vivo. Se administró por vía intravenosa GA-dTIT7 a una décima parte (en términos de número molar) de la dosis recomendada a un ratón portador de tumor (células B16 de melanoma, administradas por vía subcutánea) cada 1 o 2 días. Como resultado, se suprimió notablemente el crecimiento del tumor y, mediante observación histopatológica, se observó una gran cantidad de necrosis en el sitio del tumor del ratón al que se había administrado GA-dTIT7. Este efecto sugiere fuertemente la posibilidad de que dTIT7 sea superior a iF7 que requirió administración consecutiva (Hatakeyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 108: 19587-92, 2011).

Más sorprendentemente, cuando se administró por vía oral GA-dTIT7 a un modelo de tumor cerebral trasplantado con células B16 en el cerebro, se observó la regresión del tumor, el tumor continuó disminuyendo incluso después de detener la administración del fármaco y, finalmente, se observó una curación completa en 2 de 4 ratones (figura 9). También se observaron efectos terapéuticos similares en un modelo de tumor cerebral que utiliza células C6. Esto sugiere que GA-dTIT7 puede conducir a la curación completa del tumor cerebral como agente anticanceroso que se puede administrar por vía oral.

Ejemplo 4

Interacción intermolecular entre los péptidos dLRF7, dSPT7, dMPT7 y dLLS7 y Anxa1

En cuanto a los péptidos de las secuencias de LRFPTVL (SEQ ID NO: 13), SPTSLLF (SEQ ID NO: 14), MPTLTFR

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido de 7-50 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia de aminoácidos de (i), donde cada símbolo de aminoácido seguido inmediatamente por el símbolo [D] es una forma D del aminoácido:

(i) la secuencia de aminoácidos de T [D] I [D] T [D] W [D] P [D] T [D] M [D].

2. El péptido según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos del (i) mencionado anteriormente.

3. Un conjugado que comprende el péptido según la reivindicación 1 o 2, y uno o más componentes.

4. El conjugado según la reivindicación 3, en el que uno o más componentes comprenden un agente anticanceroso, opcionalmente en el que:

(a) el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico contra el cáncer, un inhibidor de microtúbulos, una preparación de platino, un inhibidor de topoisomerasa, un agente de direccionamiento molecular y un agente anti-angiogénico; y/o

(b) el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en enocitabina, capecitabina, carmofour, cladribina, gemcitabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, tegafur, tegafur/uracilo, tegafur/gimeracilo/oteracilo de potasio, doxifluridina, nelarabina, hidroxicarbamida, fluorouracilo, fludarabina, pemetrexed, pentostatina, mercaptopurina, metotrexato;

ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, busulfán, tiotepa, nimustina, ranimustina, dacarbazina, procarbazina, temozolomida, carmustina, estreptozotocina, bendamustina; actinomicina D, aclarrubicina, amrubicina, idarrubicina, epirrubicina, zinostatina stimalamer, daunorrubicina, doxorrubicina, pirarubicina, bleomicina, peplomicina, mitomicina C, mitoxantrona, doxorrubicina liposomal;

vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, oxaliplatino, carboplatino, cisplatino, nedaplatino; camptotecina, irinotecán, nogitecán, SN-38, doxorrubicina, etopósido, levofloxacino, ciprofloxacino; legolafenib, cetuximab, panitumumab, ramsilmab, gefitinib, erlotinib, afatinib, crizotinib, alectinib, ceritinib, libertinib, trastuzumab, lapatinib, pertuzumab, sunitinib, sorafenib, axitinib, pazopanib, nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, vemurafenib, everolimus, temsirolimus, rituximab, bevacizumab, geldanamicina;

angiostatina, endostatina, metastatina, anticuerpo anti-VEGF y un inhibidor de VEGFR-2.

5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que uno o más componentes comprenden una sustancia detectable, opcionalmente en el que:

(a) la sustancia detectable permite la detección del conjugado in vivo por un medio seleccionado del grupo que consiste en fotografía de rayos X, tomografía computarizada (TC), resonancia magnética nuclear (IRM), ecografía, gammagrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), endoscopia y laparoscopia; y / o

(b) la sustancia detectable es un radioisótopo, un potenciador de MRI, una sustancia radiopaca, un agente de contraste o una sustancia fluorescente; y/o

(c) la sustancia detectable se selecciona del grupo que consiste en un nucleido radiactivo seleccionado de 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72Co, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 89Zr, 94mTc, 110In, 120I, 124I, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru 99mTc, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 131I, 169Yb, 197Hg y 201Tl;

un ion paramagnético seleccionado entre cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), lantano (III), oro (III), plomo (II), bismuto (III);

un compuesto de yodo, un compuesto de bario, un compuesto de galio, un compuesto de talio;

rodamina, fluoresceína, colorante Cy, Alexa (marca registrada), flúor, ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), sus derivados y un reactivo fluorescente en el infrarrojo cercano.

6. Una composición que comprende el péptido según la reivindicación 1 o 2 o el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y un vehículo farmacológicamente aceptable.

7. Una composición que comprende el conjugado según la reivindicación 4, y un vehículo farmacológicamente aceptable, para uso en un método de tratamiento del cáncer.

8. Una composición que comprende el conjugado de acuerdo con la reivindicación 5 y un vehículo farmacológicamente aceptable para uso en un método de ensayo de cáncer.

9. La composición para uso según la reivindicación 7 u 8, en donde el cáncer es un cáncer sólido o un cáncer líquido.

10. La composición para uso según la reivindicación 9, en donde el cáncer sólido es un cáncer sólido angiogénico; y/o en donde el cáncer sólido es cáncer del cerebro o del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del tracto digestivo, cáncer del aparato urinario o reproductor, cáncer del sistema respiratorio, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de hueso o cáncer de músculo.

11. La composición para uso según la reivindicación 9 o 10, en donde el cáncer sólido es tumor cerebral, tumor de médula espinal, cáncer de laringe, cáncer oral, cáncer de glándulas salivales, cáncer de seno paranasal, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de ano, cáncer de hígado, cáncer de vías biliares, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pelvis renal y uréter, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de testículo, cáncer de pene, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de ovario, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma maligno, osteosarcoma o rabdomiosarcoma.

12. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cáncer sólido es un tumor cerebral benigno o maligno, opcionalmente en donde:

(a) el tumor cerebral es un tumor cerebral primario o un tumor cerebral metastásico; y/o

(b) el tumor cerebral es meningioma, adenoma hipofisario, schwannoma, astrocitoma, oligodendroglioma, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico o glioblastoma.

13. La composición para uso según la reivindicación 9, en donde el cáncer líquido es linfoma de células B.