DE69628731T3 - Gezielte magnetisch markierte molekularmarkersysteme als nmr-bilderzeugungsmittel - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft verabreichbare molekulare Konjugatsysteme oder Zusammensetzungen, die magnetisch markierte Vektoren enthalten, die zu Kernspinresonanztomographiezwecken zu spezifischen Stellen im Körper menschlicher und tierischer Patienten geführt werden sollen.
  • Systeme dieser Art sind aus einer auf Magnetismus ansprechenden Signalerzeugungseinheit (I) und einer daran mittels einer Bindung oder eines Linkers (L) gekoppelten Substanz (II), beispielsweise einem Protein, einem Peptid oder einem bioaktiven Substrat mit spezifischer Affinität für spezifische Stellen in dem Organismus zusammengesetzt, d. h. spezifischen Organen oder Geweben, die visualisiert werden müssen. In der Tat wirkt Einheit (II) als Pfeilspitze oder Zielansteuerungsfaktor, um die Signalerzeugungseinheit (I) über den Kreislauf oder anderweitig zu spezifischen Zielen in dem Körper zu führen und zu transportieren. (II) kann gegebenenfalls auch die Endozytose von (I) vermitteln.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung verabreichbarer Konjugatsysteme, bei denen Biomoleküle (II), die zu spezifischen Stellen oder Rezeptoren im Organismus von Patienten zielgeführt werden, mit diagnostisch aktiven Liganden (I) gekoppelt sind, die als Signalerzeugungsmittel wirken, um diagnostisch nützliche Informationen zu liefern, ist in den letzten Jahren weitverbreitet bekannt geworden.
  • Die diagnostisch aktiven Mittel können Materialien einschließen, die in der Lage sind, ein Antwortsignal zu erzeugen, dass durch geeignete Empfangsinstrumente aufgenommen, elektronisch verarbeitet und zur Anzeige gebracht werden kann. Beispielsweise kann ein elektromagnetisches Signal durch geeignete Geräte nachgewiesen und verarbeitet und schließlich in Daten umgewandelt werden, die durch geeignet ausgebildetes Personal medizinisch interpretierbar sind. Zu den diagnostisch aktiven Mitteln können Radionuklide (β- oder γ-Emitter), die durch Zählung und Szintillation nachweisbar sind, iodierte röntgenopake Mittel, die eine Kontrastwirkung bei Radiountersuchungen liefern, auf Magnetismus ansprechende Materialien (ferromagnetische, paramagnetische und superparamagnetische Substanzen), die Kontrastwirkungen in der Kernspinresonanztomographie (MRI) liefern, und Mikrobläschen sowie Mikroballons zählen, die Kontrastwirkungen in der Ultraschall-Echographie-Bildgebung liefern.
  • Die Kopplung in den genannten Konjugaten basiert im Allgemeinen auf der Mitwirkung einer Bindung oder eines Linkers (L) mit chemisch reaktiven Funktionen, die entworfen wurden, um eine kovalente Bindung zwischen den Einheiten (I) und (II) zu bewirken. Eine Reihe von Systemen, die durch die allgemeine Formel (l-L-ll) wiedergegeben werden können, d. h. Systeme, die chemisch über einen Linker (L) verbundene Einheiten (I) und (II) enthalten, sind in der Technik bekannt.
  • Viele unterschiedliche bekannte Vorschläge schließen beispielsweise polymere Mikrokugeln ein, die magnetisch aktive Fe3O4-Partikel enthalten, wobei hauptsächlich Acrylpolymere, die reaktive Funktionen enthalten, beispielsweise Polyacrylamid, Polyacrylsäure und dergleichen, mit kovalent gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen, Lektinen, Antigenen, Antikörpern und anderen biologisch aktiven Substanzen markiert werden, wodurch Nachweis und Lokalisierung spezifischer Kohlehydraterückstände, Hormonrezeptoren und anderer spezifischer Zelloberflächenkomponenten möglich wird.
  • Superparamagnetische Metalloxidpartikel sind auch vorgeschlagen worden, die in vivo für die diagnostische Lokalisierung von Zellen oder Geweben, die durch ein spezielles Bioaffinitätsadsorbens erkannt werden, das an die Partikel gekoppelt ist, und auch für magnetische Führung therapeutisch aktive Mittel, die an die Partikel gekoppelt sind, zu pathologischen Stellen brauchbar sind. Die magnetischen Partikel, die an einen Silanlinker durch eine Silanisierungsreaktion gebunden werden, an der reaktive Silane R-Si(OX)3 beteiligt sind, worin X ein niederes Alkyl ist und R jede aliphatische oder aromatische Sequenz ist, die mit -NH2, -OH, -SH, einer aliphatischen hydrophoben oder einer amphipatischen Funktion endet, werden als geeignet zum kovalenten Koppeln an ein Bioaffinitätsabsorbens beschrieben.
  • In ähnlicher Weise sind auch verabreichbare magnetische Mikropartikel (beispielsweise Magnetit) bekannt, die an Substanzen mit Bindungsaffinität für organische Gewebe gekoppelt sind. Gewebespezifische Substanzen, wie Antikörper, Neurotransmitter, Hormone, Metaboliten, Enzyme, Toxine und natürliche oder synthetische Arzneimittel, sind beispielsweise an Magnetitpartikel gekoppelt worden, indem die Partikel mit biologisch abbaubaren Polymeren beschichtet wurden, die reaktive funktionale Gruppen tragen, und über die reaktiven Gruppen an die gewebespezifischen Substanzen gebunden werden. Die gewebespezifisch zielgeführten Magnetitmikropartikel, die durch Injektion in den Blutstrom verabreicht werden, werden so zu den Zielorganen oder -geweben geführt, wo sie als Kontrastverstärker in MRI-Untersuchungen der Organe wirken.
  • Verfahren und Reagentien zur In-vivo-Markierung von polymorphkernigen Leukozyten (PMN), z. B. Lymphozyten, mit einem medizinisch sinnvollen Metallion einschließlich Radioisotopen und paramagnetischen Elementen und nachfolgender Nachweis der PMN-Bewegungen und Stellen konzentrierter Leukozyten innerhalb des Organismus durch Radiodetektion oder MRI sind auch vorgeschlagen worden. In dem vorgeschlagenen Verfahren wird eine wirksame Menge einer Formulierung, die ein leukostimulierendes Reagenz (ein Lektin) enthält, das an eine brauchbare Metallspezies gebunden ist, unter Bedingungen verabreicht, die das Binden des Reagenzes an Leukozyten ermöglicht, wodurch die Konzentrationen der stimulierten Leukozyten nachfolgend durch Nachweis und Quantifizierung des Metalls unter Verwendung konventioneller Messverfahren ermittelt werden.
  • EP-A-0 398 143 (A. J. Fischman et al.) offenbart markierte chemotaktische Peptide zur Bildgebung von Infektions- oder Entzündungstellen. Die in dieser Druckschrift beschriebenen markierten Peptide werden schematisch durch die Formel N(X)-Y-Leu-Phe-Z-W wiedergegeben, wobei N Stickstoff ist, X eine Formyl-, Acetyl- oder t-Boc-Schutzgruppe ist; Y Methionin oder Norleucin ist; W eine Markierung ist, z. B. ein EDTA- oder DTPA-Chelat eines radioaktiven oder paramagnetischen Isotops, und Z eine kovalente Bindung oder eine Linkersequenz ist. Die Druckschrift beschreibt auch die Injektion der radioaktiv markierten chemotaktischen Peptide in Versuchsratten, die zuvor in den Schenkeln mit Stämmen von E. coli infiziert worden waren, und die nachfolgende Lokalisierung der Infektionsstellen durch stündliche serielle Bilder mit der γ-Kamera.
  • Zudem ist offenbart worden, dass derivatisierte hydrophile-hydrophobe Blockcopolymere Substrate mit zielführenden Proteinen verbrücken. WO-A-95/06251 (Universität Utah) offenbart derivatisierte Pluronic®- und Tetronic®-Verbindungen, die am Ende der PEG-Blöcke reaktive Gruppen tragen. Die derivatisierten Copolymere werden zum Beschichten hydrophober Oberflächen (z. B. Polystyrolperlen und ähnlichen Trägern) mittels Adsorption verwendet, wobei die beschichtete Oberfläche dann als Substrate zum Immobilisieren von Proteinen und ähnlichen Substanzen wirkt (Anwendungen: z. B. ELISA-Tests).
  • DE-A-43 09 333 betrifft superparamagnetische Partikel, die in der Medizin zum Zerstören von Tumoren, zur Steigerung der Immunität und zur Diagnose eingesetzt werden können. Dies wird erreicht, indem sehr kleine superparamagnetische Eindomänenpartikel zum Aggregieren gebracht werden und vor weiterer Aggregation durch chemische Bindung reaktiver Stabilisatorsubstanzen auf der Oberfläche der superparamagnetischen Partikel geschützt werden. Die Partikel bestehen somit aus stabilen, abbaubaren Aggregaten mit einer Partikelgröße im Bereich zwischen 10 und 1000 Nanometern mit definiertem Verhalten in dem Magnetfeld, wobei die Aggregate aus einer Vielzahl kleiner superparamagnetischer Eindomänenpartikel aus Eisenoxid, gemischtem Eisenoxid oder Eisen bestehen und eine Partikelgröße im Bereich zwischen 3 und 20 Nanometern aufweisen, die, chemisch an ihre Oberfläche gebunden, organische Substanzen aus der Gruppe der Phosphat-, Diphosphat-, Polyphosphat-, Thiophosphat-, Phosphonat- oder Thiophosphonatgruppe enthaltenden Polyalkylenglykole, Phosphatgruppe enthaltenden Nukleotide, deren Oligomeren oder deren Polymeren und Phosphatgruppe enthaltenden Kohlehydraten tragen, die weitere Bindungsstellen haben können. Sowohl die superparamagnetischen Aggregate als auch die reaktiven Stabilisatorsubstanzen können aktive Substanzen sein.
  • Obwohl die Errungenschaften des Standes der Technik Vorteile aufweisen, können sie an einigen unvermeidbaren Nachteilen leiden, die die Herstellung der Systeme mit der allgemeinen Formel (l-L-ll) durch konventionelle chemische Mittel betreffen, welche mühselig und kostspielig sind.
  • Ein weiterer Nachteil der bislang bekannten Systeme ist mit dem Problem der Metabolisierung oder Eliminierung dieser komplexen Moleküle aus dem Körper verbunden, die, nachdem sie ihrem Zweck, d. h. der Bildgebung, des Zielgewebes gedient haben, keinen weiteren Zweck oder Grund für ihre Anwesenheit haben. Wenn solche komplexen Systeme verwendet werden, um ein therapeutisches Mittel an einer gegebenen Stelle abzugeben, führt die Abgabe der therapeutisch aktiven Substanz gleichzeitig mindestens zu einer partiellen Verdauung und nachfolgenden Eliminierung des komplexen Moleküls. Wenn solche Systeme jedoch zur Bildgebung verwendet werden, wird die Eliminierung des verbrauchten Moleküls zu einem Problem.
  • Die vorliegende Erfindung, in der auch die Linkereigenschaften derivatisierter hydrophober-hydrophiler Blockcopolymere verwendet werden, weist einen deutlichen Vorteil in Richtung Vereinfachung der Kopplung zwischen den auf Magnetismus ansprechenden Einheiten (I) und den zielführenden Proteinen oder -Peptiden (II) auf.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine erste Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer verabreichbarer Konjugatsysteme mit der Formel (IfL-II), wie in Anspruch 1 definiert.
  • Die neuen Systeme sind dadurch gekennzeichnet, dass, obwohl die Bindung zwischen L und (II) kovalent ist, die Bindung zwischen (I) und L nicht-kovalent ist, vorzugsweise eine Bindung mittels Affinität, die durch Van-der-Waal'sche Kräfte gesteuert wird, die zu erheblicher molekularer Mobilität in wässrigen Trägermedien und hervorragender Beständigkeit des Konjugats gegen Opsonisation nach Injektion in den Kreislauf führt.
  • Offensichtlich ist die Injektion solcher Systeme IfL-II in den Kreislauf zum Transportieren von Ligand I zu spezifizierten Zielstellen auch eine Aufgabe der Erfindung.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Linker (L) gemäß den genannten Strukturen, bei dem eine amphiphile Tensidverbindung YWm [oder (WY)2NY1N(YW)2], wobei m 2 ist, wobei ”Y” eine lipophile und hydrophobe Sequenz ist und ”W” eine hydrokompatible Sequenz mit Öl-in-Wasser-Dispergiereigenschaften ist und mit -OH oder -NH2 endet, funktionalisiert wird, indem sie mit Reaktanden umgesetzt wird, die geeignet sind, um reaktive Funktionen R ausgewählt z. B. aus -NHNH2, -CO-NH-NH2, -O-CO-NH-NH2 zu liefern.
  • Eine weitere Aufgabe ist ein Verfahren, bei dem die Linker L kovalent über Reaktionen, die die Funktion R beinhalten, an Zielführungsvektoren (II) gebunden werden, um Intermediate (L-I1) herzustellen, die geeignet aufgebaut sind, um Transport zu spezifischen Stellen in dem Organismus zu bewirken.
  • In dieser Erfindung ist die lipophile Sequenz Y ausgewählt, um sich durch Anziehungskräfte (nicht-kovalent) an ähnliche Sequenzen der Signalerzeugungseinheit (I) zu binden. Wie bereits gesagt wird dieser Bindungstyp in dieser Beschreibung durch ein f bezeichnet. Somit kann in Abhängigkeit von der Natur von Y die Bindungskraft zum Binden an den Signalerzeuger (I) moduliert werden, wodurch die adäquate Steuerung der Stabilität der Systeme (IfL-ll) sowie deren Lebensdauer vor der Metabolisierung, nach Verabreichung an den Körper, möglich wird. Diese Struktur ermöglicht auch leichteren Abbau (unter optionaler Freisetzung aktiver Spezies) und nachträgliche Eliminierung aus dem Organismus.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems IfL-ll. In dieser Ausführungsform werden Gadoliniumchelate (große Kreise, die mit Gd bezeichnet sind) mit hydrophoben Segmenten (einfache Linien) versehen, deren hydrophobe Segmente durch Affinität mit entsprechenden Segmenten (Y) eines amphiphilen Linkers (L) assoziieren, dessen hydrophile Segmente (W) (kleine Kreise) derivatisiert (-ZR-) und mit Pfeilspitze II verknüpft sind.
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines anderen erfindungsgemäßen Systems. In dieser Ausführungsform werden Magnetitmikropartikel (Fe3O4), die als MRI-Signalerzeuger wirken, mit einer Phosphatidsäure (Kreise mit fettem Seitenarm) beschichtet, deren hydrophobe Einheit (gerader Arm) mit den hydrophoben Segmenten (einfache gerundete Linien) eines Amphiphils (YW) assoziiert. Die hydrophilen Bereiche (W) der letzteren (kleine Kreise) sind derivatisiert und an einen Zielansteuerungsfaktor wie in der vorhergehenden Ausführungsform von 1 gekoppelt.
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die die Erkennung eines erfindungsgemäßen molekularen Systems, das magnetische Partikel mit Zielführung durch Biotin über einen Linker enthält, gegenüber einem System ohne Zielführung durch Avidin zeigt.
  • 4 ist eine graphische Darstellung, die die Aktivität eines erfindungsgemäßen Systems gegenüber Kulturen zellulärer Neutrophile zeigt, welches magnetische Mikropartikel (SBPA) enthält, die mit einem chemotaktischen Zielführungsfaktor (RGD-Peptid) über einen Linker (derivatisiertes Amphiphil) ausgestattet sind.
  • 5 (a und b) sind graphische Darstellungen, die die Reduktionsrate von NET durch menschliches PMN zeigen, das durch Magnetit-markiertes Hexapeptid stimuliert worden ist.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Hauptaspekte der Erfindung, wie sie in den dazugehörigen Ansprüchen beschrieben sind, basieren auf der unerwarteten Feststellung, dass verabreichbare Konjugatsysteme mit der Formel (IfL-II), wie in Anspruch 1 definiert, alle Vorteile der Systeme besitzen, in denen beide Bindungen kovalent sind, ihre Metabolisierung, d. h. Eliminierung, jedoch viel rascher erfolgt.
  • Die neuen Systeme sind durch die Tatsache gekennzeichnet, dass, obwohl die Bindung zwischen L und (II) kovalent ist, die Bindung zwischen (I) und L nicht-kovalent ist, vorzugsweise eine Bindung über Affinität, die durch Van-der-Waal'sche Kräfte gesteuert wird, was zu erheblicher molekularer Mobilität in wässrigen Trägermedien und hervorragender Beständigkeit des Konjugats gegen Opsonisation nach Injektion in den Kreislauf führt.
  • Offensichtlich ist die Injektion solcher Systeme IfL-ll in den Kreislauf zum Transportieren von Ligand I zu spezifizierten Zielstellen auch eine Aufgabe der Erfindung.
  • Die Linker L können die Formel (i) Y(W-Z-R)m, m ist 2, aufweisen, in der der Teil YW ein amphiphiles Segment ist, das aus einer hydrophoben-lipophilen Sequenz ”Y” zur nicht-kovalenten Bindung mit der Einheit (I) und einer hydrophilenlipophoben Sequenz ”W” zusammengesetzt ist, die kovalent miteinander verbunden sind, Z eine chemische Bindung oder eine intermediäre Verbindungssequenz ist, vorzugsweise ein aliphatisches C1-C4-Segment, und R eine Bindungsfunktion zur Bewirkung der Verknüpfung (Kopplung) mit den ausgewählten bioaktiven, zielführenden Verbindungen (II) ist.
  • ”Y” enthält sich wiederholende Propyleneinheiten, die durch Sauerstoffatome getrennt sind. In der Praxis enthält ein bevorzugtes Y etwa 10 bis 60 Propylenoxyeinheiten. Die Kriterien für die beste Auswahl der Beschaffenheit von Y ist seine Affinität zu ähnlichen Gruppen, die an Einheit (I) gebunden sind, wie nachfolgend umfassender offenbart wird.
  • Um im Sinne der vorliegenden Erfindung zu funktionieren, sollten die hydrophilen Eigenschaften der Sequenz W des Linkers vorzugsweise so sein, dass die leichte Dispersion von Systemen mit der Struktur (IfL-II) in wässrigen Flüssigkeiten gefördert wird. Somit sollten für richtiges Funktionieren die Lipophilität von Y und die Hydrophilität von W in geeigneter Weise zusammenpassen. In der Praxis sollte die HLB-Bilanz vorzugsweise um 10 bis 35, vorzugsweise 25 bis 30 liegen, obwohl dieser Bereich nach Bedarf in speziellen Fällen verlassen werden kann. W ist eine Polyethylenoxykette, die Anzahl der Polyethylenoxyeinheiten kann 5 bis 300 sein, vorzugsweise jedoch etwa 50 bis 150.
  • Die reaktiven Funktionen R schließen beispielsweise die folgenden Gruppen ein: NH2, -CO-NH-NH2, -O-CO-NH-NH2,. In der vorliegenden Erfindung werden solche Funktionen vorzugsweise durch Endmodifizierung des Segments W eingeführt, wie nachfolgend in den Beispielen detaillierter beschrieben wird.
  • Die reaktiven Funktionen ermöglichen die Herstellung von Intermediaten der Struktur (L-II), indem ein funktionalisiertes -W-R des Linkers mit einer zielführenden Substanz umgesetzt wird. Unter den zielführenden Substanzen können die folgenden einschließlich der jeweiligen Ziele genannt werden:
    Zielansteuerungsfaktor Ziel
    Antikörper (und Fragmente, wie Fab, F(ab)'2, Fv, Fc, usw. RES-System
    epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) zelluläre Rezeptoren
    Kollagen zelluläre Rezeptoren
    Gelatine zelluläre Rezeptoren
    Fibrin bindendes Protein Fibrin
    Plasminogenaktivator Thrombus
    Urokmaseinhibitoren invasive Zellen
    Somatostatinanaloga zelluläre Rezeptoren
    Lektin (WGA) Axone
    f-Met-Leu-Phe Neutrophile
    Selektin-aktive Fragmente Glycosylstrukturen
    ELAM, GMP 140 Leukozytenrezeptoren
    ”RGD”-Proteine Integrine, Granulozyten
    IL-2 aktivierte T-Zellen
    CD4 HIV-infizierte Zellen
    kationisiertes Albumin Fibroblasten
    Carnitin Acetyl-, Maleyl-Proteine Makrophagenabfangrezeptor
    Hyaluronsäure zelluläre Rezeptoren
    Lactosylceramid Hepatozyten
    Asialofoetuin Hepatozyten
    Arabinogalaktan Hepatozyten
    galaktosylierte Partikel Kupffer-Zellen
    endständige Fucose Kupffer-Zellen
    Mannose Kupffer-Zellen, Makrophagen
    Laktose Hepatozyten
    Dimuramyltripeptid Kupffer-Zellen, Makrophagen
    Fucoidin-dextransulfat Kupffer-Zellen, Makrophagen
    Sulfatide Hirn
    Glykosylsteroide, Glykosphingolipide andere glykosylierte Strukturen
    Hypoxie-Mediatoren infarktiertes Gewebe
    Amphetamine Nervensystem
    Barbiturate Nervensystem
    Sulfonamide Monoaminoxidaseinhibitorsubstrate Hirn
    chemotaktische Peptide (*) Entzündungsstellen
    Muscarin- und Dopaminrezeptorsubstrate Nervensystem
    (*) chemotaktische Peptide sind nützlich zum Nachweis und zur Untersuchung erkrankter oder gestörter Gewebestellen oder Organe im Körper menschlicher oder tierischer Patienten, d. h. Stellen von Infektion, Entzündung oder anderen Traumata.
  • Das Inkontaktbringen von Intermediat (L-Il) mit einem zweckmäßigen, auf Magnetismus ansprechenden Signalerzeugungsliganden (I) in einer wässrigen Trägerflüssigkeit umfasst das Bewirken direkter Bindung und Bildung des zielgeführten Faktors (IfL-ll) und dessen Dispergierung innerhalb der Trägerflüssigkeit. Dies ist vermutlich auf die Beschaffenheit der lipophilen Sequenz Y in den erfindungsgemäßen Linkern zurückzuführen, die sich vermutlich mit geeigneten lipophilen Gruppen des Liganden (I), beispielsweise dem Alkylrest von Fettalkoholen oder Fettsäuren, verschlingt oder verwebt (möglicherweise durch Adsorption oder Van-der-Waal'sche Kräfte).
  • Bei einer bevorzugten Herstellungs- und Anwendungsausführungsform der erfindungsgemäßen Linker wird ein reaktiv derivatisiertes Polyalkylenoxy-Blockcopolymer Y(WR)2 (wobei Y eine Polypropylenoxysequenz ist, W eine Polyethylenoxysequenz ist und R -NH2 ist) mit einem Protein-Zielansteuerungsfaktor (beispielsweise Biotin-N-hydroxysuccinimidmethylester) verknüpft, um ein Intermediat (L-Il) der Struktur Y(W-Biotin)2 zu liefern. Wenn die letztere in einer wässrigen Trägerflüssigkeit in Gegenwart eines Fettalkoholmono- oder -diesters von DTPA (in Form eines Chelats mit einem paramagnetischen Metall) gebracht wird, findet Kopplung statt und es wird eine Dispersion eines Systems (IfL-ll) der Struktur DTPAfY(W-Biotin)2 erhalten, die sich nach Injektion auf zelluläre Rezeptoren richtet, die Biotin-Avidin-Aktivierung unterliegen. Dies wird durch das Schema von 1 illustriert. Hier in Frage kommende Techniken, die Affinitätskopplung nicht modifizierter Polyoxyalkylen-Blockcopolymere (z. B. Poloxamer®e, Pluronic®, Synperonic®) und ”hydrophobisierter” paramagnetischer DTPA-Chelate umfassen, sind in EP-A-0 804 251 offenbart. In der Tat sind außergewöhnlich wirksame paramagnetische NMR-Kontrastzusammensetzungen erhalten worden, wenn die Bildgebungszusammensetzung zusätzlich zu einem paramagnetischen Metallion, das mit einem Polyamino-Polycarboxylat-Chelatbildner mit einer lipophilen Einheit komplexiert ist, ein physiologisch annehmbares nicht-ionisches Tensid oder eine Mischung nicht-ionischer Tenside und vorzugsweise eine oder mehrere amphiphatische Verbindungen enthält, wie Phospholipide.
  • In dieser Erfindung wird die lipophile Sequenz Y ausgewählt, um sich durch Anziehung (nicht-kovalent) an ähnliche Sequenzen der Signalerzeugungseinheit (I) zu binden. Wie bereits gesagt, wird dieser Bindungstyp durch ein f bezeichnet. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit von Y kann somit die Bindungskraft zum Binden mit dem Signalerzeuger (I) moduliert werden, was die adäquate Steuerung der Stabilität der Systeme (IfL-ll) sowie deren Lebensdauer nach Verabreichung an den Körper vor der Metabolisierung ermöglicht. Diese Struktur ermöglicht auch den leichteren Abbau (mit optionaler Freisetzung aktiver Spezies) und die nachträgliche Eliminierung aus dem Organismus.
  • In einer weiteren vorteilhaften Herstellungs- und Anwendungsausführungsform der vorliegenden Erfindung (siehe 2) wird ein Intermediat L-Il hergestellt, wobei L derivatisiertes Pluronic® F-108 ist und II Laktose ist, indem Laktoseisocyanat und das derivatisierte Amphiphil, das endständige -NH2 Gruppen an den Polyethylenoxyenden trägt, miteinander verbunden werden. Die leichte Kopplung des lipophilen Segments Y des ln-termediats mit den Fettsäureresten von Phospholipiden kann dann vorteilhaft zur Zielführung zu Hepatozyten genutzt werden, beispielsweise Magnetitpartikel, die mit Phosphatidsäuren beschichtet sind, z. B. Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA). Die Beschichtung von Magnetitpartikeln mit Phospholipiden ist in der Veröffentlichung WO-A-94/04197 (Stealth magnetit particles) offenbart, auf die hier Bezug genommen wird.
  • Die bemerkenswerte Affinität der Y-Segmente der Linker und der Fettreste von Phospholipiden kann verwendet werden, um absichtlich Liposomvesikel zu zähmen. Hierfür kann beispielsweise der Einbau amphiphiler Substanzen (siehe EP-A-0 354 855 ) in die Phospholipide genannt werden, die die Umhüllung liposomer Arzneiträgervesikel bilden, wobei die amphiphilen Substanzen eine ähnliche Beschaffenheit wie diejenige haben, die den Anteil YW der vorliegenden Linker stellen. In den in dem vorhergehenden Dokument offenbarten Techniken ist der hydrophobe Anteil des Amphiphils in den membranbildenden Lipiden versunken, während der hydrophile Anteil aus ihnen herausragt und sich in das umgebende wässrige Medium hinein erstreckt.
  • Wenn durch Analogie mit dem vorhergehenden als Amphiphil ein Intermediat (L-Il) gemäß der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, d. h. eine markierte Struktur, die ein Konjugat einer hydrophilen-lipophilen Verbindung WY und einer markierenden biospezifischen Substanz enthält, wird ein System erhalten, das zielgeführte Liposomvesikel enthält. Wenn das Liposom beispielsweise darin verkapselt therapeutisch oder diagnostisch aktive Mittel enthält, kann das letztere verabreicht und auf spezifische Stellen in dem Organismus gerichtet werden. Diese Technik ist einfach und übertrifft frühere Techniken (wie jene, die beispielsweise in WO-A-86/04232 offenbart ist), um Liposomen zum Ziel zu führen, die darauf basieren, Liposom-bildende Lipide zu verwenden, die gepfropfte funktionale Gruppen tragen, um nachfolgend an ausgewählte Zielansteuerungsproteine zu binden. Diese bekannten Techniken können die Vesikeleinschlusseigenschaften der Lipide und ihre Verkapselungsstabilität jedoch nachteilig beeinflussen, die vorliegende Erfindung weist diesen Fallstrick jedoch nicht auf.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • 10 g Pluronic® F-108 mit der Formel H-(O(CH2)2)a-(OCH(CH3)CH2)b-(O(CH2)2)a-OH, wobei a = 147 und b = 48 (1,43 mÄq OH) wurden unter Bewegung in 40 ml trockenem Ethylacetat (Ac-OEt) gelöst, 255 mg (1,47 mÄq) Carbonyldiimidazol (CDI) zugegeben und das Rühren etwa 1/2 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Lösung wurde entgast, und 396 mg (3 mÄq) tert.-Butylcarbazat (tBu-O-CO-NH-NH2) wurden zugefügt. Nach einer Pause von 24 Stunden wurden 40 ml Ether zugegeben und die Lösung über Nacht bei 4°C kristallisieren gelassen. Der Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und aus AcOEt (oder CH2CI2) und Ether umkristallisiert; Ausbeute 9,37 g F-108-Di[hydrazidourethan-BOC].
  • Die Reaktionen werden wie folgt schematisch dargestellt:
    Figure 00130001
  • BEISPIEL 2
  • Zwanzig (20) g Pluronic® F-108 mit der Formel H-(O(CH2)2)a-(OCH(CH3)CH2)b-(O(CH2)2)a-OH, wobei a = 147 und b = 48 (2,86 mÄq OH), wurden unter Bewegung in 80 ml trockenem Ethylacetat (AcOEt) gelöst, 0,72 ml (3 mmol) Tri-n-butylamin N(n-Bu)3 und 0,7 g (7 mmol) Bernsteinsäureanhydrid wurden zugegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden auf 70°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Nach Erwärmen auf 40°C wurden 40 ml Ether und 5 mmol Essigsäure (AcOH) zugegeben und die Mischung über Nacht bei 4°C kristallisieren gelassen. Der Feststoff wurde aufgefangen, in 200 ml Ether suspendiert, ablaufen gelassen und getrocknet. Es wurden 19,74 g F-108-Disäuresuccinat mit einer Reinheit von etwa 90% (ermittelt durch Titration der freien Carboxylgruppen mit 0,02 N NaOH-Lösung) aufgefangen. Die Reaktion war:
    Figure 00130002
  • BEISPIEL 3
  • In 20 ml CCI4 wurden 5 g (0,62 mÄq COOH) des wie in Beispiel 2 hergestellten F-108-Disäuresuccinats gelöst und 0,3 ml (4,2 mmol, 6,5 Äq. in Bezug auf COOH) Thionylchlorid zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden unter Rückfluss gehalten und das Lösungsmittel vollständig am Rotationsverdampfer entfernt. Zu dem Rückstand wurden 10 ml trockenes AcOEt gegeben, dann eine Lösung aus 1,32 g (10 mmol) tert.-Bu-Carbazat und 2,39 ml (10 mmol) N(n-Bu)3 in 8 ml AcOEt. Die gelbe Lösung wurde eine Stunde auf 50°C erwärmt, dann mit 40 ml Ether verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur kristallisieren gelassen.
  • Der Feststoff (4,97 g) wurde in 10 ml trockenem Methylenchlorid gelöst und 5 ml Tetrafluoressigsäure (TFA) zugegeben. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt, 20 ml AcOEt zugegeben und die Lösung auf 40°C erwärmt, wobei zu der Zeit 40 ml Ether zugegeben wurden und die Lösung wieder auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde, wodurch sich Kristalle bildeten. Diese wurden aufgefangen, in 20 ml AcOEt gelöst, 0,5 ml N(n-Bu)3 zugegeben, die Lösung wieder auf 40°C erwärmt, mit 40 ml Ether verdünnt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Dann wurden weitere 30 ml Ether zugegeben und nach Ruhenlassen über Nacht 4,33 g F108-Dihydrazidosuccinat aufgefangen, wie durch konventionelle Hydrazidanalyse (siehe unten) ermittelt wurde. Die Reaktionen waren:
    Figure 00140001
  • BEISPIEL 4
  • Zu einer Lösung von 10 g (1,3 mÄq) F108 in 10 ml CCI4 wurden 0,8 ml (3,6 mÄq) N(n-Bu)3, dann bei 0°C 14,3 mÄq Succinyldichlorid (wie von Fluka AG) gegeben. Nachdem die schwarze Mischung wieder auf Raumtemperatur erwärmt wurde, wurde sie 2,5 Stunden auf 50°C erwärmt, dann abkühlen und über Nacht stehen gelassen. Die Mischung wurde am Rotationsverdampfer auf etwa 50 ml konzentriert und 200 ml Ether zugefügt, wodurch Trübung bewirkt wurde. Die milchige Flüssigkeit wurde dann in 600 ml Ether gegossen, wodurch ein grünlicher Feststoff ausfiel. Dieser Feststoff wurde wieder aufgelöst, mit Aktivkohle behandelt und erneut mit Ether aus der filtrierten Lösung ausgefällt, was 8,84 g des Dichlorids lieferte. Falls in dem vorhergehenden Ansatz redestilliertes Succinyldichlorid (46 bis 47°C/0,7 bis 0,9 Torr) verwendet wurde, kristallisierte das erhaltene Produkt langsam nach Zugabe von Ether, und die Reinigung mit Aktivkohle war nicht notwendig. Die Ausbeute war auch höher. Die Reaktion ist wie folgt:
    Figure 00150001
  • Das Dichlorid wurde wie in Beispiel 3 offenbart in das entsprechende Dihydrazid überführt.
  • Die Dihydrazidverbindungen (der Beispiele 1 bis 4) wurden spektrometrisch (505 nm, Kontron Spektrometer) in wässrigen Lösungen in Gegenwart von Trinitrobenzolsulfonat (TNBS) und Kaliumbisulfat analysiert. Die Messungen erfolgten mit Lösungen im Bereich von 10–5 bis 10–3 M in Bezug auf eine Kalibrationskurve, die aus bekannten verdünnten Lösungen von tert.-Bu-Carbazat erhalten worden war. Die zu messenden Proben (1 ml) enthielten 0,8 ml der Hydrazidlösung (Kontrolle oder Test), 0,1 ml 1 M KHSO4 und 1 ml TNBS (1 g/L). Die Extinktionsmessungen erfolgten eine Stunde nach der Probenherstellung, wobei diese Verzögerung erforderlich war, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Für die Blindproben wurde destilliertes Wasser verwendet.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die Techniken der Beispiele 1 und 4 bevorzugt waren, um Hydrazide mit optimaler Reinheit und optimalen Ausbeuten zu liefern.
  • BEISPIEL 5
  • Fünf g (0,62 mÄq-COOH) des F108-Disäuresuccinats (wie in Beispiel 2 erhalten) wurden in 20 ml AcOEt gelöst (leichtes Erwärmen führte zum Erfolg) und bei Raumtemperatur wurde 1 g (6 mmol) CDI zugefügt. Die Lösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gelassen, dann wurde sie 3 Stunden auf 50°C erwärmt. Nachdem sie 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde, wurde sie erneut auf 50°C erwärmt, und 50 ml Ether wurden zugefügt, wodurch ein Feststoff kristallisierte (4,91 g). Dieser wurde aufgefangen, mit Ether gewaschen und getrocknet.
  • Der Feststoff wurde in 20 ml CH2CI2 gelöst, und zu 10 ml davon wurden 400 mg (3 mmol) tert.-Bu-Carbazat in 1 ml CH2CI2 gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden 0,72 ml (3 mmol) N (n-Bu)3 zugefügt und die Mischung über Nacht stehen gelassen. Das Produkt, welches auskristallisierte, wurde aufgefangen und aus AcOEt/Ether umkristallisiert; Ausbeute 2,31 g. Dieses Produkt wurde durch Umsetzen mit 4 ml TFR in 4 ml CH2CI2 wie in Beispiel 3 entschützt, und der nach Entfernung der Lösungsmittel erhaltene Feststoff wurde aus AcOEt/Ether kristallisiert; Ausbeute 2,12 g F108-Disuccinylhydrazid. Die wie oben offenbart durchgeführte Hydrazidanalyse ergab 2,96 mÄq/g, was nahe am theoretischen Wert liegt.
  • Die anderen 10 ml Lösung des oben hergestellten Diimidazolylcarbonylderivats wurden mit einer Lösung behandelt, die 253 ml (3 mmol) 1,3-Diaminopropan und 0,72 ml (3 mmol) Tributylamin in CH2CI2 enthielt. Nach einer Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung filtriert und mit 50 ml Ether verdünnt, was einen Feststoff ergab. Letzterer wurde aufgefangen und nacheinander aus AcOEt/Ether und CCI4/Ether umkristallisiert; Ausbeute 2,26 g des Di[aminopropylamidosuccinyl]derivats von F108. Die Reaktionen sind:
    Figure 00170001
  • BEISPIEL 6
  • Fünf g F108 (0,7 mÄq) wurden in 10 ml Methylenchlorid aufgelöst und 0,51 ml (2,15 mÄq) N(n-Bu)3 zugefügt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und es wurden 0,23 ml (2 mÄq) Tresylchlorid zugegeben. Nachdem langsam zurück auf Raumtemperatur erwärmt wurde (5 Stunden), wurden 10 ml AcOEt zugefügt, die Lösung wurde auf etwa 50°C erwärmt, 50 ml Ether zugegeben und das Ganze der Kristallisation überlassen. Nach 2 Tagen wurde der Feststoff durch Zentrifugation (8000 g) abgetrennt, mit Ether gewaschen, getrocknet und in 20 ml Methylenchlorid gelöst.
  • Eine 10 ml Portion dieser Lösung wurde mit 400 mg (3 mmol) tert.-Bu-Carbazat in 1 ml CH2CI2 behandelt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden 0,72 ml (3 mmol) Tributylamin zugefügt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gelassen. Dann wurden 50 ml Ether zugegeben, wodurch ein Niederschlag aus F108-Di(hydrazino-BOC) nach mehreren Stunden bei 4°C gebildet wurde; Ausbeute 2,11 g.
  • Der obige Feststoff wurde in 4 ml CH2CI2 gelöst und mit 4 ml TFA wie in den vorhergehenden Beispielen offenbart entschützt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 8 ml AcOEt mit 0,24 ml Tributylamin behandelt; die Zugabe von Ether führte zur Ausfällung von 2 g des gewünschten Dihydrazino-F108.
  • Die Reaktionen sind:
    Figure 00180001
  • Aus dem Reaktionsschema folgt, dass die entsprechende Di(aminopropylamino)verbindung aus den anderen 10 ml der Ditresylatlösung in Methylenchlorid durch Behandlung mit 3 mmol 1,3-Diaminopropan und 3 mmol Trl-n-butylamin bei Raumtemperatur, Ausfällung mit Ether und Kristallisation aus CCI4/Ether erhalten wurde.
  • BEISPIEL 7
  • Zu einer filtrierten Lösung von 21 g (3 mÄq) F108 in 80 ml CCI4 wurden bei Raumtemperatur 1 ml (4,2 mÄq) Tributylamin gegeben. Nach Abkühlen wurden 2,2 ml (30 mmol) Thionylchlorid zugegeben und die Mischung 4 Stunden unter Rückfluss gehalten, wodurch sie rot wurde. Sie wurde filtriert, von den Lösungsmitteln befreit, der Rückstand erneut bei etwa 60°C in 80 ml CCI4 gelöst und 200 ml Ether zugefügt, was zur Ausfällung von 20,3 g Feststoff führte. Letzterer wurde in AcOEt (80 ml) gelöst, mit Aktivkohle gebleicht, filtriert und nach Zugabe von 200 ml Ether kristallisieren gelassen. 19,06 g des gewünschten F108-Dichlorids wurden aufgefangen. Die Reaktion ist nachfolgend schematisch dargestellt.
  • Figure 00180002
  • BEISPIEL 8
  • F108 (21 g, 3 mÄq) wurden in 200 ml Toluol gelöst, und das Lösungsmittel wurde langsam abdestilliert, um die Feuchtigkeit zu entfernen. Nach Entfernen von etwa 120 ml Lösungsmittel wurde die Lösung abgekühlt, und es wurden 0,5 g (4 mmol) Kalium-tert.-butoxid zugegeben. Nach 2 Stunden Rückfluss wurde die orange Lösung abgekühlt und 0,7 ml (6 mmol) Ethylbromacetat zugefügt. Nach Ruhen lassen über Nacht wurde die Lösung 2 Stunden unter Rückfluss gehalten, abgekühlt und durch Celite filtriert. Zugabe von 200 ml Ether führte zur Bildung von 20,71 g Feststoff, der aufgefangen und nacheinander aus EtOH (100 ml)/Ether (4°C) und AcOEt (80 ml)/Ether (200 ml) umkristallisiert wurden. Ausbeute 19,25 g. F108(O–)2 + 2BrAcOEt EtOOC-CH2-O-F108-O-CH2-COOEt
  • BEISPIEL 9
  • Fünf g des Diesters von Beispiel 8 (0,7 mÄq) wurden in 25 ml EtOH bei etwa 50°C gelöst, und etwa 1 ml (21 mmol) Hydrazinhydrat wurden zugefügt, danach wurde die Mischung 3 Stunden unter Rückfluss gehalten. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und 4°C wurden Kristalle des Dihydrazids gebildet, die aufgefangen und mit Alkohol und Ether gewaschen wurden; Ausbeute 4,85 g. F108(OCH2-COOEt)2 + N2H4·H2O – F108(OCH2-CO-NH-NH2)2
  • BEISPIEL 10
  • Zehn g des Ethyl-F108-diacetats aus Beispiel 8 wurden in einer Lösung von 50 ml EtOH und 70 ml H2O gelöst und 3 ml 32 NaOH wurden zugefügt. Nach 2 Stunden bei 50°C und einer Nacht bei Raumtemperatur wurden 15 g Salz zugegeben, der pH-Wert wurde mit konzentrierter HCl auf 2 gebracht, und die Mischung wurde zwei Mal mit 100 ml CH2CI2 extrahiert. Die kombinierten organischen Fraktionen wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na-Mg-Sulfat getrocknet. Nach Eindampfen wurde der Rückstand erneut in 50 ml Alkohol aufgelöst und bei 4°C kristallisieren gelassen.
  • Die Dicarbonsäure wurde mit einem Überschuss NaOH 0,2 N titriert (0,52 g in 9 ml H2O) und mit 0,2 N HCl rücktitriert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Substitution 74% betrug.
  • BEISPIEL 11
  • Zwei g (0,28 mÄq) des F108-Dichlorids aus Beispiel 7 wurden in 8 ml trockenem DMF aufgelöst, und es wurden 0,54 g (2,9 mmol) Kaliumphthalimid zugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei 90°C gerührt, danach abgekühlt und durch Celite filtriert. Die Lösung wurde auf 50°C erwärmt, 30 ml Ether zugegeben und nach Abkühlen bildete sich ein Feststoff; die Ausbeute betrug nach Kristallisation aus EtOH (20 ml)/Ether (50 ml) 1,46 g. Bessere Ausbeuten und reineres Produkt wurden erhalten, wenn das Kaliumphthalimid in Form einer Lösung in Formamid zugegeben wurde.
  • Figure 00200001
  • BEISPIEL 12
  • Die Verbindung des vorhergehenden Beispiels (1,46 g, 0,2 mÄq) wurde in 9 ml EtOH gelöst und 0,1 ml (2 mmol) Hydrazinhydrat wurden zugegeben. Nach einer Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit 10 ml EtOH verdünnt und 3 Stunden unter Rückfluss gehalten. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in 8 ml EtOH aufgelöst und ein Feststoff durch die Zugabe von 40 ml Ether ausgefällt. Der Feststoff wurde aufgefangen, mit Ether gewaschen, in 8 ml Ethanol gelöst und 0,11 ml (0,2 mmol) AcOH zugegeben. Die Mischung wurde auf 50°C erwärmt, 50 ml Ether zugegeben und kristallisieren gelassen. Weiße Kristalle (1,24 g) Diamino-F108 wurden aufgefangen und analysiert. Titration der -NH2 Gruppen zeigte, dass die Substitution im Wesentlichen 100 war.
  • Figure 00200002
  • BEISPIEL 13
  • F108 (21 g, 3 mÄq OH) wurde durch azeotrope Destillation in Toluol getrocknet und nachfolgend in eine Lösung (120 ml) des entsprechenden Dikaliumalkoxids überführt, wie in Beispiel 8 offenbart ist. Sechzig ml dieser Lösung wurden unter Bewegung mit 1,82 ml (15 mmol) Bromacetaldehyddimethylacetal umgesetzt. Die gelbe Lösung wurde über Nacht unter Rückfluss gehalten, wodurch sie orange und trübe wurde. Sie wurde durch Celite filtriert, am Rotationsverdampfer konzentriert und mit 120 ml Ether verdünnt, wodurch sie beim Stehen lassen kristallisierte. Der Feststoff wurde aufgefangen und in 50 ml EtOH gelöst, die Ethanollösung wurde mit Aktivkohle behandelt, filtriert und mit 40 ml Ether verdünnt. Nach Abkühlen auf 4°C hatten sich Kristalle aus F108-Diacetaldehyd-dimethylacetal (9,05 g) gebildet, die aufgefangen, getrocknet und analysiert wurden. F108(O–)2 + BrCH2-CH(OCH3)2 – (CH3O)2CH-CH2-O-F108-O-CH2-CH(OCH3)2
  • BEISPIEL 14
  • F108 (7,5 g, 10,7 mÄq OH) wurde in 30 ml CCI4 bei 50°C gelöst. Die Lösung wurde filtriert und 0,27 ml (1,1 mÄq) Tri-n-butylamin wurden bei Raumtemperatur zugegeben, gefolgt von 1,07 g (3,6 mmol) Bis(tri-chlormethyl)carbonat (Triphosgen), wobei dies 10,8 mmol COCI2 entspricht. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung 20 Stunden bei 50°C erwärmt, dann wurde sie unter Vakuum eingedampft, um den Überschuss an HCl und Phosgen vollständig zu entfernen.
  • Der Rückstand wurde in 30 ml CCI4 gelöst und mit 80 ml Ether verdünnt. Der gebildete Feststoff wurde bei 4°C aufgefangen, mit Ether gewaschen und erneut in 30 ml CCI4 gelöst.
  • Eine Lösung wurde hergestellt, die 1,9 g (14,3 mmol) tert.-Butylcarbazat und 0,2 ml (0,8 mÄq) Tributylamin in 2 ml CCI4 enthielt. Hierzu wurden 20 ml der obigen Lösung von F108-Dichlorformiat (0,715 mÄq) gegeben. Nach 18 Stunden bei 50°C wurde die Lösung filtriert und durch Zugabe von 50 ml Ether ausgefällt und auf 4°C abgekühlt. Der Feststoff wurde in AcO-Et/Ether (20 ml/50 ml) kristallisiert, um 4,21 g zu ergeben.
  • Die Di(hydrazid-COO-tert.-Bu)-Verbindung in 8 ml CH2CI2 wurde mit 8 ml TFA zum Entschützen behandelt, wie in Beispiel 4 offenbart ist. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung unter Vakuum eingedampft, der Rückstand erneut in 15 ml CH2CI2 gelöst und ein Feststoff durch Zugabe von 90 ml Ether ausgefällt. Dieser Feststoff wurde aus 20 ml EtOH + 0,5 ml Tributylamin kristallisiert, wobei die Lösung über Nacht auf 4°C gelassen wurde. Ausbeute 4,04 g F108-Dicarbazat (Urethanhydrazid).
  • Figure 00220001
  • BEISPIEL 15
  • Zu einer Lösung von 0,1 ml (0,4 mmol) Tributylamin und 0,5 ml (7,2 mmol) Ethylendiamin in 2 ml CCI4 wurden 10 ml (0,36 mÄq) der F108-Dichlorformiatlösung von Beispiel 13 gegeben. Die Lösung wurde 18 Stunden auf 50°C erwärmt, sie wurde mit 10 ml Methanol verdünnt, filtriert und ein Feststoff wurde durch 50 ml Ether ausgefällt. Der Feststoff wurde aufgefangen und aus AcOEt (10 ml)/Ether (30 ml) umkristallisiert; Ausbeute 2,25 g H2N-(CH2)2-NH-COO-F108-OOC-NH-(CH2)2-NH2. Titration der -NH2 Gruppen durch übliche Mittel zeigten, dass die Substitutionsrate etwa 60% betrug.
  • BEISPIEL 16
  • In 100 ml Ether wurden 13,22 g (0,1 Mol) tert.-Butylcarbazat und 15,4 ml (0,11 Mol) Triethylamin gelöst. Nach Abkühlen (0 bis 5°C) wurden langsam (etwa 0,5 Stunden) 8,9 ml (0,1 Mol) Bromacetylbromid zugefügt. Am Ende wurde die Temperatur wieder auf Umgebungsbedingungen kommen gelassen, und das ausgefällte Triethylammoniumbromid wurde durch Filtration entfernt (19,86 g = nahezu Theorie). Das rote Filtrat wurde an Silica (24 cm Säule; 200 ml) unter Verwendung von Ether als Eluierungsmittel (100 + 250 ml) chromatographiert. Das gelbe Eluat wurde auf etwa 80 ml konzentriert und Hexan zugesetzt, bis eine Trübung auftrat. Kristalle bildeten sich bereitwillig nach Schütteln; die letzteren wurden bei 4°C aufgefangen, Ausbeute 21,46 g, 85%.
  • Das erhaltene Produkt (tert.-Butyl-N-bromacetylcarbazat) wurde mit dem Kaliumsalz von F108 wie in den Beispielen 8 und 13 umgesetzt und danach die tert.-Bu-Gruppe durch TFA entfernt. Es wurde somit das Hydrazid erhalten, das dem in Beispiel 9 erhaltenen Produkt entspricht. Br-CH2-COBr + H2NNH-COO-t.Bu – BrCH2-CONHNH-COOt-Bu
    Figure 00230001
  • Die nach den Beispielen 1 bis 16 produzierten Linker wurden mit Erfolg zum Assoziieren von Arzneimitteln oder Signalerzeugungseinheiten (I) und bioaktiven zielführenden Molekülen (II) verwendet, um effiziente Vektoren für den Transport von (I) zu Stellen in dem Organismus mit Rezeptoraffinität für (II) zu liefern.
  • Wenn in den vorhergehenden Beispielen die amphiphile Pluronic® F108-Verbindung durch andere Co-polymere mit hydrophilen Polyalkylenoxysegmenten mit endständigem OH oder NH2 ersetzt wurden, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wobei die resultierenden entsprechenden Linkerprodukte zum Verbrücken der Einheiten (I) und (II) wie oben beschrieben verwendbar waren. Als solche Copolymere können die Pluronics® und Synperonics® mit verschiedenen Strukturen genannt werden, die in die Spezifikationen dieser Erfindung fallen, wobei diese Strukturen verschiedene hydrophile und hydrophobe Sequenzen mit unterschiedlichen Längen beinhalten. Unter speziellen Bedingungen sind auch andere Poloxamere® und Poloxamine® sowie andere konventionelle Amphiphile möglich, die zu den Marken gehören, die unter den allgemeinen eingetragenen Namen Solulan®, Brij®, Mirj®, Tween®, Triton®, Span®, usw, bekannt sind.
  • BEISPIEL 17
  • (a) Herstellung von (IfL)-Linker-Magnetit-Partikeln
  • In 40 ml Wasser wurden 81,1 mg (0,3 mmol) FeCI3·6H2O und 56,9 mg (0,3 mmol) FeCI2·4H2O (Gesamt-Fe = 0,6 mmol oder 33,5 mg) gelöst. Hierzu wurden 0,1 mCi 59Fe (Spurenmenge) in Form von FeCI3 gegeben.
  • Die Mischung wurde gerührt und eine wässrige 7,5% Lösung von Ammoniak tropfenweise zugegeben, bis der pH-Wert einen stabilen Wert von 8,6 erreichte. Eine Suspension von schwarzen Partikeln bildete sich, die 5 Minuten auf 75°C erhitzt wurde, und die Partikel wurden sich bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Der Niederschlag wurde drei Mal durch Dekantieren mit Portionen von 100 ml Wasser gewaschen, danach wurde er erneut in 60 ml Wasser unter Bewegen suspendiert. Die Eisenkonzentration dieser Suspension betrug 0,5 mg/ml.
  • Zu 10 ml dieser Suspension (5 mg Fe) wurden (als Komponente (a)) 100 mg des Natriumsalzes von Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPANa) gegeben und Schallbehandlung 20 Minuten lang durchgeführt (BRANSON 250 Schallgerät, 1/8” Mikrosonde, Leistung 20 (15 bis 20 W). Die Temperatur, die während der Schallbehandlung auf etwa 68°C stieg, wurde auf Raumtemperatur sinken gelassen, und dann wurde (als Komponente (b)) 100 mg Pluronic® (NH2)2 wie in Beispiel 12 hergestellt zugegeben (oder identisch modifizierte Amphiphile, wie Synperonic® von ICI oder Poloxamer® 338). Die Schallbehandlung wurde dann unter den genannten Bedingungen für 15 Minuten fortgesetzt.
  • Die erhaltene Suspension beschichteter Partikel (Probe SBPA-NH2) enthielt daher pro Milliliter 0,5 mg Eisen, 10 mg DPPA und 10 mg des derivatisierten Pluronic® (NH2)2-Tensids (Gewichtsverhältnis von (a) zu (b) 1:1). Messungen mittels einer Partikelzählvorrichtung (Nicomp 370 HDL-NPSS von Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Kalifornien, USA) zeigten, dass in Abhängigkeit von dem Durchgang die durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 50 bis 100 nm (±20 bis 40%) lag.
  • Andere Proben (siehe unten) wurden in identischer Weise wie die anderen derivatisierten Amphiphile hergestellt, die in den vorhergehenden Beispielen offenbart sind.
    Derivatisiertes Amphiphil Beispiel Nr. Probencode
    F108 (nicht derivatisiert) (für Kontrollen) SBPA-Ctrl
    F108 (NHNH2)2 6 SBPA-Hz
    F108 (OOC-NHNH2)2 14 SBPA-COHz
    F108 (OCH2-CONHNH2)2 9 SBPA-MeCOHz
  • (b) Herstellung der Konjugate (IfL-II)
  • Zehn ml Probe SBPA-NH2 (siehe oben unter a) wurden eine Stunde mit 27.000 g zentrifugiert. Der untere Rückstand wurde mit 2,5 ml 100 mM Boratpuffer (pH 8,2) [oder phosphatfreie isotone Lösung] aufgenommen, um eine Suspension zu liefern, die 2 mg Eisen/ml enthielt. Zu 1 ml der Suspension wurden 5 μmol gekoppeltes Biotin-NHS (NHS = N-Hydroxysuccinimid), erhältlich von Fluka AG, Schweiz, unverdünnt oder als konzentrierte DMSO-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur (Raumtemperatur) bewegt, dann 4 Mal nacheinander gegen destilliertes Wasser dialysiert, um eine gereinigte Probe des gewünschten Magnetit-Biotin-Konjugat-markierten SBPA-NH-Bio zu ergeben.
  • Ähnliche Reaktionen wurden zwischen SBPA-NH2 und anderen zielführenden Faktoren (II) durchgeführt, Laktoseisocyanat beziehungsweise Folat-NHS (hergestellt gemäß J. Biol. Chem. 269 (1994) 3198 bis 3204), um jeweils SBPA-NH-Laktose und SBPA-NH-Fol zu ergeben. Das Koppeln mit dem ”RGD”-Peptid (H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-OH), um SBPA-NH-RGD zu ergeben, wurde mit der zusätzlichen Unterstützung von sSMBP [N-Hydroxysulfosuccinimidyl-(4-maleinimidophenyl)-butyrat] gemäß dem folgenden Schema bewirkt:
    Figure 00250001
  • Das Verfahren war wie folgt: Ein Zentrifügationsrückstand einer SBPA-NH2 Probe [wie unter b) erhalten, siehe oben im Zusammenhang mit der Kopplung mit Biotin] wurde in 100 mM Hepes-Puffer, pH 7, auf eine Konzentration von 2 mg Fe/ml suspendiert. Zu 1 ml der Eisensuspension wurden 5 μmol sSMPB gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Produktsuspension wurde von überschüssigem Reagenz durch Gelfiltrationschromatographie (Säule G25) gereinigt. Die gereinigte Hepes-Suspension von SBPA-Maleimid wurde über Nacht mit einer Menge von 2,5 μmol pro mg Fe des Thiol-derivatisierten Peptids in Gegenwart von EDTA (10 mM) umgesetzt, dann wurden die überschüssigen Reagentien durch ausgiebige Dialyse gegen Hepes entfernt. Kontrollen wurden auch durch ”Pseudokopplung” (unter den vorhergehenden Bedingungen) von Magnetitpartikeln, die nichtderivatisiertes F108 trugen, mit den obigen Zielansteuerungsfaktoren durchgeführt.
  • Die vorhergehenden zielgeführten (und Kontroll-) Präparationen wurden über 0,2 μm Membranen filtriert und sowohl in vitro (Avidin und THP1-Rezeptoren) und in vivo an Laborratten getestet.
  • Für das in vitro Testen wurde zuerst eine Kontrollpräparation hergestellt, indem die Kontrollprobe SBPA-ctrI (siehe oben) mit Biotin unter denselben Bedingungen aktiviert wurde, die zur Herstellung der Präparation SBPA-NH-Bio verwendet worden waren. Dann wurden beide Präparationen auf eine Reihe von Konzentrationen verdünnt, die 60, 30, 15, 7,5 beziehungsweise 3,75 mg/ml Eisen entsprachen. Die verschiedenen
  • Verdünnungen wurden dann durch Impfen in Mikrotiterplatten getestet, die zuvor mit Avidin inkubiert worden waren. Nach 4 Stunden wurden nicht absorbierte Materialien von den Platten gewaschen und das gebundene Eisen durch konventionelle Analyse (Thioglykolat) ermittelt. Die Ergebnisse werden in Form des folgenden Graphen wiedergegeben, bei dem das adsorbierte Eisen (”Y”-Achse) gegen das Eisen in den vorhergehenden Verdünnungen (”X”-Achse) aufgetragen wird. Die Kurve, die das Verhalten von SBPA-NH-Bio zeigt, ist mit ”♦” markiert; die Kontrollkurve ist mit ”☐” markiert. Der Graph zeigt eindeutig, dass die zielgeführten magnetischen Partikel eine viel größere Affinität zu Avidin haben als die nicht zielgeführten.
  • Weitere in vitro Tests im Zusammenhang mit der Bindung von 59Fe-markierten Präparationen von SBPA-RGD (Kontrolle: SBPA-Cys) erfolgten unter Verwendung von Zellinien zum Exprimieren des entsprechenden Rezeptors. Hierfür wurden Proben von U937-Stämmen, die verschiedene Konzentrationen der zu testenden Präparationen enthielten, 48 Stunden in Standardmedien kultiviert, die mit 50 nM PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) aktiviert waren, dann eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in kaltem PBS gewaschen; abgelöst und radiogezählt. Aus den Messungen konnte die Menge eisenmarkierter Zellen relativ zu den Kontrollen ermittelt werden.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Sie zeigen, dass die Eisenmenge, die von den SBPA-zielgeführten Partikeln abgegeben wurde, erheblich größer als diejenige der Kontrollen ist. Tabelle 1
    Mittelwert ng Fe für 106 Zellen (Standardabweichung)
    10 30 100
    SBPA-rgd 74 (13,2) 181 (31) 854 (4,5)
    SBPA-Cys 42 (0,8) 154 (14,9) 427 (120)
  • In ähnlicher Weise wurde die Bindung des 55Fe-SBPA-Folatsystems (siehe oben) auf Affinität zu der menschlichen KB-Zelllinie getestet, die Folatrezeptoren exprimiert. KB-Zellen wurden wie in P. N. A. S. 92 (1995), 3318 bis 3322, beschrieben kultiviert und zwei Stunden bei 37°C mit unterschiedlichen Konzentrationen 55Fe-SBPA-Folat inkubiert. Als Kontrolle wurde eine Präparation verwendet, die 55Fe-SBPA, F108 (OH) an Folat ”pseudogekoppelt” enthielt.
  • Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben, die die Eisenkonzentration (Mittelwerte und Standardabweichung in Klammern) zeigt, die in den Medien zurückblieben (in Gegenwart und in Abwesenheit von zusätzlichem fötalem Kalbserum [FCS]). Tabelle 2
    mg Fe/ml im Kulturmedium
    Fe (ng)/106 Zellen 10 30 100
    SBPA-Folat 111 (7,5) 361 (28,5) 1170 (53)
    SBPA-Folat + FCS 77,5 (8,5) 228 (27,5) 557 (54,8)
    Kontrolle 124 (25,89) 317 (37) 739 (47)
    Kontrolle + FCS 99,7 (3,2) 245 (10,2) 611 (45)
  • Für in vivo Tests wurden die Präparationen (20-fach verdünnt) in die Schwanzvene der Versuchsratten (Startzeit t0); dann nach verschiedenen Zeitspannen (t10Minuten bis t120Minuten) injiziert, Blutproben genommen und auf Eisenkonzentration analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefasst (ausgedrückt in % der injizierten Dosis). (A = SBPA-Ctrl; B = SBPA-NH-; ”+” zeigt, dass es keine Kopplung zwischen ”A” und der zielführenden Verbindung gab). Tabelle 3
    Zeit (Min) A B – Lak A + Lak B – Bio A + Bio B – Fol A + Fol B – RGD
    10 87,9 87,8 85,3 94,1 96,1 9,1 91,3 91,7
    30 85,8 66,5 72,6 68,9 76,2 0,4 74,3 71,9
    60 80,4 33,9 31,3 34,6 43,9 0,7 26,7 22,4
    90 76,7 25,4 10,3 24,6 22,9 0,6 9,9 8,1
    120 66,5 19,6 4,3 18,0 13,9 0,5 5,6 4,6
  • Die Ergebnisse der vorhergehenden Tabelle zeigen, dass mit Ausnahme von einem Fall (B – Fol) die Konjugate für einen nennenswerten Zeitraum tatsächlich länger als die nicht gekoppelten Mischungen in dem Kreislauf verbleiben; dies zeigt, dass sie nicht rasch durch die Leber entfernt und in effizienter Weise zu der gewählten Stelle getragen werden können. Der Fall von B – Fol bleibt rätselhaft, sein Schicksal basiert vermutlich jedoch auf irgendeinem nicht identifizierten Artefakt.
  • BEISPIEL 18
  • Die DTPA-Mono- und -Distearylester der Formeln
    Figure 00290001
    und die entsprechenden Gadoliniumchelate (Gd-DTPASE) und (Gd-DTPA-(SE)2) wurden wie in G. W. Kabalka et al., Magnetic Resonance in Medicine 8 (1988) 89 bis 95 offenbart hergestellt. Das in der Synthese erforderliche DTPA-Anhydrid wurde gemäß Eckelman et al., J. Pharm. Sei. 64 (1975), 704 bis 706 hergestellt. Die Reinheit der Bildgebungsmittel wurde überprüft, indem der Gadoliniumgehalt durch übliche Mittel (Dekomplexieren in 2 N Salzsäure und Titrieren mit EDTA-Lösung; Indikator Xylenol-Orange) gemessen wurde. Diese Analyse ergab Ergebnisse, die im Wesentlichen nahe der Theorie lagen.
  • Hundert mg Gd-DTPA-SE (0,127 mmol) und 200 mg Dipalmitoylphosphatinsäure (DPPA-Na) wurden in 25 ml einer 1/1-Mischung von MeOH und CHCI3 gelöst. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft (Rotavapor, 72°C/15 Torr, 1,5 Stunden), danach wurden 20 ml destilliertes Wasser unter Bewegung zugegeben. Die Mischung wurde ferner durch Schallbehandlung für etwa 30 Minuten bei 70°C homogenisiert (Branson Schallgerät, Abgabe 40). Zu der obigen Suspension wurden 200 mg modifiziertes Synperonic® F-108 (NH2)2 wie in Beispiel 12 offenbart gegeben, und die Schallbehandlung wurde für einige Minuten wiederaufgenommen, wodurch eine stabile, optisch klare Suspension von Partikeln von Submikrometergröße (mit der Bezeichnung ”M1”) in Micellenform erhalten wurden. Die vorhergehende Präparation wurde wiederholt, wobei dieses Mal jedoch Gd-DTPA-(SE)2 (0,095 mmol) anstelle von Gd-DTPA-SE verwendet wurde, um eine Suspension mit der Bezeichnung ”M2” zu ergeben.
  • Protonenspinrelaxationen der vorhergehenden Suspension wurden unter Verwendung eines Minispec PC-120 Geräts (Bruker) gemessen, das mit 0,47 Tesla (20 MHz) arbeitete. EDM 510A (EDM = Experimentdefinitionsmodul) wurde verwendet, um die Spin-Gitter-Relaxationszeit T1 nach dem ”Inversionserholungs”-Verfahren zu messen. EDM 610A wurde verwendet, um die Spin-Spin-Relaxationszeit T2 nach der Carr-Purcell-Meiboom-Gill-(GPMG)-Technik zu messen. Die Relaxationswerte (r1 und r2), ausgedrückt als r in [mMs]–1 = 1/T für eine Konzentration von 1 mM, sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
  • Wenn die vorhergehende Präparation an ausgewählte Zielansteuerungsfaktoren (II) wie in Beispiel 17 beschrieben gekoppelt wurde, wurden entsprechende verabreichbare Systeme Gd-DTPA-SEfF108-NH-(ll) und Gd-DTPA-(SE)2fF108NH-(II) erhalten. Wie in Beispiel 17 wurden mit Ratten in vivo Tests durchgeführt und ergaben vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf den Blutkreislauf. Tabelle 4
    Probe r1 r2 Größe (nm)
    ”M1” 36,0 35,0 60 ± 30
    ”M2” 30 31 80 ± 40
  • Magnetit-Mikropartikel, die mit Synperonlc@F108 beschichtet waren, das mit endständigen NH2-Gruppen derlvatlslert war, wurden wie In Beispiel 17 (b) beschrieben an das ”RGD”-Peptid gekoppelt, um die mit SBPA-RGD bezeichnete Testprobe zu liefern. Die Kontrolle (SBPA-ME) wurde in ähnlicher Weise hergestellt, wobei in der am Ende erfolgenden Kopplungsreaktion jedoch Mercaptoethanol anstelle des Peptids verwendet wurde. Es wurden Verdünnungen von Test und Kontrolle hergestellt, die 66 beziehungsweise 33 μg Eisen/ml enthielten. Diese werden als SBPA-RGD (66 μg Fe/ml) beziehungsweise SBPA-RGD (33 μg Fe/ml), SBPA-ME (66 μg Fe/ml) und SBPA-ME (33 μg Fe/ml) bezeichnet.
  • Der Anstieg der Atmungsaktivität der Neutrophilen, der durch Zugabe des RGD-zielgeführten Systems ausgelöst wurde, wurde wie folgt getestet:
    Vollständig lebensfähige Granulozytenkulturen wurden wie von Y. Kasuya et al. in J. Biomedical Materials Research 28 (1994), 397 bis 404, offenbart hergestellt.
  • Dann wurden die folgenden Reagentien in geeignete Mikroplattenmulden eingebracht: (a) 150 μl Lösung (2 mg/ml in Hank's BSS) von Nitroblautetrazolium (NBT), (b) 100 μl der Test- oder Kontrollproben, die auf die genannten Werte verdünnt waren, (c) 50 μl der gereinigten Granulozytenpräparation, die 5·106 Zellen/ml in HBSS enthielt. Inkubation bei 37°C wurde für verschiedene Zeitspannen durchgeführt.
  • Die Reaktion der lebenden Zellen wurde durch die progressive Zunahme der Extinktion bei 540 nm infolge der Reduktion des Farbstoffs (gelb zu blau) durch das O2- geprüft, das während der Inkubation erzeugt wurde. Eine zusätzliche Platte, die dieselbe Mischung in 10 μM lodacetamid enthielt, wurde als Farbreferenz verwendet; ihre Extinktion wurde von jeder Messung der Tests oder Kontrollen subtrahiert.
  • Die Ergebnisse der vorhergehenden Experimente werden in der graphischen Darstellung von 4 wiedergegeben, die die erhebliche Aktivität der erfindungsgemäßen Systeme zeigt.
  • BEISPIEL 20
  • Präparation von SBPA-Maleinimidophenylbutyramid
  • Zehn ml der Probe SBPA-NH2 (siehe oben unter Beispiel 17) wurden eine Stunde mit 27000 g zentrifugiert. Der unten befindliche Rückstand wurde mit 100 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) aufgenommen und auf 2 mg Fe/ml verdünnt. Hierzu wurden 2,5 μmol Sulfosuccinimidyl-4[p-maleinimidophenyl]-butyrat (Sulfo-SMPB) gegeben und die Mischung 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde beseitigt, indem EDTA (10 mM) zugegeben und zentrifugiert (2 Min, 100 g) wurde. Der Rückstand wurde erneut in HEPES suspendiert (2,5 mg Fe/ml).
  • BEISPIEL 21
  • Präparation des S-Acetylthioacetats des Hexapeptids f-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys
  • 6 μmol des Hexapeptids (hergestellt wie in EP-A-0 398 143 ) wurden in DMSO gelöst, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu ergeben, und 1 Äquivalent N-Hydroxysuccinimidyl-S-thioacetat (SATA) wurde in Form einer 14 mg/ml DMSO-Lösung zugemischt. Danach wurde N-Ethylmorpholin zugegeben, um den scheinbaren pH-Wert auf 8 zu bringen (feuchter pH-Streifen). Nach einer Stunde wurde die Mischung mit H2O auf das 20-fache verdünnt und auf eine HPLC-Chromatographiekartusche geladen, die mit Wasser äquilibriert wurde (C18 Bond Elut Kartusche, Eluierungsmittel 80% wässriges Acetonitril). Das thioacetylierte Peptid erschien in der 18,77 Min Fraktion, die zu einem Feststoff getrocknet wurde. Der letztere wurde in ein wenig DMSO wieder aufgelöst.
  • BEISPIEL 22
  • Herstellung des an die SBPA-Magnetitpartikel gekoppelten Hexapeptids
  • Die Lösung von Hexapeptid-S-acetylthioacetat (2 mg) in DMSO wurde zu einer HEPES-Lösung der SBPA-Maleinimid-derivatisierten Eisenoxidpartikel (2,5 mg Fe) gegeben, die wie in Beispiel 21 offenbart hergestellt war. Der verwendete HEPES-Puffer enthielt auch EDTA (2,5 mM) und Hydroxylamin (50 mM); das Hydroxylamin wirkte als Deacetylierungsreagenz. Die Mischung wurde zwei Stunden auf Raumtemperatur gehalten, dann wurden die Eisenoxidpartikel durch Zentrifugieren isoliert, erneut in Puffer suspendiert und zur Reinigung ausgiebig dialysiert.
  • BEISPIEL 23
  • Testen der Affinität des Magnetit-Chemoanziehungspeptid-Konjugats zu Granulozyten
  • Gewebeverletzung und Entzündung durch bakterielle Infektion führt zur Bildung von Granulozyten (PMN) und einkernigen Phagozyten in Reaktion auf die chemotaktischen Peptide, die an der Infektionsstelle produziert werden. Wie aus Beispiel 19 bekannt ist, produzieren Granulozyten O2--Radikale, die im Assay durch die Reduktion des Farbstoffs Nitroblautetrazolinium (NBT) mit einer Extinktion bei 540 nm erfasst werden können.
  • Neutrophile wurden aus frischen Leukozytenfilmen isoliert und gemäß Magn. Res. Imaging 13 (1995), 393 bis 400, kultiviert. Die Rate der NBT-Reduktion wurde direkt in den in Mikroplatten kultivierten Zellen gemessen. Die Assay-Medien umfassten 150 μl NBT-Lösung (2 mg/ml), 100 μl der Konjugatlösung (diese schließt Proben mit unterschiedlicher Konzentration ein), denen 50 μl PMN (2,5–105 Zellen) zugegeben wurden, lodacetamid (ein Inhibitor des Oxidationsanstiegs) wurde dem Medium in der Photometerreferenzmulde (auf 10 mM Endkonzentration) zugegeben, wobei die Zellen 10 Minuten bei 37°C in 10 mM lodacetamid vorinkubiert wurden. Die vollständigen Details des Assays sind in ”Methods in Enzymology” 312, 417 Academic Press 1987 offenbart.
  • In dem Graph (a) von 5 sind jeweils die Raten der O2-Produktion durch Granulozyten in Reaktion auf verschiedene Verdünnungen (identifiziert durch die Eisenkonzentrationen) des SBPA-chemoanziehenden synthetischen Peptids) gezeigt. Die Kapazität von PMN, die in dosisabhängiger Weise durch das SBPA-Hexa-peptid stimuliert werden soll, wird durch die Anwesenheit der an das Chemoanziehungsmittel gekoppelten Magnetitpartikel offensichtlich. Bei den Kontrollen (b) ist der Effekt der Magnetitpartikel allein, die nicht an das Peptid gekoppelt sind, praktisch Null.
  • Die vorhergehenden Ergebnisse sind durch Radioaktivitätsmessungen (59Fe-markierte Konjugate) und T2'-Protonenrelaxationsparameter (NMR) weiter bestätigt worden. Für diese Experimente wurde frisch gereinigtes Human-PMN eine Stunde mit verschiedenen SBPA-Peptidkonjugaten bei 37°C inkubiert, dann mit kaltem PBS gewaschen. Die T2-Messungen zeigten, dass der Einbau/die Assoziation von Eisen aus dem Konjugat eine Wirkung ergab, die 6 bis 43 Mal größer als bei den nicht gekoppelten Magnetitpartikeln war.
  • In Laborratten zeigten Tracer-Messungen nach intravenöser Injektion von 59Fe-SBPA-Hexapeptidproben einen bevorzugten Transport des Eisens zu traumatisierten Stellen durch den Kreislauf.
  • BEISPIEL 24
  • Die Konjugation von Magnetitpartikeln mit unspezifischen
  • F(ab)2-Fragmenten
  • Zehn ml Probe SBPA-NH2 (siehe oben unter Beispiel 17) wurden eine Stunde mit 27000 g zentrifugiert. Der unten befindliche Rückstand wurde mit 100 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) aufgenommen und auf 2 mg Fe/ml verdünnt. Hierzu wurden 2,5 μmol Sulfosuccinimidyl-4[p-maleinimidophenyl]-butyrat (Sulfo-SMPB) gegeben und die Mischung 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde beseitigt, indem EDTA (10 mM) zugegeben und zentrifugiert (2 Min, 100 g) wurde. Der Rückstand wurde erneut in HEPES suspendiert (2,5 mg Fe/ml).
  • Eine Probe Antikörper (Ab = unspezifisches IgG) wurde 20 Stunden bei 37°C mit Pepsin (in 0,2 M Na-OAc, pH 4,2) verdaut und die Fragmente durch Affinitätschromatographie und Gelfiltration gereinigt.
  • Um die freien -SH Gruppen freizulegen, wurden die F(ab)2'-Fragmente eine Stunde bei 37°C mit einer Lösung von 1,5 mg/ml in 0,2 M NaOAc, pH 5, von 2-Mercaptoethylamin (MEA) inkubiert, um eine Lösung mit ungefähr 10 mM Endpeptidkonzentration zu erhalten. Dann wurden die modifizierten Fab-Fragmente isoliert und durch Gelfiltration in 0,15 M NH4OAc gereinigt, pH 6,8.
  • Eine Menge (1 mg) des reduzierten Ab-Fragments wurde in Gegenwart von EDTA (10 mM) zu 2 ml der vorhergehenden SBPA-NH-sSMPB-Lösung (verdünnt auf 2 mg Fe/ml) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gelassen, dann wurde sie an Sepharose 4B chromatographiert, die in PBS äquilibriert wurde, wodurch nicht konjugiertes Fab beseitigt wurde. Die Identifizierung der verbleibenden erwünschten Verbindung wurde durch Analyse unter Verwendung konventioneller Mittel bewirkt (Eisen- und Peptidbestimmung).
  • BEISPIEL 25
  • Zu einer Lösung von ausgewähltem Antikörper (Ab) (2,5 mg/ml in PBS, pH 6) wurde bei 0°C eine Menge von 0,5 M wässriger Periodatlösung gegeben, um eine 22 mM NalO4-Lösung zu ergeben. Die Mischung wurde im Dunkeln auf Eis für 75 Minuten inkubieren gelassen, dann wurde 1,3-Diamino-2-propanol (um 30 mM zu ergeben) zugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Der pH-Wert wurde mit AcOH auf 4 abgesenkt, und das oxidierte Glykoprotein (Erzeugung reaktiver -CO Gruppen) wurde durch Gelfiltration an einer Parmacia Superose 12 Säule entsalzt.
  • Zwei ml Lösung des vorhergehenden oxidierten Ab (1,5 g/ml in 0,1 M NaOAc, pH 4,6 bis 5,3) wurden zu 1 ml einer SBPA-OCO-NH-NH2 Lösung gegeben, die 4 mg Fe/ml enthielt (Code SBPA-COHz, siehe Beispiele 14 und 17), und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch Hydrazonbindungen gebildet wurden.
  • Vor der Isolierung der markierten magnetischen Partikel wurde eine Reduktion der Hydrazonfunktion unter Verwendung von 0,2 M Natriumcyanoborhydrid bei pH 4,6 bewirkt. Das Ab-SBPA-Konjugat wurde nachfolgend durch Gelfiltration an einer Sepharose 4B Säule abgetrennt.
  • BEISPIEL 26
  • In einer Variante des Verfahrens von Beispiel 17 wurde ein Addukt (L-Il), das einen derivatisierten amphiphilen Linker (Synperonic® F108-NH2) und ein zielführendes Peptid (Folat-NHS) umfasste, zuerst hergestellt und danach mit signalerzeugenden magnetischen Eisenpartikeln konjugiert, um das Beispielsystem (IfL-ll) zu ergeben. Als Ausgangsbestandteil wurde eine konzentrierte Lösung (100 bis 180 mg/ml) von derivatisiertem Synperonic® F108-NH2 (siehe Beispiel 12) in DMSO verwendet.
  • Zu einer Menge dieser Lösung wurde 1 Moläquivalent des modifizierten Folat-NHS-Peptids (siehe Beispiel 17) und ausreichend N-Ethylmorpholin gegeben, um den pH-Wert auf 8,2 (feuchte Streifen) zu bringen. Nach 24 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wurde nicht umgesetzter Ligand durch Gelfiltrationschromatographie entfernt und das F108-Peptid-Konjugat weiter durch wiederholte Dialyse gegen reines Wasser gereinigt. Die Ausbeute an Folatgekoppeltem F108 wurde spektrophotometrisch bei 365 nm ermittelt und war 0,63 Mol Folat/Mol F108. Tabelle 6
    Mg Fe/ml in Kulturmedium
    Fe (ng)/106 Zellen 10 30 100
    SBPA-Folat 1060 (142) 2010 (98) 3960 (413)
    SBPA-Folat + FCS 543 (38,4) 1410 (39,4) 3620 (360)
    Kontrolle 132 (2,3) 381 (30,7) 1530 (201)
    Kontrolle + FCS 118 (12,7) 434 (8,4) 1500 (141)
  • Die Adduktherstellung wurde als solche verwendet, um das entsprechende SBPA-Folat-System durch Schallbehandlung gemäß der in Beispiel 17, Abschnitt a) zur Herstellung des SBPA-NH2 Addukts (IfL) offenbarten Technik herzustellen. Die Präparation wurde zentrifugiert und das Pellet in isotonem Puffer erneut suspendiert. Die Bindungskapazität des Konjugatsystems an KB-Zellen wurde wie in Beispiel 17 für das entsprechende 59Fe-SBPA-Folat-Konjugataddukt beschrieben bewirkt. Die Ergebnisse sind im Vergleich mit einer gleichen Kontrolle in der obigen Tabelle 6 wiedergegeben.

Claims (6)

  1. Molekulare Konjugatsysteme, dargestellt durch die Formel (IfL-II), in der: (I) eine auf Magnetismus ansprechende Einheit der Ligandenkomponente ist, die durch magnetische Partikel, die mit Phosphatidsäure beschichtet sind, oder ein paramagnetisches Metallchelat von Polyaminocarbonsäure gebildet wird, das partiell mit einem hydrophoben, langkettigen aliphatischen Alkohol verestert ist, (II) eine ausgewählte biospezifische Einheit der zielführenden Komponente ist, die Bioaffinität für spezifische Stellen, Organe oder Gewebe im Körper aufweist, wobei (I) und (II) durch die amphiphile Brückenlinkerkomponente L miteinander verbunden werden, die hydrophobe Gruppen und reaktiv funktionalisierte hydrophile Sequenzen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zwischen L und (II) kovalent ist und die reaktive Funktion der hydrophilen Sequenzen umfasst, die Verbindung zwischen L und (I), schematisiert durch f, nicht-kovalent ist und Affinitätskräfte zwischen hydrophoben Gruppen von beiden der Komponenten umfasst, und in denen (II) aus gewebe- und zellspezifischen oder oberflächenspezifischen, zielsuchenden Proteinen, Peptiden, Glykopeptiden und Kohlenhydraten ausgewählt ist, und L ein derivatisiertes Blockcopolymer von Polyethylen- und Polypropylenglykol ist, das aus F108 (NH2)2, F108 (NHNH2)2, F108 (OOC-NHNH2)2, F108 (OCH2-CONHNH2)2, F108 (OC-NHNH2)2 ausgewählt ist, wobei F108 ein α-Hydro-w-hydroxypoly(oxyethylen)poly(oxypropylen)poly(oxyethylen)blockcopolymer ist.
  2. Verfahren zur Herstellung der Systeme nach Anspruch 1, bei dem man amphiphile Linker auswählt, die geeignete hydrophile und hydrophobe Sequenzen enthalten, man dann (a) die Linker durch Derivatisieren mit chemisch reaktiven Gruppen versieht, (b) über die reaktiven Gruppen mit einem zielführenden Faktor (II) kovalent verknüpft und (c) über die hydrophoben Sequenzen mit einer magnetisch ansprechenden Verbindung nicht-kovalent verbindet, wobei man die Systeme der Formel (IfL-II) erhält.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem man nach Schritt (b) ein Intermediat der Struktur (L-II) erhält, wobei man Schritt (c) durch Verwendung des Intermediats (L-II) bewirkt.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem man Schritt (c) vor Schritt (b) durchführt, wobei man ein Intermediat (IfL) in Schritt (c) erhält.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der derivatisierte Linker L aus F108 (NH2)2, F108 (NHNH2)2, F108 (OOC-NHNH2)2, F108 (OCH2-CONHNH2)2, F108 (OC-NHNH2)2 ausgewählt ist, wobei F108 ein Hydro-w-hydroxypoly(oxyethylen)poly(oxypropylen)poly(oxyethylen)-blockcopolymer ist, (I) aus Magnetitpartikeln im Submikrometerbereich, die mit einer Phosphatidsäure beschichtet sind, und hydrophobierten, paramagnetischen Chelaten ausgewählt ist, und II aus Biotin, Lactose, Folat und H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-OH ausgewählt ist.
  6. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Kontrastmitteln, die bei der Kernspinresonanztomographie von spezifischen Stellen im Körper von menschlichen und tierischen Patienten verwendet werden.
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