JP4018141B2 - Nmr画像形成用の標的磁気標識分子マーカーシステム - Google Patents
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Description
この種の分子共役系は、磁気応答信号発生剤成分(I)、および結合またはリンカー(L)によって該成分(I)に連結した物質(II)、たとえば生体の特異的部位(すなわち、映像化が必要な特異的器官または組織)に対して特異的親和性を有するプロテイン、ペプチドまたは生物活性物質から成る。実際に、成分(II)は、循環あるいはその他を介して体内の特異的標的に、信号を発生する成分(I)を輸送指示するアローヘッド(arrowhead)またはホーミング(homing)因子として作用する。必要に応じて、成分(II)は成分(I)のエンドサイトーシスを仲介しうることもある。
本発明は特に、新規中間体(I−LおよびL−II)および3成分構造(I−L−II)で示される分子共役系に関する。
背景技術
患者の生体の特異的部位またはレセプタへの標的となる生体分子(II)が、信号発生剤手段として作用する診断上活性な配位子(I)に連結して、診断上有用な情報を提供する、投与しうる共役系の使用は、最近数年間で広く知られるようになった。
診断上活性な作用物質としては、適当な受信機でとらえられ、電子工学的に処理され、次いでディスプレーに変換される応答信号を発生しうる物質が包含される。たとえば、電磁気信号を検出し、適当な機器で処理し、最後に適当な訓練者によって医療上解釈できるデータに変換することができる。診断上活性な作用物質の中で、カウントおよびシンチレーションで検出できる放射性核種(β−またはγ−エミッター)、放射線調査でコントラスト効果(contrast effect)を付与するヨウ素化X線不透明剤、磁気共鳴画像法(MRI)でコントラスト効果を付与する磁気応答物質(鉄磁性、常磁性および超常磁性物質)、並びに超音波検査法でコントラスト効果を付与するマイクロバルブおよびマイクロバルーンが挙げられる。
上記共役系における連結は一般に、結合または成分(I)と(II)の共有結合をもたらすための化学的反応性基を有するリンカー(L)の助力に依存する。一般式(I−L−II)で示されうる多くの系、すなわち、成分(I)と(II)がリンカー(L)によって化学的に連結してなる系は、当該分野で公知である。
多くの異なる公知の提案としては、たとえば磁気活性Fe3O4粒子を含有するポリマー微小球が包含され、該ポリマー微小球において、反応性基含有の主としてアクリル系ポリマー、たとえばポリアクリルアミド、ポリアクリル酸等は、共有結合した蛍光染料、レクチン、抗原、抗体および他の生物学的活性物質で標識され、従って、特定の炭水化物残基、ホルモンレセプタおよび他の特異的細胞表面成分の検出および局在(localization)を可能にする。
また、細胞または組織の診断局在に対してインビボで使用できる超常磁性(superparamagnetic)酸化金属粒子も提案されており、ここで、細胞または組織は該粒子に連結する特定の生物親和性吸着剤によって見分けられ、また該粒子は、これに連結する治療上活性な作用物質を病的部位へ磁気指示するようにもなっている。必然的に式:R−Si(OX)3(式中、Xは低級アルキル、およびRは末端に−NH2、−OH、−SH、脂肪族疎水性基、もしくは両親媒性基(amphipatic function)を有する脂肪族または芳香族配列である)の反応性シランを伴うシラン化反応によって、シランリンカーに結合した磁気粒子は、生物親和性吸収剤に共有連結するのに好適であることが報告されている。
同じく、有機組織に対し結合親和性を有する物質に連結した、投与しうる磁気微粒子(たとえばマグネタイト)も知られている。このように、たとえば、組織−特異的物質(抗体、神経伝達物質、ホルモン、代謝産物、酵素、トキシン、および天然もしくは合成薬物など)は、磁気粒子に対し、該粒子に反応性官能基を有する生分解性ポリマーを被覆し、次いで上記反応性官能基を介して組織−特異的物質へ結合させることにより連結する。すなわち、血流に注射で投与される組織−特異的標的マグネタイト微粒子は、標的器官または組織へ輸送され、そこで、該器官のMRI調査において、コントラスト増強剤として機能する。
また、多形核白血球(PMN)、たとえばリンパ球の、医療上有用な金属イオン(放射性同位元素および常磁性元素を含む)によるインビボ標識、およびその後のPMN往来(trafficking)および放射線検出あるいはMRIによる生体内の集中白血球の部位の検出のための方法および試薬も提案されている。この提案方法において、白血球刺激性試薬(レクチン)が白血球に結合するのを可能にする条件下で、該白血球刺激性試薬が有用な金属種に結合してなる配合物の有効量が投与されることにより、その後に、通常の測定手段を用いる該金属の検出および定量によって、刺激された白血球の濃度が確かめられる。
EP−A 0398 143(A.J.フィッシュマンら)に、感染または炎症の病巣部位を画像形成する、標識化学走性ペプチドが開示されている。この特許文献に記載の標識ペプチドは、式:
N(X)−Y−Leu−Phe−Z−W
(式中、Nは窒素、Xは保護するホルミル、アセチルまたはt−Boc基;Wは放射性または常磁性同位元素の標識、たとえばEDTAまたはDTPAキレートおよびZは共有結合またはリンカー配列(sequence)である)
で示される。また、この特許文献には、放射性標識化学走性ペプチドの、予め大腿をE.coli.菌株で感染した実験ラットへの注射、次いで毎時継続γ−カメラ画像による感染部位の局在も記載されている。
さらに、基質を標的プロテインにブリッジする、変性(derivatized)親水性−疎水性ブロックコポリマーが開示されている。たとえば、WO−A−95/06251(ユタ大学)に、PEGブロックの末端に反応性基を有する変性プルロニック(Pluronic、登録商標)およびテトロニック(Tetronic、登録商標)化合物が開示されている。疎水性表面(たとえばポリスチレンビーズおよび類似担体)を吸着により被覆するのに変性コポリマーを用い、ここで、被覆した表面は、プロテインや類似物質を固定する基質として機能する(用途:たとえばELISA試験)。
先行技術の遂行はメリットを有するが、冗漫かつ費用の高い通常の化学手段による一般式(I−L−II)の系の製造に関連して幾つかの避けられない欠点がある。
これまでに知られている系の他の不利な点は、いったんその目的、すなわち、標的組織の画像形成を果たすと、それ以上の目的を持たない、これらの複合分子の代謝または体からの排泄の問題に関連する。このような複合系を、治療剤の一定部位へのデリバリーに用いると、治療上活性な物質の減少は同時に、少なくとも一部の消化、次いで複合分子の除去をもたらす。しかしながら、かかる系を画像形成に用いるとき、使用した分子の除去が問題となる。
本発明は、変性疎水性−親水性ブロックコポリマーのリンカー性質を同様に使用するが、磁気応答成分(I)とホーミングプロテインまたはペプチド(II)の連結を簡易化するという重要な向上を構成する。
発明の概要
本発明の最初の目的は、式:
(I−L−II)
(式中、IはMRIにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプレーのコントラストの因子として作用する磁気応答配位子成分Lは適当に官能化された疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、シンペロニック(Synperonic、登録商標)等から誘導される両親媒性ブリッジリンカー成分およびIIは体の特異的部位、器官または組織に対し親和性を有するペプチド、プロテインまたは他の生物活性物質などの標的因子成分である)
の新規な投与しうる分子共役系、すなわち共役結合体化合物を提供することにある。
新規系の特徴は、以下の通りである。すなわち、LとIIの結合は共有結合であるが、IとLの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度および循環の注射後オプソニン作用に対し共役系の優れた抵椛もたらす。この特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式:IfL−IIで表すことが好ましい。
明らかに、磁気応答配位子成分Iを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかる共役結合体化合物IfL−IIの注射も、本発明の目的の一つである。
リンカーLは、式(i):
Y(W−Z−R)m (i)
(式中、mは1、2または4;
YW部は、成分Iと非共有結合する疎水性−親油性基“Y”と親水性−疎油性配列“W”が共に共有結合してなるセグメント;
Zは化学結合または中間連結配列[たとえばC1−C4脂肪族セグメント];および
Rは選定した生物活性標的因子成分IIとの共有連結をもたらす反応性基(すなわち、結合基)である)の構造を有しうる。
本発明の他の目的は、前記構造に係るリンカーLの製造方法にあり、該方法は、式:
YWm
(式中、mは1または2、
Yは親油性および疎水性基および
Wは油/水型分散特性を持ち、末端に−OHまたは−NH2を有する水相溶性配列である)の両親媒性の界面活性剤化合物を、−NHNH2、−CHO(遊離またはジアルキルアセタールの形状)、−CH=N−NH2、−NCO、NCS、−CO−NH−NH2、−O−CO−NH−NH2、−COOH、−SH、−COCl、−O−COCl等から選ばれる反応性基Rを付与するのに好適な反応物と反応させることにより、該界面融剤化合物を官能化することから成る。
さらに本発明の他の目的は、必然的に基Rを伴う反応を介して、リンカーLを標的因子成分IIと共有結合させて、生体の特異的部位への輸送をもたらすよう適当に設計された中間体(L−II)を製造する方法にある。
本発明において、疎水性基Yは磁気応答配位子成分Iの類似の疎水性基に誘引結合(非共有結合)するように選ばれる。上述の如く、この説明で、この種の結合はfで示される。このため、Yの性質に基づき、磁気応答配位子成分Iと連結する結合力は、調節可能であり、共役結合体化合物(IfL−II)の安定性並びに体へ投与した後代謝前の該共役結合体化合物の寿命を適切にコントロールすることができる。またこの構造は、より容易なおよび生体からの排泄後の分解(活性種の任意の放出を伴う)を可能ならしめる。
このため、本発明のさらに他の目的は、IおよびLが前記と同意義である非共有結合中間体(IfL)、およびリンカーLを磁気応答配位子成分Iと非共有結合させることによる上記中間体(IfL)の製造法の提供にあり、連結は、Lの疎水性基Yと上記配位子成分Iの類似疎水性基との相互の誘引力による。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明に係る共役結合体化合物IfL−IIの具体例を示す概要図である。この具体例において、ガドリニウムキレート(大きな円にGdを記す)に疎水性セグメント(プレーン(plain)の線)が備わり、その疎水性セグメントは親和性により、両親媒性リンカーLの対応セグメンYと会合し、その親水性セグメントW(小さい円)は、変性され(−ZR−)、アローヘッドIIと連結する。
図2は、本発明に係る他の共役結合体化合物を示す概要図である。この具体例において、マグネタイト微粒子(Fe3O4)は、MRI信号発生剤として作用し、ホスファチジン酸(太いサイドアームを持つ円)が被覆され、その疎水性成分(ストレートアーム)は、両親媒性基(amphiphile)(YW)の疎水性セグメント(プレーンの丸くなった線)と会合する。後者(小さい円)の親水性部(W)は、変性され、先の具体例の図1と同様、ホーミング因子と連結する。
図3は、本発明に係るリンカーを介するビオチン標的の磁気粒子からなる分子共役系対未標的系のアビジンによる確認を示すグラフである。
図4は、本発明のリンカー(変性両親媒性基)を介する化学走性標的因子(RGDペプチド)を備えた磁気微粒子(SBPA)からなる系の細胞好中球の培養に対する活性を示すグラフである。
図5aおよび5bは、マグネタイト−標識ヘキサペプチドで刺激されたヒトPMNによるNBTの減少速度を示すグラフである。
発明の詳細な説明
添付の請求の範囲に記載の本発明の主たる観点は、以下に示す予想外の知見に基づく。すなわち、式:
(I−L−II)
(式中、IはMRIにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプレーのコントラストの因子として作用する磁気応答配位子成分;Lは適当に官能化された疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、シンペロニック等から誘導される両親媒性ブリッジリンカー成分;IIは体の特異的部位、器官または組織に対し親和性を有するペプチド、プロテインまたは他の生物活性物質などの標的因子成分、およびLとIIの結合は共有結合、IとLの結合は非共有結合である)
の投与しうる共役系は、両結合が共有結合であるが、それらの代謝、すなわち排泄が極めて速い系の全ての利点を持つことである。
新規系の特徴は、以下の事実による。すなわち、LとIIの結合は共有結合であるが、IとLの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度および循環の注射後オプソニン作用に対し共役系の優れた抵抗をもたらすという事実である。この特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式:IfL−IIで表すことが好ましい。
明らかに、磁気応答配位子成分Iを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかる共役結合体化合物IfL−IIの注射も、本発明の目的の一つである。
Yは好ましくは、ステロール類(たとえばコレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、コプロスタノール、トコフェロール等)、長鎖アルコール類(たとえばC10〜C18アルコール類)のアルキル成分、長鎖酸類(たとえば脂肪酸)、長鎖ポリグリセリド類(たとえばモノ、ジおよびトリグリセリドのアルキル部)、アルキルフェノール類、アルキルアミン類およびアルキルアミド類、疎水性ポリオキシアルキレン類等から選ばれる配列を有する化合物の種類の中から選定される。他の具体例としては、疎水性の多価酸無水物、ポリオルトエステル類、ポリホスファゼン類、ポリヒドロキシ酸類、ポリカプロラクトン類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ−酪酸が挙げられる。“Y”は有利には、酸素原子で分けられる短い脂肪族鎖、たとえばプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレン等を繰返して含有してもよい。実際、好ましいYは約10〜60個の疎水性アルキレンオキシド単位、好ましくはプロピレンオキシを有する。一般に、Yの性質の最良選択の基準は、以下により詳しく記載するように、配位子成分Iに結合する類似基に対する親和性である。
本発明のセンス(sense)で有効に操作するためには、リンカーの配列Wの親水性特性は好ましくは、構造(IfL−II)の共役結合体化合物の水性液体への容易な分散を促進するようなものであるべきである。従って、正確な操作のため、Yの疎水性とWの親水性の適切な調和が必要である。実際に、HLBバランスは好ましくは、約10〜35、好ましくは25〜30が必要であるが、この範囲は、特別な場合必要ならば逸脱してもよい。“W”はイオン、たとえばスルホネート、ポリホスフエート等も可能であるが、好ましくは、Wは非イオン、すなわち、親水性のポリオキシアルキレン類、糖類および糖誘導体、親水性のセルロース誘導体(たとえばヒドロキシメチルセルロースおよび類縁体)、第三級アミンオキシド類、クラウン(crown)エーテル類、ソルビタン環および類似の親水性環式化合物などの構造を含むべきである。Wの有利な構造は、ポリエチレンオキシおよびポリメチレンオキシ配列のものである。Wがポリエチレンオキシ鎖の場合、ポリエチレンオキシ単位の数は5〜300であってよく、好ましくは約50〜150である。
一般に、本発明を興味深く実施するのに、以下に示すラベルで同定される種類の市販の変性界面活性剤を使用しうる:プルロニック,シンペロニック,ポロキサマー(Poloxamer、登録商標)のL38、F38、L42、L44、L61、L62、L62LF、L64、F68、P75、L81、P85、F108、L121、F127;シンペロニックT−シリーズ;シンペロニックL−シリーズ;BRIJ(登録商標);MYRJ(登録商標);ツイーン(Tween、登録商標)等。
反応性基(結合基)Rは非常に数多くあり、当該分野で周知である。かかる基およびその製造に関する完全な記述は、本明細書の前記、すなわち背景技術の項で引用した文献で見ることができる。かかる反応性基としては、たとえば−OH、−NH2(またはNR1R2、ここでR1およびR2はHまたは低級アルキル)、−CHO(遊離またはジアルキルアセタールの形状、−CO−NH−NH2、−O−CO−NH−NH2、−COOH、−SH、−COCl、−O−COCl等が包含される。本発明において、後記実施例でより詳しく説明するように、セグメントWの末端変性によってかかる基を導入することが好ましい。
この反応性基は、リンカーの官能化された−W−Rを標的物質と反応させることにより、構造(L−II)の中間体の製造を可能にする。標的物質の中で、それぞれの標的を含む以下に示すものを引用することができる。
中間体(L−II)を、水性担体液体中の手ごろな磁気応答配位子成分Iと接触状態にすると、必然的に共役結合体化合物(IfL−II)の直接結合および形成並びにその上記担体液体内の分散をもたらす。これは、配位子成分Iの適当な疎水性基、たとえば脂肪アルコール類または脂肪酸類のアルキル残基とまざり合いもしくはからみ合う(多分、吸着またはファンデルワールス力による)と思われる、本発明のリンカーの疎水性基Yの性質に基づくと考えられる。
本発明のリンカーの好ましい製造および使用態様において、反応的に変性したポリアルキレンオキシブロック−コポリマーY(WR)2(Yはプロピレンオキシ疎水性基、Wはエチレンオキシ親水性配列およびRは−NH2)をプロテイン・ホーミング因子(たとえばビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミド・メチルエステル)と連結させることにより、構造Y(W−ビオチン)2の中間体(L−II)を得る。この中間体を水性担体液体中、DTPA(常磁性金属とのキレートの形状)の脂肪アルコールモノまたはジエステルの存在下に置くと、連結反応が起こり、構造DTPAfY(W−ビオチン)2の共役結合体化合物(IfL−II)の分散体が得られ、これは注射によって、ビオチン−アビジン活性化に付される細胞レセプタへ向けられる。これは図1の概要図で示される。ここで関係のある、必然的に未変性ポリオキシアルキレンブロック−コポリマー(たとえばポロキサマー、プルロニック、シンペロニック)と“疎水化した”DTPA常磁性キレートの親和力連結を伴う技法は、ヨーロッパ特許出願No.95810403.6に開示されている。事実、画像形成組成物が、親油性成分を有するポリアミノ−ポリカルボキシレートキレート化剤と複合した常磁性金属イオンに加えて、生理学的に許容しうる非イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤と好ましくは1種以上の両親媒性化合物(たとえばホスホリピド)の混合物を包含すると、並はずれて有効な常磁性NMRコントラスト組成物が得られる。
本発明の他の有利な製造および使用態様において(図2参照)、ラクトースイソシアネートとポリエチレンオキシ端に−NH2末端基を有する変性両親媒性基と共に連結させることにより、Lが変性プルロニックF−108およびIIがラクトースである、中間体L−IIを製造する。次いで、この中間体の親油性セグメントYとホスホリピドの脂肪酸残基との即座の連結を利用して、肝細胞に対して、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)などのホスファチジン酸類で被覆したマグネタイト粒子を標的とすることができる。マグネタイト粒子のホスホリピドによる被覆は、国際出願公開WO−A−94/04197(ひそかなマグネタイト粒子)に開示されている。
本発明のリンカーのYセグメントとホスホリピドの脂肪残基の顕著な親和性を用いて、故意にリポソーム小胞を和らげる(tame)ことができる。この場合、たとえばリポソーム薬物−担体小胞の膜を作るホスホリピドへの、両親媒性物質の混和(EP−A−0354855参照)を言及しうる。なお、該両親媒性物質は、本発明リンカーのYW部を構成するものに類する性質を持つ。前記文献に開示の技法において、両親媒性基の疎水性部は膜形成リピドに埋もれるが、そこから親水性部が突出し、まわりの水性媒体に広がる。
もし、前記との類推によって、両親媒性基として、本明細書に記載の中間体(L−II)、すなわち親水性−親油性化合物WYと標識する生物特異的物質の共役からなる標識構造を使用すれば、標的リポソーム小胞を包含する系が得られる。リポソームがその中に、たとえば治療上または診断上活性な作用物質を封入して含有するとき、該作用物質を生体の特異的部位に向けて投与することができる。この技法は簡単で、かつリポソーム形成リピドにおいて、グラフト化した官能基を有し、後に選択ホーミングプロテインと結合する成分を用いることに基づくリポソームを標的にする古い技法(たとえばWO−A−86/04232に開示の技法)に取って代わるものである。これらの公知技法は、リピドの小胞閉じ込め特性およびその封入安定性に悪影響を及ぼしうるが、明らかに本発明において、このような落し穴は存在しない。
次に実施例を挙げて、本発明を説明する。
実施例1
式:H−(O(CH2)2)a−(OCH(CH3)CH2)b−(O(CH2)2)a−OH(式中、a=147およびb=48)のプルロニックF−108(10g、1.43mEqOH)を撹拌下、40mlの乾燥酢酸エチル(AcOEt)に溶解し、255mg(1.47mEq)のカルボニルジイミダゾール(CDI)を加え、室温で撹拌を約1/2時間続ける。溶液を脱泡し、396mg(3mEq)のt−ブチルカルバゼート(carbazate)(t−Bu−O−CO−NH−NH2)を加える。24時間の静止後、40mlのエーテルを加え、溶液を4℃で一夜結晶化せしめる。固体を濾取し、AcOEt(またはCH2Cl2)およびエーテルより再結晶する。F−108−ジ[ヒドラジドウレタン−BOC]の収量97g。
かかる反応の概要は、以下の通りである。
実施例2
式:H−(O(CH2)2)a−(OCH(CH3)CH2)b−(O(CH2)2)a−OH(式中、a=147およびb=48)のプルロニックF−108(20g、2.86mEqOH)を撹拌下、80mlの乾燥酢酸エチル(AcOEt)に溶解し、0.72ml(3ミリモル)のトリ−n−ブチルアミンN(n−Bu)3および0.7g(7ミリモル)の無水コハク酸を加える。混合物を70℃で18時間加熱し、室温まで冷却し、濾過する。40℃に加熱後、40mlのエーテルおよび5ミリモルの酢酸(AcOH)を加え、混合物を4℃で一夜結晶化せしめる。固体を集め、200mlのエーテルに懸濁し、排液し、乾燥する。純度約90%(0.02N−NaOH溶液による遊離カルボキシル基の滴定で確認)のF−108ジ酸コハク酸エステル19.74gを集めた。かかる反応は、以下の通りである。
実施例3
20mlのCCl4に、実施例2で製造したF−108ジ酸コハク酸エステル5g(0.62mEqCOOH)を溶解し、0.3ml(4.2ミリモル、COOHに関して6.5eq)の塩化チオニルを加える。混合物を2時間還流し、回転エバポレータ(rotavapor)で溶媒を完全除去する。残渣に10mlの乾燥AcOEtを加え、次いで8mlのAcOEt中の1.32g(10ミリモル)のt−Bu−カルバゼートおよび2.39ml(10ミリモル)のN(n−Bu)3の溶液を加える。黄色溶液を50℃で1時間加熱し、次いで40mlのエーテルで希釈し、室温で一夜結晶化せしめる。固体(4.97g)を10mlの乾燥塩化メチレンに溶解し、5mlのテトラフルオロ酢酸(TFA)を加える。室温で1.5時間後、回転エバボレータで溶媒を除去し、20mlのAcOEtを加え、溶液を40℃に加熱し、この時点で40mlのエーテルを加え、溶液をr.t.(室温)に戻すことにより、結晶が形成する。これらの結晶を集め、20mlのAcOEtに溶解し、0.5mlのN(n−Bu)3を加え、溶液を再度40℃に加熱し、40mlのエーテルで希釈し、室温まで冷却せしめる。次いで、さらに30mlのエーテルを加え、一夜静止後、通常のヒドラジド分析(下記参照)で確認して、4.33gのF108−ジヒドラジドコハク酸エステルを集めた。かかる反応は、以下の通りである。
実施例4
10mlのCCl4中の10g(1.3mEq)のF108の溶液に、0.8ml(3.6mEq)のN(n−Bu)3を加え、次いで0℃にて、14.3mEqのスクシニルジクロリド(フルカ(Fluka)A.G.より)を加える。黒色混合物を室温にもどした後、50℃に2.5時間加熱し、次いで冷却せしめ、一夜放置する。混合物を回転エバポレータで約50mlに濃縮し、200mlのエーテルを加えて、くもらせる。次いで、ミルク状液体を600mlのエーテルに注ぐことにより、緑色がかった固体が沈澱する。この固体を再溶解し、活性炭で処理し、濾過溶液からエーテルで再沈澱させて、8.84gのジクロリドを得る。上記製造において、再蒸留したスクシニルジクロリド(46〜47℃/0.7〜0.9トル)を使用すれば、得られる生成物は、エーテルの添加後ゆっくりと晶出し、活性炭精製は不要であった。また収量は多くなる。かかる反応は、以下の通りである。
ジクロリドを、実施例3の記載と同様にして、対応するジヒドラジドに変換する。
ジヒドラジド化合物(実施例1〜4の)を水溶液中、トリニトロベンゼンスルホネート(TNBS)および重硫酸カリウムの存在下、分光測定で(505nm、コントロン(Kontron)スペクトロメーター)分析する。測定は、t−Bu−カルバゼートの公知希釈溶液から作成した検量線に関して、10-5〜10-3M範囲の溶液で行った。測定されるサンプル(1ml)は、0.8mlのヒドラジド溶液(対照または試験)、0.1mlの1M−KHSO4および1mlのTNBS(1g/L)を含有する。吸光度測定は、サンプル調製の1時間後に行い、この遅れは再現性を確実にするのに必要である。ブランク対照の場合、蒸留水を用いた。
これらの結果から、最適純度および収量のヒドラジドを得るのに、実施例1および4の技法が好ましいことが認められる。
実施例5
5g(0.62mEq−COOH)のF108−ジ酸コハク酸エステル(実施例2で得たもの)を、20mlのAcOEtに溶解し(少し加熱が有用)、そして室温で1g(6ミリモル)のCDIを加える。溶液を室温で30分間放置し、次いで50℃に3時間加熱する。室温で2時間静置後、50℃に再加熱し、50mlのエーテルを加えることにより、固体が晶出する(4.91g)。これを集め、エーテルで洗い、乾燥する。
固体を20mlのCH2Cl2に溶解し、その10mlに、1mlのCH2Cl2中の400mg(3ミリモル)のt−Bu−カルバゼートを加える。室温で2時間後、0.72ml(3ミリモル)のN(n−Bu)3を加え、混合物を一夜放置する。晶出した生成物を集め、AcOEt/エーテルで再結晶する。収量2.31g。この生成物を実施例3と同様に、4mlのTFA/4mlのCH2Cl2と反応させて脱保護し、溶媒の除去後得られる固体を、AcOEt/エーテルより結晶化する。F108−ジスクシニル−ヒドラジドの収量2.12g。
上記と同様にヒドラジド分析を行ったところ、ほぼ理論量の2.96mEq/gを得た。
上記製造したジイミダゾリル−カルボニル誘導体の他の10ml溶液を、253ml(3ミリモル)の1,3−ジアミノプロパンおよび0.72ml(3ミリモル)のトリブチルアミン含有のCH2Cl2溶液で処理する。室温で一夜後、溶液を濾過し、50mlのエーテルで希釈して、固体を得る。固体を集め、AcOEt/エーテルおよびCCl4/エーテルより連続して再結晶する。F108のジ[アミノプロピルアミドスクシニル]−鶴体の収量2.26g。かかる反応は、以下の通りである。
実施例6
5gのF108(0.7mEq)を10mlの塩化メチレンに溶解し、0.51ml(2.15mEq)のN(n−Bu)3を加える。溶液を0℃に冷却し、そして0.23ml(21mEq)の塩化トレシルを加える。ゆっくりと室温まで戻した後(5時間)、10mlのAcOEtを加え、溶液を約50℃に加熱し、50mlのエーテルを加え、全体を結晶化のため放置する。2日後、固体を遠心分離し(8000g)、エーテルで洗い、乾燥し、20mlの塩化メチレンに溶解する。
この溶液の10ml分を、1mlのCH2Cl2中の400mg(3ミリモル)のt−Bu−カルバゼートで処理する。室温で2時間後、0.72ml(3ミリモル)のトリブチルアミンを加え、混合物を室温で一夜放置する。次いで、50mlのエーテルを加えることにより、4℃で数時間後に、F108−ジ(ヒドラジノ−BOC)の沈澱物が形成する。収量2.11g。
上記固体を4mlのCH2Cl2に溶解し、前記実施例の記載と同様に、4mlのTFAで脱保護する。室温で1時間後、回転エバポレータで溶媒を除去し、残渣を8mlのAcOEt中0.24mlのトリブチルアミンで処理し、エーテルの添加で、所望のジヒドラジノ−F108(2g)の沈澱を起す。
かかる反応は、以下の通りである。
上記反応工程に従って、塩化メチレン中のジトレシレート溶液の他の10ml分から、室温で3ミリモルの1,3−ジアミノプロパンおよび3ミリモルのトリ−n−ブチルアミンによる処理、エーテルによる沈澱およびCCl4/エーテルからの結晶化によって、対応するジ(アミノプロピルアミノ)化合物を得る。
実施例7
80mlのCCl4中の21g(3mEq)のF108の濾過溶液において、室温で1ml(4.2mEq)のトリブチルアミンを加える。冷却後、2.2ml(30ミリモル)の塩化チオニルを加え、混合物を4時間還流することにより、赤色に変化する。これを濾過し、溶媒よりストリッピングし、残渣を約60℃で80mlのCCl4に再溶解し、200mlのエーテルを加えて、20.3gの固体を沈澱せしめる。固体を、活性炭で漂白したAcOEt(80ml)に溶解し、濾過し、200mlのエーテルの添加後、結晶化せしめる。所望のF108ジクロリドを19.06g集めた。反応の概要は、以下の通りである。
実施例8
F108(21g、3mEq)を200mlのトルエンに溶解し、溶媒をゆっくり留去し、水分を除去する。約120mlの溶媒の除去後、溶液を冷却し、0.5g(4ミリモル)のカリウム・t−ブトキシドを加える。2時間の還流後、オレンジ色溶液を冷却し、0.7ml(6ミリモル)のエチルブロモアセテートを加える。一夜静止後、溶液を2時間還流し、冷却し、セライト(celite)上で濾過する。200mlのエーテルを加えて20.71gの固体を形成せしめ、該固体を集め、EtOH(100ml)/エーテル(4℃)、およびAcOEt(80ml)/エーテル(200ml)より連続して結晶化する。収量19.25g。反応は、以下の通りである。
F108(O-)2+2BrAcOEt→EtOOC−CH2−O−F108−O−CH2−COOEt
実施例9
実施例8の5gのジエステル(0.7mEq)を、約50℃にて25mlのEtOHに溶解し、約1ml(21ミリモル)のヒドラジン水和物を加えた後、混合物を3時間還流する。室温、次いで4℃に冷却後、ジヒドラジドの結晶が形成し、これを集め、アルコールおよびエーテルで洗う。収量4.85g。反応は、以下の通りである。
F108(OCH2−COOEt)2+N2H4・H2O→F108(OCH2−CO−NH−NH2)2
実施例10
実施例8の10gのエチルF108−ジアセテートを、50mlのEtOHおよび70mlのH2Oの溶液に溶解し、3mlの32%NaOHを加える。50℃で2時間および室温で一夜後、15gの塩を加え、濃HClでpH2に調整し、混合物を100mlのCH2Cl2で2回抽出する。コンバインした有機画分を飽和塩水で洗い、無水Na−Mgスルフェート上で乾燥する。蒸発後、残渣を50mlのアルコールに再溶解し、4℃で結晶化せしめる。
ジカルボン酸を過剰の0.2N−NaOHで滴定し(9mlのH2O中0.52g)、0.2N−HClで逆滴定する。この結果、置換率74%が認められる。
実施例11
実施例7の2g(0.28mEq)のF108ジクロリドを、8mlの乾燥DMFに溶解し、0.54g(2.9ミリモル)のカリウム・フタルイミドを加える。混合物を90℃で一夜撹拌後、冷却し、セライト上で濾過する。溶液を50℃に加熱し、30mlのエーテルを加え、冷却すると固体が形成する。EtOH(20ml)/エーテル(50ml)より結晶化後の収量1.46g。なお、カリウム・フタルイミドをホルムアミド溶液の形状で加えると、より良好な収量および純度の生成物が得られる。反応は、以下の通りである。
実施例12
前記実施例の化合物(1.46g、0.2mEq)を9mlのEtOHに溶解し、0.1ml(2ミリモル)のヒドラジン水和物を加える。室温で一夜後、溶液を10mlのEtOHで希釈し、3時間還流する。次いで溶媒を減圧下で除去し、残渣を8mlのEtOHに溶解し、40mlのエーテルを加えて、固体を沈澱させる。固体を集め、エーテルで洗い、8mlのエタノールに溶解し、0.11ml(2ミリモル)のAcOHを加える。混合物を50℃に加熱し、これに50mlのエーテルを加え、放置して結晶化する。ジアミノ−F108の白色結晶(1.24g)を集め、分析する。−NH2基の滴定により、置換率が実質上100%であることが認められる。反応は、以下の通りである。
実施例13
F108(21g、3mEqOH)を、トルエン中の共沸蒸留で乾燥した後、実施例8の記載と同様に、対応するジカリウム・アルコキシドの溶液(120ml)に変換する。この溶液60mlを撹拌下、1.82ml(15ミリモル)のブロモアセトアルデヒド・ジメチルアセタールと反応させる。黄色溶液を一夜還流することにより、濁ったオレンジ色となる。これをセライト上で濾過し、回転エバポレータで濃縮し、120mlのエーテルで希釈し、これによって静置で結晶化する。固体を集め、50mlのEtOHに溶解し、エタノール溶液を活性炭で処理し、濾過し、40mlのエーテルで希釈する。4℃に冷却後、F108ジアセトアルデヒド・ジメチルアセタールの結晶(9.05g)が形成し、これを集め、乾燥し、分析する。反応は、以下の通りである。
実施例14
F108(7.5g、1.07mEqOH)を、50℃にて30mlのCCl4に溶解する。溶液を濾過し、室温で0.27ml(1.1mEq)のトリ−n−ブチルアミンを加えた後、1.07g(3.6ミリモル)のビス(トリクロロメチル)カーボネート(トリホスゲン)(これは10.8ミリモルのCOCl2に相当)を加える。室温で1.5時間後、溶液を50℃で20時間加熱し、次いで減圧下で蒸発して、HClおよびホスゲン過剰分を完全に除去する。
残渣を30mlのCCl4に溶解し、80mlのエーテルで希釈する。形成した固体を4℃で集め、エーテルで洗い、30mlのCCl4に再溶解する。
2mlのCCl4中に1.9g(14.3ミリモル)のt−ブチルカルバゼートおよび0.2ml(0.8mEq)のトリブチルアミンを含有する溶液を作る。これに上記F108ジクロロホルメート溶液20ml(0.715mEq)を加える。50℃で18時間後、溶液を濾過し、50mlのエーテルの添加で沈澱せしめ、4℃に冷却する。固体をAcOEt/エーテル(20ml/50ml)中で結晶化して4.21gを得る。
ジ(ヒドラジド−COO−t−Bu)化合物を8mlのCH2Cl2中、実施例4記載と同様な脱保護のため8mlのTFAで処理する。室温で3時間後、混合物を減圧下で蒸発し、残渣を15mlのCH2Cl2に再溶解し、90mlのエーテルを加えて、固体を沈澱せしめる。この固体を20mlのEtOH+0.5mlのトリブチルアミンより結晶化し、溶液を4℃で一夜放置する。F108−ジカルバゼート(ウレタンヒドラジド)の収量4.04g。反応は以下の通りである。
実施例15
2mlのCCl4中の0.1ml(0.4ミリモル)のトリブチルアミンおよび0.5ml(7.2ミリモル)のエチレンジアミンの溶液に、実施例14の10ml(0.36mEq)のF108−ジクロロホルメート溶液を加える。溶液を50℃で18時間加熱し、10mlのメタノールで希釈し、濾過し、50mlのエーテルで固体を沈澱させる。固体を集め、AcOEt(10ml)/エーテル(30ml)中で再結晶する。H2N−(CH2)2−NH−COO−F108−OOC−NH−(CH2)2−NH2の収量2.25g。通常の手段で−NH2基の滴定を行ったところ、置換率約60%が認められる。
実施例16
100mlのエーテルに、13.22g(0.1モル)のt−ブチル・カルバゼートおよび15.4ml(0.11モル)のトリエチルアミンを溶解する。冷却下(0〜5℃)、8.9ml(0.1モル)のブロモアセチルブロミドをゆっくりと(約0.5時間で)加える。添加終了時に、温度を周囲温度に戻し、沈澱したトリエチルアンモニウムブロミドを濾去する(19.86g≒理論量)。赤色濾液をシリカ(24cmカラム、200ml)にて、溶離剤としてエーテル(100+250ml)を用いるクロマトグラフィーに付す。黄色溶出液を約80mlに濃縮し、濁りが生じてくるまでヘキサンを加える。その後、振とうすると結晶がすぐに形成する。結晶を4℃で集める。収量21.46g(85%)。
得られる生成物(t−ブチル・N−ブロモアセチルカルバゼート)を実施例8および13と同様に、カリウム塩と反応させた後、t−Bu基をTFAで除去する。このようにして、実施例9で得た生成物に対応するヒドラジドが得られる。反応は、以下の通りである。
Br−CH2−COBr+H2NNH−COO−t.Bu→BrCH2−CONHNH−COO−t.Bu
実施例1〜16に従って製造したリンカーは、薬物または信号発生剤成分(I)と生物活性標的分子(II)を会合して、(II)に対してレセプタ親和性を有する生体の部位への(I)の輸送のため有効なベクターを付与するのに首尾よく用いた。
前記実施例において、プルロニックF108両親媒性化合物を、OHまたはNH2末端の親水性ポリアルキレンオキシセグメントを有する他のコポリマーで交換しても、同様な結果が得られ、生成する対応リンカー生成物は上記と同様に成分(I)と(II)のブリッジ連結に使用しうる。かかるコポリマーの中で、本発明の明細事項に属する各種の構造のプルロニックおよびシンペロニックを引用することができ、これらの構造は、長さが異なる種々の親水性および疎水性配列を含む。他のポロキサマーおよびポロキサミン並びにソルラン(Solulan、登録商標)、ブリジ(Brij、登録商標)、ミルジ(Mirj、登録商標)、ツイーン(Tween、登録商標)、スパン(Span、登録商標)等の一般登録名下で知られているブランドに属する他の手ごろな両親媒性基(amphiphile)も、特別な条件下で可能である。
実施例17
(a)(IfL)リンカー−マグネタイト粒子の製造
40mlの水に、81.1mg(0.3ミリモル)のFeCl3・6H2Oおよび56.9mg(0.3ミリモル)のFeCl2・4H2O(トータルFe=0.6ミリモルまたは33.5mg)を溶解する。これに、0.1mCiの59Fe(トレーサ量)をFeCl3形状で加える。
混合物を撹拌し、pHが安定値8.6に到達するまで、7.5%アンモニア水溶液を滴下する。形成した黒色粒子の懸濁液を75℃で5分間加熱し、室温で粒子を沈降せしめる。沈澱物を100mlの水を分けたデカントで3回洗った後、再び撹拌下で60mlの水に懸濁する。この懸濁液の鉄濃度は0.5mg/mlであった。
この懸濁液10ml(5mgのFe)に、成分(a)として100mgのジパルミトイルホスファチジン酸のナトリウム塩(DPPA・Na)を加え、音波破砕を20分間行う(BRANSON 250音波発生器、1/8”ミクロプローブ、出力20(15−20)W)。温度は音波破砕中に約68℃まで上昇したが、これを室温まで下げ、成分(b)として実施例12で製造した100mgのプルロニック(NH2)2(または同一に変性した両親媒性基、たとえばICIのシンペロニック、またはポロキサマー338)を加える。次いで、上述の条件下で音波破砕を15分間再開する。
従って、得られる被覆粒子(サンプルSBPA−NH2)の懸濁液は、1ml当り、0.5mgの鉄、10mgのDPPAおよび10mgの変性プルロニック(NH2)2界面活性剤を含有する((a)と(b)の重量比=1:1)。粒子計数装置(USAカリフォルニア州のサンタ・バーバラ、Nicomp370HDL−NPSSオブ・パーティクル・サイジング・システムズ)による測定で、生産量に基づき、平均粒度は50〜100nm(±20〜40%)の範囲にあることがわかった。
前記実施例に記載の他の変性両親媒性基を用いて、他のサンプル(下記参照)を同様に製造した。
(b)共役結合体化合物(IfL−II)の製造
10mlのサンプルSBPA−NH2(上記(a)参照)を、27000g下で1時間遠心分離する。下層残渣を2.5mlの100mMボレート緩衝剤(pH8.2)[またはホスフェートの無い等張溶液]で採取して、2mg鉄/ml含有の懸濁液を得る。
1mlの懸濁液に、スイスのFluka A.Gから入手の5μモルのビオチン−NHS(NHS=N−ヒドロキシスクシンイミド)連結を、正味のままあるいはDMSO濃厚溶液で加える。混合物を室温で2時間撹拌し、次いで蒸留水に4回連続して透析して、所望のマグネタイト−ビオチン共役結合体標識SBPA−NH−Bioの精製サンプルを得る。
SBPA−NH2と他の標的因子(II)、すなわちラクトースイソチオシアネートおよびホレート(folate)−NHS(「J.Biol.Chem.」,269(1994年),3198〜3204頁の記載に従って製造)とに対し同様な反応を行って、それぞれSBPA−NH−LacおよびSBPA−NH−Folを得る。下記の反応式に従って“RGD”ペプチド(H−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Cys−OH)と連結してSBPA−NH−RGDを得るため、該連結を別途sSMBP[N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−(4−マレインイミドフェニル)−ブチレート]の助けをかりて行なう。
反応操作は以下の通りである。すなわち、SBPA−NH2サンプル[ビオチンとの連結に関して、上記(b)と同様にして得る]を、100mMヘペス(Hepes)緩衝剤(pH7)に懸濁して、2mgFe/ml濃度とする。1mlの鉄懸濁液に、5μモルのsSMBPを加え、混合物を室温で2時間培養する。生成物懸濁液を過剰の試薬から、ゲル濾過クロマトグラフィー(G25カラム)で精製する。精製したSBPA−マレインイミドのHepes懸濁液をEDTA(10mM)の存在下、1mgFe当り2.5μモル量のチオール−変性ペプチドと一夜反応させ、次いで過剰の試薬を、Hepesに対する広範透析で除去する。
また、未変性F108を有するマグネタイト粒子を上記ホーミング因子と“偽連結”(上記の条件下で)を行って、対照も作成する。
上述の標的(および対照)試料(preparation)を0.2μm膜で濾過し、インビトロ(アビジンおよびTHPIレセプタ)および実験室ラットのインビボの両方で試験する。
インビトロ試験の場合、先ず、対照サンプルSBPA−ctrl(上記参照)を、試料SBPA−NH−Bioの作成に用いたのと同じ条件下、ビオチンで活性化することにより、対照試料を調製する。次いで、両試料をそれぞれ、60,30,15,7.5および3.75mg/鉄1mlに相当する一連の濃度に希釈する。次に各種の希釈液を、予めアビジンと共に培養したミクロ滴定プレートに接種することにより試験する。4時間後、プレートの非吸着物質を洗い流し、通常の分析(チオグリコール酸塩)で鉄の結合を確認する。結果を図3のグラフで示し、ここで、吸着鉄(“Y”軸)を上記希釈液中の鉄(“X”軸)に対してプロットする。SBPA−NH−Bioの挙動を示すカーブに◆の印を付し、対照カーブに□の印を付した。このグラフから明らかに、標的磁性粒子はアビジンに対する親和性が非標的磁性粒子と比べてはるかに大きいことが証明される。
さらに、SBPA−RGD(対照:SBPA−cys)の59Fe−標識試料の結合に関するインビトロ試験を、対応するレセプタを表わす細胞株を用いて行なう。この場合、試験すべき各種濃度の試料を含有するU937菌株サンプルを、50nM−PMA(ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート)で活性化した標準培地中で48時間培養し、次いで37℃で1時間培養する。細胞を冷PBS中で洗い、分離し、放射線計量する。この測定から、対照に比す鉄−標識細胞の量を確認することができる。
結果を下記表1に示す。表1の結果から、SBPA−標的粒子によって放出される鉄量は対照のそれよりかなり多いことが認められる。
同様な方法で、55Fe−SBPA−ホレートシステム(上記参照)の結合について、ホレートレセプタを表わすヒトKB細胞株に対する親和性を試験する。KB細胞をP.N.A.S,92(1995年),3318〜3322頁の記載と同様に培養し、次いで各種濃度の55Fe−SBPA−ホレートと共に37℃で2時間培養する。対照として、ホレートと“偽連結”する55Fe−SBPA、F108(OH)を含有する試料を用いた。
結果を下記表2に示すが、これには、培地(別途ウシ胎児血清[FCS]の存在および非存在)に保持される鉄濃度(平均値およびかっこ内は標準偏差)が記載されている。
インビボ試験の場合、各試料(20倍に希釈)を実験ラットの尾の静脈に注射し(開始時間to)、次いで時間の各種経過後(t10分〜t120分)、血液サンプルを採取し、鉄濃度を分析する。結果を下記表3に示す(注射用量の%で表示)。なお、A=SBPA−Ctrl、B=SBPA−NH−、“+”は“A”と標的化合物に連結のないことを示す。
表3の結果から、1つのケース(B−Fol)を除き、共役結合体はかなりの長時間にわたり、実際に未連結混合物よりも長く、循環中に残存したことが認められ、またこのことは、共役結合体が肝臓によって急速に除去されず、かつ選定部位へ有効に運ばれうることを示す。なお、B−Folケースについては説明できないが、その結末はある未確認のアーチファクトによるものと思われる。
実施例18
式:
のDTPAモノ−およびジ−ステアリルエステル並びに対応するガドリニウム・キレート(Gd−DTPASE)および(Gd−DTPA(SE)2)を、G.W.カバルカ(Kabalka)らの「Magnetic Resonance in Medicine」(8(1988年)、89〜95頁)の記載に準じて製造する。合成に必要なDTPA無水物は、エッケルマン(Eckelman)らの「J.Pharm.Sci.」(64(1975年)、704〜706頁)に従って作る。通常の手段[2N塩酸中で分解(decomplexing)し、EDTA溶液で滴定;指示薬キシレノール−オレンジ]でガドリニウム分を測定して、画像化剤の純度をチェックする。この分析により、実質的に理論値に近い結果が得られる。
100mgのGd−DTPA−SE(0.127ミリモル)および200mgのジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA−Na)を、MeOH/CHCl3(1/1)混合物25mlに溶解する。溶液を減圧下で蒸発乾固した後(回転エバポレータ、72℃/15トル、1.5時間)、撹拌下で20mlの蒸留水を加える。さらに混合物を、70℃、約30分間の音波破砕(ブランソン・ソニファイア(Branso Sonifier)音波発生器、出力40)により均質化する。この懸濁液に、実施例12に開示の200mgの変性シンペロニックF108(NH2)2を加え、音波破砕を数分間再開することにより、微粒子(標識“M1”)の安定で視覚上透明な懸濁液をミセル形状で得る。かかる調製を繰返すが、この場合、Gd−DTPA−SEの代わりにGd−DTPA−(SE)2(0.095ミリモル)を用いて、“M2”標識懸濁液を得る。
上記懸濁液のプロトン・スピン緩和度を、ミニスペック(Minispec)PC−120(ブルカー)装置を用い、0.47テスラ(20MHz)で運転して測定する。EDM510A(EDM=エクスペリメント・デフィニション・モジュール(Experiment Definition Module))を用いて、“反転回収(inversion recovery)”法でスピン−格子緩和時間T1を測定する。EDM610Aを用い、カール(Carr)−パーセル(Purcell)−メイブーム(Meiboom)−ジル(Gill)(GPMG)技法で、スピン−スピン緩和時間T2を測定する。1mM濃度の場合のγ,単位[mMs]-1=1/Tで表わされる緩和度(γ1およびγ2)を下記表4に示す。
上記試料を、実施例17に記載の選定ホーミング因子(II)と連結させると、対応する投与しうる共役結合体Gd−DTPA−SEfF108−NH−(II)、およびGd−DTPA−(SE)2fF108NH−(II)が得られる。実施例17と同様に、ラットを用いてインビボ試験を行ったところ、血液循環に関してほぼ同等な結果が得られた。
実施例19
末端NH2基変性のシンペロニックF108で被覆したマグネタイト微粒子を、実施例17(b)に記載の“RGD”ペプチドと連結させて、試験サンプル標識SBPA−RGDを得る。末端連結反応において、ペプチドの代わりにメルカプトエタノールを用いる以外は、同様にして対照(SBPA−ME)を作成する、66および33μgの鉄/mlを含有する、それぞれ試験および対照の希釈液を調製する。これらは標識SBPA−RGD(66μgFe/ml)およびSBPA−RGD(33μgFe/ml),それぞれSBPA−ME(66μgFe/ml)およびSBPA−ME(33μgFe/ml)である。
RGP標的系の添加でひき起る好中球レスピラトリーバースト活性を、以下の手順で試験する。
すなわち、十分生育可能な顆粒球培養物を、カスヤらの「J.Biomedical Materials Research」(28(1994年)、397〜404頁)の開示に準じて調製する。
次いで、以下に示す試薬を、適当なミクロプレート(microplate)溜めに投入する:(a)ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(NBT)の150μl溶液(ハンクスBSS中、2mg/ml)、(b)上記の値まで希釈した100μlの試験または対照サンプル、(c)HBSS中、5×106細胞/mlを含有する50μlの精製顆粒球試料。次いで、各種の時間長さで、37℃の培養を行なう。
培養中に発生するO2による染料(黄色〜青色)の還元に基づく540nmでの吸収度の漸進的増加によって、生きている細胞の応答をチェックする。色対照として、10μMヨードアセトアミド中に同じ混合物を含有する別のプレートを用いる。その吸収度を、試験または対照の各時間測定から減算する。
上記実験の結果を図4のグラフに示すが、ここで、本発明に係る共役結合体化合物のかなりの活性が認められる。
実施例20
SBPA−マレインイミドフェニル−ブチラミドの製造
10mlのサンプルSBPA−NH2(実施例17参照)を、27000g下で1時間遠心分離する。下層残渣を100mM−HEPES緩衝剤(pH7.0)で採取し、2mgFe/mlに希釈する。これに2.5μモルのスルホスクシンイミジル−4(p−マレインイミドフェニル]−ブチレート(スルホ−SMPB)を加え、混合物を室温で2時間培養する。EDTA(10mM)を加え、遠心分離して(2分、100g)、過剰試薬を除去する。残渣をHEPES(2.5mgFe/ml)に再懸濁する。
実施例21
ヘキサペプチドf−Nle−Leu−Phe−Nle−Tyr−LysのS−アセチルチオアセテートの製造
6μモルのヘキサペプチド(EP−A−0398143の記載に準じ製造)のDMSOに溶解して、濃度10mg/mlとし、1当量のN−ヒドロキシスクシンイミジル−S−チオアセテート(SATA)を14mg/mlDMSO溶液の形状で添加した後、N−メチルモルホリンを加えて、見掛pHを8にする(湿ったpH試験片)。1時間後、混合物をH2Oで20倍に希釈し、水中で平衡なHPLCクロマトグラフィー・カートリッジに装填する(C18ボンド・エルト(Bond Elut)カートリッジ、溶離剤80%水性アセトニトリル)。チオアセチル化ペプチドが18.77分画分に生成し、これを乾燥して固体とし、該固体を少量DMSOに再溶解する。
実施例22
SBPAマグネタイト粒子に連結したヘキサペプチドの製造
実施例21の記載に従って製造したSBPA−マレインイミド変性酸化鉄粒子のHEPES溶液(2.5mgFe)に、ヘキサペプチドS−アセチルチオアセテート(2mg)のDMSO溶液を加える。使用するHEPES緩衝剤もEDTA(2.5mM)およびヒドロキシルアミン(50mM)を含有し、ヒドロキシルアミンは脱アセチル化剤として作用する。混合物を室温で2時間保持し、次いで遠心分離で酸化鉄粒子を単離し、緩衝剤に再懸濁し、精製のため広範に透析する。
実施例23
マグネタイト−化学誘引物質(Chemoattractant)ペプチド共役結合体の顆粒球との親和性試験
細菌感染による組織損傷および炎症は、感染部位に生じる化学走性ペプチドに応答する顆粒球(PMN)および単核食細胞形成を誘発する。実施例19で認められるように、顆粒球はO2基を生成し、該O2基は、540nmで吸収する染料ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(NBT)の還元によって分析することができる。
新しいバフィコートから好中球を単離し、「Magn.Res.Imaging」(13(1995年)、393〜400頁)の記載に従って培養する。NBT還元の速度を、ミクロプレートで培養した細胞において直接測定する。分析培地は、150μlのNBT溶液(2mg/ml)、100μlの共役結合体溶液(これは各種濃度のサンプルを含む)からなり、これに50μlのPMN(2.5×105細胞)を加える。光度計参照溜めの培地へ、ヨードアセトアミド(酸化バーストの抑制剤)を加える(最終濃度10mMに)。細胞は予め、10mMヨードアセトアミド中37℃にて10分間培養しておく。分析の完全詳細は、「Methods in Enzymology」(132、147頁、アカデミック・プレス、1987年)に開示されている。
図5のグラフ(a)において、SBPA−化学誘引物質合成ペプチドの各種希釈度(鉄濃度で同定)のそれぞれに応答する顆粒球によるO2生成の速度が示されている。SBPA−ヘキサペプチドによる用量依存法で刺激されるPMNの容量について、化学誘引物質に連結するマグネタイト粒子の存在で示す。対照(b)において、ペプチドに連結しない、マグネタイト粒子単独の効果は、実質的に役に立たない。
さらに上述の結果を、放射能測定値(59Fe−標識共役結合体)およびT2プロトン緩和パラメータ(NMR)で確認した。これらの実験の場合、新たに精製したヒトPMNを、各種のSBPA−ペプチド共役結合体と共に37℃で1時間培養し、次いで冷PBS中で洗う。T2測定値により、共役結合体からの鉄の取込み/会合は、未連結マグネタイト粒子の場合より6〜43倍大きい効果を付与することが認められる。
実験室ラットにおいて、59Fe−SBPA−ヘキサペプチドサンプルの静脈注射後のトレーサ測定により、循環を経て損傷部位への鉄の優先的な輸送が認められる。
実施例24
マグネタイト粒子と非特異的F(ab)2フラグメントの共役結合
10mlのサンプルSBPA−NH2(実施例17参照)を、27000g下で1時間遠心分離する。下層残渣を100mM−HEPES緩衝剤(pH7.0)に採取し、2mgFe/mlに希釈する。これに、2.5μモルのスルホスクシンイミジル−4[p−マレインイミドフェニル]−ブチレート(スルホーSMPB)を加え、混合物を室温で2時間培養する。EDTA(10mM)を加え、遠心分離して(2分、100g)、過剰試薬を除去する。残渣をHEPES(2.5mgFe/ml)に再懸濁する。
抗体(Ab=非特異的IgG)のサンプルを、ペプシン(0.2M−NaOAc中、pH4.2)と共に37℃で20時間消化し、フラグメントを親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過で精製する。
遊離−SH基を暴露するため、F(ab)2フラグメントを、0.2M−NaOAc中1.5mg/mlの2−メルカプトエチルアミン(MEA)溶液(pH5)と共に、37℃で1時間培養して、約10mM最終ペプチド濃度の溶液を得る。次いで、変性したFabフラグメントを単離し、0.15M−NH4OAc(pH6.8)中ゲル濾過で精製する。
2mlの上記SBPA−NH−sSMPB溶液(2mgFe/mlに希釈)に、EDTA(10mM)の存在下一定量(1mg)の還元したAbフラグメントを加える。溶液を窒素下室温で一夜放置し、次いでPBS中平衡のセファロース(sepharose)4Bにてクロマトグラフィーに付することにより、未共役結合のFabを除去する。残った所望化合物の同定は、通常の手段を用いる分析法(鉄およびペプチド測定)で行なった。
実施例25
選定抗体(Ab)の溶液(PBS中2.5mg/ml、pH6)に、22mM−NaIO4溶液を得るため、0℃にて一定量の0.5M過ヨウ素酸塩溶液を加える。混合物を暗所で氷上にて75分間放置、培養し、次いで1,3−ジアミノ−2−プロパノールを加え(30mM調整)、反応を止める。AcOHでpHを4まで下げ、酸化したグリコプロテイン(反応性−CO基の発生)を、パーマシア・スパロース(Pamacia Superose)12カラムにてゲル濾過で脱塩する。
上記酸化したAbの溶液(0.1M−NaOAc中、1.5g/ml、pH4.6〜5.3)20mlを、4mgFe/ml(コードSBPA−COHz、実施例14および17参照)を含有する1mlのSBPA−OCO−NH−NH2溶液に加え、混合物を室温で20時間培養することにより、ヒドラゾン結合を形成する。
標識磁気粒子の単離前に、pH4.6にて0.2Mシアノホウ水素化ナトリウムを用いてヒドラゾン基の還元を行なう。その後、Ab−SBPA共役結合体を、セファロース4Bカラムにて、ゲル濾過で分離する。
実施例26
実施例17の操作の変形として、先ず変性両親媒性リンカー(シンペロニックF108−NH2)および標的ペプチド(ホレート−NHS)を含むアダクト(L−II)を製造した後、信号発生磁気鉄粒子を共役させて、実例共役結合体化合物(IfL−II)を得る。出発成分として、変性シンペロニックF108−NH2(実施例12参照)のDMSO濃溶液(100〜180mg/ml)を用いる。
一定量のこの溶液に、1モル当量の変性したホレート−NHSペプチド(実施例17参照)およびpHを8.2とするのに(湿った試験片)十分なN−エチルモルホリンを加える。室温で24時間の静置後、未反応の配位子をゲル濾過クロマトグラフィーで除去し、さらに純水に対する透析を繰返して、Fl08−ペプチド共役結合体を精製する。ホレート−連結F108の収量は、365nmの分光光度計で測定すると、0.63モルのホレート/モル(F108)であった。
アダクト試料を用い、SBPA−NH2アダクト(IfL)を作成するための、実施例17/(a)に開示の技法に係る音波破砕によって、対応するSBPA−ホレート系を製造する。試料を遠心分離し、ペレットを等張緩衝剤に再懸濁する。対応する59Fe−SBPA−ホレート共役アダクトの場合の、実施例17の記載と同様に、該共役系のKB細胞への結合能力を正確にもたらした。同じ対象と比較した結果を、下記表6に示す。
Claims (14)
- 式:
IfL−II
[式中、Iはホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポリカルボン酸の常磁性金属キレートで構成される磁気応答配位子成分;
IIは体内の特異的部位、器官または組織に対して生物親和性を有する、組織および表面−特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれた生物特異的な標的因子成分;
Lは、プロピレンオキシ疎水性基Yおよび上記選ばれた標的因子成分IIとの連結をもたらす結合基Rを含有するエチレンオキシ親水性配列Wを有するポリオキシアルキレンブロックコポリマーの形状の両親媒性ブリッジリンカー成分であり;
並びにLとIIの連結は、上記親水性配列Wの結合基Rを介する共有結合であり;および
LとIのfで示される連結は、非共有結合でかつ該両成分の疎水性基間の親和力を含む]
で示されることを特徴とする共役結合体化合物。 - Yが、10〜60個のプロピレンオキシ単位を有するポリオキシプロピレンから選ばれる請求の範囲1に記載の共役結合体化合物。
- Wが、50〜150個のポリエチレンオキシ単位を有するポリオキシエチレンから選ばれる請求の範囲1に記載の共役結合体化合物。
- Yが48個のプロピレンオキシ単位のポリオキシプロピレンおよびWが127個のエチレンオキシ単位のポリエチレンオキシである請求の範囲1に記載の共役結合体化合物。
- Iがホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポリカルボン酸の常磁性金属キレートで構成され、IIが組織および細胞特異的または表面特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれ、およびLがF108(NH2)2、F108(NHNH2)2、F108(OOC−NHNH2)2、F108(OCH2−CONHNH2)2、F108(OC−NHNH2)2から選ばれ、ここで、F108が−(O(CH2)2)a−(OCH(CH3)CH2)b−(O(CH2)2)a−で示され、aが147およびbが48である請求の範囲1に記載の共役結合体化合物。
- 請求の範囲1に記載の共役結合体化合物を製造する方法であって、適当なプロピレンオキシ疎水性基Yおよびエチレンオキシ親水性配列Wを有する両親媒性リンカーを選択し、次いで(a)該両親媒性リンカーに変性によって結合基Rを付与して両親媒性ブリッジリンカー成分Lとし、(b)この両親媒性ブリッジリンカー成分Lを結合基Rを介して標的因子成分IIと共有結合せしめ式(L−II)の中間体を得ること、および(c)この両親媒性ブリッジリンカー成分Lを磁気応答配位子成分Iと両成分の疎水性基を介して非共有結合(f)せしめ式(IfL)の中間体を得ることにより、式(IfL−II)の共役結合体化合物を得ることを特徴とする共役結合体化合物の製造法。
- 工程(b)の後に式(L−II)の中間体を得、該中間体(L−II)を用いて工程(c)を行なう請求の範囲6に記載の製造法。
- 工程(c)を工程(b)の前に行なうことによって、工程(c)から中間体(IfL)を得る請求の範囲6に記載の製造法。
- 両親媒性リンカーに付与される結合基Rを、−NH2(またはNHR1、ここでR1は低級アルキル)、−CHO(遊離またはジアルキルアセタールの形状)、−CO−NH−NH2、−O−CO−NH−NH2、−COOH、−SH、−COOC1、−O−COC1等の中から選択する請求の範囲6に記載の製造法。
- 両親媒性ブリッジリンカー成分Lを、F108(NH2)2、F108(NHNH2)2、F108(OOC−NHNH2)2、F108(OCH2−CONHNH2)2、F108(OC−NHNH2)2から選択し、ここで、F108が−(O(CH2)2)a−(OCH(CH3)CH2)b−(O(CH2)2)a−で示され、aが147およびbが48であり;磁気応答配位子成分Iをホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト微粒子、および疎水化常磁性キレートから選択し、および標的因子成分IIをビオチン、ラクトース、ホレート、および
式:H−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Cys−OHの“RGD″ペプチドから選択する請求の範囲6に記載の製造法。 - 式:
(IfL)または(L−II)
[式中、Iはホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポルカルボン酸の常磁性金属キレートで構成される磁気応答配位子成分;
IIは体内の特異的部位、器官または組織に対して生物親和性を有する、組織および表面−特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれた生物特異的な標的因子成分;
Lは、プロピレンオキシ疎水性基Yおよび上記選ばれた標的因子成分IIとの連結をもたらす結合基Rを含有するエチレンオキシ親水性配列Wをするポリオキシアルキレンブロックコポリマーの形状の両親媒性ブリッジリンカー成分であり;
並びにLとIIの連結は、上記親水性配列Wの結合基Rを介する共有結合であり;および
LとIのfで示される連結は、非共有結合でかつ該両成分の疎水性基間の親和力を含む]
の中間体。 - Lが、F108(NH2)2、F108(NHNH2)2、F108(OOC−NHNH2)2、F108(OCH2−CONHNH2)2、F108(OC−NHNH2)2から選ばれ、ここで、F108が−(O(CH2)2)a−(OCH(CH3)CH2)b−(O(CH2)2)a−で示され、aが147およびbが48であり;およびIがホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト微粒子、および疎水化常磁性キレートから選ばれる請求の範囲11に記載の中間体。
- ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のMRI画像形成に用いる請求の範囲11または12に記載の中間体。
- ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のMRI画像形成に用いるコントラスト剤の製造用の、請求の範囲1乃至5のいずれか1つに記載の共役結合体化合物の用途。
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