JPH10512617A - Ｎｍｒ画像形成用の標的磁気標識分子マーカーシステム - Google Patents

Ｎｍｒ画像形成用の標的磁気標識分子マーカーシステム

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JPH10512617A JP9517196A JP51719697A JPH10512617A JP H10512617 A JPH10512617 A JP H10512617A JP 9517196 A JP9517196 A JP 9517196A JP 51719697 A JP51719697 A JP 51719697A JP H10512617 A JPH10512617 A JP H10512617A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトおよび動物患者の体の特異的部位に向けられる、投与しうる因子または組成物を提供する。本発明の因子または組成物は、医療上および／または診断上有効成分(Ｉ)、およびリンカー(Ｌ)によって該有効成分(Ｉ)に連結する、生体の特異的部位に対し特異的親和性を有する物質(II)から成る。リンカー“Ｌ”は、式:

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＭＲ画像形成用の標的磁気標識分子マーカーシステム 技術分野 本発明は、磁気共鳴画像形成を目的とする、ヒトおよび動物患者の体の特異的 部位に向けられる磁気標識ベクターからなる、投与しうる分子共役結合体システ ム(molecular conjugate system)または組成物に関する。 この種のシステムは、磁気応答信号発生剤成分(Ｉ)、および結合またはリンカ ー(Ｌ)によって該成分(Ｉ)に連結した物質(II)、たとえば生体の特異的部位(す なわち、映像化が必要な特異的器官または組織)に対して特異的親和性を有する プロテイン、ペプチドまたは生物活性物質から成る。実際に、成分(II)は、循環 あるいはその他を介して体内の特異的標的に、信号を発生する成分(Ｉ)を輸送指 示するアローヘッド(arrowhead)またはホーミング(homing)因子として作用する 。必要に応じて、成分(II)は成分(Ｉ)のエンドサイトーシスを仲介しうることも ある。 本発明は特に、新規中間体(Ｉ−ＬおよびＬ−II)および３成分構造(Ｉ−Ｌ−I I)で示されるシステムに関する。 背景技術 患者の生体の特異的部位またはレセプタへの標的となる生体分子(II)が、信号 発生剤手段として作用する診断上活性な配位子(Ｉ)に連結して、診断上有用な情 報を提供する、投与しうる共役結合体システムの使用は、最近数年間で広く知ら れるようになった。 診断上活性な作用物質としては、適当な受信機でとらえられ、電子工学的に処 理され、次いでディスプレーに変換される応答信号を発生しうる物質が包含され る。たとえば、電磁気信号を検出し、適当な機器で処理し、最後に適当な訓練者 によって医療上解釈できるデータに変換することができる。診断上活性な作用物 質の中で、カウントおよびシンチレーションで検出できる放射性核種(β−また はγ−エミッター)、放射線調査でコントラスト効果(contrast effect)を付与す るヨウ素化Ｘ線不透明剤、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)でコントラスト効果を付与す る磁気応答物質(鉄磁性、常磁性および超常磁性物質)、並びに超音波検査法でコ ントラスト効果を付与するマイクロバルブおよびマイクロバルーンが挙げられる 。 上記共役結合体における連結は一般に、結合または成分(Ｉ)と(II)の共有結合 をもたらすための化学的反応性基を有するリンカー(Ｌ)の助力に依存する。一般 式(Ｉ−Ｌ−II)で示されうる多くのシステム、すなわち、成分(Ｉ)と(II)がリン カー(Ｌ)によって化学的に連結してなるシステムは、当該分野で公知である。 多くの異なる公知の提案としては、たとえば磁気活性Ｆe3Ｏ4粒子を含有する ポリマー微小球が包含され、該ポリマー微小球において、反応性基含有の主とし てアクリル系ポリマー、たとえばポリアクリルアミド、ポリアクリル酸等は、共 有結合した蛍光染料、レクチン、抗原、抗体および他の生物学的活性物質で標識 され、従って、特定の炭水化物残基、ホルモンレセプタおよび他の特異的細胞表 面成分の検出および局在(localization)を可能にする。 また、細胞または組織の診断局在に対してインビボで使用できる超常磁性(sup erparamagnetic)酸化金属粒子も提案されており、ここで、細胞または組織は該 粒子に連結する特定の生物親和性吸着剤によって見分けられ、また該粒子は、こ れに連結する治療上活性な作用物質を病的部位へ磁気指示するようにもなってい る。必然的に式: Ｒ−Ｓi(ＯＸ)3(式中、Ｘは低級アルキル、およびＲは末端に −ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、脂肪族疎水性基、もしくは両親媒性基(amphipatic f unction)を有する脂肪族または芳香族配列である)の反応性シランを伴うシラン 化反応によって、シランリンカーに結合した磁気粒子は、生物親和性吸収剤に共 有連結するのに好適であることが報告されている。 同じく、有機組織に対し結合親和性を有する物質に連結した、投与しうる磁気 微粒子(たとえばマグネタイト)も知られている。このように、たとえば、組織− 特異的物質(抗体、神経伝達物質、ホルモン、代謝産物、酵素、トキシン、およ び天然もしくは合成薬物など)は、磁気粒子に対し、該粒子に反応性官能基を有 する生分解性ポリマーを被覆し、次いで上記反応性官能基を介して組織−特異的 物質へ結合させることにより連結する。すなわち、血流に注射で投与される組織 一特異的標的マグネタイト微粒子は、標的器官または組織へ輸送され、そこで、 該器官のＭＲＩ調査において、コントラスト増強剤として機能する。 また、多形核白血球(ＰＭＮ)、たとえばリンパ球の、医療上有用な金属イオン (放射性同位元素および常磁性元素を含む)によるインビボ標識、およびその後の ＰＭＮ往来(trafficking)および放射線検出あるいはＭＲＩによる生体内の集中 白血球の部位の検出のための方法および試薬も提案されている。この提案方法に おいて、白血球刺激性試薬(レクチン)が白血球に結合するのを可能にする条件下 で、該白血球刺激性試薬が有用な金属種に結合してなる配合物の有効量が投与さ れることにより、その後に、通常の測定手段を用いる該金属の検出および定量に よって、刺激された白血球の濃度が確かめられる。 ＥＰ−Ａ ０３９８ １４３(Ａ．Ｊ．フィッシュマンら)に、感染または炎症の 病巣部位を画像形成する、標識化学走性ペプチドが開示されている。この特許文 献に記載の標識ペプチドは、式: Ｎ(Ｘ)−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−Ｚ−Ｗ (式中、Ｎは窒素、Ｘは保護するホルミル、アセチルまたはt−Ｂoc基; Ｗは放 射性または常磁性同位元素の標識、たとえばＥＤＴＡまたはＤＴＰＡキレートお よびＺは共有結合またはリンカー配列(sequence)である) で示される。また、この特許文献には、放射性標識化学走性ペプチドの、予め大 腿をＥ．coli．菌株で感染した実験ラットへの注射、次いで毎時継続γ−カメラ 画像による感染部位の局在も記載されている。 さらに、基質を標的プロテインにブリッジする、変性(derivatized)親水性− 疎水性ブロックコポリマーが開示されている。たとえば、ＷＯ−Ａ−９５／０６ ２５１(ユタ大学)に、ＰＥＧブロックの末端に反応性基を有する変性プルロニッ ク(Ｐluronic、登録商標)およびテトロニック(Ｔetronic、登録商標)化合物が開 示されている。疎水性表面(たとえばポリスチレンビーズおよび類似担体)を吸着 により被覆するのに変性コポリマーを用い、ここで、被覆した表面は、プロテイ ンや類似物質を固定する基質として機能する(用途: たとえばＥＬＩＳＡ試験)。 先行技術の遂行はメリットを有するが、冗漫かつ費用の高い通常の化学手段に よる一般式(Ｉ−Ｌ−II)のシステムの製造に関連して幾つかの避けられない欠点 がある。 これまでに知られているシステムの他の不利な点は、いったんその目的、すな わち、標的組織の画像形成を果たすと、それ以上の目的を持たない、これらの複 合分子の代謝または体からの排泄の問題に関連する。このような複合システムを 、治療剤の一定部位へのデリバリーに用いると、治療上活性な物質の減少は同時 に、少なくとも一部の消化、次いで複合分子の除去をもたらす。しかしながら、 かかるシステムを画像形成に用いるとき、使用した分子の除去が問題となる。 本発明は、変性疎水性−親水性ブロックコポリマーのリンカー性質を同様に使 用するが、磁気応答成分(Ｉ)とホーミングプロテインまたはペプチド（II）の連 結を簡易化するという重要な向上を構成する。 発明の概要 本発明の最初の目的は、式: (Ｉ−Ｌ−II) (式中、(Ｉ)はＭＲＩにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプ レーのコントラストの因子として作用する磁気応答成分; Ｌは適当に官能化され た疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、 シンペロニック(Ｓynperonic、登録商標)等から誘導されるリンカーまたはブリ ッジ単位; および(II)は体の特異的部位、器官または組織に対し親和性を有する ペプチド、プロテインまたは他の生物活性物質などの標的単位である) の新規な投与しうる共役結合体システムを提供することにある。 新規システムの特徴は、以下の通りである。すなわち、Ｌと(II)の結合は共有 結合であるが、(Ｉ)とＬの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力 で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度およ び循環の注射後オプソニン作用に対し共役結合体の優れた抵抗をもたらす。この 特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式: ＩfＬ−IIで表すことが好ま しい。 明らかに、配位子Ｉを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかるシステ ムＩfＬ−IIの注射も、本発明の目的の一つである。 リンカーＬは、式(ｉ): Ｙ(Ｗ−Ｚ−Ｒ)m (ｉ) (式中、mは１、２または４; ＹＷ部は、成分(Ｉ)と非共有結合する疎水性−親油性配列“Ｙ”と親水性−疎 油性配列“Ｗ”が共に共有結合してなるセグメント; Ｚは化学結合または中間連結配列[たとえばＣ1−Ｃ4脂肪族セグメント]; およ び Ｒは選定した生物活性標的化合物(II)との共有連結をもたらす反応性基である )の構造を有しうる。 変形態様において、リンカーは“Ｌ”で表示、かつ式(ii): Ｌ'＝(ＲＺＷＹ)2Ｎ−Ｙ1−Ｎ(ＹＷＺＲ)2 (ii) (式中、Ｎは窒素、並びにＹ、Ｗ、ＺおよびＲは前記式(ｉ)の場合と同意義で あるが、１〜３つのＲはＨであってもよく、またＹ1は疎水性ブリッジ配列、た とえばＹのような配列、すなわち、必要に応じてヘテロ原子で中断された脂肪族 鎖、たとえばＣ2〜Ｃ6アルキレン、または＝Ｎ(ＣＨ2)2〜6Ｎ＝である) で示すことができる。リンカーＬ'は、リンカーＬと同様な性質を有するが、有 効な多官能価を持ち、すなわち、４つ以下の標的単位との連結をもたらしうる。 本発明の他の目的は、前記構造に係るリンカー(ＬまたはＬ')の製造方法にあ り、該方法は、式: ＹＷm[または(ＷＹ)2ＮＹ1Ｎ(ＹＷ)2] (式中、mは１または２、 Ｙは親油性および疎水性配列および Ｗは油／水型分散特性を持ち、末端に−ＯＨまたは−ＮＨ2を有する水相溶性 配列である)の両親媒性の界面活性剤化合物を、−ＮＨＮＨ2、−ＣＨＯ(遊離ま たはジアルキルアセタールの形状)、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ2、−ＮＣＯ、ＮＣＳ、− ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣ l、−Ｏ−ＣＯＣl等から選ばれる反応性基Ｒを付与するのに好適な反応物と反応 させることにより、該界面活性剤化合物を官能化することから成る。 さらに本発明の他の目的は、必然的に基Ｒを伴う反応を介して、リンカーＬ( またはＬ')を標的ベクター(II)と共有結合させて、生体の特異的部位への輸送を もたらすよう適当に設計された中間体(Ｌ−II)を製造する方法にある。 本発明において、親油性配列Ｙは信号発生剤成分(Ｉ)の類似の配列に誘引結合 (非共有結合)するように選ばれる。上述の如く、この説明で、この種の結合はf で示される。このため、Ｙの性質に基づき、信号発生剤(Ｉ)と連結する結合力は 、調節可能であり、システム(ＩfＬ−II)の安定性並びに体へ投与した後代謝前 の該システムの寿命を適切にコントロールすることができる。またこの構造は、 より容易なおよび生体からの排泄後の分解(活性種の任意の放出を伴う)を可能な らしめる。 このため、本発明のさらに他の目的は、(Ｉ)およびＬが前記と同意義である非 共有結合中間体(ＩfＬ)、およびリンカーＬ(またはＬ')を磁気活性信号発生剤配 位子(Ｉ)と非共有結合させることによる上記中間体(ＩfＬ)の製造法の提供にあ り、連結は、Ｌの親油性配列Ｙと上記配位子(Ｉ)の類似配列との相互の誘引力に よる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に係るシステムＩfＬ−IIの具体例を示す概要図である。この 具体例において、ガドリニウムキレート(大きな円にＧdを記す)に疎水性セグメ ント(プレーン(plain)の線)が備わり、その疎水性セグメントは親和性により、 両親媒性リンカー(Ｌ)の対応セグメント(Ｙ)と会合し、その親水性セグメント( Ｗ)(小さい円)は、変性され(−ＺＲ−)、アローヘッドIIと連結する。 図２は、本発明に係る他のシステムを示す概要図である。この具体例において 、 マグネタイト微粒子(Ｆe3Ｏ4)は、ＭＲＩ信号発生剤として作用し、ホスファチ ジン酸(太いサイドアームを持つ円)が被覆され、その疎水性成分(ストレートア ーム)は、両親媒性基(amphiphile)(ＹＷ)の疎水性セグメント(プレーンの丸くな った線)と会合する。後者(小さい円)の親水性部(Ｗ)は、変性され、先の具体例 の図１と同様、ホーミング因子と連結する。 図３は、本発明に係るリンカーを介するビオチン標的の磁気粒子からなる分子 システム対未標的システムのアビジンによる確認を示すグラフである。 図４は、本発明のリンカー(変性両親媒性基)を介する化学走性標的因子(ＲＧ Ｄペプチド)を備えた磁気微粒子(ＳＢＰＡ)からなるシステムの細胞好中球の培 養に対する活性を示すグラフである。 図５aおよび５bは、マグネタイト−標識ヘキサペプチドで刺激されたヒトＰＭ ＮによるＮＢＴの減少速度を示すグラフである。 発明の詳細な説明 添付の請求の範囲に記載の本発明の主たる観点は、以下に示す予想外の知見に 基づく。すなわち、式: (Ｉ−Ｌ−II) (式中、(Ｉ)はＭＲＩにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプ レーのコントラストの因子として作用する磁気応答成分; Ｌは適当に官能化され た疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、 シンペロニック等から誘導されるリンカーまたはブリッジ単位;(II)は体の特異 的部位、器官または組織に対し親和性を有するペプチド、プロテインまたは他の 生物活性物質などの標的単位、およびＬと(II)の結合は共有結合、(Ｉ)とＬの結 合は非共有結合である) の投与しうる共役結合体システムは、両結合が共有結合であるが、それらの代謝 、すなわち排泄が極めて速いシステムの全ての利点を持つことである。 新規システムの特徴は、以下の事実による。すなわち、Ｌと(II)の結合は共有 結合であるが、(Ｉ)とＬの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力 で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度およ び循環の注射後オプソニン作用に対し共役結合体の優れた抵抗をもたらすという 事実である。この特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式: ＩfＬ−II で表すことが好ましい。 明らかに、配位子Ｉを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかるシステ ムＩfＬ−IIの注射も、本発明の目的の一つである。 リンカーＬは、式(ｉ): Ｙ(Ｗ−Ｚ−Ｒ)m (ｉ) (式中、mは１、２または４； ＹＷ部は、成分(Ｉ)と非共有結合する疎水性−親油性配列“Ｙ”と親水性−疎 油性配列“Ｗ”が共に共有結合してなるセグメント； Ｚは化学結合または中間連結配列[たとえばＣ1−Ｃ4脂肪族セグメント]; およ び Ｒは選定した生物活性標的化合物(II)との共有連結をもたらす反応性基である )の構造を有しうる。 変形態様において、リンカーは“Ｌ”で表示、かつ式(ii): Ｌ'＝(ＲＺＷＹ)2Ｎ−Ｙ1−Ｎ(ＹＷＺＲ)2 (ii) (式中、Ｎは窒素、並びにＹ、Ｗ、ＺおよびＲは前記式(ｉ)の場合と同意義で あるが、１〜３つのＲはＨであってもよく、またＹ1は疎水性ブリッジ配列、た とえばＹのような配列、すなわち、必要に応じてヘテロ原子で中断された脂肪族 鎖、たとえばＣ2〜Ｃ6アルキレン、または＝Ｎ(ＣＨ2)2〜6Ｎ＝である) で示すことができる。リンカーＬ'は、リンカーＬと同様な性質を有するが、有 効な多官能価を持ち、すなわち、４つ以下の標的単位との連結をもたらしうる。 リンカーにおいて、m＝１または２のとき、配列Ｙは通常、必要に応じてヘテ ロ原子(たとえばＯ、ＮおよびＳ)で中断された疎水性／親油性脂肪族またはアリ ール−脂肪族配列であってよい。mが４のとき、Ｙは式: Ａ(Ｙ')4 (式中、ＡおよびＹ'はまた前記Ｙの定義にも相当し、たとえば、この場合Ａは 好ましくは式:−(ＣＨ2)pまたは＝Ｎ(ＣＨ2)pＮ＝(ここで、pは２〜６の整数)の 基であってよい) を有するのが有利である。 このように、Ｙは好ましくは、ステロール類(たとえばコレステロール、ラノ ステロール、エルゴステロール、コプロスタノール、トコフェロール等)、長鎖 アルコール類(たとえばＣ10〜Ｃ18アルコール類)のアルキル成分、長鎖酸類(た とえば脂肪酸)、長鎖ポリグリセリド類(たとえばモノ、ジおよびトリグリセリド のアルキル部)、アルキルフェノール類、アルキルアミン類およびアルキルアミ ド類、疎水性ポリオキシアルキレン類等から選ばれる配列を有する化合物の種類 の中から選定される。他の具体例としては、疎水性の多価酸無水物、ポリオルト エステル類、ポリホスファゼン類、ポリヒドロキシ酸類、ポリカプロラクトン類 、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ−酪酸が挙げられる。“Ｙ”は 有利には、酸素原子で分けられる短い脂肪族鎖、たとえばプロピレン、イソプロ ピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレン等を繰返して含有してもよい 。実際、好ましいＹは約１０〜６０個の疎水性アルキレンオキシド単位、好まし くはプロピレンオキシを有する。一般に、Ｙの性質の最良選択の基準は、以下に より詳しく記載するように、成分(Ｉ)に結合する類似基に対する親和性である。 本発明のセンス(sense)で有効に操作するためには、リンカーの配列Ｗの親水 性特性は好ましくは、構造(ＩfＬ−II)のシステムの水性液体への容易な分散を 促進するようなものであるべきである。従って、正確な操作のため、Ｙの親油性 とＷの親水性の適切な調和が必要である。実際に、ＨＬＢバランスは好ましくは 、約１０〜３５、好ましくは２５〜３０が必要であるが、この範囲は、特別な場 合必要ならば逸脱してもよい。“Ｗ”はイオン、たとえばスルホネート、ポリホ スフエート等も可能であるが、好ましくは、Ｗは非イオン、すなわち、親水性の ポリオキシアルキレン類、糖類および糖誘導体、親水性のセルロース誘導体(た とえばヒドロキシメチルセルロースおよび類縁体)、第三級アミンオキシド類、 クラ ウン(crown)エーテル類、ソルビタン環および類似の親水性環式化合物などの構 造を含むべきである。Ｗの有利な構造は、ポリエチレンオキシおよびポリメチレ ンオキシ配列のものである。Ｗがポリエチレンオキシ鎖の場合、ポリエチレンオ キシ単位の数は５〜３００であってよく、好ましくは約５０〜１５０である。 一般に、本発明を興味深く実施するのに、以下に示すラベルで同定される種類 の市販の変性界面活性剤を使用しうる: プルロニック，シンペロニック，ポロキ サマー(Poloxamer、登録商標)のＬ３８、Ｆ３８、Ｌ４２、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ ６２、Ｌ６２ＬＦ、Ｌ６４、Ｆ６８、Ｐ７５、Ｌ８１、Ｐ８５、Ｆ１０８、Ｌ１ ２１、Ｆ１２７; シンペロニックＴ−シリーズ; シンペロニックＬ−シリーズ; ＢＲＩＪ(登録商標); ＭＹＲＪ(登録商標); ツイーン(Ｔween、登録商標)等。 反応性基Ｒは非常に数多くあり、当該分野で周知である。かかる基およびその 製造に関する完全な記述は、本明細書の前記、すなわち背景技術の項で引用した 文献で見ることができる。かかる反応性基としては、たとえば−ＯＨ、−ＮＨ2( またはＮＲ1Ｒ2、ここでＲ1およびＲ2はＨまたは低級アルキル)、−ＣＨＯ(遊離 またはジアルキルアセタールの形状、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ −ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣl、−Ｏ−ＣＯＣl 等が包含される。本 発明において、後記実施例でより詳しく説明するように、セグメントＷの末端変 性によってかかる基を導入することが好ましい。 この反応性基は、リンカーの官能化された−Ｗ−Ｒを標的物質と反応させるこ とにより、構造(Ｌ−II)の中間体の製造を可能にする。標的物質の中で、それぞ れの標的を含む以下に示すものを引用することができる。 中間体(Ｌ−II)を、水性担体液体中の手ごろな磁気応答信号発生剤配位子(Ｉ) と接触状態にすると、必然的に標的因子(ＩfＬ−II)の直接結合および形成並び にその上記担体液体内の分散をもたらす。これは、配位子(Ｉ)の適当な親油性基 、たとえば脂肪アルコール類または脂肪酸類のアルキル残基とまざり合いもしく はからみ合う(多分、吸着またはファンデルワールス力による)と思われる、本発 明のリンカーの親油性配列Ｙの性質に基づくと考えられる。 本発明のリンカーの好ましい製造および使用態様において、反応的に変性した ポリアルキレンオキシブロック−コポリマーＹ(ＷＲ)2(Ｙはポリプロピレンオキ シ配列、Ｗはポリエチレンオキシ配列およびＲは−ＮＨ2)を、プロテイン・ホ ーミング因子(たとえばビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・メチルエス テル)と連結させることにより、構造Ｙ(Ｗ−ビオチン)2の中間体(Ｌ−II)を得る 。この中間体を水性担体液体中、ＤＴＰＡ(常磁性金属とのキレートの形状)の脂 肪アルコールモノまたはジエステルの存在下に置くと、連結反応が起こり、構造 ＤＴＰＡfＹ(Ｗ−ビオチン)2のシステム(ＩfＬ−II)の分散体が得られ、これは 注射によって、ビオチン−アビジン活性化に付される細胞レセプタへ向けられる 。これは図１の概要図で示される。ここで関係のある、必然的に未変性ポリオキ シアルキレンブロック−コポリマー(たとえばポロキサマー、プルロニック、シ ンペロニック)と“疎水化した”ＤＴＰＡ常磁性キレートの親和力連結を伴う技 法は、ヨーロッパ特許出願Ｎo．９５８１０４０３.６に開示されている。事実、 画像形成組成物が、親油性成分を有するポリアミノ−ポリカルボキシレートキレ ート化剤と複合した常磁性金属イオンに加えて、生理学的に許容しうる非イオン 性界面活性剤または非イオン性界面活性剤と好ましくは１種以上の両親媒性化合 物(たとえばホスホリピド)の混合物を包含すると、並はずれて有効な常磁性ＮＭ Ｒコントラスト組成物が得られる。 本発明において、親油性配列Ｙは、信号発生剤成分(Ｉ)の類似配列と誘引結合 (非共有結合)するように選ばれる。上述の如く、この種の結合はfで示される。 このため、Ｙの性質に基づき、信号発生剤(Ｉ)と連結する結合力は、調節可能で あり、システム(ＩfＬ−II)の安定性並びに体へ投与した後代謝前の該システム の寿命を適切にコントロールすることができる。またこの構造は、より容易なお よび生体からの排泄後の分解(活性種の任意の放出を伴う)を可能ならしめる。 本発明の他の有利な製造および使用態様において(図２参照)、ラクトースイソ シアネートとポリエチレンオキシ端に−ＮＨ2末端基を有する変性両親媒性基と 共に連結させることにより、Ｌが変性プルロニックＦ−１０８およびIIがラクト ースである、中間体Ｌ−IIを製造する。次いで、この中間体の親油性セグメント Ｙとホスホリピドの脂肪酸残基との即座の連結を利用して、肝細胞に対して、た とえばジパルミトイルホスファチジン酸(ＤＰＰＡ)などのホスファチジン酸類で 被覆したマグネタイト粒子を標的とすることができる。マグネタイト粒子のホス ホリピドによる被覆は、国際出願公開ＷＯ−Ａ−９４／０４１９７(ひそかなマ グネタイト粒子)に開示されている。 本発明のリンカーのＹセグメントとホスホリピドの脂肪残基の顕著な親和性を 用いて、故意にリポソーム小胞を和らげる(tame)ことができる。この場合、たと えばリポソーム薬物−担体小胞の膜を作るホスホリピドへの、両親媒性物質の混 和(ＥＰ−Ａ−０３５４８５５参照)を言及しうる。なお、該両親媒性物質は、本 発明リンカーのＹＷ部を構成するものに類する性質を持つ。前記文献に開示の技 法において、両親媒性基の疎水性部は膜形成リピドに埋もれるが、そこから親水 性部が突出し、まわりの水性媒体に広がる。 もし、前記との類推によって、両親媒性基として、本明細書に記載の中間体( Ｌ−II)、すなわち親水性−親油性化合物ＷＹと標識する生物特異的物質の共役 結合体からなる標識構造を使用すれば、標的リポソーム小胞を包含するシステム が得られる。リポソームがその中に、たとえば治療上または診断上活性な作用物 質を封入して含有するとき、該作用物質を生体の特異的部位に向けて投与するこ とができる。この技法は簡単で、かつリポソーム形成リピドにおいて、グラフト 化した官能基を有し、後に選択ホーミングプロテインと結合する成分を用いるこ とに基づくリポソームを標的にする古い技法(たとえばＷＯ−Ａ−８６／０４２ ３２に開示の技法)に取って代わるものである。これらの公知技法は、リピドの 小胞閉じ込め特性およびその封入安定性に悪影響を及ぼしうるが、明らかに本発 明において、このような落し穴は存在しない。 本発明の他の目的は、前記構造に係るリンカー(ＬまたはＬ')の製造方法にあ り、該方法は、式: ＹＷm[または(ＷＹ)2ＮＹ1Ｎ(ＹＷ)2] (式中、mは１または２、 Ｙは親油性および疎水性配列および Ｗは油／水型分散特性を持ち、末端に−ＯＨまたは−ＮＨ2を有する水相溶性 配列である） の両親媒姓の界面活性剤化合物を、−ＮＨＮＨ2、−ＣＨＯ(遊離またはジアルキ ルアセタールの形状)、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ2、−ＮＣＯ、ＮＣＳ、−ＣＯ−ＮＨ− ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣl、−Ｏ−Ｃ ＯＣl等から選ばれる反応性基Ｒを付与するのに好適な反応物と反応させること により、該界面活性剤化合物を官能化することから成る。 さらに本発明の他の目的は、必然的に基Ｒを伴う反応を介して、リンカーＬ( またはＬ')を標的ベクター(II)と共有結合させて、生体の特異的部位への輸送を もたらすよう適当に設計された中間体(Ｌ−II)を製造する方法にある。 次に実施例を挙げて、本発明を説明する。 実施例１ 式:Ｈ−(Ｏ(ＣＨ2)2)a−(ＯＣＨ(ＣＨ3)ＣＨ2)b−(Ｏ(ＣＨ2)2)a−ＯＨ(式中 、a＝１４７およびb＝４８)のプルロニックＦ−１０８(１０ｇ、１．４３mＥqＯ Ｈ)を撹拌下、４０mlの乾燥酢酸エチル(ＡcＯＥt)に溶解し、２５５mg(１．４７ mＥq)のカルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ)を加え、室温で撹拌を約１／２時間 続ける。溶液を脱泡し、３９６mg(３mＥq)のt−ブチルカルバゼート(carbazate) (t−Ｂu−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2)を加える。２４時間の静止後、４０mlのエー テルを加え、溶液を４℃で一夜結晶化せしめる。固体を濾取し、ＡcＯＥt(また はＣＨ2Ｃl2)およびエーテルより再結晶する。Ｆ−１０８−ジ[ヒドラジドウレ タン−ＢＯＣ]の収量９７g。 かかる反応の概要は、以下の通りである。 実施例２ 式:Ｈ−(Ｏ(ＣＨ2)2)a−(ＯＣＨ(ＣＨ3)ＣＨ2)b−(Ｏ(ＣＨ2)2)a−ＯＨ(式中 、a＝１４７およびb＝４８)のプルロニックＦ−１０８(２０g、２．８６mＥqＯ Ｈ)を撹拌下、８０mlの乾燥酢酸エチル(ＡcＯＥt)に溶解し、０．７２ml(３ミリ モル)のトリ−n−ブチルアミンＮ(n−Ｂu)3および０．７g(７ミリモル)の無水コ ハク酸を加える。混合物を７０℃で１８時間加熱し、室温まで冷却し、濾過する 。４０℃に加熱後、４０mlのエーテルおよび５ミリモルの酢酸(ＡｃＯＨ)を加え 、混合物を４℃で一夜結晶化せしめる。固体を集め、２００mlのエーテルに懸濁 し、排液し、乾燥する。純度約９０％(０．０２Ｎ−ＮaＯＨ溶液による遊離カル ボキシル基の滴定で確認)のＦ−１０８ジ酸コハク酸エステル１９．７４gを集め た。かかる反応は、以下の通りである。 実施例３ ２０mlのＣＣl4に、実施例２で製造したＦ−１０８ジ酸コハク酸エステル５g( ０．６２mＥqＣＯＯＨ)を溶解し、０．３ml(４．２ミリモル、ＣＯＯＨに関して ６．５eq)の塩化チオニルを加える。混合物を２時間還流し、回転エバポレータ( rotavapor)で溶媒を完全除去する。残渣に１０mlの乾燥ＡcＯＥtを加え、次いで ８mlのＡcＯＥt中の１．３２g(１０ミリモル)のt−Ｂu−カルバゼートおよび２ ．３９ml(１０ミリモル)のＮ(n−Ｂu)3の溶液を加える。黄色溶液を５０℃で１ 時間加熱し、次いで４０mlのエーテルで希釈し、室温で一夜結晶化せしめる。 固体(４．９７g)を１０mlの乾燥塩化メチレンに溶解し、５mlのテトラフルオ ロ酢酸(ＴＦＡ)を加える。室温で１．５時間後、回転エバポレータで溶媒を除去 し、２０mlのＡcＯＥtを加え、溶液を４０℃に加熱し、この時点で４０mlのエー テルを加え、溶液をr．t．(室温)に戻すことにより、結晶が形成する。これらの 結晶を集め、２０mlのＡcＯＥtに溶解し、０．５mlのＮ(n−Ｂu)3を加え、溶液 を再度４０℃に加熱し、４０mlのエーテルで希釈し、室温まで冷却せしめる。次 いで、さらに３０mlのエーテルを加え、一夜静止後、通常のヒドラジド分析(下 記参照)で確認して、４．３３gのＦ１０８−ジヒドラジドコハク酸エステルを集 めた。かかる反応は、以下の通りである。 実施例４ １０mlのＣＣl4中の１０g(１．３mＥq)のＦ１０８の溶液に、０．８ml(３．６ mＥq)のＮ(n−Ｂu)3を加え、次いで０℃にて、１４．３mＥqのスクシニルジクロ リド(フルカ(Ｆluka)Ａ．Ｇ．より)を加える。黒色混合物を室温にもどした後、 ５０℃に２．５時間加熱し、次いで冷却せしめ、一夜放置する。混合物を回転エ バポレータで約５０mlに濃縮し、２００mlのエーテルを加えて、くもらせる。次 いで、ミルク状液体を６００mlのエーテルに注ぐことにより、緑色がかった固体 が沈澱する。この固体を再溶解し、活性炭で処理し、濾過溶液からエーテルで再 沈澱させて、８．８４gのジクロリドを得る。上記製造において、再蒸留したス クシニルジクロリド(４６〜４７℃／０．７〜０．９トル)を使用すれば、得られ る生成物は、エーテルの添加後ゆっくりと晶出し、活性炭精製は不要であった。 また収量は多くなる。かかる反応は、以下の通りである。 ジクロリドを、実施例３の記載と同様にして、対応するジヒドラジドに変換す る。 ジヒドラジド化合物(実施例１〜４の)を水溶液中、トリニトロベンゼンスルホ ネート(ＴＮＢＳ)および重硫酸カリウムの存在下、分光測定で(５０５nm、コン トロン(Ｋontron)スペクトロメーター)分析する。測定は、t−Ｂu−カルバゼー トの公知希釈溶液から作成した検量線に関して、１０-5〜１０-3Ｍ範囲の溶液で 行った。測定されるサンプル(１ml)は、０．８mlのヒドラジド溶液(対照または 試験)、０．１mlの１Ｍ−ＫＨＳＯ4および１mlのＴＮＢＳ(１g／Ｌ)を含有する 。吸光度測定は、サンプル調製の１時間後に行い、この遅れは再現性を確実にす るのに必要である。ブランク対照の場合、蒸留水を用いた。 これらの結果から、最適純度および収量のヒドラジドを得るのに、実施例１お よび４の技法が好ましいことが認められる。 実施例５ ５g(０．６２mＥq−ＣＯＯＨ)のＦ１０８−ジ酸コハク酸エステル(実施例２で 得たもの)を、２０mlのＡcＯＥtに溶解し(少し加熱が有用)、そして室温で１g( ６ミリモル)のＣＤＩを加える。溶液を室温で３０分間放置し、次いで５０℃に ３時間加熱する。室温で２時間静置後、５０℃に再加熱し、５０mlのエーテルを 加 えることにより、固体が晶出する(４．９１g)。これを集め、エーテルで洗い、 乾燥する。 固体を２０mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、その１０mlに、１mlのＣＨ2Ｃl2中の４０ ０mg(３ミリモル)のt−Ｂu−カルバゼートを加える。室温で２時間後、０．７２ ml(３ミリモル)のＮ(n−Ｂu)3を加え、混合物を一夜放置する。晶出した生成物 を集め、ＡcＯＥt／エーテルで再結晶する。収量２．３１g。この生成物を実施 例３と同様に、４mlのＴＦＡ／４mlのＣＨ2Ｃl2と反応させて脱保護し、溶媒の 除去後得られる固体を、ＡcＯＥt／エーテルより結晶化する。Ｆ１０８−ジスク シニルーヒドラジドの収量２．１２g。 上記と同様にヒドラジド分析を行ったところ、ほぼ理論量の２．９６mＥq／g を得た。 上記製造したジイミダゾリル−カルボニル誘導体の他の１０ml溶液を、２５３ ml(３ミリモル)の１,３−ジアミノプロパンおよび０．７２ml(３ミリモル)のト リブチルアミン含有のＣＨ2Ｃl2溶液で処理する。室温で一夜後、溶液を濾過し 、５０mlのエーテルで希釈して、固体を得る。固体を集め、ＡcＯＥt／エーテル およびＣＣl4／エーテルより連続して再結晶する。Ｆ１０８のジ[アミノプロピ ルアミドスクシニル]−誘導体の収量２．２６g。かかる反応は、以下の通りであ る。 実施例６ ５gのＦ１０８(０．７mＥq)を１０mlの塩化メチレンに溶解し、０．５１ml(２ ．１５mＥq)のＮ(n−Ｂu)3を加える。溶液を０℃に冷却し、そして０．２３ml( ２mＥq)の塩化トレシルを加える。ゆっくりと室温まで戻した後(５時間)、１０m lのＡcＯＥtを加え、溶液を約５０℃に加熱し、５０mlのエーテルを加え、全体 を結晶化のため放置する。２日後、固体を遠心分離し(８０００g)、エーテルで 洗い、乾燥し、２０mlの塩化メチレンに溶解する。 この溶液の１０ml分を、１mlのＣＨ2Ｃl2中の４００mg(３ミリモル)のt−Ｂu −カルバゼートで処理する。室温で２時間後、０．７２ml(３ミリモル)のトリブ チルアミンを加え、混合物を室温で一夜放置する。次いで、５０mlのエーテルを 加えることにより、４℃で数時間後に、Ｆ１０８−ジ(ヒドラジノ−ＢＯＣ)の沈 澱物が形成する。収量２．１１g。 上記固体を４mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、前記実施例の記載と同様に、４mlのＴ ＦＡで脱保護する。室温で１時間後、回転エバポレータで溶媒を除去し、残渣を ８mlのＡcＯＥt中０．２４mlのトリブチルアミンで処理し、エーテルの添加で、 所望のジヒドラジノ−Ｆ１０８(２g)の沈澱を起す。 かかる反応は、以下の通りである。 上記反応工程に従って、塩化メチレン中のジトレシレート溶液の他の１０ml分 から、室温で３ミリモルの１,３−ジアミノプロパンおよび３ミリモルのトリ−n −ブチルアミンによる処理、エーテルによる沈澱およびＣＣl4／エーテルからの 結晶化によって、対応するジ(アミノプロピルアミノ)化合物を得る。 実施例７ ８０mlのＣＣl4中の２１g(３mＥq)のＦ１０８の濾過溶液において、室温で１m l(４．２mＥq)のトリブチルアミンを加える。冷却後、２．２ml(３０ミリモル) の塩化チオニルを加え、混合物を４時間還流することにより、赤色に変化する。 これを濾過し、溶媒よりストリッピングし、残渣を約６０℃で８０mlのＣＣl4に 再溶解し、２００mlのエーテルを加えて、２０．３gの固体を沈澱せしめる。固 体を、活性炭で漂白したＡcＯＥt(８０ml)に溶解し、濾過し、２００mlのエーテ ルの添加後、結晶化せしめる。所望のＦ１０８ジクロリドを１９．０６g集めた 。反応の概要は、以下の通りである。 実施例８ Ｆ１０８(２１g、３mＥq)を２００mlのトルエンに溶解し、溶媒をゆっくり留 去し、水分を除去する。約１２０mlの溶媒の除去後、溶液を冷却し、０．５g(４ ミリモル)のカリウム・t−ブトキシドを加える。２時間の還流後、オレンジ色溶 液を冷却し、０．７ml(６ミリモル)のエチルブロモアセテートを加える。一夜静 止後、溶液を２時間還流し、冷却し、セライト(celite)上で濾過する。２００ml のエーテルを加えて２０．７１gの固体を形成せしめ、該固体を集め、EtＯＨ(１ ００ml)／エーテル(４℃)、およびＡcＯＥt(８０ml)／エーテル(２００ml)より 連続して結晶化する。収量１９．２５g。反応は、以下の通りである。 F108(O-)2+2BrAcOEt-EtOOC-CH2-O-F108-O-CH2-COOEt 実施例９ 実施例８の５gのジエステル(０．７mＥq)を、約５０℃にて２５mlのＥtＯＨに 溶解し、約１ml(２１ミリモル)のヒドラジン水和物を加えた後、混合物を３時間 還流する。室温、次いで４℃に冷却後、ジヒドラジドの結晶が形成し、これを集 め、アルコールおよびエーテルで洗う。収量４．８５g。反応は、以下の通りで ある。 F108(OCH2-COOEt)2＋N2H4.H2O-F108(OCH2-CO-NH-NH2)2 実施例１０ 実施例８の１０gのエチルＦ１０８−ジアセテートを、５０mlのＥtＯＨおよび ７０mlのＨ2Ｏの溶液に溶解し、３mlの３２％ＮaＯＨを加える。５０℃で２時間 および室温で一夜後、１５gの塩を加え、濃ＨＣlでpＨ２に調整し、混合物を１ ００mlのＣＨ2Ｃl2で２回抽出する。コンバインした有機画分を飽和塩水で洗い 、無水Ｎa−Ｍgスルフェート上で乾燥する。蒸発後、残渣を５０mlのアルコール に再溶解し、４℃で結晶化せしめる。 ジカルボン酸を過剰の０．２Ｎ−ＮaＯＨで滴定し(９mlのＨ2Ｏ中０．５２g) 、０．２Ｎ−ＨＣlで逆滴定する。この結果、置換率７４％が認められる。 実施例１１ 実施例７の２g(０．２８mＥq)のＦ１０８ジクロリドを、８mlの乾燥ＤＭＦに 溶解し、０．５４g(２．９ミリモル)のカリウム・フタルイミドを加える。混合 物を９０℃で一夜撹拌後、冷却し、セライト上で濾過する。溶液を５０℃に加熱 し、３０mlのエーテルを加え、冷却すると固体が形成する。ＥtＯＨ(２０ml)／ エーテル(５０ml)より結晶化後の収量１．４６g。なお、カリウム・フタルイミ ドをホルムアミド溶液の形状で加えると、より良好な収量および純度の生成物が 得られる。反応は、以下の通りである。 実施例１２ 前記実施例の化合物(１．４６ｇ、０．２mＥq)を９mlのＥtＯＨに溶解し、０ ．１ml(２ミリモル)のヒドラジン水和物を加える。室温で一夜後、溶液を１０ml のＥtＯＨで希釈し、３時間還流する。次いで溶媒を減圧下で除去し、残渣を８m lのＥtＯＨに溶解し、４０mlのエーテルを加えて、固体を沈澱させる。固体を集 め、エーテルで洗い、８mlのエタノールに溶解し、０．１１ml(２ミリモル)のＡ cＯＨを加える。混合物を５０℃に加熱し、これに５０mlのエーテルを加え、放 置して結晶化する。ジアミノ−Ｆ１０８の白色結晶(１．２４g)を集め、分析す る。−ＮＨ2基の滴定により、置換率が実質上１００％であることが認められる 。反応は、以下の通りである。 実施例１３ Ｆ１０８(２１g、３mＥqＯＨ)を、トルエン中の共沸蒸留で乾燥した後、実施 例８の記載と同様に、対応するジカリウム・アルコキシドの溶液(１２０ml)に変 換する。この溶液６０mlを撹拌下、１．８２ml(１５ミリモル)のブロモアセトア ルデヒド・ジメチルアセタールと反応させる。黄色溶液を一夜還流することによ り、濁ったオレンジ色となる。これをセライト上で濾過し、回転エバポレータで 濃縮し、１２０mlのエーテルで希釈し、これによって静置で結晶化する。固体を 集め、５０mlのＥtＯＨに溶解し、エタノール溶液を活性炭で処理し、濾過し、 ４０mlのエーテルで希釈する。４℃に冷却後、Ｆ１０８ジアセトアルデヒド・ジ メチルアセタールの結晶(９．０５g)が形成し、これを集め、乾燥し、分析する 。反応は、以下の通りである。 実施例１４ Ｆ１０８(７．５g、１．０７mＥqＯＨ)を、５０℃にて３０mlのＣＣl4に溶解 する。溶液を濾過し、室温で０．２７ml(１．１mＥq)のトリ−n−ブチルアミン を加えた後、１．０７g(３．６ミリモル)のビス(トリクロロメチル)カーボネー ト(トリホスゲン)(これは１０．８ミリモルのＣＯＣl2に相当)を加える。室温で １．５時間後、溶液を５０℃で２０時間加熱し、次いで減圧下で蒸発して、ＨＣ lおよびホスゲン過剰分を完全に除去する。 残渣を３０mlのＣＣl4に溶解し、８０mlのエーテルで希釈する。形成した固体 を４℃で集め、エーテルで洗い、３０mlのＣＣl4に再溶解する。 ２mlのＣＣl4中に１．９g(１４．３ミリモル)のt−ブチルカルバゼートおよび ０．２ml(０．８mＥq)のトリブチルアミンを含有する溶液を作る。これに上記Ｆ １０８ジクロロホルメート溶液２０ml(０．７１５mＥq)を加える。５０℃で１８ 時間後、溶液を濾過し、５０mlのエーテルの添加で沈澱せしめ、４℃に冷却する 。固体をＡcＯＥt／エーテル(２０ml／５０ml)中で結晶化して４．２１gを得る 。 ジ(ヒドラジド−ＣＯＯ−ｔ−Ｂu)化合物を８mlのＣＨ2Ｃl2中、実施例４記載 と同様な脱保護のため８mlのＴＦＡで処理する。室温で３時間後、混合物を減圧 下で蒸発し、残渣を１５mlのＣＨ2Ｃl2に再溶解し、９０mlのエーテルを加えて 、固体を沈澱せしめる。この固体を２０mlのＥtＯＨ＋０．５mlのトリブチルア ミンより結晶化し、溶液を４℃で一夜放置する。Ｆ１０８−ジカルバゼート(ウ レタンヒドラジド)の収量４．０４g。反応は以下の通りである。 実施例１５ ２mlのＣＣl4中の０．１ml(０．４ミリモル)のトリブチルアミンおよび０．５ ml(７．２ミリモル)のエチレンジアミンの溶液に、実施例１３の１０ml(０．３ ６mＥq)のＦ１０８−ジクロロホルメート溶液を加える。溶液を５０℃で１８時 間加熱し、１０mlのメタノールで希釈し、濾過し、５０mlのエーテルで固体を沈 澱させる。固体を集め、ＡcＯＥt(１０ml)／エーテル(３０ml)中で再結晶する。 Ｈ2Ｎ−(ＣＨ2)2−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｆ１０８−ＯＯＣ−ＮＨ−(ＣＨ2)2−ＮＨ2の 収量２．２５g。通常の手段で−ＮＨ2基の滴定を行ったところ、置換率約６０％ が認められる。 実施例１６ １００mlのエーテルに、１３．２２g(０．１モル)のt−ブチル・カルバゼート および１５．４ml(０．１１モル)のトリエチルアミンを溶解する。冷却下(０〜 ５℃)、８．９ml(０．１モル)のブロモアセチルブロミドをゆっくりと(約０．５ 時間で)加える。添加終了時に、温度を周囲温度に戻し、沈澱したトリエチルア ンモニウムブロミドを濾去する(１９．８６g≒理論量)。赤色濾液をシリカ(２４ cmカラム、２００ml)にて、溶離剤としてエーテル(１００＋２５０ml)を用いる クロマトグラフィーに付す。黄色溶出液を約８０mlに濃縮し、濁りが生じてくる までヘキサンを加える。その後、振とうすると結晶がすぐに形成する。結晶を４ ℃で集める。収量２１．４６g(８５％)。 得られる生成物(t−ブチル・Ｎ−ブロモアセチルカルバゼート)を実施例８お よび１３と同様に、カリウム塩と反応させた後、t−Ｂu基をＴＦＡで除去する。 このようにして、実施例９で得た生成物に対応するヒドラジドが得られる。反応 は、以下の通りである。 Br-CH2-COBr+H2NNH-COO-t.Bu-BrCH2-CONHNH-COOt.Bu 実施例１〜１６に従って製造したリンカーは、薬物または信号発生剤成分(Ｉ) と生物活性標的分子(II)を会合して、(II)に対してレセプタ親和性を有する生体 の部位への(Ｉ)の輸送のため有効なベクターを付与するのに首尾よく用いた。 前記実施例において、プルロニックＦ１０８両親媒性化合物を、ＯＨまたはＮ Ｈ2末端の親水性ポリアルキレンオキシセグメントを有する他のコポリマーで交 換しても、同様な結果が得られ、生成する対応リンカー生成物は上記と同様に 成分(Ｉ)と(II)のブリッジ連結に使用しうる。かかるコポリマーの中で、本発明 の明細事項に属する各種の構造のプルロニックおよびシンペロニックを引用する ことができ、これらの構造は、長さが異なる種々の親水性および疎水性配列を含 む。他のポロキサマーおよびポロキサミン並びにソルラン(Solulan、登録商標) 、ブリジ(Brij、登録商標)、ミルジ(Ｍirj、登録商標)、ツイーン(Ｔween、登録 商標)、スパン(Ｓpan、登録商標)等の一般登録名下で知られているブランドに属 する他の手ごろな両親媒性基(amphiphile)も、特別な条件下で可能である。 実施例１７ (a)(ＩfＬ)リンカー−マグネタイト粒子の製造 ４０mlの水に、８１．１mg(０．３ミリモル)のＦeＣl3・６Ｈ2Ｏおよび５６． ９mg(０．３ミリモル)のＦeＣl2・４Ｈ2Ｏ(トータルＦe＝０．６ミリモルまたは ３３．５mg)を溶解する。これに、０．１mＣiの59Ｆe(トレーサ量)をＦeＣl3形 状で加える。 混合物を撹拌し、pＨが安定値８．６に到達するまで、７．５％アンモニア水 溶液を滴下する。形成した黒色粒子の懸濁液を７５℃で５分間加熱し、室温で粒 子を沈降せしめる。沈澱物を１００mlの水を分けたデカントで３回洗った後、再 び撹拌下で６０mlの水に懸濁する。この懸濁液の鉄濃度は０．５mg／mlであった 。 この懸濁液１０ml(５mgのＦe)に、成分(a)として１００mgのジパルミトイルホ スファチジン酸のナトリウム塩(ＤＰＰＡ・Ｎa)を加え、音波破砕を２０分間行 う(ＢＲＡＮＳＯＮ ２５０音波発生器、１／８”ミクロプローブ、出力２０(１ ５−２０)Ｗ)。温度は音波破砕中に約６８℃まで上昇したが、これを室温まで下 げ、成分(b)として実施例１２で製造した１００mgのプルロニック(ＮＨ2)2(また は同一に変性した両親媒性基、たとえばＩＣＩのシンペロニック、またはポロキ サマー３３８)を加える。次いで、上述の条件下で音波破砕を１５分間再開する 。 従って、得られる被覆粒子(サンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2)の懸濁液は、１ml当り 、０．５mgの鉄、１０mgのＤＰＰＡおよび１０mgの変性プルロニック(ＮＨ2)2界 面活性剤を含有する((a)と(b)の重量比＝１:１)。粒子計数装置(ＵＳＡカリフォ ルニア州のサンタ・バーバラ、Ｎicomp３７０ＨＤＬ−ＮＰＳＳオブ・パーティ ク ル・サイジング・システムズ)による測定で、生産量に基づき、平均粒度は５０ 〜１００nm(±２０〜４０％)の範囲にあることがわかった。 前記実施例に記載の他の変性両親媒性基を用いて、他のサンプル(下記参照)を 同様に製造した。 (b)共役結合体(ＩfＬ−II)の製造 １０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2(上記(a)参照)を、２７０００g下で１時間 遠心分離する。下層残渣を２．５mlの１００mＭボレート緩衝剤(pＨ８．２)[ま たはホスフェートの無い等張溶液]で採取して、２mg鉄／ml含有の懸濁液を得る 。 １mlの懸濁液に、スイスのＦluka Ａ．Ｇから入手の５μモルのビオチン−Ｎ ＨＳ(ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド)連結を、正味のままあるいはＤＭ ＳＯ濃厚溶液で加える。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで蒸留水に４回連続 して透析して、所望のマグネタイト−ビオチン共役結合体標識ＳＢＰＡ−ＮＨ− Ｂioの精製サンプルを得る。 ＳＢＰＡ−ＮＨ2と他の標的因子(II)、すなわちラクトースイソチオシアネー トおよびホレート(folate)−ＮＨＳ(「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」,２６９(１９９４年) ,３１９８〜３２０４頁の記載に従って製造)とに対し同様な反応を行って、それ ぞれＳＢＰＡ−ＮＨ−ＬacおよびＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｆolを得る。下記の反応式に 従って、“ＲＧＤ”ペプチド(Ｈ−Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer−Ｃys−ＯＨ) と連結してＳＢＰＡ−ＮＨ−ＲＧＤを得るため、該連結を別途sＳＭＢＰ[Ｎ−ヒ ドロキシスルホスクシンイミジル−(４−マレインイミドフェニル)−ブチレート ]の助けをかりて行なう。 反応操作は以下の通りである。すなわち、ＳＢＰＡ−ＮＨ2サンプル[ビオチン との連結に関して、上記(b)と同様にして得る]を、１００mＭヘペス(Hepes)緩衝 剤(pＨ７)に懸濁して、２mgＦe／ml濃度とする。１mlの鉄懸濁液に、５μモルの sＳＭＢＰを加え、混合物を室温で２時間培養する。生成物懸濁液を過剰の試薬 から、ゲル濾過クロマトグラフィー(Ｇ２５カラム)で精製する。精製したＳＢＰ Ａ−マレインイミドのＨepes懸濁液をＥＤＴＡ(１０mＭ)の存在下、１mgＦe当り ２．５μモル量のチオール−変性ペプチドと一夜反応させ、次いで過剰の試薬を 、Ｈepesに対する広範透析で除去する。 また、未変性Ｆ１０８を有するマグネタイト粒子を上記ホーミング因子と“偽 連結”(上記の条件下で)を行って、対照も作成する。 上述の標的(および対照)試料(preparation)を０．２μm膜で濾過し、インビト ロ(アビジンおよびＴＨＰＩレセプタ)および実験室ラットのインビボの両方で試 験する。 インビトロ試験の場合、先ず、対照サンプルＳＢＰＡ−ctrl(上記参照)を、試 料ＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｂioの作成に用いたのと同じ条件下、ビオチンで活性化する ことにより、対照試料を調製する。次いで、両試料をそれぞれ、６０,３０,１５ ,７．５および３．７５mg／鉄１mlに相当する一連の濃度に希釈する。次に各種 の希釈液を、予めアビジンと共に培養したミクロ滴定プレートに接種することに より試験する。４時間後、プレートの非吸着物質を洗い流し、通常の分析(チオ グリコール酸塩)で鉄の結合を確認する。結果を以下のグラフで示し、ここで、 吸着鉄(“Ｙ”軸)を上記希釈液中の鉄(“Ｘ”軸)に対してプロットする。ＳＢＰ Ａ−ＮＨ−Ｂioの挙動を示すカーブに◆の印を付し、対照カーブに□の印を付し た。 このグラフから明らかに、標的磁性粒子はアビジンに対する親和性が非標的磁性 粒子と比べてはるかに大きいことが証明される。 さらに、ＳＢＰＡ−ＲＧＤ(対照:ＳＢＰＡ−cys)の59Ｆe−標識試料の結合に 関するインビトロ試験を、対応するレセプタを表わす細胞株を用いて行なう。こ の場合、試験すべき各種濃度の試料を含有するＵ９３７菌株サンプルを、５０n Ｍ−ＰＭＡ(ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート)で活性化した 標準培地中で４８時間培養し、次いで３７℃で１時間培養する。細胞を冷ＰＢＳ 中で洗い、分離し、放射線計量する。この測定から、対照に比す鉄−標識細胞の 量を確認することができる。 結果を下記表１に示す。表１の結果から、ＳＢＰＡ−標的粒子によって放出さ れる鉄量は対照のそれよりかなり多いことが認められる。 同様な方法で、55Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレートシステム(上記参照)の結合につい て、ホレートレセプタを表わすヒトＫＢ細胞株に対する親和性を試験する。ＫＢ 細胞をＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ,９２(１９９５年),３３１８〜３３２２頁の記載と同様に 培養し、次いで各種濃度の55Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレートと共に３７℃で２時間培 養する。対照として、ホレートと“偽連結”する55Ｆe−ＳＢＰＡ、Ｆ１０８(Ｏ Ｈ)を含有する試料を用いた。 結果を下記表２に示すが、これには、培地(別途ウシ胎児血清[ＦＣＳ]の存在 および非存在)に保持される鉄濃度(平均値およびかっこ内は標準偏差)が記載さ れている。 インビボ試験の場合、各試料(２０倍に希釈)を実験ラットの尾の静脈に注射し (開始時間to)、次いで時間の各種経過後(t10分〜t120分)、血液サンプルを採取 し、鉄濃度を分析する。結果を下記表３に示す(注射用量の％で表示)。なお、Ａ ＝ＳＢＰＡ−Ｃtrl、Ｂ＝ＳＢＰＡ−ＮＨ−、“＋”は“Ａ”と標的化合物に連 結のないことを示す。 表３の結果から、１つのケース(Ｂ−Ｆol)を除き、共役結合体はかなりの長時 間にわたり、実際に未連結混合物よりも長く、循環中に残存したことが認められ 、またこのことは、共役結合体が肝臓によって急速に除去されず、かつ選定部位 へ有効に運ばれうることを示す。なお、Ｂ−Ｆolケースについては説明できない が、その結末はある未確認のアーチファクトによるものと思われる。 実施例１８ のＤＴＰＡモノ−およびジ−ステアリルエステル並びに対応するガドリニウム・ キレート(Ｇd−ＤＴＰＡＳＥ)および(Ｇd−ＤＴＰＡ(ＳＥ)2)を、Ｇ．Ｗ．カバ ルカ(Kabalka)らの「Magnetic Ｒesonance in Ｍedicine」(８(１９８８年)、 ８９〜９５頁)の記載に準じて製造する。合成に必要なＤＴＰＡ無水物は、エッ ケルマン(Ｅckelman)らの「Ｊ．Ｐharm．Ｓci．」(６４(１９７５年)、７０４〜７ ０６頁)に従って作る。通常の手段[２Ｎ塩酸中で分解(decomplexing)し、ＥＤＴ Ａ溶液で滴定;指示薬キシレノールーオレンジ]でガドリニウム分を測定して、画 像化剤の純度をチェックする。この分析により、実質的に理論値に近い結果が得 られる。 １００mgのＧd−ＤＴＰＡ−ＳＥ(０．１２７ミリモル)および２００mgのジパ ルミトイルホスファチジン酸(ＤＰＰＡ−Ｎa)を、ＭeＯＨ／ＣＨＣl3(１／１)混 合物２５mlに溶解する。溶液を減圧下で蒸発乾固した後(回転エバポレータ、７ ２℃／１５トル、１．５時間)、撹拌下で２０mlの蒸留水を加える。さらに混合 物を、７０℃、約３０分間の音波破砕(ブランソン・ソニファイア(Branso Sonif ier)音波発生器、出力４０)により均質化する。この懸濁液に、実施例１２に開 示の２００mgの変性シンペロニックＦ１０８(ＮＨ2)2を加え、音波破砕を数分間 再開することにより、次微子(標識“Ｍ１”)の安定で視覚上透明な懸濁液をミセ ル形状で得る。かかる調製を繰返すが、この場合、Ｇd−ＤＴＰＡ−ＳＥの代わ りにＧd−ＤＴＰＡ−(ＳＥ)2(０．０９５ミリモル)を用いて、“Ｍ２”標識懸濁 液を得る。 上記懸濁液のプロトン・スピン緩和度を、ミニスペック(Ｍinispec)ＰＣ−１ ２０(ブルカー)装置を用い、０．４７テスラ(２０ＭＨｚ)で運転して測定する。 ＥＤＭ５１０Ａ(ＥＤＭ＝エクスペリメント・デフィニション・モジュール(Ｅxp eriment Ｄefinition Ｍodule))を用いて、“反転回収(inversion recovery) ”法でスピン−格子緩和時間Ｔ1を測定する。ＥＤＭ６１０Ａを用い、 カール(Ｃarr)−パーセル(Ｐurcell)−メイブーム(Ｍeiboom)−ジル(Ｇill)(Ｇ ＰＭＧ)技法で、スピン−スピン緩和時間Ｔ2を測定する。１mＭ濃度の場合のγ, 単位[mＭs]-1＝１／Ｔで表わされる緩和度(γ１およびγ２)を下記表４に示す。 上記試料を、実施例１７に記載の選定ホーミング因子(II)と連結させると、対 応する投与しうるシステムＧd−ＤＴＰＡ−ＳＥfＦ１０８−ＮＨ−(II)、および Ｇd−ＤＴＰＡ−(ＳＥ)2fＦ１０８ＮＨ−(II)が得られる。実施例１７と同様に 、ラットを用いてインビボ試験を行ったところ、血液循環に関してほぼ同等な結 果が得られた。 実施例１９ 末端ＮＨ2基変性のシンペロニックＦ１０８で被覆したマグネタイト微粒子を 、実施例１７(b)に記載の“ＲＧＤ”ペプチドと連結させて、試験サンプル標識 ＳＢＰＡ−ＲＧＤを得る。末端連結反応において、ペプチドの代わりにメルカプ トエタノールを用いる以外は、同様にして対照(ＳＢＰＡ−ＭＥ)を作成する、６ ６および３３μgの鉄／mlを含有する、それぞれ試験および対照の希釈液を調製 する。これらは標識ＳＢＰＡ−ＲＧＤ(６６μgＦe／ml)およびＳＢＰＡ−ＲＧＤ (３３μgＦe／ml),それぞれＳＢＰＡ−ＭＥ(６６μgＦe／ml)およびＳＢＰＡ− ＭＥ(３３μgＦe／ml)である。 ＲＧＤ標的システムの添加でひき起る好中球レスピラトリーバースト活性を、 以下の手順で試験する。 すなわち、十分生育可能な顆粒球培養物を、カスヤらの「Ｊ．Ｂiomedical Ｍ aterials Ｒesearch」(２８(１９９４年)、３９７〜４０４頁)の開示に準じて調 製する。 次いで、以下に示す試薬を、適当なミクロプレート(microplate)溜めに投入す る:(a)ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(ＮＢＴ)の１５０μl溶液(ハンクスＢＳ Ｓ中、２mg／ml)、(b)上記の値まで希釈した１００μlの試験または対照サンプ ル、(c)ＨＢＳＳ中、５×１０6細胞／mlを含有する５０μlの精製顆粒球試料。 次いで、各種の時間長さで、３７℃の培養を行なう。 培養中に発生するＯ2による染料(黄色〜青色)の還元に基づく５４０nmでの吸 収度の漸進的増加によって、生きている細胞の応答をチェックする。色対照とし て、１０μＭヨードアセトアミド中に同じ混合物を含有する別のプレートを用い る。その吸収度を、試験または対照の各時間測定から減算する。 上記実験の結果を図４のグラフに示すが、ここで、本発明に係るシステムのか なりの活性が認められる。 実施例２０ ＳＢＰＡ−マレインイミドフェニル−ブチラミドの製造 １０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2(実施例１７参照)を、２７０００g下で１時 間遠心分離する。下層残渣を１００mＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝剤(pＨ７．０)で採取し 、２mgＦe／mlに希釈する。これに２．５μモルのスルホスクシンイミジル−４( p−マレインイミドフェニル]−ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)を加え、混合物を 室温で２時間培養する。ＥＤＴＡ(１０mＭ)を加え、遠心分離して(２分、１００ g)、過剰試薬を除去する。残渣をＨＥＰＥＳ(２．５mgＦe／ml)に再懸濁する。 実施例２１ ヘキサペプチドf−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−ＬysのＳ−アセチルチオ アセテートの製造 ６μモルのヘキサペプチド(ＥＰ−Ａ−０３９８１４３の記載に準じ製造)のＤ ＭＳＯに溶解して、濃度１０mg／mlとし、１当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミ ジル−Ｓ−チオアセテート(ＳＡＴＡ)を１４mg／mlＤＭＳＯ溶液の形状で添加し た後、Ｎ−メチルモルホリンを加えて、見掛pＨを８にする(湿ったpＨ試験片)。 １時間後、混合物をＨ2Ｏで２０倍に希釈し、水中で平衡なＨＰＬＣクロマトグ ラフィー・カートリッジに装填する(Ｃ１８ボンド・エルト(Ｂond Ｅlut)カー トリッジ、溶離剤８０％水性アセトニトリル)。チオアセチル化ペプチドが１８ ． ７７分画分に生成し、これを乾燥して固体とし、該固体を少量ＤＭＳＯに再溶解 する。 実施例２２ ＳＢＰＡマグネタイト粒子に連結したヘキサペプチドの製造 実施例２１の記載に従って製造したＳＢＰＡ−マレインイミド変性酸化鉄粒子 のＨＥＰＥＳ溶液(２．５mgＦｅ)に、ヘキサペプチドＳ−アセチルチオアセテー ト(２mg)のＤＭＳＯ溶液を加える。使用するＨＥＰＥＳ緩衝剤もＥＤＴＡ(２． ５mＭ)およびヒドロキシルアミン(５０mＭ)を含有し、ヒドロキシルアミンは脱 アセチル化剤として作用する。混合物を室温で２時間保持し、次いで遠心分離で 酸化鉄粒子を単離し、緩衝剤に再懸濁し、精製のため広範に透析する。 実施例２３ マグネタイト−化学誘引物質(Ｃhemoattractant)ペプチド共役結合体の顆粒球 との親和性試験 細菌感染による組織損傷および炎症は、感染部位に生じる化学走性ペプチドに 応答する顆粒球(ＰＭＮ)および単核食細胞形成を誘発する。実施例１９で認めら れるように、顆粒球はＯ2基を生成し、該Ｏ2基は、５４０nmで吸収する染料ニト ロ・ブルー・テトラゾリウム(ＮＢＴ)の還元によって分析することができる。 新しいバフィコートから好中球を単離し、「Ｍagn．Ｒes．Ｉmaging」(１３(１ ９９５年)、３９３〜４００頁)の記載に従って培養する。ＮＢＴ還元の速度を、 ミクロプレートで培養した細胞において直接測定する。分析培地は、１５０μｌ のＮＢＴ溶液(２mg／ml)、１００μｌの共役結合体溶液(これは各種濃度のサン プルを含む)からなり、これに５０μｌのＰＭＮ(２．５×１０5細胞)を加える。 光度計参照溜めの培地へ、ヨードアセトアミド(酸化バーストの抑制剤)を加える (最終濃度１０mＭに)。細胞は予め、１０mＭヨードアセトアミド中３７℃にて１ ０分間培養しておく。分析の完全詳細は、「Ｍethods in Ｅnzymology」(１３２ 、１４７頁、アカデミック・プレス、１９８７年)に開示されている。 図５のグラフ(a)において、ＳＢＰＡ−化学誘引物質合成ペプチドの各種希釈 度(鉄濃度で同定)のそれぞれに応答する顆粒球によるＯ2生成の速度が示されて いる。ＳＢＰＡ−ヘキサペプチドによる用量依存法で刺激されるＰＭＮの容量に ついて、化学誘引物質に連結するマグネタイト粒子の存在で示す。対照(ｂ)にお いて、ペプチドに連結しない、マグネタイト粒子単独の効果は、実質的に役に立 たない。 さらに上述の結果を、放射能測定値(59Ｆe−標識共役結合体)およびＴ2プロト ン緩和パラメータ(ＮＭＲ)で確認した。これらの実験の場合、新たに精製したヒ トＰＭＮを、各種のＳＢＰＡ−ペプチド共役結合体と共に３７℃で１時間培養し 、次いで冷ＰＢＳ中で洗う。Ｔ2測定値により、共役結合体からの鉄の取込み／ 会合は、未連結マグネタイト粒子の場合より６〜４３倍大きい効果を付与するこ とが認められる。 実験室ラットにおいて、59Ｆe−ＳＢＰＡ−ヘキサペプチドサンプルの静脈注 射後のトレーサ測定により、循環を経て損傷部位への鉄の優先的な輸送が認めら れる。 実施例２４ マグネタイト粒子と非特異的Ｆ(ab)2フラグメントの共役結合 １０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2(実施例１７参照)を、２７０００g下で１時 間遠心分離する。下層残渣を１００mＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝剤(pＨ７．０)に採取し 、２mgＦe／mlに希釈する。これに、２．５μモルのスルホスクシンイミジル− ４[p−マレインイミドフェニル]−ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)を加え、混合 物を室温で２時間培養する。ＥＤＴＡ(１０mＭ)を加え、遠心分離して(２分、１ ００g)、過剰試薬を除去する。残渣をＨＥＰＥＳ(２．５mgＦe／ml)に再懸濁す る。 抗体(Ａb＝非特異的ＩgＧ)のサンプルを、ペプシン(０．２Ｍ−ＮaＯＡc中、p Ｈ４．２)と共に３７℃で２０時間消化し、フラグメントを親和性クロマトグラ フィーおよびゲル濾過で精製する。 遊離−ＳＨ基を暴露するため、Ｆ(ab)2フラグメントを、０．２Ｍ−ＮaＯＡc 中１．５mg／mlの２−メルカプトエチルアミン(ＭＥＡ)溶液(pＨ５)と共に、３ ７℃で１時間培養して、約１０mＭ最終ペプチド濃度の溶液を得る。次いで、変 性したＦabフラグメントを単離し、０．１５Ｍ−ＮＨ4ＯＡc(pＨ６．８)中ゲル 濾過で精製する。 ２mlの上記ＳＢＰＡ−ＮＨ−sＳＭＰＢ溶液(２mgＦe／mlに希釈)に、ＥＤＴＡ (１０mＭ)の存在下一定量(１mg)の還元したＡbフラグメントを加える。溶液を窒 素下室温で一夜放置し、次いでＰＢＳ中平衡のセファロース(sepharose)４Ｂに てクロマトグラフィーに付すことにより、未共役結合のＦabを除去する。残った 所望化合物の同定は、通常の手段を用いる分析法(鉄およびペプチド測定)で行な った。 実施例２５ 選定抗体(Ａb)の溶液(ＰＢＳ中２．５mg／ml、pＨ６)に、２２mＭ−ＮaＩＯ4 溶液を得るため、０℃にて一定量の０．５Ｍ過ヨウ素酸塩溶液を加える。混合物 を暗所で氷上にて７５分間放置、培養し、次いで１,３−ジアミノ−２−プロパ ノールを加え(３０mＭ調整)、反応を止める。ＡcＯＨでpＨを４まで下げ、酸化 したグリコプロテイン(反応性−ＣＯ基の発生)を、パーマシア・スパロース(Ｐa rmacia Ｓuperose)１２カラムにてゲル濾過で脱塩する。 上記酸化したＡbの溶液(０．１Ｍ−ＮaＯＡc中、１．５g／ml、pＨ４．６〜５ ．３)２０mlを、４mgＦe／ml(コードＳＢＰＡ−ＣＯＨz)実施例１４および１７ 参照)を含有する１mlのＳＢＰＡ−ＯＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2溶液に加え、混合物を室 温で２０時間培養することにより、ヒドラゾン結合を形成する。 標識磁気粒子の単離前に、pＨ４．６にて０．２Ｍシアノホウ水素化ナトリウ ムを用いてヒドラゾン基の還元を行なう。その後、Ａb−ＳＢＰＡ共役結合体を 、セファロース４Ｂカラムにて、ゲル濾過で分離する。 実施例２６ 実施例１７の操作の変形として、先ず変性両親媒性リンカー(シンペロニック Ｆ１０８−ＮＨ2)および標的ペプチド(ホレート−ＮＨＳ)を含むアダクト(Ｌ−I I)を製造した後、信号発生磁気鉄粒子を共役結合させて、実例システム(ＩfＬ− II)を得る。出発成分として、変性シンペロニックＦ１０８−ＮＨ2(実施例１２ 参照)のＤＭＳＯ濃溶液(１００〜１８０mg／ml)を用いる。 一定量のこの溶液に、１モル当量の変性したホレート−ＮＨＳペプチド(実施 例１７参照)およびpＨを８．２とするのに(湿った試験片)十分なＮ−エチルモル ホリンを加える。室温で２４時間の静置後、未反応の配位子をゲル濾過クロマト グラフィーで除去し、さらに純水に対する透析を繰返して、Ｆ１０８−ペプチド 共役結合体を精製する。ホレート−連結Ｆ１０８の収量は、３６５nmの分光光度 計で測定すると、０．６３モルのホレート／モル(Ｆ１０８)であった。 アダクト試料を用い、ＳＢＰＡ−ＮＨ2アダクト(ＩfＬ)を作成するための、実 施例１７／(a)に開示の技法に係る音波破砕によって、対応するＳＢＰＡ−ホレ ートシステムを製造する。試料を遠心分離し、ペレットを等張緩衝剤に再懸濁す る。対応する59Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレート共役結合体アダクトの場合の、実施例 １７の記載と同様に、該共役結合体システムのＫＢ細胞への結合能力を正確にも たらした。同じ対照と比較した結果を、下記表６に示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．疎水性基を備えた磁気応答配位子成分(Ｉ)と、選ばれた生物特異的な標的 因子成分(II)が、疎水性基および反応的に官能化された親水性配列を有する両親 媒性ブリッジリンカー成分Ｌ(Ｌ')によって共に連結して成り、Ｌと(II)の連結 は共有結合でかつ上記親水性配列の反応性基を含み;およびＬと(Ｉ)のfで示され る連結は非共有結合でかつ該両成分の疎水性基間の親和力を含み;かつ式(ＩfＬ −II)で示されることを特徴とする分子共役結合体システム。 ２．常磁性または超常磁性複合成分(Ｉ)と、選ばれた生物特異的な標的成分(I I)が、変性両親媒性ブリッジリンカーＬによって共に連結して成り、該リンカー は式(ｉ): Ｙ(Ｗ−Ｚ−Ｒ)m (ｉ) (式中、mは１、２または４； ＹＷ部は、成分(Ｉ)と非共有結合する疎水性−親油性配列“Ｙ”と親水性−疎 油性配列“Ｗ”が共に共有結合してなるセグメント； Ｚは化学結合または中間連結配列、好ましくはＣ1〜Ｃ4脂肪族セグメント;お よび Ｒは選ばれた生物活性標的化合物(II)との連結をもたらす結合基である） で示される請求の範囲１に記載の分子共役結合体システム。 ３．リンカーＬ'が、式(ii): Ｌ'＝(ＲＺＷＹ)2Ｎ−Ａ−Ｎ(ＹＷＺＲ)2 (ii) (式中、Ｙ,Ｗ,ＺおよびＲは請求の範囲２のＬの場合と同意義およびＡは疎水 性配列、たとえばＹのような配列または脂肪族鎖、好ましくはＣ2〜Ｃ6アルキレ ンであって、但し、式(ii)中の１〜３つのＲはＨであってもよく、およびリンカ −Ｌ'は有効な多官能価を持ち、すなわち、４つ以下の標的単位との連結をもた らしうる) で示される請求の範囲２に記載の分子共役結合体システム。 ４．mが４のとき、Ｙは式: Ａ(Ｙ')4 (式中、ＡおよびＹ'は必要に応じてヘテロ原子で中断された、疎水性脂肪族ま たはアリール脂肪族配列である) で示される請求の範囲２に記載の分子共役結合体システム。 ５．Ａが式:＝Ｎ(ＣＨ2)pＮ＝(ここで、pは２〜６の整数)の基である請求の範 囲３に記載の分子共役結合体システム。 ６．Ｙがポリアルキレンオキシ鎖(ここで、アルキレンは直鎖または分枝鎖Ｃ3 〜Ｃ8脂肪族単位を示す)から選ばれる請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載 の分子共役結合体システム。 ７．疎水性配列Ｙが、１０〜６０個のプロピレンオキシ単位を有するポリオキ シプロピレンから選ばれる請求の範囲６に記載の分子共役結合体システム。 ８．親水性配列Ｗがポリオキシメチレンおよびポリオキシエチレンから選ばれ る請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結合体システム。 ９．Ｗが、５０〜１５０個のポリエチレンオキシ単位を有するポリオキシエチ レンから選ばれる請求の範囲８に記載の分子共役結合体システム。 10．Ｙの相対親油性および疎水性がＷの相対親水性および疎油性とほぼ調和し て、ＨＬＢ値が１０〜３５の範囲となる請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記 載の分子共役結合体システム。 11．ＹＷが、プルロニック、シンペロニック、ポロキサマーのＬ３８、Ｆ３８ 、Ｌ４２、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６２ＬＦ、Ｌ６４、Ｆ６８、Ｐ７５、Ｌ ８１、Ｐ８５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｆ１２７;シンペロニックＴ−シリーズ;シ ンペロニックＬ−シリーズ;ＢＲＩＪ;ＭＹＲＪ;およびツイーンを含む両親媒性 界面活性剤から選ばれる請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結 合体システム。 12．配位子(Ｉ)が常磁性種および磁気次微子から選ばれ、因子(II)が組織およ び表面−特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ば れる請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結合体システム。 13．m＝２並びにＹが４８個のプロピレンオキシ単位のポリオキシプロピレン およびＷが１２７個のエチレンオキシ単位のポリエチレンオキシで、ＷＹがプル ロニックＦ１０８である請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結 合体システム。 14．(Ｉ)がホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪酸で 部分エステル化されたポリアミノポリカルボン酸の常磁性金属キレートで構成さ れ、(II)が組織および細胞特異的または表面特異的ホーミングプロテイン、グリ コペプチドおよび炭水化物から選ばれ、およびＬがＦ１０８(ＮＨ2)2、Ｆ１０８ (ＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＯＣ−ＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮ Ｈ2)2、Ｆ１０８(ＯＣ−ＮＨＮＨ2)2から選ばれる変性シンペロニックである請 求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結合体システム。 15．請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の分子共役結合体システムを製 造する方法であって、適当な親水性および疎水性配列を包含する両親媒性リンカ ーを選択し、次いで(a)該リンカーに変性によって化学的反応性基を付与し、(b) 該反応性基を介して標的因子(II)と共有結合せしめ、および(c)上記疎水性配列 を介して磁気応答化合物と非共有結合せしめることにより、式(ＩfＬ−II)の分 子共役結合体システムを得ることを特徴とする分子共役結合体システムの製造法 。 16．工程(b)の後に構造(Ｌ−II)の中間体を得、該中間体(Ｌ−II)を用いて工 程(c)を行なう請求の範囲１５に記載の製造法。 17．工程(c)を工程(b)の前に行なうことによって、工程(c)から中間体(ＩfＬ) を得る請求の範囲１５に記載の製造法。 18．変性リンカー官能基を、−ＮＨ2(またはＮＨＲ1、ここでＲ1は低級アルキ ル)、−ＣＨＯ(遊離またはジアルキルアセタールの形状)、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2 、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣl、−Ｏ−ＣＯＣl 等の中から選択する請求の範囲１５に記載の製造法。 19．変性リンカーＬを、Ｆ１０８(ＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８ (ＯＯＣ−ＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＣ− ＮＨＮＨ2)2から選択し、(Ｉ)をホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト次 微子、および疎水化常磁性キレートから選択し、およびIIをビオチン、ラクトー ス、ホレート、および“ＲＧＤ”ペプチドから選択する請求の範囲１５に記載の 製 造法。 20．変性リンカーが、式: で示される請求の範囲１５に記載の製造法。 21．請求の範囲１２に記載の変性後のリンカー(ＬおよびＬ')の用途であって 、官能基Ｒの反応を介して、標的ベクター(II)と共有結合し、生体の特異的部位 への輸送をもたらすように適当に設計された中間体(Ｌ−IIまたはＬ'−II)を製 造する上記リンカーの用途。 22．変性後のリンカー(ＬまたはＬ')の親油性配列と磁気応答配位子(Ｉ)の類 似配列との相互の親和力による、上記配位子(Ｉ)との結合を経て、中間体(ＩfＬ およびＩfＬ')を製造する請求の範囲２１に記載の用途。 23．式: (ＩfＬ)、(ＩfＬ')、(Ｌ−II)または(Ｌ'−II) (式中、(Ｉ),(II),Ｌ,Ｌ'およびfは請求の範囲１〜４に記載と同意義である) の中間体。 24．Ｌが請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載のリンカー、およびＩが疎 水性基を備えたＭＲＩコントラスト剤である請求の範囲２０に記載の構造(ＩfＬ )の中間体化合物。 25．Ｌが、Ｆ１０８(ＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＯＣ−Ｎ ＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ2)2、Ｆ１０８(ＯＣ−ＮＨＮＨ2)2 から選ばれ、Ｉがホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト次微子、および疎 水化常磁性キレートから選ばれる請求の範囲２４に記載の中間体化合物。 26．ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のＭＲＩ画像形成に用いる請求の範 囲２３乃至２５のいずれか１つに記載の化合物。 27．ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のＭＲＩ画像形成に用いるコントラ スト剤の製造用の、請求の範囲１乃至１４のいずれか１つに記載の化合物の用途 。
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