KR20110074632A - 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 피절단 표적 분자에 대해 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 생성 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 표적 단백질이 관련된 질병을 치료하기 위해 상기 프로테아제를 사용하는 방법을 개시한다. 프로테아제를 이용하여, 특정 기질 서열에서 특정 표적 단백질을 절단하는 것이 상기 병변의 치료 방법이다.

Description

변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법{METHODS OF GENERATING AND SCREENING FOR PROTEASES WITH ALTERED SPECIFICITY}

본 발명은 질병과 관련된 것으로 알려진 단백질을 절단하는 프로테아제의 제조 및 선별에 관한 것이다.

효소는 광범위한 용도들에서 사용된다. 한 중요한 효소군은 단백질을 절단하는 프로테아제이다. 많은 프로테아제들은 특정된 기질 서열에서 특이적으로 표적 단백질을 절단한다. 프로테아제에 의한 특이적 절단의 이러한 경향을, 기질, 또는 기질 서열, 특이성이라 칭한다. 다양한 부류의 단백질분해 효소들의 상이한 구성원들과 연관된 기질 특이성은 부분적으로, 기질 인식 및 촉매작용을 위한 각 효소에 의해 이용되어지는, 결합 도메인 내의 상이한 세트의 아미노산들에 의한 것일 수 있다. 변이 효소를 유전자 조작하기 위한 합리적인 방법은 수가지 프로테아제들에서 성공적이었다. 결정학적 데이터로부터 결합 틈 내에 존재하는 것으로 알려진, 서브틸리신의 보존된 아미노산 잔기 (글리신 166)를 수가지 상이한 아미노산 잔기들 중 하나로 변경시켰다. 수득된 효소 유도체는 소수성 및 아미노산 크기가 증가하면서, 기질에 대한 특이성에서 극적인 변화를 나타냈다 (Wells 등, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., (1987) 52: 647-52). 또 다른 세균성 코딩된 세린 엔도펩티다제인 α-리틱 프로테아제도 또한 메티오닌 192를 알라닌으로 변화시킴으로써 합리적으로 변경되었다. 효소의 활성 부위 내에서의 수득된 변이는 효소 활성 부위의 구조적 유연성을 증가시킨 것으로 나타났다. 수득된 α-리틱 프로테아제 유도체는 더 크고 더 많은 소수성 표적에 대해 더 광범위한 기질 특이성을 가진다 (Bone 등, Biochemistry, 1991, (43): 10388-98).

세린 프로테아제는 소위 촉매적 삼원 (Asp His Ser)을 특징으로 하는, 예의 검토된 관련 엔도펩티다제 부류이다. 유사한 단백질들의 부류 내에서, 보존된 일차, 이차 및 삼차 구조의 영역은 활성 부위(들)와 관련된 잔기 및 활성에 중요한 다른 잔기를 포함하는 경향이 있다. 예를 들어, 촉매적 삼원의 구성원은 세린 프로테아제의 일차 구조 (아미노산 서열)에서 멀리 떨어져 있으나, 이 잔기는 단백질의 삼차 구조 (즉, 접힘)에 의해 결합 형성 거리 내에 들어가게 된다.

세린 프로테아제는 기질 서열 인식 성질이 현저하게 상이하다. 즉 일부는 매우 특이적이고 (즉, 혈액 응고 및 면역보체 시스템과 관련된 프로테아제), 일부는 단지 부분적으로만 특이적이며 (즉, 포유동물 소화성 프로테아제 트립신 및 키모트립신), 또한 서브틸리신과 같이 다른 세균성 프로테아제는 완전히 비특이적이다. 이러한 특이성의 상이점에도 불구하고, 5개의 수소결합으로 활성 부위에 절단성 펩티드를 올바르게 위치시키는 기질 서열-결합 부위로 구성되는 세린 프로테아제의 촉매적 메커니즘은 잘 보존된다. 펩티드가 결합되면, 촉매적 삼원의 3개의 비변종체 잔기 간의 수소결합 네트워크는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매한다. 이 큰 부류의 프로테아제는 촉매작용의 메커니즘에서 매우 보존됨에도 불구하고, 서열 특이성에서 광범위하게 발산성일 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 질병과 관련된 것으로 알려진 단백질을 절단하는 프로테아제의 제조 및 선별에 관한 것이다. 수득된 단백질은 생체내 치료를 위한 제제로 사용될 수 있다.

본 발명은 광범위하게, 프로테아제를, 그 기질 서열 특이성의 변경에 의해 변형된 프로테아제가 병변과 관련되거나 병변을 일으키는 표적 단백질을 절단하도록 변형시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이 변형된 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 본 발명의 다른 한 실시양태에서, 이 변형된 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다.

본 발명의 한 실시양태는 원하는 기질 서열에서 원하는 표적 단백질을 절단하는 변형된 프로테아제를 선별하는 데 사용하기 위한 프로테아제 서열의 라이브러리를 생성시키는 것을 포함한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 라이브러리의 각 구성원은 라이브러리의 각 구성원에서 일어난 수많은 변이들을 갖는 프로테아제 골격 (scaffold)이다. 프로테아제 골격은 공지된 프로테아제와 동일하거나 유사한 서열을 가진다. 한 실시양태에서, 이 골격은 세린 프로테아제이다. 본 발명의 다른 한 실시양태에서, 이 골격은 시스테인 프로테아제이다. 라이브러리의 각 구성원의 절단 활성은 원하는 표적 단백질로부터의 원하는 기질 서열을 이용하여 측정된다. 라이브러리의 각 구성원은 원하는 표적 단백질로부터의 원하는 기질 서열을 이용하여 측정된다. 그 결과, 원하는 기질 서열에 대해 가장 큰 절단 활성을 갖는 프로테아제가 검출된다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 프로테아제 골격에 대해 일어난 변이의 수는 1, 2 내지 5 (예컨대, 2, 3, 4 또는 5), 5 내지 10 (예컨대, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10), 또는 10 내지 20 (예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)이다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 공지된 프로테아제 골격은 트립신, 키모트립신, 서브틸리신, 트롬빈, 플라스민, 인자 Xa, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 (uPA), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 막형 세린 프로테아제-1 (MTSP-1), 그랜자임 A, 그랜자임 B, 그랜자임 M, 엘라스타제, 키마제, 파파인, 호중구 엘라스타제, 혈장 칼리크레인, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제, 보체 인자 세린 프로테아제, ADAMTS13, 신경 엔도펩티다제/네프릴리신, 푸린 또는 크루자인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 표적 단백질은 병변과 관련되며, 예를 들어 표적 단백질은 병변을 유발한다. 병변은 예를 들어, 류마티스성 관절염, 패혈증, 암, 후천성 면역결핍증, 기도 감염증, 인플루엔자, 심장혈관 질병 또는 천식일 수 있다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 검출된 프로테아제의 활성은 라이브러리 평균 활성의 10배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 증가된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 변형된 프로테아제가 가장 효율적으로 절단하는 기질 서열(들)을 검출하기 위해, 변형된 프로테아제를 선별하는 데 사용하기 위한 기질 서열의 라이브러리를 생성시키는 것을 포함한다. 라이브러리의 구성원은 랜덤화 아미노산 서열로 이루어지고, 프로테아제에 의한 라이브러리의 각 구성원의 절단 활성이 측정된다. 프로테아제에 의해 가장 효율적으로 절단되는 기질 서열이 검출된다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 라이브러리에서의 기질 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이이다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 기질 서열은 표적 단백질의 부분이다. 이 표적 단백질은 병변과 관련될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질은 병변을 일으키는 단백질이다. 이 실시양태의 다른 한 측면에서, 이 병변은 류마티스성 관절염, 패혈증, 암, 후천성 면역결핍증, 기도 감염증, 인플루엔자, 심장혈관 질병 또는 천식이다.

이 실시양태의 다른 한 측면에서, 검출된 기질 서열의 절단 효율성은 라이브러리의 평균 활성에 비해 10배 이상, 100배 이상, 또는 1000배 이상 증가된다.

또 다른 한 실시양태로서, 본 발명은 병변을 갖는 환자의 치료 방법을 포함한다. 그 방법은 병변과 관련된 표적 단백질을 절단하는 프로테아제를 환자에게 투여함으로써, 단백질의 절단으로 병변을 치료하는 것을 포함한다.

이 실시양태의 한 측면에서, 병변은 류마티스성 관절염, 패혈증, 암, 후천성 면역결핍증, 기도 감염증, 인플루엔자, 심장혈관 질병 또는 천식일 수 있다. 이 실시양태의 다른 한 측면에서, 프로테아제는 세린 프로테아제일 수 있다. 본 발명의 다른 한 실시양태에서, 이 변형된 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 이 실시양태의 다른 한 측면에서, 표적 단백질은 병변을 유발한다.

병변을 갖는 환자, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 치료되는 환자는 포유동물, 또는 더욱 구체적으로 인간일 수 있다.

실시양태의 또 다른 한 측면에서, 표적 단백질은 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-2, 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-5, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-12, 인터류킨-12 수용체, 인터류킨-13, 인터류킨-13 수용체, p-셀렉틴, p-셀렉틴 당단백질 리간드, 물질 P, 브래디키닌 (Bradykinin), PSGL, 인자 IX, 면역글로불린 E, 면역글로불린 E 수용체, CCR5, CXCR4, 당단백질 120, 당단백질 41, CD4, 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, B7, CD28, CD2, CD3, CD4, CD40, 혈관내피세포 성장인자, VEGF 수용체, 섬유아세포 성장인자, 내피세포 성장인자, EGF 수용체, TGF 수용체, 전환성장인자, Her2, CCR1, CXCR3, CCR2, Src, Akt, Bcl-2, BCR-Abl, 글루카곤 신타제 키나제-3, 사이클린 의존성 키나제-2 (cdk-2), 또는 사이클린 의존성 키나제-4 (cdk-4)일 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되어지는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적당한 방법 및 물질이 이하에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다. 분쟁의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 좌우하게 될 것이다. 부가적으로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명을 위한 것으로서, 제한적이지 않은 것으로 의도된다.

본 발명의 다른 특성 및 이점은 이하 발명의 상세한 설명 및 청구범위를 통해 명백해질 것이다.

본 발명을 상세히 설명하기 이전에, 본원에 사용된 특정 용어들이 정의된다.

용어 "대립 변종체"는 동일한 염색체 위치를 차지하는 2개 이상의 대안적 형태의 유전자들 중 임의의 것을 의미한다. 대립 변종화는 변이를 통해 자연적으로 일어나며, 모집단 내에서 표현형 다형을 초래할 수 있다. 유전자 변이는 침묵형일 수 있거나 (코딩된 폴리펩티드 내에서의 변화가 없음), 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 "대립 변종체"는 또한 유전자의 대립 변종체에 의해 코딩된 단백질을 나타내기 위해 본원에 사용된다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 상보물"은 기준 서열에 비해, 상보적 염기 서열 및 역방향을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 예를 들어, 서열 5'ATGCACGGG 3'은 5'CCCGTGCAT 3'에 대해 상보적이다.

용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 (폴리펩티드를 코딩하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자에 비해) 하나 이상의 축퇴 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 축퇴 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플릿을 포함하나, 동일한 아미노산 잔기를 코딩한다 (즉, GAU 및 GAC 트리플릿은 각기 Asp를 코딩한다).

"DNA 구성체"는 자연에서 나타나지 않는 방식으로 조합되고 병치된 DNA 단편을 포함하는 단일 또는 이중 나선의 직선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구성체는 인간 조작의 결과물로서 존재하며, 이에는 조작된 분자의 클론 또는 다른 복제물이 포함된다.

"DNA 단편"은 특정화된 속성을 갖는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정화된 폴리펩티드를 코딩하는 단백질 단편은, 5'에서 3'의 방향으로 읽을 때 특정화된 폴리펩티드의 아미노산의 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편과 같은 보다 긴 DNA 분자의 부분이다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 전사를 제공하는 부가적 단편에 작동적으로 연결된 당해 폴리펩티드를 코딩하는 단편을 포함하는 DNA 구성체를 의미한다. 그러한 부가적 단편은 프로모터 및 종결자 서열을 포함할 수 있고, 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 임의적으로 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 양자 모든 요소를 포함할 수 있다.

용어 "단리된"은, 폴리뉴클레오티드 분자에 적용 시, 폴리뉴클레오티드가 자연적인 유전성 환경으로부터 제거되었고, 이에 따라 다른 외인성 또는 원치 않는 코딩 서열이 없고, 전적으로 유전자 조작된 단백질 생성 시스템 내에 사용하기에 적당한 형태임을 의미한다. 그러한 단리된 분자는 자연적 환경으로부터 분리된 것이며, 이는 DNA 및 게놈 클론, 또한 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 비번역 부위를 포함할 수 있다. 연관된 영역의 확인은, 임의의 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, [Dynan 및 Tijan, Nature 316: 774-78, 1985]을 참고한다). 단백질에 적용 시, 용어 "단리된"은 천연 환경 이외의 조건에서, 예컨대 혈액 및 동물 조직과 떨어진 조건에서 발견된다는 것을 가리킨다. 한 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 동물 기원의 다른 단백질이 실질적으로 없다. 매우 정제된 형태, 즉 순도 90% 이상, 바람직하게는 95% 초과, 더욱 바람직하게는 순도 99% 초과인 단백질을 제공하는 것이 바람직하다.

용어 "작동적으로 연결된"은, DNA 단편에 관한 경우, 단편들이 의도된 목적에 맞춰 기능할 수 있도록 배열된 것, 즉 전사를 코딩 단편들을 프로모터에서 개시하고, 종결자를 통해 진행하는 것을 의미한다.

용어 "오톨로그 (ortholog)"는 상이한 종들로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 상응부인 한 종으로부터 수득된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 오톨로그 간의 서열 차이는 종분화의 결과이다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3' 말단으로 읽혀지는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 나선 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 구성원으로부터 단리되거나 생체외 합성되거나, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드 ("nt"로 약기됨) 또는 염기쌍 ("bp"로 약기됨)의 용어로 본원에 주어진다. 용어 "뉴클레오티드"는 본문이 허용하는 단일 및 이중 나선에 대해 사용된다. 용어가 이중 나선에 적용되는 경우, 그것은 전체적 길이를 의미하며, 용어 "염기쌍"과 동등하도록 이해되어질 것이다. 당업자는, 이중 나선의 폴리뉴클레오티드의 두 나선이 길이가 약간 상이하며, 그것의 말단이 효소적 절단의 결과로서 엇갈릴 수 있으며, 이에 따라 이중 나선 내의 폴리뉴클레오티드 분자 모든 뉴클레오티드들이 쌍을 이루지 못할 수 있음을 인지할 것이다. 그러한 쌍을 이루지 못한 말단은 일반적으로 길이 20 nt 이하일 것이다.

용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 갖는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나, 통상적으로 유전자의 5’ 비코딩 영역에서 발견된다.

"프로테아제"는 단백질에서의 펩티드 결합을 절단하는 효소이다. "프로테아제 전구체"는 또 다른 프로테아제에 의해 절단 시에 통상 활성화되는 상대적 불활성 형태의 효소이다.

용어 "분비 신호 서열"은 합성 장소인 세포의 분비 경로를 통해 보다 큰 폴리펩티드의 구성성분으로서, 보다 큰 폴리펩티드를 지휘하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 의미한다. 보다 큰 폴리펩티드는 분비 경로를 통해 통과하는 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 통상 절단된다.

용어 "기질 서열"은 프로테아제에 의한 절단을 위해 특이적으로 표적화되는 서열을 의미한다.

용어 "표적 단백질"은 프로테아제에 의해 기질 서열에서 특이적으로 절단되는 단백질을 의미한다.

용어 "S1-S4" 기질 서열 결합 포켓을 구성하는 프로테아제의 잔기를 가리킨다. 그것은 인식 부위 N-말단에서 단백질분해-절단성 결합의 부위로 순차적으로 넘버링 (numbered) 된다.

용어 "P1-P4" 및 "P1'-P4'"는 상기 발견되는 S1-S4 잔기와 특이적으로 상호작용하는 피절단 펩티드에서의 잔기를 가리킨다. P1-P4 일반적으로 기질 서열을 포함한다. P1-P4는 절단 부위의 N-말단측상의 위치이고, 반면 P1'-P4'는 절단 부위의 C-말단측에 대한 위치이다 (도 2 참고).

용어 "골격 (scaffold)"은 각종 변이가 일어나는 현존 프로테아제를 가리킨다. 일반적으로, 이 변이들은 골격의 특이성 및 활성을 변화시킨다.

"단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분은 프로테아제 단백질을 유래시키는 세포 또는 조직원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적 합성 시에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 표현 "세포 물질이 실질적으로 없음"은 단백질이 단리 또는 재조합 생성되도록 하는 세포의 세포 구성성분들로부터 그 단백질이 분리되는 프로테아제 단백질의 제조를 포함한다. 한 실시양태에서, 표현 "세포 물질이 실질적으로 없음"은 약 30% (건조 중량) 미만의 비-프로테아제 단백질 (본원에서 "오염 단백질"이라고도 칭해짐), 더욱 바람직하게는 약 20% 미만의 비-프로테아제 단백질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 비-프로테아제 단백질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비-프로테아제 단백질을 갖는 프로테아제 단백질의 제조를 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분이 재조합으로 생성될 때, 그것은 또한 바람직하게 배양 배지가 실질적으로 없으며, 이는 즉 배양 배지가 프로테아제 단백질 제제의 체적의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 나타낸다는 것이다.

표현 "화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없음"은 단백질 합성과 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 단백질이 분리되는 프로테아제 단백질의 제조를 포함한다. 한 실시양태에서, 표현 "화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없음"은 약 30% (건조 중량) 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질, 더욱 바람직하게는 약 20% 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 비-프로테아제 화학물질을 갖는 프로테아제 단백질의 제조를 포함한다.

본 발명은 주어진 기질 서열에서 표적 단백질을 절단하는 프로테아제의 제조 및 선별 방법에 관한 것이다. 프로테아제는 표적 단백질 내의 아미노산 또는 아미노산 기질 서열을 인식하는 단백질 분해 효소이다. 기질 서열의 인식 시, 프로테아제는 표적 단백질 내의 펩티드 결합의 가수분해 또는 절단을 촉매한다. 그러한 표적 단백질의 가수분해는 표적 서열의 전장 서열의 영역 내에서 펩티드 결합의 위치에 따라서, 그 단백질을 불활성화시킬 수 있다. 프로테아제의 특이성은 단백질 유전자 조작을 통해 변경될 수 있다. (i.) 펩티드 결합 가수분해의 촉매작용 시에 표적 단백질(들)의 불활성화에 의해 기능을 변경하고, ( ii .) 표적 단백질(들)이 특별한 질병 또는 질병들을 위해 분자 개입의 기점으로 인식 또는 비인식되는 표적 단백질 또는 단백질 내의 기질 서열을 인식하도록 프로테아제를 유전자 조작할 경우, 유전자 조작된 프로테아제가 단백질분해-중재 불활성화 이벤트를 통해 치료적 효과를 가지게 된다. 특히, 프로테아제는 막통과 및 사이토킨 결합 도메인 간의 수용체를 절단하도록 유전자 조작될 수 있다. 이로써, 단백질 수용체를 세포 또는 루프 영역의 표면에 결합하는 기능을 하는 경상부 영역이 폴리펩티드 사슬 내의 구형 도메인으로부터 연결이 끊긴다.

한 실시양태에서, 피절단 표적 단백질은 병변과 관련되고, 여기에서 주어진 기질 서열에서 표적 단백질을 절단함은 병변의 치료법으로서 작용한다.

한 실시양태에서, 프로테아제는 류마티스성 관절염과 관련된 단백질을 절단한다. 예를 들어, 프로테아제는 막통과 도메인과 사이토킨 결합 도메인 사이의 TNF 수용체를 절단한다. 이 절단은 수용체를 불활성화시킬 수 있다. 이로써, 류마티스성 관절염은 종양 괴사 인자 (TNF)의 작용을 억제함으로써 치료된다.

프로테아제는 활성화된 단백질 C와 동일한 표적을 절단한다. 이 절단은 혈액 응고 캐스케이드를 약화시킬 수 있다. 이로써, 패혈증은 단백질 C의 작용을 보충함으로써 치료된다.

프로테아제는 종양유발성의 원인이 되는 세포 표면 분자를 절단하고, 암이 퍼지는 것을 방지한다. 예를 들어, 세포 표면 분자의 절단은 세포외 신호, 특히 세포 증식의 전달 능력을 불활성화시킬 수 있다. 이 신호가 없으면, 암 세포가 종종 증식할 수 없다. 그러므로 본 발명의 프로테아제는 암의 치료에 사용될 수 있다. 이 실시양태의 다른 한 측면에서, 프로테아제는 암이 퍼지는 것의 원인이 되는 임의의 표적 단백질을 절단할 수 있다. 세포 사이클 진행과 관련된 표적 단백질의 절단은 단백질이 세포 사이클이 전진하는 것을 허용하는 단백질의 능력을 불활성화시킬 수 있다. 세포 사이클의 진행이 없으면, 암 세포는 증식할 수 없다. 그러므로, 본 발명의 프로테아제는 암 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 또는 인플루엔자 상에서 발견되는 막 융합 단백질을 절단하여, 세포를 감염시키는 바이러스 능력을 억제한다. 이 막 단백질이 없으면, 이 바이러스들은 세포를 감염시킬 수 없다. 그러므로, 프로테아제는 HIV, RSVm 또는 인플루엔자에 의한 감염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 플라스미노겐 활성화제와 동일한 표적 단백질을 절단한다. 플라스미노겐 활성화제의 표적을 절단함으로써, 트롬보분해 캐스케이드가 불활성화된다. 혈액 응고물에 의해 유발되는 발작 또는 심장마비의 경우, 프로테아제가 심장혈관 질병의 치료법으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 염증 관련의 천식 또는 다른 병변의 치료법으로서, 염증 관련의 사이토킨 또는 수용체를 절단한다. 사이토킨 또는 수용체를 절단함으로써, 프로테아제가 많은 염증 공정들과 관련된 신호전달 캐스케이드를 불활성화시킬 수 있다. 이로써, 프로테아제는 염증 및 관련 병변의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 아폽토시스의 원인이 되는 신호전달 캐스케이드를 포함하는, 각종 신호 캐스케이드와 관련된 신호전달 분자를 절단한다. 예를 들어, 프로테아제는 카스파제를 절단한다. 이 카스파제는, 예를 들어 카스파제-3일 수 있다. 신호 캐스케이드와 관련된 단백질을 절단함으로써, 프로테아제가 신호 캐스케이드의 불활성화 또는 조절에 사용될 수 있다.

일부 예들에서, 유전자 조작된 프로테아제는 표 1에서의 표적 단백질들 중 임의의 것을 절단함으로써, 단백질의 활성을 불활성화시키도록 고안된다. 프로테아제는 표적 단백질들 중 하나를 불활성화시킴으로써, 그 단백질과 연관된 병변을 치료하는데 사용될 수 있다.

[표 1]

프로테아제 골격은 또한 하기 표 2에 개시된 단백질들 중 임의의 것이다.

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

[표 2d]

[표 2e]

프로테아제의 유전자 조작

프로테아제의 실질적으로 모든 측면은, 효소 기질 서열 특이성, 열안정성, pH 프로파일, 촉매적 효율, 산화안정성, 및 촉매적 기능을 포함하여 재유전자 조작될 수 있다.

현존 프로테아제는 자체 기질 특이성을 변화시키는 각종 변이를 포함하는 골격으로 사용된다. 골격은 대체로, 트립신, 키모트립신, 서브틸리신, 트롬빈, 플라스민, 인자 Xa, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 (uPA), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 그랜자임 B, 엘라스타제, 파파인, 크루자인, 막형 세린 프로테아제-1 (MTSP-1), 키마제, 호중구 엘라스타제, 그랜자임 A, 혈장 칼리크레인, 그랜자임 M, 보체 인자 세린 프로테아제, ADAMTS13, 신경 엔도펩티다제/네프릴리신, 및 푸린 또는 이들의 조합물의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 골격은 그랜자임 B, MTSP-1, 키마제, 호중구 엘라스타제, 그랜자임 A, 혈장 칼리크레인, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제, 그랜자임 M, 키모트립신, 트롬빈, 보체 인자 세린 프로테아제, ADAMTS13, 신경 엔도펩티다제/네프릴리신, 푸린 및 플라스민을 포함한다. 세린 프로테아제 내의 기질 서열 특이성의 결정자는 활성 부위 내의 S1-S4 위치에서 나오며, 거기에서 프로테아제는 펩티드 기질 서열의 P1-P4 잔기와 접촉한다. 일부 예들에서, 활성 부위의 S1- S4 포켓 간에 상호작용은 (있다해도) 거의 없으며, 이에 따라 각 포켓은 다른 포켓과 무관한 펩티드 기질 서열 상의 상응하는 잔기를 인식하여 결합하는 것으로 보인다. 이에 따라, 특이성 결정자는 다른 포켓의 특이성에 영향을 주지 않으면서, 한 포켓 내에서 일반적으로 변화될 수 있다.

예를 들어, 특별한 결합 부위에서의 잔기 또는 특별한 서열에 대한 특이성이 낮은 프로테아제는 기질 서열 결합 포켓에서 점돌연변이를 일으킴으로써 그 특이성이 변경된다. 일부 경우들에서, 수득된 변이체는 야생형에서보다 한 부위에서 또는 특별한 서열에 대해 특이성이 10배 초과의 증가를 가진다. 다른 한 실시양태에서, 수득된 변이체는 야생형에서보다 한 부위에서 또는 특별한 서열에 대해 특이성이 100배 초과의 증가를 가진다. 다른 한 실시양태에서, 수득된 변이체는 야생형에서보다 한 부위에서 또는 특별한 서열에 대해 특이성이 1000배 초과의 증가를 가진다.

또한 당업계에 공지된 방법 및 이하 상세하게 설명되는 방법을 이용하여 생성 및 선별되는 각종 변이를 갖는 골격의 라이브러리도 본 발명에 의해 고찰된다. 그 구성원의 기질 서열 특이성을 확실히 얻기 위해 라이브러리를 선별한다. 골격의 라이브러리를 그 구성원들을 기질 펩티드 서열에 노출함으로써, 특이성에 대해 시험한다. 기질 서열을 절단하도록 허용하는 변이가 있는 구성원을 동정한다. 임의의 기질 펩티드 서열이 라이브러리의 구성원에 의해 절단되도록 골격 내에 충분히 다양한 변이를 갖는 라이브러리를 구축한다. 이에 따라, 임의의 표적 단백질에 대해 특이적인 프로테아제를 생성시킬 수 있다.

공정

1. 골격의 선택

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 하기 요건을 이용하여, 골격 프로테아제를 선택한다: 1) 프로테아제가 공지된 서열의 인간 또는 포유동물의 프로테아제이고; 2) 프로테아제가 현 분자생물학 기술을 통해 조작될 수 있고; 3) 프로테아제가 적당한 숙주 내에서 비교적 높은 수준으로 이종으로 발현될 수 있으며; 또한 4) 프로테아제가 선별하기에 충분한 수준으로 화학적으로 경쟁적인 형태로 정제될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태들에서, 변이가 일어나는 골격 프로테아제는 세포외에서 발견되는 단백질을 절단한다. 이 세포외 단백질은, 예를 들어, 수용체, 신호전달 단백질 또는 사이토킨이다. 변이 시에 두 부류의 골격 프로테아제의 활성 및 특이성에 영향을 주는 잔기가 여기에 기재되어 있다. 바람직하게, 프로테아제에 대한 3차원 구조적 정보가 입수가능하다. 또한, 프로테아제의 초기 기질 특이성의 정보가 있는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제가 생체외 활성 및 안정성을 가지고, 프로테아제의 거대분자 조절자의 정보가 입수가능한 것이 바람직하다. 또한, 병변에 영향을 주는 것과 관련된 표적을 절단하는 프로테아제, 예컨대 병변의 단백질 유효인자를 불활성화하는 프로테아제가 바람직하다.

세린 프로테아제

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 변경된 특이성을 갖는 세린 프로테아제가, 구조에 기초하는 고안법에 의해 생성된다. 각 프로테아제는 활성 부위 포켓을 구성하고, 기질과 직접적으로 접촉시키는 일련의 아미노산들을 가진다. 키모트립신 부류 전체에 걸쳐, 기질과 효소 간의 골격 상호작용이 완전히 보존되나, 측쇄 상호작용은 부류 전반에 걸쳐 상당히 다양하다. 활성 부위의 S1-S4 포켓을 구성하는 아미노산의 동정은 그 특별한 포켓의 기질 특이성을 결정한다. 한 세린 프로테아제의 동일 폴드 내의 다른 한 세린 프로테아제로의 아미노산 그라프팅은 상호간의 특이성을 변형시킨다. 예를 들어, S2 포켓 내의 위치 99에서의 작은 아미노산으로의 변이는 P2 기질 위치 내의 큰 소수성 잔기에 대한 선호를 부여한다. 선택적 변이유발의 이 공정을 이용한 후, 기질 라이브러리 선별을 함으로써, 각종 질병과 관련된 단백질에 대한 신규 기질 특이성을 갖는 프로테아제가 고안된다.

세린 프로테아제는 키모트립신과 서열 및 구조적 상동성을 공유한다는 점에서, 키모트립신과 동일한 부류의 구성원이다. 활성 부위 잔기는 Asp102, His57 및 Ser195이다. 직선상 아미노산 서열은 키모트립신의 서열과 같이 배열되고, 키모트립신의 β시이트에 따라 넘버링된다. β시이트 사이에 있는 루프에서 삽입 및 결실이 일어나나, 구조적 부류 전체에 걸쳐 코어 시이트는 보존된다. 세린 프로테아제는 보존된 β시이트 방식으로 기질과 상호작용한다. 기질과 효소 간에, 6개 이하의 보존된 수소결합이 일어날 수 있다.

시스테인 프로테아제

파파인-유사 시스테인 프로테아제는 파파인과의 구조적 유사성으로 인해 티올 의존성 엔도펩티다제의 한 부류이다. 그것은 R 및 L로 라벨링된 (우측 및 좌측) 도메인을 갖는 2-도메인 단백질을 형성하고, 양 도메인으로부터의 루프는 기질 인식 틈을 형성한다. 그것은 아미노산 Cys25, His159 및 Asn175로 구성된 촉매적 삼원을 가진다. (기질의 β-시이트 형태에 기초하는 표적 펩티드를 인식하고 단백질분해하는) 세린 프로테아제와 달리, 이 부류의 프로테아제는 기질 인식을 위해 잘 한정된 포켓을 가지지 않는다. 주요 기질 인식이 (세린 프로테아제에서는 P1 잔기에서 일어나는 것에 비해), P2 아미노산에서 일어난다.

S2 포켓은 프로테아제 기질 인식 부위가 가장 선택적이고 가장 잘 특징화되어 있다. 그것은 하기 공간 위치에서 아미노산에 의해 한정된다 (파파인 넘버링): 66, 67, 68, 133, 157, 160 및 205. 위치 205는 특이성을 결정하는 포켓의 바닥에 매입된 잔기인, 세린 프로테아제 내의 위치 189와 유사한 역할을 한다.

수많은 시스테인 프로테아제 (인간 카텝신 L, V, K, S, F, B, 파파인 및 크루자인)의 기질 특이성을 완전한 다양한 위치 스캐닝 합성 조합 라이브러리 (PS-SCL)를 이용하여 프로파일링하였다. 완전한 라이브러리는, 한 위치가 고정되고, 다른 3개 위치가 20개의 가능한 아미노산의 동몰 혼합물로 랜덤화됨으로써 총 다양도 ~160,000의 테트라펩티드 서열을 수득케 하는 P1, P2, P3 및 P4 테트라펩티드 기질로 구성된다.

전체적으로, P1 특이성은 카텝신 간이 거의 동일하고, Arg 및 Lys이 강하게 선호되며, 한편 작은 지방족 아미노산이 내성을 가지게 되었다. 많은 선택도가 인간 카텝신이 소수성 아미노산에 대해 매우 선택적인 P2 위치에서 발견되었다. 흥미롭게도, 소수성 잔기에 대한 P2 특이성이 Phe, Tyr 및 Trp (카텝신 L, V)과 같은 방향족 아미노산과 Val 또는 Leu (카텝신 K, S, F)과 같은 벌크성 지방족 아미노산 간에 분할되었다. P2 위치에 비해, P3 위치에서의 선택성은 상당히 덜 엄격하였다. 그러나, 수개의 프로테아제는 프롤린 (카텝신 V, S 및 파파인), 류신 (카텝신 B), 또는 아르기닌 (카텝신 S, 크루자인)에 대해 뚜렷한 선호도를 나타냈다. 한 아미노산이 다른 아미노산과 구별되어 선택되지 못함에 따라, 프로테아제는 P4 위치에서 넓은 특이성을 나타냈다.

기질 인식 프로파일

변경된 기질 인식 프로파일로 변종체 프로테아제를 제조하기 위해, 기질 선택성 (특이성 결정자)에 기여하는 3차원 구조의 아미노산이 변이유발의 표적이 된다. 세린 프로테아제의 경우, 부류 구성원의 수많은 구조들은 확장된 기질 특이성에 기여하는 표면 잔기를 한정하였다 (Wang 등, Biochemistry 2001년 8월 28일; 40(34): 10038-46; Hopfner 등, Structure Fold Des. 1999년 8월 15일; 7(8): 989-96; Friedrich 등, J. Biol. Chem. 2002년 1월 18일; 277(3): 2160-8; Waugh 등, Nat. Struct. Biol. 2000년 9월; 7(9): 762-5). 공지된 확장된 특이성을 갖는 것으로 결정된 부류 구성원들의 한 하위세트에서의 아미노산의 열거와 함께, 각종 프로테아제에 대한 구조적 결정자가 표 3에 열거되어 있다. 세린 프로테아제의 경우, 일차 서열에서의 하기 아미노산은 특이성의 결정자이다: 195, 102, 57 (촉매적 삼원); 189, 190, 191, 192, 및 226 (P1); 57, 58 및 64 간의 루프, 및 99 (P2); 192, 217, 218 (P3), Cys168 및 Cys180 간의 루프, 215 및 97 내지 100 (P4).

[표 3]

그랜자임 B는 키모트립신 폴드 세린 프로테아제의 부류의 한 구성원이고, 그랜자임 C 내지 G, 카텝신 G, 및 래트 비만세포 프로테아제 II를 포함하는 그랜자임 부류의 다른 구성원들과 50% 초과의 상동성을 가진다. 단백질은 짧은 α-나선에 의해 연결된, 2개의 6 나선의 비평행 β-배럴 도메인의 샌드위치이다. 촉매적 삼원은 Asp102, His57 및 Ser195로 구성된다. 표면 루프는 α-키모트립신에 대비되는 첨가 및 결실에 따라 넘버링되며, 이 구조적 부류의 가장 가변적인 영역을 나타낸다. 특이성의 결정자는 기질-유사 결합 루프를 갖는 거대 분자 억제제인 에코틴 [IEPD]과 착화된 래트 그랜자임 B의 3차원 구조에 의해 한정된다 (Waugh 등, Nature Struct. Biol). 특이성의 이 구조적 결정자는 키모트립신 넘버링에 의해 Ile99, Arg192, Asn218, Tyr215, Tyr174, Leu172, Arg226 및 Tyr151을 포함한다. 흥미롭게도, 세린 프로테아제의 그랜자임 부류의 다른 구성원들은 그랜자임 B와 단지 2개의 상기 아미노산을 공유한다. 그것은 Tyr215 및 Leu172이고, 이 두 잔기는 전체 구조적 부류 전반에 걸쳐 거의 변화가 없다. 이는 그랜자임의 서열 상동성은 크나, 그것의 기질특이성은 매우 상이하다는 것을 제시한다.

확장된 특이성에서의 이 아미노산의 역할을 결정하기 위해, Ile99, Arg192, Asn218 및 Tyr174는 아미노산 알라닌으로 변이가 일어났다. Ile99는 P2 특이성에, Asn218 및 Arg192는 P3 특이성에, 또한 Tyr174는 P4 특이성에 기여하는 것으로 결정되었다. 확장된 특이성에 대한 변이의 영향을 결정하기 위해, 각 변형된 프로테아제를 조합 기질 라이브러리를 이용하여 프로파일링하였다. 프로테아제의 P1 특이성이 그 특이성의 대부분을 나타내기 때문에, 변형은 P1 아스파르트산 아미노산으로의 그랜자임 B의 고유 특이성을 파괴하지 않으나, 확장된 P2 내지 P4 부위에서의 특이성을 조절한다.

P3 및 P4 하위부위에 있어서, Tyr174, Arg192 및 Asn218에서의 변이는 특이성에 상당한 영향을 주지 않았다 (하기 표 4 참고). Y174A는 P4에서 Leu로의 활성을 증가시키나, 나머지 아미노산은 계속 불량하게 선택되었다. R192A 및 N218A는 양자 모두 P3에서의 특이성을 넓게 하였다. 글루탐산에 대한 강한 선호 대신에, Ala, Ser, Glu 및 Gln는 변이체에서 유사하게 바람직하다. 변이체의 전체적 활성 (kcat/Km)은 이상적 야생형 기질, N-아세틸-Ile-Glu-Pro-Asp-AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린) (Ac-IEPD-AMC)보다 10% 미만 더 낮았다.

더욱 더 큰 현저한 효과가 P2 하위부위에서 관찰된다 (하기 표 4를 참고한다). 야생형 그랜자임 B에서, 선호도는, Pro 잔기에 대해 약간 선호도를 가지면서 넓다. I99A는 Phe 및 Tyr 잔기에 대한 P2 특이성을 좁힌다. Phe는 이제 이 위치에 있는 다른 아미노산의 평균 활성보다 거의 5배 큰 것이 바람직하다. 세린 프로테아제의 키모트립신 부류 내에서, 12개 초과의 프로테아제가 이 구조적 부위에서 작은 잔기, 즉 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 알라닌 또는 글리신을 가진다. 이 군으로부터, 2개의 프로테아제가 조합 기질 라이브러리, (혈장 칼리크레인 및 플라스민)을 이용하여 프로파일링되었고, 양자 모두 Phe 및 Tyr에 대한 선호도를 나타냈다. 이 두 결과는 위치 99 에서 Asn, Ser, Thr, Gly 또는 Ala로 변이된 임의의 세린 프로테아제가 혈장 칼리크레인, 플라스민 및 I99A 그랜자임 B 변이체에서 발견되는 것과 동일한 소수성 특이성을 나타낸다는 것을 제시한다.

P2 특이성 결정자의 이해는 대조 변이 및 기질 선호도로 확장될 수 있다. 거의 2 십여 키모트립신-폴드 세린 프로테아제가 위치 99에서 방향족 아미노산을 가진다. 이 프로테아제들 중 4개가 조합 기질 라이브러리를 이용하여 프로파일링되었다: 인간 그랜자임 B, 조직형 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 및 막형 세린 프로테아제 1. 그랜자임 B를 제외한 모든 것이 기질 P2 위치에서 세린, 글리신 및 알라닌 아미노산에 대한 선호도를 가진다.

[표 4]

[표 5]

표 4 및 표 5로부터, 래트 그랜자임 B에서 변경하고자 선택된 특이성의 결정자는 하기와 같다: Ser195, Asp102, His57, Ala189, Ser190, Phe191, Arg192, Arg226, Ser58, Gly59, Ser60, Lys61, Ile62, Asn63, Ile99, Gln217, Asn218, Glu169, Ser170, Tyr171, Leu171A (키모트립신에 비해 하나의 아미노산 삽입을 주목한다), Lys172, Asn173, Tyr174, Phe175, Asp176, Lys177, Ala178, Asn179, Glu180, Ile181, Tyr215, Lys97, Thr98, Ile99, 및 Ser100.

시스테인 프로테아제의 경우, 변형되도록 선택되는 아미노산은 덜 잘 기재되어 있다. S2 포켓은 프로테아제 기질 인식 부위가 가장 선택적이고 가장 잘 특징화된다. 그것은 하기 3차원 위치에 있는 아미노산에 의해 한정된다 (파파인 넘버링): 66, 67, 68, 133, 157, 160 및 205. 위치 205는 특이성을 결정하는 포켓의 바닥에 매입된 잔기인, 세린 프로테아제 내의 위치 189와 유사한 역할을 한다. 다른 특이성 결정자는 (파파인에 따라 넘버링된) 하기 아미노산들을 포함한다: 61 및 66 (P3); 19,20, 및 158 (P1).

[표 6]

2. 골격 프로테아제의 변이유발

주어진 아미노산에 대한 주어진 하위부위 (S1-S4)의 기질 선호도를 변화시키기 위해, 결합 포켓을 구성하는 특이성 결정자를 개별적으로 또는 조합하여 변이시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, 포켓을 구성하는 변이유발 잔기가 20개의 가능한 아미노산들 각각에 대해 변이되는 포화 변이유발 기술이 사용된다. 이는 쿤클 (Kunkle) 방법 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa.)을 이용하여 달성될 수 있다. 간략히, 원하는 코돈에서 NNS 또는 NNK 랜덤화를 함유하는 변이유발원 올리고뉴클레오티드 프라이머가 합성된다. 프라이머는 단일 나선 DNA 주형에 접합되고, DNA 폴리머라제가 첨가되어, 주형에 상보적인 나선이 합성된다. 라이게이션 후, 이중 나선 DNA 주형은 증폭을 위해 이. 콜라이 (E. coli )로 형질전환된다. 대안적으로, 단일 아미노산 변화가 표준 시중입수가능한 부위-지정 변이유발 키트, 예컨대 퀵체인지 (QuikChange)[스트라타겐 (Stratagene)]를 이용하여 이루어진다. 다른 한 실시양태에서, 부위 특이적 아미노산 변이를 위한 당업계에 통상 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.

3. 변종체 프로테아제의 발현 및 정제

프로테아제는 활성 또는 불활성 자이모겐 형태로 발현될 수 있다. 프로테아제는 이. 콜라이 , 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris ), S. 세레비자에 (S. cerevisae)와 같은 이종 발현 시스템, 또는 바쿨로바이러스 발현 시스템 내에 있을 수 있다. 단백질은 세포간 환경에서 발현되거나, 배지로 배출될 수 있다. 프로테아제는 또한 생체외 발현 시스템에서 발현될 수도 있다. 변종체 프로테아제를 정제하기 위해, 칼럼 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 프로테아제는 니켈 칼럼 상에 정제하기 위해 C-말단 6-His 태그를 함유할 수 있다. 프로테아제의 pI에 따라, 양이온 또는 음이온 교환 칼럼이 적당할 수 있다. 프로테아제는 자체가 분해되지 않도록 촉매 활성을 최소화시키는 낮은 pH 완충액에 저장될 수 있다. 정제는 또한 면역흡수법, 겔 투과법, 또는 당업계에 통상 사용되는 임의의 다른 정제법을 통해 달성될 수 있다.

4. ACC 위치 스캐닝 라이브러리의 합성

당업자는 본 발명의 펩티드 및 라이브러리를 제조하기 위해 많은 방법들이 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 한 예시적 실시양태에서, 형광유발 태그 라이브러리를 고체 지지체에 부착시킴으로써 라이브러리를 선별한다. 기질 펩티드로부터의 형광유발 이탈기를, N-Fmoc 쿠마린 유도체를, 산-불안정 링크 링커 (Rink linker)에 축합하여, ACC 수지를 제공함으로써 합성한다 (Backes 등. Nat Biotechnol. 2000년 2월; 18(2): 187-93). Fmoc-제거는 유리 아민을 생성시킨다. 천연, 비천연 및 변형 아미노산이 아민에 커플링될 수 있고, 이는 부가적 아미노산의 커플링에 의해 정련될 수 있다. 펩티드의 합성이 완료된 후, 펩티드-형광유발 부분기 복합체를 고체 지지체로부터 절단할 수 있거나, 대안적으로 복합체가 고체 지지체에 결합된 상태로 유지될 수 있다.

이에 따라, 다른 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 형광유발 펩티드 또는, 형광유발 펩티드를 포함하는 물질의 제조 방법을 제공한다. 그 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 고체 지지체에 공유결합된 형광유발 부분기를 포함하는 제1 복합체를 제공함; (b) 제1 복합체를 제1 피보호 아미노산 부분기 및 활성화제와 접촉시킴으로써, 제1 복합체의 아민 질소와 카르복실기 간에 펩티드 결합을 형성함; (c) 탈보호시킴으로써, 반응성 아민 부분기를 갖는 제2 복합체를 형성함; (d) 제2 복합체와 제2 피보호 아미노산 및 활성화제를 접촉시킴으로써, 카르복실기와 반응성 아민기 간에 펩티드 결합을 형성함; 및 (e) 탈보호시킴으로써, 반응성 아민 부분기를 갖는 제3 복합체를 형성함.

한 바람직한 실시양태에서, 그 방법은 추가로 하기 단계들을 포함한다: (f) 제3복합체를 제3 피보호 아미노산 및 활성화제와 접촉시킴으로써, 카르복실기와 반응성 아민 부분기 간에 펩티드 결합을 형성함; 및 (e) 탈보호시킴으로써, 반응성 아민 부분기를 갖는 제4 복합체를 형성함.

커플링하기 어려운 아미노산 (Ile, Val 등)의 경우, 미반응 유리 아민이 지지체 상에 남아, 후속 반응 및 검정 작업들을 복잡하게 할 수 있다. DMF 중의 아세트산의 3-니트로트리아졸 활성 에스테르를 이용하는 한 특수화된 캡핑 단계는 남아있는 아닐린을 효율적으로 아크릴화한다. 정제된 기질 서열 용액 내에 존재할 수 있는 수득된 아세트산-캠핑된 쿠마린은 일반적으로 프로테아제 기질 서열이 아니다. 이 방법에 의해 제공되는 P1-치환된 수지는 임의의 ACC-형광유발 기질을 제조하는데 사용될 수 있다.

다른 한 바람직한 실시양태에서, 임의의 특별한 위치 또는 위치들의 조합에서의 다양성은, 펩티드 사슬을 구성하게 되는 2개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 더욱 바람직하게는 12개 이상, 더욱 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산들의 혼합물을 이용함으로써 도입된다. 아미노산들의 혼합물은 임의의 유용량의 하나 이상의 상이한 아미노산들과 조합되는 임의의 유용량의 특별한 아미노산을 포함할 수 있다. 현재 바람직한 한 실시양태에서, 그 혼합물은 아미노산들의 등반응속도 혼합물 (모든 성분들의 동등한 몰 반응성을 허용하기에 적당한 비율의 혼합물)이다. 등반응속도 혼합물은 아미노산들의 몰 비율이 보고된 반응속도에 기초하여 조정된 것이다 (Ostresh, J. M., Winkle, J. H., Hamashin, V. T., 및 Houghten, R. A. (1994). Biopolymers 34, 1681-1689).

서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후, 서열에 남아있는 아미노산을 순차적으로 첨가하는 고체상 펩티드 합성이, 본 발명의 펩티드 골격을 제조하는 바람직한 방법이다. 고체상 합성 기술이 하기에 기술되어 있다: Barany 및 Merrifield의 고체상 펩티드 합성 (Solid-Phase Peptide Synthesis); pp. 3-284, The Peptides: Anal, Synthesis, Biology. 제2권; 펩티드 합성의 특별한 방법 (Special Methods In Peptide Synthesis, 파트 A., Gross 및 Meienhofer 편저, Academic press, 미국 뉴욕 소재, 1980; 및 Stewart 등, 고체상 펩티드 합성 (Solid Phase Peptide Synthesis); 제2판 Pierce Chem. Co., 로크포드, I11. (1984) (이는 모두 참고로 본원에 인용됨). 고체상 합성은 Fmoc 또는 t-BOC 화학을 이용하는 시중입수가능한 펩티드 합성기를 이용하여 가장 용이하게 달성된다.

한 특히 바람직한 실시양태에서, 펩티드 합성은 Fmoc 합성 화학을 이용하여 수행된다. Asp, Ser, Thr 및 Tyr의 측쇄는 바람직하게 t-부틸기를 이용하여 보호되고, Cys 잔기의 측쇄는 S-트리틸 및 S-t-부틸티오를 이용하여 보호되며, Lys 잔기는 바람직하게 t-Boc, Fmoc 및 4-메틸트리틸을 이용하여 보호된다. 적당하게 보호된 아미노산 시약은 시중입수가능하거나, 당업계에 인지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다중 보호기의 사용은, 임의의 특별한 원하는 측쇄에 형광발색단의 선택적 탈보호 및 커플링을 허용한다. 이에 따라, 예를 들어, t-Boc 탈보호는 디클로로메탄 중 TFA를 이용하여 달성된다. Fmoc 탈보호는 예를 들어, DMF 또는 N-메틸피롤리돈 중 20% (v/v) 피페리딘을 이용하여 달성되고, 4-메틸트리틸 탈보호는 예를 들어, 물 중 1 내지 5% (v/v) TFA, 또는 DCM 중 1% TFA 및 5% 트리이소프로필실란을 이용하여 달성된다. S-t-부틸티오 탈보호는 예를 들어, 수성 메르캅토에탄올 (10%)을 이용하여 달성된다. t-부틸, t-boc 및 S-트리틸기의 제거는 예를 들어, TFA:페놀:물:티오아니졸:에탄디티올 (85:5:5:2.5:2.5), 또는 TFA:페놀:물 (95:5:5)을 이용하여 달성된다.

5. 특이성 변화를 위한 프로테아제의 선별

본 발명의 방법을 이용하여 생성된 프로테아제 내의 필수 아미노산은 당업계에 공지된 절차, 예컨대 부위-지정 변이유발 또는 활성 부위 잔기의 포화 변이유발에 따라 동정된다. 후자의 기술에서, 특이성의 중요한 결정자로 나타난 S1-S4 포켓을 형성하는 잔기는 단독으로 또는 조합되어 모든 가능한 아미노산으로 변이된다. 예를 들어, [Legendre 등, JMB (2000) 296: 87-102]를 참고로 한다. 수득된 변이체의 기질 특이성은 ACC 위치 스캐닝 라이브러리를 이용하여, 또한 단일 기질 역학적 검정법에 의해 결정된다 (Harris 등, PNAS, 2000, 97: 7754-7759).

다중 아미노산 치환이 이루어지고, 변이유발 및 선별의 공지 방법, 예컨대 Reidhaar-Olson 및 Sauer (Science 241: 53-57, 1988) 또는 Bowie 및 Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86: 2152-2156, 1989)에 개시된 방법을 이용하여 시험된다. 간략하게, 이 저자는 폴리펩티드 내의 2개 이상의 위치를 동시에 랜덤화하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 변이유발된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각 위치에서의 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법을 개시한다. 이용될 수 있는 다른 방법은 파지 식별을 포함한다 (예컨대, Legendre 등, JMB, 2000: 296: 87-102; Lowman 등, Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner등, 미국 특허 제5,223,409호; Huse, PCT 공보 WO 92/06204) 및 영역-지정 변이유발 (Derbyshire 등, Gene 46: 145, 1986; Ner 등, DNA 7: 127, 1988).

상기 개시된 변이유발 방법은 숙주 세포 내의 클로닝되고 변이유발된 폴리펩티드를 검출하기 위한 고속처리 자동화 선별 방법과 조합될 수 있다. 단백질분해 활성 단백질 또는 그것의 전구체를 코딩하는 변이유발된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수되고, 근대 장치를 이용하여 급속히 시퀀싱된다. 이 방법은 당해 폴리펩티드 내의 개별 아미노산 잔기의 중요성을 급속히 결정하도록 하고, 비공지 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

프로테아제 파지 디스플레이에 의한 선별

한 실시양태에서, 프로테아제 파지 디스플레이는 [Legendre 등, JMB, 2000: 296: 87-102, 및 Corey 등, Gene, 1993년 6월 15일; 128 (1): 129-34]에 기재된 바와 같이, 특이적 기질 서열에 대한 각종 친화성에 대한 변이체 프로테아제의 풀을 선별하는데 사용된다. 파지 기술은 단백질과, 그것을 코딩하는 유전적 정보 간의 물리적 연결점을 제공할 수 있도록 한다. 당해 단백질은 세균성 바이러스의 표면 코트 단백질에 대한 유전적 융합으로서 구축된다. 바이러스성 입자가 세균성 숙주에서 생성될 때, 당해 단백질은 융합 단백질로서 생성되어, 바이러스 표면 상에 발현되며, 그것의 유전자가 바이러스의 캡시드 입자 내에 팩킹된다. 파지 디스플레이된 랜덤 단백질 라이브러리는 고정화 표적화에 대한 결합을 위해 선별된다. 파지의 라이브러리 (각 파지는 개별 변이체를 나타냄)는 표적에 대한 증진된 친화성에 대해 분류된다. 세린 프로테아제는 파지 표면 상에 발현되며, 적당한 변이유발 기술과 조합되는 이 기술은 프로테아제 변종체의 다양한 라이브러리를 생성시키는데 사용된다.

선택되는 표적은 프로테아제의 치료용 용도와 관련된 것일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 내독소, 또는 바이러스성 단백질, 또는 세균성 벽 단백질, 또는 자동면역 조건과 관련된 천연 혈액-보유 펩티드에 존재한다. 여기에서, 선택된 프로테아제는 펩티드를 예컨대, 정맥내 투여로써 그러한 치료를 요하는 사람에게 투여하는 것에 의한 치료 방법에 사용된다.

형광을 이용하는 선별

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 효소적으로 활성인 프로테아제의 존재에 대한 검정 방법이 제공된다. 그 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 프로테아제의 작용 시에 펩티드 기질 서열로부터 형광유발 부분기가 방출되도록 하는 방식으로 샘플을 프로테아제와 접촉시키고, 이로써 형광 부분기를 생성시킴; 및 (b) 샘플이 형광물질 내 검출가능한 변화를 겪는지의 여부를 결정함 (검출가능한 변화는 샘플 내의 효소적으로 활성인 프로테아제의 존재를 가리킴).

본 발명의 이 방법은 실질적으로 임의의 공지되거나 이후 발견된 프로테아제에 대해 검정하는데 사용될 수 있다. 프로테아제를 함유하는 샘플은 실질적으로 임의의 기원 또는 유기체로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 대상으로부터의 임상적 샘플이다. 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 아스파르틱 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 메탈로 프로테아제 및 세린 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다. 본 발명의 방법은 특히 비제한적으로 세균류, 진균류, 효모, 바이러스류 및 원충을 포함하는 미생물로부터 유도된 프로테아제의 검정을 위해 특히 바람직하다.

용액 내의 프로테아제 활성의 검정은 단순히 일정량의 공급원액을 형광유발 프로테아제 인디케이터에 첨가하고, 흡수 스펙트럼 내의 후속하는 형광 증가 또는 여기 밴드 감소를 측정함을 필요로 한다. 용액 및 형광유발 인디케이터는 또한 조합되어, 프로테아제의 활성을 최적화하는 "소화 완충액"에서 검정된다. 프로테아제 활성을 검정하기에 적당한 완충액이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 특별한 프로테아제의 pH 최적값에 상응하는 pH를 갖도록 완충액이 선택된다. 예를 들어, 엘라스타제 활성을 검정하기에 특히 적당한 완충액은 50 mM 인산나트륨, 1 mM EDTA (pH 8.9)으로 구성된다. 측정은 형광발색단에 대한 "여기" 광원을 제공한 후, 특별한 파장에서 후속하여 방출되는 빛을 측정하는 장비인 플루오로미터에서 가장 용이하게 이루어진다. 프로테아제 결여의 대조군 인디케이터 용액과의 비교는, 프로테아제 활성의 측정을 제공한다. 활성 수준은, 공지된 활성의 프로테아제 용액에 의해 생성되는 형광의 변화 속도가 결정되는 프로테아제/인디케이터 조합에 대한 표준 곡선을 제작함으로써 정확히 정량될 수 있다.

형광유발 화합물의 검출이 바람직하게 플루오로미터를 이용하여 달성되는 한편, 검출은 바람직하게는 당업자에게 공지된 다양한 다른 방법들에 의해 달성될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어 형광발색단이 가시광선 파장으로 방출될 때, 광원에 의한 여기에 대응하여, 간단히 형광의 가시적 관찰에 의해 검출될 수 있다. 디지타이저 또는 기타 이미지 획득 시스템에 접하고 있는 비디오 카메라를 이용하는 이미지 분석 시스템에 의해 검출될 수 있다. 또한, 형광 현미경 하에서와 같이, 필터를 통한 가시화에 의해 검출될 수 있다. 현미경은 작동자에 의해 간단히 가시화되는 신호를 제공할 수 있다. 대안적으로, 신호는 사진 필름 상에 기록되거나, 비디오 분석 시스템을 이용하여 기록될 수 있다. 신호는 또한 이미지 분석 시스템 또는 포토미터를 이용하여 실시간으로 정량화될 수 있다.

이에 따라, 예를 들어 샘플의 프로테아제 활성에 대한 기본적 검정은, [Harris 등, J. Biol. Chem., Vol. 273, Issue 42, 27364-27373, 1998년 10월 16일]에 기재되어 있는 바와 같이, 샘플을 (검정되는 특별한 프로테아제의 pH 최적값을 갖는) 완충액에 현탁 또는 용해시키고, 그 완충액에 형광유발 프로테아제 인디케이터를 첨가하며, 스펙트로플루오로미터를 이용하여 수득된 형광 변화를 모니터링하는 것을 포함한다. 형광발색단의 여기 파장에서 형광발색단을 여기시키고, 형광발색단의 방출 파장에서 수득된 형광을 검출하도록 스펙트로플루오로미터를 설정한다. 형광유발 프로테아제 인디케이터는 인디케이터를 절단하는 프로테아제로 인해 형광을 변화시키는 프로테아제의 기질 서열이다.

한 예시적 실시양태에서, 본 발명은 각종 세린 및 시스테인 프로테아제의 프로파일링에 유용한 라이브러리를 제공한다. 라이브러리는 상이한 아미노산에 대한 특이성을 갖는 프로테아제를 구분할 수 있다.

다른 한 예시적 실시양태에서, 혈액 응고와 관련된 수가지 세린 프로테아제의 확장된 기질 서열 특이성을 프로빙하기 위한 라이브러리로서, 프로테아제의 바람직한 P1-특이성에 따라 P1 위치가 Lys 또는 Arg로서 일정하게 유지되는 라이브러리가 제공된다.

PS-SCL 법은 단백질분해 기질 서열 특이성을 급속하고도 용이하게 결정할 수 있도록 한다. 당업자는 이 방법이 매우 다양한 대안적 라이브러리 포맷을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, P2-위치를 큰 소수성 아미노산으로 고정하는 것은 파파인-폴드 프로테아제에 의한 우선적 내부 절단을 둘러싸서, 기질 서열의 적당한 등록을 가져올 수 있다. 임의의 특별한 효소 또는 기질 서열 특이성 결정의 방법과 관련된 특별한 한계점에 대한 결정 및 고려는 당업자의 역량 안에 포함된다.

본 발명의 방법은 선택된 효소의 존재에 대한 검정에서의 사용에 부가하여, 또한 샘플 내의 효소 (예컨대, 프로테아제)를 검출, 동정 및 정량하는데 유용하다. 이에 따라, 다른 한 바람직한 실시양태에서, 선별 방법은, (c) 형광 부분기를 정량함으로써, 샘플 내에 존재하는 효소 (예컨대, 프로테아제)를 정량함을 추가 포함한다. 샘플은 예컨대 혈액, 혈청, 소변, 눈물, 젖 또는 정액과 같은 생물학적 유체일 수 있다.

프로테아제 서열 특이성 검정을 이용하는 선별

다른 한 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 표적 서열을 특이적으로 절단하는 효소, 바람직하게는 효소적으로 활성인 프로테아제를 선택하는데 사용된다. 그 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 내부 켄칭된 형광발색단을 함유하는 랜덤 펩티드 라이브러리 (여기에서, 형광발색단은 예컨대, o-아미노벤조일이고, 켄처는 예컨대 3-니트로티로신임); (b) 내부 켄칭된 형광발색단을 또한 함유하는, 절단을 위해 표적화된 서열에 상응하는 펩티드 기질 서열 (여기에서, 형광발색단은 예컨대 Cy3B이고, 켄처는 예컨대 Cy5Q임); (c) 랜덤 펩티드 라이브러리 및 펩티드 기질 서열을 1:1의 비로 혼합함; (d) 혼합물을 변이체 프로테아제에 노출시킨 후, Cy3B 형광물질:o-아미노벤조일 형광물질의 비를 정량함. 프로테아제가 표적 펩티드에 대해 선택적인 경우, 그것은 단지 표적 펩티드만을 절단하고, 랜덤 라이브러리는 절단하지 않으며, 이에 따라, Cy3B 형광물질:o-아미노벤조일 형광물질의 비가 높을 것이다 (Meldal 및 Breddam, Anal. Biochem. (1991) 195: 141-147; Gron 등 Biochemistry (1992) 31: 6011-6018).

다른 한 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 효소, 바람직하게는 효소적으로 활성인 프로테아제의 서열 특이성을 결정하는데 사용된다. 이 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 펩티드 기질 서열로부터 형광유발 부분기가 방출되도록 하는 방식으로 프로테아제를 본 발명의 펩티드의 라이브러리와 접촉시키고, 이로써 형광 부분기를 생성시킴; (b) 형광 부분기를 검출함; 및 (c) 펩티드 서열의 서열을 결정함으로써 프로테아제의 펩티드 서열 특이성 프로파일을 결정함.

상기 방법의 한 바람직한 실시양태에서, 그 방법은 (d) 형광 부분기를 정량함으로써, 프로테아제를 정량함을 추가로 포함한다.

또한, 상기 기술된 각각의 측면 및 실시양태에서, 프로테아제는 실질적으로 당해 임의의 프로테아제일 수 있으나, 바람직하게는 아스파르틱 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제이다. 본 발명의 방법을 이용하여 검정된 프로테아제는 실질적으로, 비제한적으로 포유동물 (예컨대, 인간), 조류, 파충류, 곤충류, 식물류, 진균류 등을 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 비제한적으로 세균류, 진균류, 효모, 바이러스류 및 원충을 포함하는 유기체로부터 유래된다.

6. 단계 1 내지 5의 반복

확장된 결합 하위부위, P2, P3, 및 P4의 각각에서 원하는 특이성 및 선택도를 가지는 변종체 프로테아제를 생성시키기 위해 방법을 되풀이하여 반복한다. 일부 경우들에서, 세린 프로테아제에서의 변이는, 활성 부위 (S1-S4)을 형성하는 각각의 하위부위가 상호간에 독립적으로 기능함으로써, 하위부위에서의 특이성의 변형이 인접한 하위부위에서의 특이성에 거의 영향을 주지 않음을 나타냈다. 이에 따라, 확장된 결합 부위의 전반에 걸친 기질 특이성 및 선택도의 유전자 조작은 단계별 방식으로 달성될 수 있다.

이어서, 기질 라이브러리에 의해 결정되는 원하는 특이성 프로파일에 매칭되는 변이체 프로테아제를, 원하는 절단 서열에 상응하는 개별 펩티드 기질을 이용하여 검정한다. 변종체 프로테아제를 또한 전장 단백질의 영역에서 제시될 때, 원하는 서열을 절단하도록 확실히 하기 위해 검정한다. 표적 단백질의 활성을 또한, 그 기능이 절단 이벤트에 의해 파괴되었는지를 입증하기 위해 검정한다. 절단 이벤트를, 정제된 전장 단백질을 변종체 프로테아제와 배양한 후에 SDS-PAGE에 의해 모니터링한다.

다른 한 실시양태에서, 변이체 프로테아제를 조합하여, 다중 프로테아제의 특이성을 획득한다. 한 부위에서 특이성을 생성하는 골격의 한 잔기에서의 변이는, 골격 상의 다른 한 부위에서의 다른 한 변이와 동일한 프로테아제에서 조합되어, 조합된 특이성 프로테아제를 제조한다. 동일한 골격 상의 구별되는 부위에서의 임의의 수의 변이는, 조합된 특이성 프로테아제를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 이소류신에서 알라닌까지의 위치 99의 그랜자임 B 골격에서의 변이는 아스파라긴에서 알라닌까지의 위치 218에서의 변이와 조합되어, 조합된 특이성 프로테아제 I99A/N218A 그랜자임 B를 제조하며, 그것의 성질은 본원에 상세히 기술된다.

절단 및 불활성화를 위해 표적화된 단백질은 하기 기준에 의해 동정된다: 1) 단백질은 병변과 관련됨; 2) 단백질이 병변 치료를 위한 개입의 결정적 기점이라는 강한 증거가 있음; 3) 단백질의 단백질분해 절단이 가능히 그 기능을 파괴할 수 있음. 표적 단백질 내의 절단 부위는 하기 기준에 의해 동정된다: 1) 그것이 단백질의 노출 표면 상에 위치함; 2) 그것이 원자적 구조 또는 구조 예측 알고리즘에 의해 결정 시, 이차구조가 없는 (즉, β시이트나 α나선이 아닌) 영역에 위치함 (이 영역은 세포 표면 수용체 상의 단백질 또는 경상부의 표면 상의 루프인 경향이 있음); 3) 그것이 공지된 기능에 기초하여, 단백질을 가능히 불활성화시킬 수 있는 부위에 위치함. 절단 서열은 예컨대 많은 세린 프로테아제의 확장된 기질 특이성에 매칭되도록 4개 잔기의 길이를 가지나, 더 길거나 더 짧을 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시양태에서, 표적 단백질-보조 촉매작용은 표적 단백질에 대해 특이적인 프로테아제의 생성에 사용된다. 표적 단백질-보조 촉매작용에서, 세린 프로테아제에서의 촉매적 삼원의 일부인 비변종체 히스티딘은 알라닌으로 변이되어, 프로테아제가 불활성화된다. 표적 단백질 내에서 적당한 위치에 있는 히스티딘은 수소 어셉터로 기능할 수 있으며, 이는 프로테아제에서 변이된 히스티딘과 동일한 역할을 하는 것이며, 이로써 촉매적 활성이 복원된다. 그러나, 이는 기질 서열에서 적당한 위치 (P2 또는 P1')에 히스티딘을 갖기 위한 엄격한 요건을 둔다. 프로테아제의 기질 서열 결합 부위에서의 단일 변이는 그것의 특이성을 변경시켜, 기질 서열 특이성의 변화를 가지도록 유발할 수 있다. 기질 서열 특이성은 적은 수의 변이를 이용하여 변경될 수 있다.

상기 방법들을 이용하여, 당업자는 프로테아제 골격 또는 그것의 대립 변종체에 실질적으로 상동성을 갖는 다양한 폴리펩티드들을 동정 및/또는 제조하고, 야생형 단백질의 단백질분해 성질을 보유할 수 있다. 한 실시양태에서, 이 골격은 트립신, 키모트립신, 서브틸리신, 트롬빈, 플라스민, 인자 Xa, uPA, tPA, 그랜자임 B, 그랜자임 A, 키마제, MTSP-1, 카텝신 G, 엘라스타제, 파파인, 또는 크루자인의 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 독립적으로 폴딩 결합 도메인을 형성하는 부가적 아미노산 잔기를 포함하는 표적화 부분기를 포함할 수 있다. 그러한 도메인은 예를 들어, 사이토킨 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인 (예컨대, 하나 이상의 피브로넥틴 III형 도메인); 면역글로불린 도메인; DNA 결합 도메인 (예컨대, He 등, Nature 378: 92-96, 1995); 친화성 태그; 등을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 또한 상기 일반적으로 개시된 바와 같이, 부가적 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다.

프로테아제 폴리펩티드

본 발명에 따른 폴리펩티드는, 서열이 본원에 기재된 골격들 중 하나에서 제공되는 프로테아제의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 잔기가 본원에 기재된 골격들 중 임의의 하나에서 나타나는 상응하는 잔기로부터 변화될 수 있고, 한편 프로테아제 활성 및 생리학적 기능 또는 그것의 기능적 단편을 유지하는 단백질을 여전히 코딩하는 변이체 또는 변종체 프로테아제를 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본원에 상세하게 설명되는 바와 같이, 프로테아제의 S1-S4 영역에서 변이가 일어난다.

일반적으로, 프로테아제-유사 기능을 보존하는 프로테아제 변종체는 서열 내의 특별한 위치에서의 잔기가 다른 아미노산에 의해 치환되었고, 부가적 잔기 또는 잔기들을 모단백질의 2개의 잔기 사이에 삽입하는 가능성, 및 모서열로부터 하나 이상의 잔기를 결실시키는 가능성을 추가로 갖는 임의의 변종체를 포함한다. 임의의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 본 발명에 포함된다. 바람직한 환경에서, 치환은 상기 정의된 바와 같은 보존적 치환이다.

본 발명의 한 측면은 단리된 프로테아제, 및 그것의 생물학적 활성 부분, 또는 그것의 유도체, 단편, 유사체 또는 동종체에 관한 것이다. 또한 항-프로테아제 항체를 증가시키는 면역원으로서 사용하기에 적당한 폴리펩티드 단편이 제공된다. 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대한 대안으로서, 프로테아제 단백질 또는 폴리펩티드가 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.

프로테아제 단백질의 생물학적 활성 부분은 전장 프로테아제 단백질보다 적은 수의 아미노산을 포함하고, 프로테아제 단백질의 하나 이상의 활성을 나타내는 프로테아제 단백질의 아미노산 서열에 충분히 상동성을 가지거나, 그로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 프로테아제 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티브를 포함한다. 프로테아제 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어, 10, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 폴리펩티드이다.

또한, 단백질의 다른 영역이 결실되는 단백질의 다른 생물학적 활성 부분이, 재조합 기술에 의해 제조되어, 천연 프로테아제의 기능적 활성들 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.

한 실시양태에서, 프로테아제는 골격들 중 하나, 또는 골격 변이체들 중 하나의 아미노산 서열을 가진다. 프로테아제 단백질은 실질적으로 본원에 기재된 골격들 중 하나, 또는 골격들의 변이체들 중 하나에 대해 상동성을 가지며, 단백질의 기능적 활성을 보유하나, 천연 대립 변종 또는 변이유발로 인해 아미노산 서열이 상이하다. 따라서, 다른 한 실시양태에서, 프로테아제는 본원에 기재된 골격들 중 하나, 또는 골격들의 변이체들 중 하나에 대해 약 45% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 본원에 기재된 골격들 중 하나, 또는 골격들의 변이체들 중 하나의 기능적 활성을 보유한다. 한 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 골격들 중 하나의 아미노산 서열에 대해 약 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 한 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 골격들 중 하나의 아미노산에 대해 약 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 한 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 골격들 중 하나의 아미노산에 대해 약 99% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.

2개 이상의 서열 간의 상동성 결정

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 상동성 (%)을 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 배치한다 (예컨대, 제1 아미노산의 서열 또는, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적으로 배치된 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지될 때, 분자는 그 위치에 상동성을 가진다 (즉, 본원에 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성 (homology)"은 "아미노산 또는 핵산 "일치성 (identity)"과 동등하다).

핵산 서열 상동성은 2개의 서열 간의 일치도로서 결정될 수 있다. 상동성은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 팩키지에 제공되는 GAP 소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다. 이에 대해, [Needleman 및 Wunsch, 1970. JMol. Biol . 48: 443-453]를 참고한다. 핵산 서열 비교를 위한 GAP 생성 페널티: 5.0 및 GAP 확장 패널티: 0.3의 세팅을 갖는 GCG GAP 소프트웨어를 이용할 때, 상기 언급된 유사 핵산 서열의 코딩 영역은 바람직하게 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 일치도를 나타낸다.

용어 "서열 일치성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 특별한 비교 영역 상에서 잔기별로 일치하는 정도를 가리킨다. 용어 "서열 일치성의 백분율"은, 비교 영역 상에서 2개의 최적 배치된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예컨대, 핵산의 경우, A, T, C, G, U, 또는 I)가 양 서열에서 일어나 매칭된 위치의 수를 산출하고, 그 매칭된 위치의 수를 비교 영역 (즉, 윈도우 크기) 내의 위치의 총 수로 나누며, 그 결과값을 100으로 곱하여, 서열 일치성의 백분율로 산출함으로써 계산된다. 본원에 사용된 용어 "실질적 일치성"은 비교 영역 전반에 걸친 기준 서열과 비교 시에, 80% 이상의 서열 일치성, 바람직하게는 85% 이상의 일치성, 또한 종종 90 내지 95%의 서열 일치성, 더욱 주로는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 한 특성을 나타낸다.

키메라 단백질 및 융합 단백질

본 발명은 또한 프로테아제 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용되는 프로테아제 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-프로테아제 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 프로테아제 폴리펩티드를 포함한다. "프로테아제폴리펩티드"는 본원에 기재된 골격들 중 하나 또는 그 골격의 변이체들 중 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 가리키며, 반면 "비-프로테아제 폴리펩티드"는 골격들 중 하나에 실질적으로 동종성이 아닌 단백질, 예컨대 골격과 상이한 단백질, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래된 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 가리킨다. 프로테아제 융합 단백질 내에서, 프로테아제 폴리펩티드는 프로테아제 단백질의 모두 또는 일부에 상응할 수 있다. 한 실시양태에서, 프로테아제 융합 단백질은 프로테아제 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 프로테아제 융합 단백질은 프로테아제 단백질의 2개 이상의 생물학적 활성 부분들을 포함한다. 또 다른 한 실시양태에서, 프로테아제 융합 단백질은 프로테아제 단백질의 3개 이상의 생물학적 활성 부분들을 포함한다. 융합 단백질에 있어서, 용어 "작동적으로 연결된"은 프로테아제 폴리펩티드 및 비-프로테아제 폴리펩티드가 상호 프레임 내에서 융합됨을 가리키도록 의도된다. 비-프로테아제 폴리펩티드는 프로테아제 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

한 실시양태에서, 융합 단백질은 프로테아제 서열이 GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제) 서열의 N-말단에 융합된 GST-프로테아제 융합 단백질이다. 그러한 융합 단백질은 재조합 프로테아제 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 융합 단백질은 프로테아제 서열이 면역글로불린 G로부터 Fc 도메인의 N-말단에 융합된 Fc 융합물이다. 그러한 융합 단백질은 생체내 약역학적 성질을 증가시킬 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 융합 단백질은 그 N-말단에 이종성 신호 서열을 포함하는 프로테아제 단백질이다. 특정 숙주 세포들 (예컨대, 포유동물의 숙주 세포)에서, 프로테아제의 발현 및/또는 분비가 이종성 신호 서열에 사용을 통해 증가될 수 있다.

본 발명의 프로테아제 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 통상적 기술에 따라, 예컨대 라이게이션을 위해 블런트 말단 또는 엇갈린 말단을 이용하거나, 적당한 말단의 제공을 위해 제한효소 소화를 이용하거나, 바람직하지 못한 연결 및 효소적 라이게이션을 피하기 위해 적당한 알칼리성 포스파타제 처리로서 응집성 말단을 채워 넣음으로써, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편을 함께 프레임 내에서 라이게이션한다. 다른 한 실시양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속하여 어닐링 및 재증폭됨으로써 키메라 유전자 서열을 생성시킬 수 있는 2개의 연속적 유전자 단편들 간에 상보적 돌출을 일으키는 앵커 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다 (예컨대, Ausubel 등 (편저), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992를 참고함). 또한, 이미 융합 부분기 (예컨대, GST 폴리펩티드)를 코딩하는 많은 발현 벡터들이 시중 입수가능하다. 프로테아제-코딩 핵산은, 융합 부분기가 프로테아제 단백질로 플레임 내 연결되도록 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.

프로테아제 작용자 및 길항자

본 발명은 또한 프로테아제 작동자 (즉, 모방체) 또는 프로테아제 길항자로서 기능하는 프로테아제 단백질의 변종체에 관한 것이다. 프로테아제 단백질의 변종체는 변이유발 (예컨대, 구분되는 점돌연변이 또는 프로테아제 단백질의 절단)에 의해 생성될 수 있다. 프로테아제 단백질의 작동자는 자연 발생적 형태의 프로테아제 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나, 그것의 서브세트를 보유할 수 있다. 프로테아제 단백질의 길항자는 예를 들어, 프로테아제 단백질과 동일한 표적 단백질을 절단함으로써, 자연 발생적 형태의 프로테아제 단백질의 활성들 중 하나 이상을 억제할 수 있다. 이에 따라, 제한된 기능의 변종체를 이용한 처리에 의해, 특정 생물학적 효과가 도출될 수 있다. 한 실시양태에서, 자연 발생적 형태의 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 변종체로 대상을 처리하는 것은 자연 발생적 형태의 프로테아제 단백질을 이용한 치료에 비해, 대상에 대한 부작용이 덜하다.

아폽토시스

아폽토시스를 억제하는 방법

본 발명은 또한 아폽토시스를 억제하는 방법을 포함한다. 프로그래밍된 세포 죽음으로도 알려져 있는 아폽토시스는 발달, 노화 및 각종 병리 조건에 있어 역할을 담당한다. 발달 유기체에서, 척추 동물 및 무척추 동물의 양자 모두는 정상적 형태형성 공정의 일부로 특별한 때에 특별한 위치에서 세포가 사멸한다. 아폽토시스의 과정은 비제한적으로 수가지 이벤트를 그 특징으로 한다. 세포는 세포 접합 및 미세융모를 소실하고, 세포질은 응축하고, 핵 크로마틴은 수많은 분리된 덩어리들로 뭉쳐진다. 핵이 분열됨에 따라, 세포질이 당기고, 미토콘드리아 및 리보좀이 밀집하게 압착되게 된다. 소포체가 팽창하고, 그것이 플라즈막과 융합한 후, 세포는 수개의 막-결합 소낭, 즉 인접한 체에 의해 주로 포식되는 아폽토시스체로 파괴된다. 크로마틴이 올리고뉴클레오티드 단편으로 분해되는 것이 아폽토시스의 최종 단계의 특징이기 때문에, DNA 절단 패턴이 그것의 발생에 대한 생체외 검정법으로 사용될 수 있다 (Cory, Nature 367: 317-18, 1994).

한 측면에서, 본 발명은 아폽토시스를 억제하기 위해 치료적 유효량의 프로테아제-억제제를 대상에게 투여함으로써, 치료가 필요한 대상에게 아폽토시스-연관 장애를 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다. 대상은 예를 들어, 임의의 포유동물류, 예컨대 인간, 영장류 (인간), 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말 또는 돼지일 수 있다. 용어 "치료학적 유효"는 예를 들어, 사용되는 프로테아제- 억제제의 양이 아폽토시스-연관 장애를 약화시키기에 충분하다는 것을 의미한다.

아폽토시스 연관 장애는 예를 들어, AIDS/HIV을 포함하는 면역결핍 질병, 노령, 신경퇴행성 질병, 임의의 퇴행성 장애, 허혈성 재관류 세포 죽음, 급성 허혈성 손상, 불임, 상처 치료 등을 포함한다.

본원에 기재된 것들을 포함하는 아폽토시스의 측정을 위한 많은 방법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 비제한적으로 겔 전기영동 및 전자현미경에 의한 형태 관찰을 이용하는 DNA 사다리모양 형성의 정통적 방법들을 포함한다. 더욱 최근에 용이하게 사용되고 있는 아폽토시스 측정 방법이 유세포분류법이다. 유세포분류법은 아폽토시스성 세포에 대한 급속하고도 정량적인 측정을 가능하게 한다. 세포 내의 아폽토시스를 평가하기 위한 많은 상이한 유세포분류 방법들이 기술되어 왔다 (Darzynkiewicz 등, Cytometry 13: 795-808, 1992). 이 방법들 중 대부분은 각종 DNA 염료 (즉, 요오드화프로피듐 (PI), DAPI, Hoechst 33342)로 염색함으로써 세포내 아폽토시스 변화를 측정한다. 그러나 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TUNNEL) 또는 닉 번역 검정법을 이용하는 기술이 또한 개발되었다 (Gorczyca 등, Cancer Res 53: 1945-1951, 1993). 최근, 아폽토시스의 마커로서 세포 표면 상의 포스파티딜세린 노출을 검출하기 위해 안넥신 (Annexin) V를 사용하는 급속한 유세포분류 염색 방법이 시중 입수가능하게 되었다. 가장 최근의 유세포분류 검정법은 아폽토시스를 겪는 세포의 초기 마커인 카스파제-3 활성을 측정하고, 이 검정을 수행하기 위한 키트는 시중 입수가능하다 (Nicholson 등, Nature 376: 37-43, 1995).

프로테아제는 카스파제를 절단하기 위해 투여됨으로써 그 활성을 억제할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 카스파제-3을 절단하기 위해 투여될 수 있다. 프로테아제는 또한 아폽토시스, 예컨대 인간 사이토크롬 c, 인간 Apaf-1, 인간 카스파제-9, 인간 카스파제-7, 인간 카스파제-6, 인간 카스파제-2, 인간 BAD, 인간 BID, 인간 BAX, 인간 PARP, 또는 인간 p53과 관련되는 다른 단백질을 절단할 수도 있다. 이 단백질을 절단함으로써, 프로테아제는 그것을 불활성시킨다. 이 방식으로, 프로테아제는 아폽토시스를 억제하는데 사용될 수 있다.

다른 한 측면에서, 아폽토시스는 세포를 아폽토시스를 억제하기에 충분한 양으로 프로테아제와 접촉시킴으로써, 세포 내에서 억제된다. 프로테아제에 노출되는, 즉 프로테아제와 접촉되는 세포 집단은 임의의 수의 세포, 즉 하나 이상의 세포일 수 있고, 생체외, 생체내 또는 체외 제공될 수 있다. 세포는 프로테아제 단백질과 접촉되거나, 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된다.

아폽토시스 유도 방법

본 방법은 또한 아폽토시스의 유도 방법을 포함한다. 한 측면에서, 아폽토시스는 아폽토시스를 유도하는데 충분한 양으로 프로테아제를 투여함으로써 필요한 대상에게서 유도된다. 대상은 예컨대, 임의의 포유동물류, 예컨대 인간, 영장류 (인간), 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말 또는 돼지일 수 있다. 각종 측면들에서, 대상은 암 또는 자동면역 장애에 걸리기 쉽다.

프로테아제는 항-혈관형성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 항-혈관형성 화합물의 예는 비제한적으로 티로신 키나제 억제제, 표피-유래 성장인자 억제제, 섬유아세포-유래 성장인자 억제제, 혈소판-유래 성장인자 억제제, 기질 메탈로프로테아제 (MMP) 억제제, 인테그린 블록커, 인터페론 알파, 인터페론-유도성 단백질 10, 인터류킨-12, 펜토산 폴리술페이트, 시클로옥시게나제 억제제, 비스테로이드성 항염증성 (NSAID), 시클로옥시게나제-2 억제제, 카르복시아미도트리아졸, 테트라히드로코르티졸, 콤브레타스타틴 A-4, 스쿠알라민, 6-O-클로로아세틸-카르보닐)-푸마길롤, 탈리도미드, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 트로포닌-1, VEGF에 대한 항체, 혈소판 인자 4 또는 트롬보스폰딘을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로테아제는 화학치료적 화합물과 함께 추가 투여된다. 화학치료적 화합물의 예는, 비제한적으로 팍클리탁솔, 탁솔, 로바스타틴, 미노신, 타목시펜, 겜시타빈, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트 (MTX), 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 테니포시드, 에토포시드, 아드리아마이신, 에포틸론, 나벨빈, 캄포토테신, 다우노니비신, 닥티노마이신, 미톡산트론, 아마사크린, 에피루비신 또는 이다루비신을 포함한다.

다른 한 측면에서, 아폽토시스는 아폽토시스를 유도하기에 충분한 양으로 프로테아제와 세포를 접촉시킴으로써 세포 내에 유도된다. 프로테아제에 노출되는, 즉 프로테아제와 접촉되는 세포 집단은 임의의 수의 세포, 즉 하나 이상의 세포일 수 있고, 생체외, 생체내 또는 체외 제공될 수 있다. 세포는 프로테아제 단백질과 접촉되거나, 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된다.

일부 질병 상태는 감염된 세포에서의 아폽토시스의 결함 하향제어의 발달과 관련된다. 예를 들어, 종양은 세포 증식 신호가 부적절하게 세포 죽음 신호를 초과하는 아폽토시스-내성 상태로부터 적어도 부분적으로 초래된다. 또한, 에프스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스, 아프리칸 돼지 독감 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 일부 DNA 바이러스는 숙수 세포의 기구에 결착하여, 자체 복제를 유도한다. 또한, 림프증식성 상태와 같은 특정 질병 조건들, 약물 내성 암을 포함하는 암, 관절염, 염증, 자동면역 질병 등은 세포 죽음 제어의 하향제어로부터 초래될 수 있다. 그러한 질병 상태들에서, 아폽토시스 메카니즘을 촉진하는 것이 바람직하다.

도 1은 카스파제-3의 아미노산 서열의 모식도이며, 표는 카스파제-3의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 포함한다.
도 2는 효소의 불활성화 서열의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 보여주는 다이어그램과 함께, I99A/N218A 그랜자임 B에 의해 절단된 불활성화 서열에 초점을 둔 카스파제-3의 구조를 보여주는 X-선 결정학으로부터의 다이어그램이다.
도 3A는 야생형 그랜자임 B의 기질 특이성 대 (vs.) P2, P3 및 P4에서의 I99A/N219A 그랜자임 B의 기질 특이성을 보여주는 일련의 막대 그래프를 보여준다. 도 3B는 도 3A에서의 그래프로부터 유도된 역학적 데이터를 포함하는 표를 보여준다.
도 4는 야생형 및 I99A/N219A 그랜자임 B의 존재 하에서, 카스파제-3의 불활성화 서열에 상응하는 펩티드의 MALDI 질량분석으로부터 구해진 일련의 그래프이다.
도 5는 야생형 및 I99A/N219A 그랜자임 B에 의한 카스파제-3 작은 서브유닛의 절단생성물에 대한 밴드를 보여주는 SDS PAGE 겔을 나타낸다.
도 6A는 야생형 그랜자임 B 및 I99A/N219A 그랜자임 B의 존재 하에서 시간 경과에 따른 카스파제-3 활성을 플로팅하는 그래프를 보여준다. 도 6B는 야생형 및 I99A/N219A 그랜자임 B의 존재 하에서 카스파제-3의 활성에서의 Vmax를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다.
도 7A는 I99A/N218A 그랜자임 B의 존재 하에서 카스파제-3 활성에 의해 측정된 세포 용해물에서의 아폽토시스를 플로팅한 막대 그래프를 나타낸다. 도 7B는 야생형 및 증가하는 농도의 I99A/N218A 그랜자임 B의 존재 하에서 카스파제-3 활성에 의해 측정된 세포 용해물에서의 아폽토시스를 플로팅한 막대 그래프를 나타낸다.

실시예

실시예 1. I99A 그랜자임 B의 제조 및 저장

전술된 바와 같이, 야생형 래트 그랜자임 B 구축물을 제조하였다 (Harris 등, JBC, 1998, (273): 27364-27373). 하기 점돌연변이를 pPICZαA 플라스미드에 도입하였다: N218A, N218T, N218V, I99A, I99F, I99R, Y174A, Y174V. 5'AOX 및 3'AOX 영역에 프라이머로 시퀀싱한 후, X33 세포로 형질전환하고, 제오신 (Zeocin) [인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재]으로 선택함으로써, 각 변이를 확인하였다. 각 변종체의 발현 및 정제는 야생형 래트 그랜자임 B에 대해 전술된 방법과 동일하다 (Harris 등, JBC, 1998, (273): 27364-27373).

프로테아제 래트 그랜자임 B를 부위-지정 변이유발의 퀵체인지 (스트라타겐) 방법을 이용하여, Ile99에서 알라닌으로 변이시켰다. I99A 변이를 도입하는 DNA 프라이머는 하기와 같다: 전방 프라이머: CCA GCG TAT AAT TCT AAG ACA GCC TCC AAT GAC ATC ATG CTG (서열번호 3) 역방 프라이머: CAG CAT GAT GTC ATT GGA GGC TGT CTT AGA ATT ATA CGC TGG (서열번호 5). 야생형 이중 나선 DNA, 변이 중복의 2개의 프라이머, 반응 완충액, dNTP 및 DNA 폴리머라제가 관여하는 폴리머라제 사슬 반응을 행하였다. 30회의 어닐링 및 증폭 후에, 반응을 중단하였다. 효소 DpnI를 첨가하여, 변형된 염기쌍을 함유하는 야생형 DNA를 소화시켰고, 수득된 닉 DNA 나선은 세균으로 형질전환된다. 제오신 대항 선택은 단지 양성 클론만이 성장하도록 보장한다. 그랜자임 B 유전자를 시퀀싱함으로써 변이를 확인하였다. 나머지 그랜자임 B 변이체를 제조하기 위해, 동일한 프로토콜을 사용하였고, 변이유발원 프라이머에 적당한 변화를 가하였다.

변종체 그랜자임 B 프로테아제를 함유하는 DNA를 발행 프로토콜 (인비트로겐)을 이용하여 피치아 파스토리스 X33 세포로 형질변환시켰고, 양성 형질전환체를 제오신으로 선택하였다. 콜로니를 1 L 액체 배지에 옮겨, OD600=1.0 초과의 세포 밀도로 성장시켰다. 0.5% 메탄올을 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였고, 72시간동안 일정하게 유지시켰다. 변종체 프로테아제를 정제하기 위해, 배양액을 원심분리시켜, 상등액을 수집하였다. 중력에 기초하여, SP-세파로스 패스트 플로우 (SP-Sepharose Fast Flow) 양이온 교환 칼럼에 상등액을 적재하였다. 칼럼을 50 mM Mes, pH 6.0, 100 mM NaCl으로, 더욱 엄격하게는 50 mM MES, pH 6.0, 250 mM NaCl로 세척하였다. 단백질을 50 mM MES, pH 6.0, 1 M NaCl로 용리하였고, 칼럼을 50 mM MES, pH 6.0, 2 M NaCl 및 0.5 M NaOH로 세척하였다. 수득된 프로테아제는 순도가 < 90%이었다. 최종 프로테아제를 교환하였고, 50 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl로 농축하여, 4℃에서 저장하였다.

대안적으로, 정제에 이어, 각 변종체를 280 nm (e280=13000 M-1cm-1)에서의 흡광도에 의해 정량하고, 전술된 바와 같이 야생형 에코틴 또는 M84D 에코틴으로 적정하였으며, 50 mM MES, pH 6.0 및 100 mM NaCl의 완충액으로 교환하여, 4℃에서 저장하였다.

실시예 2. ACC 위치 스캐닝 라이브러리의 합성 및 선별

ACC -수지 합성

7-아미노쿠마린-4-아세트산을 Fmoc-Cl로 처리함으로써, 7-Fmoc-아미노쿠마린-4-아세트산을 제조하였다. 7-아미노쿠마린-4-아세트산 (10.0 g, 45.6 mmol) 및 H₂0 (228 ml)를 혼합하였다. NaHC0₃ (3.92 g, 45.6 mmol)을 소적분 첨가한 후, 아세톤 (228 ml)을 첨가하였다. 용액을 빙조로 냉각시키고, Fmoc-Cl (10.7 g, 41.5 mmol)을 1시간동안 교반 하에 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 용액을 하룻밤동안 교반하였다. 아세톤을 회전증발로써 제거하였고, 수득된 검질 고체를 여과 수집하여, 헥산의 수회 부분량으로 세척하였다. 링크 아미드 (Rink Amide) AM 수지를 7-Fmoc-아미노쿠마린-4-아세트산과 축합함으로써 ACC-수지를 제조하였다. 링크 아미드 AM 수지 (21 g, 17 mmol)를 DMF (200 ml)로 용매화하였다. 혼합물을 30분간 교반하고, 필터 캐뉼러로 여과시켰으며, 이 때 DMF (200 ml) 중 20% 피페리딘을 첨가하였다. 25분간 교반한 후, 수지를 여과하여 DMF로 세척하였다 (3 회, 각 회당 200 ml). 7-Fmoc-아미노쿠마린-4-아세트산 (15 g, 34 mmol), HOBt (4.6 g, 34 mmol) 및 DMF (150 ml)를 첨가한 후, 디이소프로필카르보디이미드 (DICI) (5.3 ml, 34 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 하룻밤동안 교반하고, 여과하여, 세척하였으며 (DMF, 200 ml로 3회; 테트라히드로푸란, 200 ml로 3회; MeOH, 200 ml로 3회), P₂0₅ 상에 건조시켰다. Fmoc 분석에 의해 결정되는 수지의 치환 수준은 0.58 mmol/g (> 95%)이었다.

P1 -다양성 라이브러리 합성

개별적 P1-치환 Fmoc-아미노산 ACC-수지 (~25 mg, 0.013 mmol)를 멀티켐 (MultiChem) 96-웰 반응 장치의 웰에 첨가하였다. 수지-함유의 웰을 DMF (0.5 ml)로 용매화하였다. 여과 후, DMF 중 20% 피페리딘 용액 (0.5 ml)을 첨가한 후, 30분간 교반하였다. 반응 블록의 웰을 여과하고, DMF로 세척하였다 (0.5 ml로 3회). 랜덤화 P2 위치를 도입하기 위해, Fmoc-아미노산 [4.8 mmol, 웰당 10 당량; Fmoc-아미노산, 몰%: Fmoc-Ala-OH, 3.4; Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 6.5; Fmoc-Asn(Trt)-OH, 5.3; Fmoc-Asp(O-t-Bu)OH, 3.5; Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH, 3.6; Fmoc-Gln(Trt)-OH, 5.3; Fmoc-Gly-OH, 2.9; Fmoc-His(Trt)-OH, 3.5; Fmoc-Ile-OH, 17.4; Fmoc-Leu-OH, 4.9; Fmoc-Lys(Boc)-OH, 6.2; Fmoc-Nle-OH, 3.8; Fmoc-Phe-OH, 2.5; Fmoc-Pro-OH, 4.3; Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH, 2.8; Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH, 4.8; Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3.8; Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH, 4.1; Fmoc-Val-OH, 11.3]의 등반응속도 혼합물을, DMF (10 ml) 중 DICI (390 ㎕, 2.5 mmol)로 및 HOBt (340 mg, 2.5 mmol)로 예비활성화시켰다. 용액 (0.5 ml)을 각 웰에 첨가하였다. 반응 블록을 3시간동안 교반하여, 여과하였고, DMF로 세척하였다(0.5 ml로 3회). 랜덤화 P3 및 P4 위치를 동일한 방식으로 혼입하였다. P4 아미노산의 Fmoc를 제거하고, 수지를 DMF로 세척하였으며 (0.5 ml로 3회), 0.5 ml의 DMF (10 ml) 중 AcOH (150 ㎕, 2.5 mmol), HOBt (340 mg, 2.5 mmol), 및 DICI (390 ㎕, 2.5 mmol)의 캡핑 용액으로 처리하였다. 4시간동안 교반한 후, 수지를 DMF (0.5 ml로 3회) 및 CH₂Cl₂ (0.5 ml로 3회)로 세척하여, 95:2.5:2.5 TFA/TIS/H₂O의 용액으로 처리하였다. 1시간동안 배양한 후, 반응 블록을 개방하여, 96-딥-웰 티터 플레이트에 두고, 웰을 부가적 절단 용액으로 세척하였다 (0.5 ml로 2회). 수집 플레이트를 농축시키고, 기질 함유의 웰 내의 물질을 EtOH (0.5 ml)로 희석하였으며, 2회 농축하였다. 개별 웰의 내용물을 CH₃CN/H₂0 혼합물로부터 동결건조시켰다. 각 웰 내의 기질의 총양은 단일 기질의 수율을 기초로 하여, 0.0063 mmol (50%)인 것으로 어림잡아 평가되었다.

P1 -고정 라이브러리 합성

수그램 양의 P1-치환 ACC-수지를 기재된 방법에 의해 합성할 수 있었다. Fmoc-아미노산-치환 ACC 수지를 96-웰 반응 블록의 57개 웰에 두었고: 서브-라이브러리는 19개 아미노산의 두 번째 고정 위치 (P4, P3, P2)에 의해 나타내어진다 (시스테인이 생략되었고, 노르류신이 메티오닌으로 치환됨). 기질의 합성, 캡핑 및 절단은 전 단락에 기재된 바와 동일하되, 단 등반응속도 혼합물이 아닌, P2, P3, 및 P4 서브-라이브러리, 개별 아미노산 (DMF 중 5 당량의 Fmoc-아미노산 단량체, 5 당량의 DICI 및 5 당량의 HOBt)이 공간 위치지정된 P2, P3, 또는 P4 위치에 혼입되었다.

완전한, 다양하고 P1-고정된 조합 라이브러리의 제조가 상술한 바와 같이 수행되었다. 라이브러리를 최종 농도 250 μM로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 변종체 프로테아제를 그랜자임 활성 완충액 (50 mM Na Hepes, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.01% Tween-20)에서 50 nM 내지 1 μM의 농도로 희석하였다. Ac-IEPD-AMC에 대한 초기 활성을 이용하여, 변종체 프로테아제 농도를 50 nM 야생형 래트 그랜자임 B와 대략 동일한 농도로 조정하였다. P1-Asp 라이브러리에서의 효소적 활성을 스펙트라-맥스 델타 (Spectra-Max Delta) 플루오리미터 (회사명) 상에 30℃에서 1시간동안 검정하였다. 여기 및 방출을 380 nm 및 460 nm에서 각기 측정하였다.

실시예 3. I99A 그랜자임 B의 개별적 동역학 측정

스펙트라-맥스 델타 플루오리미터를 이용하여, 개별 동역학 측정을 수행하였다. 각 프로테아제를 검정 완충액에서 50 nM 내지 1 μM로 희석하였다. 모든 ACC 기질들을 MeSO로써 5 내지 500 μM로 희석하였고, 한편 AMC 기질을 20 내지 2000 μM로 희석하였다. 각 검정은 5% 미만의 MeSO를 포함하였다. 각기 380 nm 및 460 nm의 여기 및 방출 파장에서 매 15초마다, 총 10분동안 효소적 활성을 모니터링하였다. 모든 검정을 1% DMSO에서 수행하였다.

이 방법을 이용하여, I99A 그랜자임 B를 선별하였다. 변이의 효과를 결정하기 위해, 위치 스캐닝 조합 기질 라이브러리에서 I99A 그랜자임을 프로파일링하였다. 상술한 바대로 라이브러리를 제조하여, 최종 농도 250 μM로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 변종체 프로테아제를 그랜자임 활성 완충액 (50 mM Na Hepes, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.01% Tween-20)에서 50 nM 내지 1 μM의 농도로 희석하였다. Ac-IEPD-AMC에 대한 초기 활성을 이용하여, 변종체 프로테아제 농도를 50 nM 야생형 래트 그랜자임 B와 대략 동일한 농도로 조정하였다. P1-Asp 라이브러리에서의 효소적 활성을 스펙트라-맥스델타 플루오리미터 상에 30℃에서 1시간동안 검정하였다. 여기 및 방출을 380 nm 및 460 nm에서 각기 측정하였다. 그랜자임 B 변종체의 프로파일을 야생형 프로파일과 비교하여, 차이를 결정하였다. I99A 변이체의 경우, 예를 들어, P2 아미노산의 특이성이 야생형에서 현저하게 변화되었다. 전자의 프롤린에 대한 광범위한 약한 선호도가, Phe 및 Tyr와 같은 소수성 잔기에 대한 강한 선호도로 대체되었다. 변종체 프로테아제의 선택도도 또한 변화되었다. 야생형은 P2 하위부위에서 임의의 아미노산을 함유하는 기질을 가수분해함에 따라, 그 부위에서 무분별하였다. I99A 프로테아제가 훨씬 더 선택적이다. P2 부위에서의 Phe가 임의의 다른 아미노산보다 더 큰 정도로 선호된다 (상기 표 5 참고).

실시예 4. 종양 괴사 인자 및 종양 괴사 인자 수용체의 단백질분해 절단 및 불활성화

수용체 절단

새로 단리된 호중구 (PMN)를 0.2% 소태아 혈청 (FCS)과 함께 RPMI 1640 내에 1×10⁷ 세포/ml로 재현탁시키고, TNF-R1 또는 TNF-R2의 경상부 영역에 대해 특이적인, 각종 농도의 프로테아제와 함께 배양하였다. 37℃에서 1 내지 40분간 배양한 후, 프로테아제 억제제를 첨가하여 반응을 중단시켰으며, 배지에 방출된 TNF-R의 양을 ELISA (Roche)를 이용하여 정량하였다.

TNF 의 절단

¹²⁵I-TNF (40,000 cpm)를 변화하는 농도의 프로테아제와 함께 배양한 후, 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 비등시켰고, 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 조사하였다. 겔을 건조시키고, -70 ℃에서 x-선 필름 [코닥 (Kodak)]에 노출시켰다.

TNF 결합 검정

¹²⁵I-TNF 또는 PMN를 상기와 같은 변화하는 농도의 프로테아제와 함께 배양하였다. 정상 PMN에 대한, 프로테아제에 노출된 ¹²⁵I-TNF의 결합, 또는 프로테아제에 노출된 PMN에 대한 정상 ¹²⁵I-TNF의 결합을, 섬광법을 이용하여 측정하였다. 간략히, 10⁵ 개 세포들을 프로테아제 억제제의 존재 하에 96-웰 플레이트 [밀리포어 (Millipore)]에서 변화하는 농도의 ¹²⁵I-TNF와 함께 배양하였다. 이어서, 세포들을 진공흡인법으로 3회 세척한 후, 30 ㎕의 섬광 유체 (Wallac)를 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 섬광을 왈락 마이크로베타 (Wallac Microbeta) 섬광계수기로 계수하였다 (van Kessel 등, J. Immunol. (1991) 147: 3862-3868 및 Porteau 등, JBC (1991) 266: 18846-18853에서 인용).

실시예 5. 프로테아제 파지 디스플레이를 이용한, 펩티드 서열 특이적 표적 절단이 가능한 효소의 선택

파지미드를 (i) M13 파지 형태발생에 필요한 모든 유전자들을 담지하고; (ii) 파지 기원과 상호작용하여 단일나선 DNA의 제조를 개시하는 팩키징 신호를 담지하며; (iii) 복제의 파괴된 파지 기원을 담지하고; (iv) 암피실린 내성 유전자를 담지하도록 구축하였다.

복제의 비효율적 파지 기원과 복제의 비변형 플라스미드 기원의 조합은 파지보다는 플라스미드 (RF, 복제 형태, DNA)로서 숙주 세균 내에서 벡터의 전파를 우선한다. 그러므로 숙주를 죽이지 않고 그것이 유지될 수 있다. 또한, 플라스미드 기원을 포함한다는 것은, 그것이 파지미드의 효율적인 파지 유사 전파와 독립적으로 복제할 수 있다는 것을 의미한다. 암피실린 내성 유전자에 의해, 벡터가 증폭될 수 있어, 이는 다시 파지미드 DNA의 파지 입자로의 팩키징을 증가시킨다.

유전자 3 또는 유전자 8 M13 코트 단백질로의 프로테아제 유전자의 융합을, 표준 클로닝 방법을 이용하여 구축할 수 있다 [Sidhu, 효소학 방법 (Methods in Enzymology), 2000년, V328, p333]. 이어서, 프로테아제 코딩의 유전자 내에서의 변종체들의 조합 라이브러리를 p3 또는 p8 M13 코트 단백질에 대한 융합으로서 M13의 표면상에 발현하고, 당해 표적 절단에 상응하는, 고정화된 알데히드 함유의 펩티드에 대해 패닝하였다. 알데히드 부분기는 프로테아제의 절단성 결합을 절단하는 프로테아제의 능력을 억제하나, 이 부분기는 펩티드의 프로테아제 인식을 간섭하지 않는다. 고정화 표적 펩티드에 대한 특이성을 갖는 변종체 프로테아제-발현 파지는 표적 펩티드 코팅된 플레이트에 결합하게 되고, 반면 비특이적 파지는 세척되어 제거된다. 연속적으로 수회패닝을 통해, 표적 서열에 대한 증진된 특이성을 갖는 프로테아제가 단리될 수 있다. 이어서, 표적 서열이 알데히드 없이 합성될 수 있고, 펩티드의 특이적 가수분해를 대해, 단리된 파지를 시험할 수 있다.

실시예 6. 라이브러리의 합성 및 형광 선별

A. P1 -다양성 라이브러리

A(i). 합성

개별적 P1-치환 Fmoc-아미노산 ACC-수지 (약 25 mg, 0.013 mmol)를 멀티-켐 96-웰 반응 장치의 웰에 첨가하였다. 수지 함유의 웰을 DMF (0.5 mL)로 용매화하였다. 20% 피페리딘의 DMF 용액 (0.5 mL)을 첨가한 후, 30분간 교반하였다. 반응 블록의 웰을 여과하여, DMF (3×0.5 mL)로 세척하였다. 랜덤화 P2 위치를 도입하기 위해, Fmoc-아미노산 (4.8 mmol, 10 당량/웰; Fmoc-아미노산, 몰%: Fmoc-Ala-OH, 3.4; Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 6.5; Fmoc-Asn(Trt)-OH, 5.3; Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OH, 3.5; Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH, 3.6; Fmoc-Gln(Trt)-OH, 5.3; Fmoc-Gly-OH, 2.9; Fmoc-His(Trt)-OH, 3.5; Fmoc-Ile-OH, 17.4; Fmoc-Leu-OH, 4.9; Fmoc-Lys(Boc)-OH, 6.2; Fmoc-Nle-OH, 3.8; Fmoc-Phe-OH, 2.5; Fmoc-Pro-OH, 4.3; Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH, 2.8; Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH, 4.8; Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3.8; Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH, 4.1; Fmoc-Val-OH, 11.3)의 등반응속도 혼합물(Ostresh, J. M. 등, (1994) Biopolymers 34: 1681-9)을, DMF (10 mL) 중에서 DICI (390 ㎕, 2.5 mmol) 및 HOBt (340 mg, 2.5 mmol)와 함께 예비활성화시켰다. 용액 (0.5 mL)을 각 웰에 첨가하였다. 반응 블록을 3시간동안 교반하고, 여과하여, DMF (3회, 0.5 mL)로 세척하였다. 랜덤화 P3 및 P4 위치를 동일한 방식으로 혼입하였다. P4 아미노산의 Fmoc를 제거하고, 수지를 DMF로 세척하여 (3×0.5 mL), DMF (10 mL) 중 AcOH (150 ㎕, 2.5 mmol), HOBt (340 mg, 2.5 mmol) 및 DICI (390 ㎕, 2.5 mmol)의 캡핑 용액 0.5 mL로 처리하였다. 4시간 동안의 교반 후에, 수지를 DMF (3×0.5 mL), CH₂Cl₂ (3×0.5 mL)로 세척하고, 95:2.5:2.5 TFA/TIS/H₂O의 용액으로 처리하였다. 1시간 동안 배양한 후, 반응 블록을 개방하여, 96-딥-웰 티터 플레이트에 두고, 웰을 부가적 절단 용액으로 세척하였다 (2×0.5 mL). 수집 플레이트를 농축시키고, 기질 함유의 웰 내의 물질을 EtOH (0.5 ml)로 희석하였으며, 2회 농축하였다. 개별 웰의 내용물을 CH₃CN/H₂0 혼합물로부터 동결건조시켰다. 각 웰 내의 기질의 총양은 단일 기질의 수율을 기초로 하여, 0.0063 mmol (50%)인 것으로 어림잡아 평가되었다.

A ( ii ). 라이브러리의 효소적 검정

단백질분해 효소의 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다 (Gill, S. C. 등, (1989) Anal. Biochem. 182: 319-26). 촉매적으로 활성인 트롬빈, 플라스민, 트립신, uPA, tPA 및 키모트립신의 분율을 MUGB 또는 MUTMAC를 이용한 활성-부위 적정에 의해 정량하였다 (Jameson, G. W. 등, (1973) Biochemical Journal 131: 107-117).

PS-SCL로부터의 기질을 DMSO에 용해시켰다. 대략 1.O×lO^-9 mol의 각 P1-Lys, P1-Arg, 또는 P1-Leu 서브-라이브러리 (361개 화합물)를 96-웰 마이크로플루오르 플레이트 (Dynex Technologies, 미국 버지니아주 챈틸리 소재)의 57개 웰에 0.1 μM의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 대략적으로, 1.O×lO^-10 mol의 각 P1-다양성 서브-라이브러리 (6859개 화합물)을 각 화합물 내의 최종 농도가 0.01 μM이 되도록 96-웰 플레이트의 20개 웰에 첨가하였다. 효소 (0.02 nM - 100 nM)의 첨가에 의해 가수분해 반응을 개시하였고, 380 nm에서 여기하고, 450 mm 또는 460 nm에서 방출하는 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) LS50B 발광 분광기를 이용하여 형광측정법으로 모니터링하였다. 세린 프로테아제의 검정을, 50 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.5 mM CaCl₂, 0.01% Tween-20, 및 1% DMSO (기질로부터)을 함유하는 완충액에서 25℃에서 수행하였다. 시스테인 프로테아제, 파파인 및 크루자인의 검정을 100 mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij-35, 및 1% DMSO (기질로부터)을 함유하는 완충액에서 25℃에서 수행하였다.

B. 137.180 기질 서열의 P1 -다양성 라이브러리를 이용한 프로테아제의 프로 파일링

기질 서열 내에서의 P1-부위에 대한 모든 아미노산의 부착 가능성을 시험하기 위해, P1-다양성 테트라펩티드 라이브러리를 생성시켰다. P1-다양성 라이브러리는 20개 웰로 구성되며, 이 중에서 단지 P1-위치만이 시스테인을 제외하고, 노르류신을 포함하는 모든 아미노산으로서 계통적으로 일정하게 유지된다. P2, P3, 및 P4 위치는 웰당, 총 6,859개 기질 서열에 대한 모든 아미노산들의 동몰 혼합물로 구성된다. 수개의 세린 및 시스테인 프로테아제를 프로파일링하여, 최적 P1 아미노산의 동정을 위해, 상기 라이브러리의 적용을 시험한다. 키모트립신은 큰 소수성 아미노산에 대한 기대되었던 특이성을 나타냈다. 트립신 및 트롬빈은 P1-염기성 아미노산에 대한 선호도 (Arg > Lys)를 나타냈다. 플라스민도 또한 염기성 아미노산에 대한 선호도 (Lys > Arg)를 나타냈다. P1-Asp 특이성을 가지는 것으로 유일하게 알려진 포유동물의 세린 프로테아제인 그랜자임 B는 다른 산성 아미노산, Glu를 포함하는 모든 다른 아미노산들에 비해 아스파르트산에 대한 뚜렷한 선호도를 나타냈다. 인간 호중구 엘라스타제에 대한 P1-프로파일은 알라닌 및 발린에 대한 정준 선호도를 가진다. 시스테인 프로테아제, 파파인 및 크루자인은 아르기닌에 대한 크지 않은 선호도를 가지나, 광범위한 P1-기질 서열 특이성을 나타냈다.

실시예 7. 개별적 기질의 절단에 대한 선별

기질 라이브러리에 의해 결정 시에, 원하는 특이성 프로파일링과 매칭되는 변이체 프로테아제는 원하는 절단 서열에 상응하는 개별적 펩티드 기질을 이용하여 검정된다. 개별적 동역학 측정을 스펙트라-맥스 델타 플루오리미터 (Molecular Devices)를 이용하여 수행한다. 각 프로테아제를 50 nM 내지 1 μM로 희석한다. 모든 ACC 기질들을 MeSO를 이용하여 5 내지 500 μM로 희석하고, 한편 AMC 기질은 20 내지 2000 μM로 희석한다. 각 검정은 5% 미만의 MeSO를 함유한다. 효소적 활성을 각기 380 nm 및 460 nm의 여기 및 발광 파장에서 매 15초마다, 총 10분동안 모니터링한다. 모든 검정을 1% DMSO 중에서 수행한다.

실시예 8. 전장 단백질의 절단에 대한 선별

변종체 프로테아제를 검정하여, 그것이 전장 단백질의 영역에서 존재할 때, 원하는 서열을 절단하는지 확인하고, 표적 단백질의 활성을 검정하여, 그것의 기능이 절단 이벤트에 의해 파괴되었는지 증명한다. 변종체 프로테아제와 정제된 전장 단백질을 함께 배양한 후, SDS-PAGE에 의해 절단 이벤트를 모니터링하였다. 단백질을 방사성 라벨링 단백질을 이용하는 자가방사기록법에 의해, 또는 적당한 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅 (Western blot)법에 의해, 표준 쿠마지 블루 염색법을 이용하여 가시화하였다. 대안적으로, 표적 단백질이 세포 표면 수용체인 경우, 표적 단백질을 발현하는 세포를 변종체 프로테아제에 노출한다. 세포를 분해한 후, SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리하고, 이어서 웨스턴 블로팅법으로 가시화함으로써 절단 이벤트를 모니터링한다. 대안적으로, 단백질분해에 의해 방출된 가용성 수용체를 ELISA로 정량한다.

종양 괴사 인자 수용체 1 및 2 (TNF-R1 및 TNF-R2)의 절단을 이 기술을 이용하여 측정하였다. 새로 단리된 호중구 (PMN)를 0.2% 소태아 혈청 (FCS)과 함께 RPMI 1640 내에 1×10⁷ 세포/ml로 재현탁시키고, TNF-R1 또는 TNF-R2의 경상부 영역에 대해 특이적인, 각종 농도의 프로테아제와 함께 배양하였다. 37℃에서 1 내지 40분간 배양한 후, 프로테아제 억제제를 첨가하여 반응을 중단시켰으며, 배지에 방출된 TNF-R의 양을 ELISA (Roche)를 이용하여 정량하였다.

본 발명은 표적 폴리펩티드 서열을 절단할 수 있는 효소의 제조 및 이용을 위한 특정 방법에 대해 기술하였으나, 본 발명의 영역을 벗어나지 않는 한, 각종 변화 및 변형이 가능할 수 있음이 명백하다.

TNF 의 절단

¹²⁵I-TNF (40,000 cpm)를 변화하는 농도의 프로테아제와 함께 배양한 후, 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 비등시켰고, 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 조사하였다. 겔을 건조시키고, -70 ℃에서 x-선 필름 (코닥사)에 노출시켰다.

TNF 결합 검정

¹²⁵I-TNF 또는 PMN를 상기와 같은 변화하는 농도의 프로테아제와 함께 배양하였다. 정상 PMN에 대한, 프로테아제에 노출된 ¹²⁵I-TNF의 결합, 또는 프로테아제에 노출된 PMN에 대한 정상 ¹²⁵I-TNF의 결합을, 섬광법을 이용하여 측정하였다. 간략히, 10⁵ 개 세포들을 프로테아제 억제제의 존재 하에 96-웰 플레이트 (밀리포어)에서 변화하는 농도의 ¹²⁵I-TNF와 함께 배양하였다. 이어서, 세포들을 진공흡인법으로 3회 세척한 후, 30 ㎕의 섬광 유체 (왈락)를 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 진동을 왈락 마이크로베타 섬광 계수기로 계수하였다 (van Kessel 등, J. Immunol. (1991) 147: 3862-3868 및 Porteau 등, JBC (1991) 266: 18846-18853에서 인용).

실시예 9. 표적 단백질 및 그 단백질 내의 절단 부위의 동정

절단 및 불활성 표적의 단백질을 하기 기준에 의해 동정한다: 1) 단백질은 병변과 관련됨; 2) 단백질이 병변 치료를 위한 개입의 결정적 기점이라는 강한 증거가 있음; 3) 단백질의 단백질분해 절단이 가능히 그 기능을 파괴할 수 있음. 표적 단백질 내의 절단 부위는 하기 기준에 의해 동정된다: 1) 그것이 단백질의 노출 표면 상에 위치함; 2) 그것이 원자적 구조 또는 구조 예측 알고리즘에 의해 결정 시에 이차구조 (즉, β시이트나 α나선)가 없는 영역에 위치함 (이 영역은 세포 표면 수용체 상의 단백질 또는 경상부의 표면 상의 루프인 경향이 있음); 3) 그것이 공지된 기능에 기초하여, 단백질을 가능히 불활성화시킬 수 있는 부위에 위치함. 절단 서열은 예컨대 많은 세린 프로테아제의 확장된 기질 특이성에 매칭되도록 4개 잔기의 길이를 가지나, 더 길거나 더 짧을 수 있다.

종양 괴사 인자 및 종양 괴사 인자 수용체

종양 괴사 인자 (TNF)는 단핵세포, 마크로파지 및 림프구세포에 의해 주로 생성되는 염증전 사이토킨이다. TNF는 2개의 표면 결합 수용체, 즉 p55 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R1) 및 p75 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R2) 중 하나와 상호작용함으로써 신호 전달을 개시한다. TNF는 류마티스성 관절염 (RA)의 병태생리학 부분에서 중심적 역할을 하고, RA와 함께 고농도의 활액막 및 활액이 환자에게서 발견된다. TNF 신호전달 이벤트는 염증전 사이토킨 (I1-1, I1-6, GM-CSF)의 생성을 초래하고, 콜라게나제 및 스트로멜리신과 같은 메탈로프로테이나제의 생성을 유도하며, 파골세포의 증식 및 활성을 증가시키며, 이 모든 이벤트들은 활막염 및 조직과 골의 파괴를 가져온다. 양 유형 모두의 TNF 수용체가 리간드 결합 능력을 보유하는 가용성 형태로 세포의 표면으로부터 유출된다. 이 가용성 TNFR는 생체외 및 생체내에서 모두 TNF 활성을 중성화시킬 수 있고, TNF 신호전달을 억제시키는 천연 억제제로서 작용하는 것으로 사료된다.

VEGFR

혈관내피세포 성장인자 (VEGF)는 배아생성 및 성장 라이프 동안 정상적으로 생성된 내피세포의 세포-특이적 미토겐이다. VEGF는 종양 발달을 포함하는, 다양한 정상적 및 병리학적 과정에서 신생혈관생성의 상당한 중재자이다. 종양 혈관화는 그것이 전이되어 나오게 하는 단계로 종양이 진행함에 있어 중요한 과정이다. VEGF에 대한 3개의 고친화성 동계 (cognate) 수용체가 동정되었다: VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/KDR, 및 VEGFR-3/Flt-4. VEGFR는 혈관 발달동안 신호전달 분자로서 기능하는 세포 표면 수용체 티로신 키나제이다.

EGFR 및 HER -2

ErbB 부류의 수용체 티로신 키나제는 4개의 구성원을 포함한다: EGFR(Her-1), ErbB2 (Her-2), ErbB3 (Her-3) 및 ErbB4 (Her-4). 이 모두는 정상적 발달에 필수적이고, 정상 세포의 기능에 관여한다. ErbB 수용체, 특히 EGFR 및 ErbB2는 특정의 주된 형태의 인간 암에서 통상적으로 탈제어된다. ErbB 신호전달의 제어장애가 유전자 증폭, 수용체 전사를 증가시키는 변이, 또는 수용체 활성을 증가시키는 변이를 포함하는 각종 메커니즘들에 의해 일어난다. 표피 성장인자 (EGF)의 결합을 통한 ErbB 수용체의 활성화는, 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 및 Akt/포스포이노시티드 3-키나제 (PI3-키나제) 경로를 통한 하향류 신호전달을 초래하며, 이는 궁극적으로 세포 증식, 분화 및 신생혈관생성을 가져온다.

잠재성 단백질분해 절단 부위

상기 단백질에 대한 단백질분해 절단 부위가 하기 표 7에 나와있다.

[표 7]

실시예 11. 그랜자임 B I99A / N218A 변이체의 절단 프로파일

도 1은 많은 세포 유형들의 아폽토시스 경로와 관련된 단백질인 카스파제-3의 서열을 보여준다. 야생형 그랜자임 B는 각기 잔기 175 및 176에 있는 아스파테이트 및 세린의 사이에 있는 카스파제 3을 절단한다. 그랜자임 B의 위치 99 및 218에서의 변이는 각기 잔기 263 및 264의 아스파테이트 및 알라닌의 사이를 절단하는 상기 프로테아제의 특이성을 변화시킨다.

도 2는 잔기 260 - 265에 있는 I99A/N218A 그랜자임 B에 의해 절단되는 불활성화 서열 (서열번호 2)에 초점을 둔 카스파제-3의 결정학적 모델을 보여준다. PS-SCL 라이브러리에서의 P2, P3 및 P4 위치에서의 잔기를 변화시키면서, 그에 따른 변이된 그랜자임 B의 특이성이 도 3A에 나와있다. P4-P3-P2-Asp-AMC 형태의 PS-SCL 라이브러리를 야생형 및 N218A/I99A 그랜자임 B로 검정하였고, 각 위치에서의 기질 특이성을 아미노산으로 플로팅한다. 변이체는 야생형의 프롤린보다 P2 위치에서의 페닐알라닌에 대한 5배 더 큰 선호도를 나타냈다 (도 3B). 또한, 변이체는 야생형이 일반적으로 단지 이소류신 및 발린만을 수용하는 P4 위치에서 페닐알라닌 및 류신을 포함하는 큰 소수성 아미노산을 수용한다.

도 4는 MALDI 질량분광법에 의한, 카스파제-3의 잔기 260 - 265로 구성되는 카스파제-3 불활성화 서열인 NH₂-FSFDAT-COOH (서열번호 2)의 절단을 보여준다. 불활성화 서열을 18시간동안 100 nM 야생형 그랜자임 B 또는 1 μM I99A/N218A와 함께 배양하였다. 첫 번째 패널은 펩티드 단독의 분자량을 나타낸다. 비절단 펩티드의 올바른 분자량을 나타내는 피크가 나와 있다. 두 번째 패널은 야생형 그랜자임 B와 혼합된 펩티드의 결과를 보여준다. 피크는 다시, 야생형 그랜자임 B이 펩티드를 절단하지 않음을 나타내는, 비절단 펩티드의 올바른 분자량을 나타낸다. 세 번째 패널은 N218A/I99A 변이체 그랜자임 B를 이용한 펩티드의 결과를 보여준다. 여기에서, 피크는 절단된 펩티드에 대해, 538.04에서 절단 생성물 (이는 적당한 크기 (538 Da)의 절단 생성물을 나타냄)을 나타내도록 이동하였다. 변이체 그랜자임 B는 펩티드를 효율적으로 절단한다.

도 5는 SDS-PAGE 겔 상에서 일어나는 3가지 개별적 반응의 결과를 보여준다. 대략 50 μM의 카스파제-3을 함유하는 3개의 개별적 튜브를, 래인 1: 완충액 단독; 래인 2: 야생형 그랜자임 B; 래인 3: 그랜자임 B I99A/N218A의 존재 하에 배양하였다. 각 반응을 2X SDS 샘플 완충액의 첨가로써 종결시킨 후, 95℃로 가열하여, 트리신 겔 상에 반응시켰다. 첫 번째 래인은 카스파제-3 단독을 나타낸다. 두 번째 래인은 야생형 그랜자임 B를 갖는 카스파제-3을 나타낸다. 세 번째 래인은 변이체 그랜자임 B를 갖는 카스파제-3을 나타낸다. 변이체는 카스파제-3의 작은 서브유닛을 절단시킬 수 있다.

I99A/N218A 그랜자임 B가 전장 카스파제-3을 절단하여 불활성화시켰다. 정제된 카스파제-3 (2 μM)을 프로테아제없이, 또한 100 nM의 야생형 그랜자임 B, 또는 1 μM의 I99A/N218A 그랜자임 B와 함께 그랜자임 B 활성 완충액에서 18시간동안 배양하였다. 10 ㎕의 각 반응액을 90 ㎕의 카스파제-3 활성 완충액에서 희석하였고, 카스파제-3 활성을 Ac-DEVD-AMC의 절단에 의해 검정하였다. 도 6A는 시간에 대해 플로팅한 카스파제-3 활성의 그래프를 나타낸다. I99A/N218A 그랜자임 B는 카스파제-3을 매우 낮은 수준의 활성으로 불활성화시켰다. 야생형 그랜자임 B는 대조군에 비해 더욱 카스파제-3을 불활성화시켰으나, 변이체가 카스파제-3 활성에 대해 갖는 영향을 없었다. 이는 또한 도 6B에 나와 있고, 거기에서 카스파제-3 활성의 Vmax는 도 6A에 나와 있는 데이터로부터 유도되는 것으로 나와 있다. 변이체 그랜자임 B의 존재 하에서의 Vmax는 대략 0이고, 거기에서 야생형만이 대조군에 상대적인 Vmax를 가진다.

변이체 그랜자임 B는 또한 카스파제-3 활성 및 카스파제-3 함유의 세포 용해물에서의 아폽토시스를 억제하는데 효과적이다. 도 7A에서, 지시량의 I99A/N218A 그랜자임 B를 세포 용해물에 첨가하여, 18시간동안 배양하였다. 이어서, 형광유발 기질 (Ac-DEVD-AMC)을 최종 농도 200 μM이 되도록 첨가하여, 카스파제-3 활성을 검정하였다. 낮은 농도에서는, 변이체가 활성화 서열 (서열번호 4)에서의 절단에 의해 카스파제-3을 활성화시키나, 고농도에서는 그것이 불활성화 서열에서의 절단에 의해 카스파제-3을 억제한다. 이에 따라, I99A/N218A 그랜자임 B는 낮은 농도에서는 아폽토시스를 유도하나, 높은 농도에서는 아폽토시스를 억제한다. 도 7A는 I99A/N218A 변이체 그랜자임 B의 농도 증가에 따라 카스파제-3 활성을 플로팅한 것이다. 세포 용매물 중에서의 변이체 그랜자임 B의 농도가 증가함에 따라, 카스파제-3 활성이 감소하였다.

지시량의 I99A/N218A 그랜자임 B와 함께 또는 그것없이, 활성화 서열에서의 절단에 의해 카스파제-3을 활성화하는 100 nM의 야생형 그랜자임 B를 첨가함으로써, 세포 용해물에서 아폽토시스를 유도하였고, 18시간동안 배양하였다. 카스파제-3 활성을 Ac-DEVD-AMC의 절단에 의해 검정하였다. I99A/N218A 그랜자임 B에 의해 유도된 배경 카스파제-3 활성에 대해 데이터를 정규화하였다. 100 nM의 야생형 그랜자임 B를, 도 7B에 나와 있는 바와 같이, 증가하는 농도의 I99A/N218A 그랜자임 B와 함께 또는 그것없이, 모든 샘플 내에서의 세포 추출물에 첨가하였다. 도 7B에 나와 있는 바와 같이, 변이체 그랜자임 B는 카스파제-3의 불활성화에 의해 아폽토시스를 유도하는 야생형 그랜자임 B의 효과에 길항작용하였다. 도 7B는 100 nM 야생형 그랜자임 B의 존재 하에서 변이체 그랜자임 B의 농도를 변화함에 따른 카스파제-3 활성의 분율을 나타내는 그래프를 보여준다. 변이체 그랜자임 B의 농도가 증가함에 따라, 카스파제-3 활성이 야생형 그랜자임 B가 단독 존재하는 경우에서의 수준 미만으로 감소하였다.

등가물

특별한 실시양태들이 본원에 상세하게 개시되었으나, 이는 단지 설명하기 위한 목적으로 예시적으로 이루어진 것으로서, 이후 첨부된 특허청구범위의 영역에 대해 비제한적인 것으로 의도된다. 특히, 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않는 한, 각종 치환, 변경 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 숙고된다. 선별 방법, 프로테아제 골격, 또는 라이브러리 유형의 선택은, 본원에 기재된 실시양태에 관한 지식을 가진 당업자에게 통상의 일인 것으로 사료된다. 그에 따른 다른 측면들, 이점들 및 변형들은 하기 특허청구범위의 영역 내에 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (37)

1. 프로테아제 골격의 기질 선택성에 기여하는 S1 내지 S4 영역 내 하나 이상의 아미노산 위치에서 변이를 포함하는 변형된 프로테아제 또는 이의 생물학적 활성 부분으로서,
   변형된 프로테아제는 단백질분해 활성을 보유하고;
   프로테아제 골격은 키모트립신; 플라스민; 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 (uPA); 막형 세린 프로테아제-1 (MTSP-1); 엘라스타제; 키마제; 호중구 엘라스타제; 혈장 칼리크레인; 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제; 카텝신 G; 보체 인자 세린 프로테아제; 푸린; 그랜자임 A, 그랜자임 M; 인간형 테스티신 (PRSS21); 트립타제 베타 1 (TPSB1); 칼리크레인 hK5 (KLK5); 코린; 칼리크레인 12 (KLK12); DESC1 프로테아제; 트립타제 감마 1 (TPSG1); 칼리크레인 hK14 (KLK14); 히알루로난-결합 세린 프로테아제; 막투과 프로테아제 세린 4 (TMPRSS4); 트립타제 델타 (TPSD1); 마랍신; 트립타제 동종체 2; 트립타제 동종체 3; 트립타제 염색체 21; 막투과 프로테아제 세린 3 (TMPRSS3); 칼리크레인 hK15; 메르네임-AA031 펩티다제; 막형 모자이크 세린 프로테아제; 메르네임-AA038 펩티다제; 메르네임-AA128 펩티다제; 양이온성 트립신 (PRSS1); 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제-3; 마이엘로블라스틴 PRTN3; 트립타제 알파; 그랜자임 K; 그랜자임 H; 키모트립신 B; 췌장 엔도펩티다제 E; 엔테로펩티다제 키모트립신 C; 프로스타신; 칼리크레인 1; 칼리크레인 hK2; 칼리크레인 3; 메소트립신; 보체 인자 D; 보체 성분 활성화 C1r; 보체 성분 활성화 C1s; 보체 성분 2 (C2); 보체 인자 B; 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제 1 (MASP1): 보체 인자 I; 췌장 엔도펩티다제 E 형태 B (B); 췌장 엘라스타제 II 형태 B; 아크로신; 헵신; 간세포 성장 인자 활성화제; 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제 2; 뉴로신; 뉴로트립신; 트립타제 베타 2 (I); 트립타제 베타 2 (2); 뉴롭신; 칼리크레인 (hK10); 에피텔리아신 (TMPRSS2); 프로스타제; 뇌 세린 프로테아제 2; 키모파신; 칼리크레인 11; 음이온성 트립신 (II); LOC144757 펩티다제; 메르네임-AA169 펩티다제; 메르네임-AA171 펩티다제; 메르네임-AA174 펩티다제; 메르네임-AA175 펩티다제; 각질층 키모트립신 효소; 트립신 유사 효소, 호흡기; 마트립타제; 칼리크레인 hK13; 칼리크레인 hK9; 메르네임-AA035 펩티다제; 제대정맥 프로테이나제; LCLP 프로테이나제; 스피네신; 메르네임-AA178 펩티다제; 메르네임-AA180 펩티다제; 메르네임-AA182 펩티다제 및 메르네임-AA122 펩티다제 중에서 선택되는,
   변형된 프로테아제 또는 이의 생물학적 활성 부분.
2. 제1항에 있어서, 변이는 프로테아제 골격과 비교하여 표적 단백질 내 변형된 프로테아제의 기질 서열에 대한 절단 활성 및/또는 특이성을 증가시키는 변형된 프로테아제.
3. 제2항에 있어서, 표적 단백질이 사이토킨, 수용체, 융합 단백질, 키나제 및 G 단백질-커플링 수용체 (GPCR) 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
4. 제2항에 있어서, 표적 단백질이 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-2, 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-5, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-12, 인터류킨-12 수용체, 인터류킨-13, 인터류킨-13 수용체, p-셀렉틴, p-셀렉틴 당단백질 리간드, 물질 P, 브래디키닌(Bradykinin), 인자 IX, 면역글로불린 E, 면역글로불린 E 수용체, CCR5, CXCR4, 당단백질 120, 당단백질 41, CD4, 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, B7, CD28, CD2, CD3, CD4, CD40, 혈관내피세포 성장인자, VEGF 수용체, 섬유아세포 성장인자, FGF 수용체, 내피세포 성장인자, EGF 수용체, 전환성장인자, TGF 수용체, CCR1, CXCR3, CCR2, Src, Akt, Bcl-2, BCR-Abl, 글루카곤 신타제 키나제-3, 사이토크롬 c, Apaf-1, 카스파제-3, 카스파제-9, 카스파제-7, 카스파제-6, 카스파제-2, BAD, BID, BAX, PARP, p53, cdk-2 및 cdk-4 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
5. 제1항에 있어서, 기질 선택성에 기여하는 아미노산 위치에서 변이가 키모트립신 넘버링에 의한 아미노산 위치 58 내지 64 사이, 97, 98, 99, 100, 171, 174, 180, 189, 190, 191, 192, 215, 217, 218 및 226 중에서 선택되는 아미노산 위치에서 존재하는 변형된 프로테아제.
6. 제1항에 있어서, 프로테아제 골격이 키모트립신, 플라스민, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 (uPA), 막형 세린 프로테아제-1 (MTSP-1), 그랜자임 A, 그랜자임 M, 엘라스타제, 키마제, 호중구 엘라스타제, 혈장 칼리크레인, 카텝신 G, 보체 인자 세린 프로테아제 및 푸린 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
7. 파파인 넘버링에 의한 아미노산 위치 19, 20, 61, 66, 67, 68, 133, 157, 158, 160 및 205 중에서 선택되는 아미노산 위치에서 프로테아제 골격 내 변이를 포함하는 변형된 시스테인 프로테아제 또는 이의 생물학적 활성 부분으로서,
   변형된 프로테아제는 단백질분해 활성을 보유하고;
   프로테아제 골격은 카텝신 L, 카텝신 VC, 카텝신 K, 카텝신 S, 카텝신 F, 카텝신 B, 파파인 및 크루자인 또는 이들의 생물학적 활성 부분 중에서 선택되는
   변형된 시스테인 프로테아제 또는 이의 생물학적 활성 부분.
8. 제7항에 있어서, 변이가 프로테아제 골격과 비교하여 표적 단백질 내 기질 서열에 대한 변형된 프로테아제의 절단 활성 및/또는 특이성을 증가시키는 변형된 프로테아제.
9. 제8항에 있어서, 표적 단백질이 사이토킨, 수용체, 융합 단백질, 키나제 및 G 단백질-커플링 수용체 (GPCR) 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
10. 제8항에 있어서, 표적 단백질이 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-2, 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-5, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-12, 인터류킨-12 수용체, 인터류킨-13, 인터류킨-13 수용체, p-셀렉틴, p-셀렉틴 당단백질 리간드, 물질 P, 브래디키닌(Bradykinin), 인자 IX, 면역글로불린 E, 면역글로불린 E 수용체, CCR5, CXCR4, 당단백질 120, 당단백질 41, CD4, 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, B7, CD28, CD2, CD3, CD4, CD40, 혈관내피세포 성장인자, VEGF 수용체, 섬유아세포 성장인자, FGF 수용체, 내피세포 성장인자, EGF 수용체, 전환성장인자, TGF 수용체, CCR1, CXCR3, CCR2, Src, Akt, Bcl-2, BCR-Abl, 글루카곤 신타제 키나제-3, 사이토크롬 c, Apaf-1, 카스파제-3, 카스파제-9, 카스파제-7, 카스파제-6, 카스파제-2, BAD, BID, BAX, PARP, p53, cdk-2 및 cdk-4 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 또는 키메릭 단백질인 변형된 프로테아제.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 골격과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 변이를 포함하는 변형된 프로테아제.
13. 제12항에 있어서, 프로테아제는 프로테아제 골격의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하는 변형된 프로테아제.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 골격과 비교하여 절단 활성 또는 특이성이 10배, 100배 또는 1000배 이상 증가된 변형된 프로테아제.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 항에 있어서,
    변형된 프로테아제가 질병 또는 병리에 관련된 표적 단백질을 절단하고;
    표적 단백질의 절단이 질병 또는 병리를 치료하고;
    질병 또는 병리가 류마티스성 관절염, 패혈증, 암, 후천성 면역결핍증, 기도 감염증, 인플루엔자, 심장혈관 질병, 염증, 천식, 신경퇴행성 질병, 허혈성 및 재관류 세포 죽음, 퇴행성 장애 및 급성 허혈성 손상 중에서 선택되는,
    질병 또는 병리의 치료용 의약의 제조를 위한 변형된 프로테아제.
16. 제15항에 있어서, 표적 단백질이 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-2, 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-5, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-12, 인터류킨-12 수용체, 인터류킨-13, 인터류킨-13 수용체, p-셀렉틴, p-셀렉틴 당단백질 리간드, 물질 P, 브래디키닌, 인자 IX, 면역글로불린 E, 면역글로불린 E 수용체, CCR5, CXCR4, 당단백질 120, 당단백질 41, CD4, 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, B7, CD28, CD2, CD3, CD4, CD40, 혈관내피세포 성장인자, VEGF 수용체, 섬유아세포 성장인자, FGF 수용체, 내피세포 성장인자, EGF 수용체, 전환성장인자, TGF 수용체, CCR1, CXCR3, CCR2, Src, Akt, Bcl-2, BCR-Abl, 글루카곤 신타제 키나제-3, 사이토크롬 c, Apaf-1, 카스파제-3, 카스파제-9, 카스파제-7, 카스파제-6, 카스파제-2, BAD, BID, BAX, PARP, p53, cdk-2 및 cdk-4 중에서 선택되는 변형된 프로테아제.
17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형된 프로테아제의 라이브러리.
18. (a) 라이브러리의 각각의 구성원이 야생형 프로테아제 골격 또는 이의 촉매적 활성 부분 내 하나의 변이 또는 변이들을 포함하는, 프로테아제 또는 이의 촉매적 활성 부분의 라이브러리를 제조하는 단계;
    (b) 표적 단백질을 포함하는 조성물 또는 표적 단백질 내 존재하는 기질 서열을 포함하는 폴리펩티드와 상기 라이브러리의 구성원들을 접촉시키는 단계;
    (c) 표적 단백질 또는 표적 단백질 내 기질 서열에 대한 라이브러리 구성원들의 절단 활성 및/또는 기질 특이성을 측정하는 단계;
    (d) 상기 측정된 활성 및/또는 기질 특이성에 기초하여, 기질 서열 또는 표적 단백질에 대한 증가된 절단 활성 및/또는 특이성을 갖는 라이브러리 구성원들을 동정하여 선택하는 단계;
    (e) 동정된 프로테아제(들)에 대하여 기질 서열을 포함하는 표적 단백질의 절단 및 활성의 불활성화를 측정하고, 이에 의하여 질병 또는 병리를 야기하거나 이와 관련된 표적 단백질의 활성을 불활성화시키는 변형된 프로테아제(들)를 동정하고, 이에 의하여 동정된 프로테아제(들)이 질병 또는 병리의 치료를 위한 후보 치료제가 되는 단계를 포함하는,
    질병 또는 병리를 야기하거나 이와 관련된 표적 단백질의 활성을 불활성화시키는 후보 치료제의 제조방법으로서,
    표적 단백질의 활성의 불활성화가 질병 또는 병리를 개선하고;
    표적 단백질 내 기질 서열의 절단이 표적 단백질의 활성을 불활성화시키는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 단계 (d) 에서
    라이브러리의 각 구성원의 활성 및/또는 특이성이 라이브러리의 평균 활성과 비교되고;
    동정된 프로테아제는 라이브러리의 평균 활성과 비교하여 증가된 절단 활성 및/또는 특이성을 갖는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, 단계 (d) 에서
    라이브러리의 각 구성원의 활성 및/또는 특이성이 야생형 골격 프로테아제와 비교되고;
    동정된 프로테아제는 골격 프로테아제와 비교하여 증가된 절단 활성 및/또는 특이성을 갖는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, 프로테아제 골격 내 라이브러리의 각 구성원의 변이의 수는 1, 1 내지 5, 5 내지 10, 및 10 내지 20 중에서 선택되는 방법.
22. 제21항에 있어서, 프로테아제 골격 내 라이브러리의 각 구성원의 변이의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개 중에서 선택되는 방법.
23. 제18항에 있어서, 프로테아제 골격은 세린 프로테아제이고,
    트롬빈; 트립신; 키모트립신; 서브틸리신; 플라스민; 인자 Xa; 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 (uPA); 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA); 막형 세린 프로테아제-1 (MTSP-1); 엘라스타제; 키마제; 호중구 엘라스타제; 혈장 칼리크레인; 카텝신 G; 보체 인자 세린 프로테아제; ADAMTS13; 중성 엔도펩티다제/네프릴리신; 파파인; 크루자인; 카텝신 L; 카텝신 V; 카텝신 K; 카텝신 S; 카텝신 F; 카텝신 B; 푸린; 그랜자임 A; 그랜자임 B; 그랜자임 M; 인간형 테스티신 (PRSS21); 트립타제 베타 1 (TPSB1); 칼리크레인 hK5 (KLK5); 코린; 칼리크레인 12 (KLK12); DESC1 프로테아제; 트립타제 감마 1 (TPSG1); 칼리크레인 hK14 (KLK14); 히알우로난-결합 세린 프로테아제; 막투과 프로테아제 세린 4 (TMPRSS4); 트립타제 델타 (TPSD1); 마랍신; 트립타제 동종체 2; 트립타제 동종체 3; 트립타제 염색체 21; 막투과 프로테아제 세린 3 (TMPRSS3); 칼리크레인 hK15; 메르네임-AA031 펩티다제; 막형 모자이크 세린 프로테아제; 메르네임-AA038 펩티다제; 메르네임-AA128 펩티다제; 양이온성 트립신 (PRSS1); 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제-3; 마이엘로블라스틴 PRTN3; 트립타제 알파; 그랜자임 K; 그랜자임 H; 키모트립신 B; 췌장 엔도펩티다제 E; 엔테로펩티다제 키모트립신 C; 프로스타신; 칼리크레인 1; 칼리크레인 hK2; 칼리크레인 3; 메소트립신; 보체 인자 D; 보체 성분 활성화된 C1r; 보체 성분 활성화된 C1s; 보체 성분 2 (C2); 보체 인자 B; 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제 1 (MASP1): 보체 인자 I; 췌장 엔도펩티다제 E 형태 B (B); 췌장 엘라스타제 II 형태 B; 응고인자 XIIa; 응고인자 XIa; 응고인자 IXa; 응고인자 VIIa; 단백질 C (활성화됨); 아크로신; 헵신; 간세포 성장 인자 활성화제; 만난-결합 렉틴-연합 세린 프로테아제 2; 뉴로신; 뉴로트립신; 트립타제 베타 2 (I); 트립타제 베타 2 (2); 뉴롭신; 칼리크레인 (hK10); 에피텔리아신 (TMPRSS2); 프로스타제; 뇌 세린 프로테아제 2; 키모파신; 칼리크레인 11; 음이온성 트립신 (II); LOC144757 펩티다제; 메르네임-AA169 펩티다제; 메르네임-AA171 펩티다제; 메르네임-AA174 펩티다제; 메르네임-AA175 펩티다제; 각질층 키모트립신 효소; 트립신 유사 효소, 호흡기; 마트립타제; 칼리크레인 hK13; 칼리크레인 hK9; 메르네임-AA035 펩티다제; 제대정맥 프로테이나제; LCLP 프로테이나제; 스피네신; 메르네임-AA178 펩티다제; 메르네임-AA180 펩티다제; 메르네임-AA182 펩티다제 및 메르네임-AA122 펩티다제 중에서 선택되는 그룹의 구성원들 중 하나의 아미노산 서열을 가지는 방법.
24. 제18항 또는 제23항에 있어서, 프로테아제 골격이 세린 프로테아제이고,
    변이가 S1 내지 S4 영역 내에 키모트립신 넘버링에 의한 아미노산 위치 58 내지 64 사이, 97, 98, 99, 100, 171, 174, 180, 189, 190, 191, 192, 215, 217, 218 및 226 중에서 선택되는 아미노산 위치에 존재하는 방법.
25. 제18항에 있어서, 프로테아제 골격이 시스테인 프로테아제이고,
    카텝신 L, 카텝신 VC, 카텝신 K, 카텝신 S, 카텝신 F, 카텝신 B, 파파인 및 크루자인 중에서 선택되는 그룹의 구성원들 중 하나의 아미노산 서열을 가지는 방법.
26. 제18항 또는 제25항에 있어서, 프로테아제 골격이 시스테인 프로테아제이고,
    변이가 S1 내지 S4 영역 내 파파인 넘버링에 의한 아미노산 위치 19, 20, 61, 66, 67, 68, 133, 157, 158, 160 및 205 중에서 선택되는 아미노산 위치에 존재하는 방법.
27. 제18항에 있어서, 질병 또는 병리가 류마티스성 관절염, 패혈증, 암, 후천성 면역결핍증, 기도 감염증, 인플루엔자, 심장혈관 질병, 염증, 천식, 신경퇴행성 질병, 허혈성 및 재관류 세포 죽음, 퇴행성 장애 및 급성 허혈성 손상 중에서 선택되는 방법.
28. 제18항에 있어서, 표적 단백질이 세포 증식을 위한 세포외 신호를 전달하는 세포 표면 분자, 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 아폽토시스를 조절하는 신호전달 단백질 중에서 선택되는 방법.
29. 제18항에 있어서, 표적 단백질이 종양 괴사 인자 수용체, 인터류킨-1, 인터류킨-1 수용체, 인터류킨-2, 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-5, 인터류킨-5 수용체, 인터류킨-12, 인터류킨-12 수용체, 인터류킨-13, 인터류킨-13 수용체, p-셀렉틴, p-셀렉틴 당단백질 리간드, 물질 P, 브래디키닌, 인자 IX, 면역글로불린 E, 면역글로불린 E 수용체, CCR5, CXCR4, 당단백질 120, 당단백질 41, CD4, 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 융합 단백질, B7, CD28, CD2, CD3, CD4, CD40, 혈관내피세포 성장인자, VEGF 수용체, 섬유아세포 성장인자, FGF 수용체, 내피세포 성장인자, EGF 수용체, 전환성장인자, TGF 수용체, CCR1, CXCR3, CCR2, Src, Akt, Bcl-2, BCR-Abl, 글루카곤 신타제 키나제-3, 사이토크롬 c, Apaf-1, 카스파제-3, 카스파제-9, 카스파제-7, 카스파제-6, 카스파제-2, BAD, BID, BAX, PARP, p53, cdk-2 및 cdk-4 중에서 선택되는 방법.
30. 제18항에 있어서,
    증가된 절단 활성 및/또는 특이성을 갖는 것으로 동정된 프로테아제 라이브러리의 2 이상의 구성원들을 제공하는 단계;
    제1 동정 프로테아제의 변이와 제2 동정 프로테아제 변이를 조합하여 제3의 변형된 프로테아제를 제조하는 단계; 및
    상기 조합이 제1 동정 프로테아제 및 제2 동정 프로테아제와 비교하여 기질 서열에 대하여 증가된 절단 활성 및/또는 특이성을 갖는 조합 특이성 프로테아제를 생산하는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 제18항에 있어서, 절단이 SDS-PAGE 에 의하여 모니터링되는 방법.
32. 제18항에 있어서, 라이브러리의 구성원들의 활성 및/또는 특이성이 하기를 포함하는 방법에 의하여 측정되는 방법:
    라이브러리의 각 구성원을 형광유발 부분기를 포함하는 표적 단백질 또는 기질 서열을 포함하는 시료와 접촉시켜, 프로테아제에 의한 표적 단백질 또는 기질 서열의 절단이 형광유발 부분기를 방출하는 단계;
    시료 내 형광을 측정하는 단계; 및
    시료가 형광의 검출가능한 변화를 겪는지 여부를 관찰하는 단계, 여기서 검출가능한 변화는 기질 서열에 대한 효소적 활성 프로테아제의 존재의 지시임.
33. 제32항에 있어서, 형광은 플루오로미터를 이용하여, 시각적 조사로, 또는 형광 현미경을 이용하여 측정되는 방법.
34. 제18항에 있어서, 라이브러리는 프로테아제 파지 디스플레이 라이브러리로써 제공되는 방법.
35. 제18항에 있어서, 표적 단백질 또는 기질 서열은 형광유발 부분기를 포함하는 방법.
36. 제18항에 있어서, 표적 단백질 내 기질 서열의 절단이 표적 단백질을 불활성화하도록 기질 서열이 미리 선택되는 방법.
37. 제18항에 있어서, 기질 서열이 표적 단백질 내 4개 아미노산 서열인 방법.
    

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