JPH05260998A - 異常プロトロンビンの測定方法 - Google Patents
異常プロトロンビンの測定方法Info
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- JPH05260998A JPH05260998A JP6369892A JP6369892A JPH05260998A JP H05260998 A JPH05260998 A JP H05260998A JP 6369892 A JP6369892 A JP 6369892A JP 6369892 A JP6369892 A JP 6369892A JP H05260998 A JPH05260998 A JP H05260998A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液試料中の異常プロトロンビン量の測定法
が提供される。 【構成】 血液試料をあらかじめ組織トロンボプラスチ
ンにて処理した試料を被検試料として用いて、蛇毒由来
のプロトロンビン活性化酵素で活性化した系と活性化し
なかった系について合成基質法を用いてそれぞれのトロ
ンビン活性量を測定し、両者の差を求めることにより、
血液試料中の異常プロトロンビンの量を極めて効率良く
高感度に測定することができる。
が提供される。 【構成】 血液試料をあらかじめ組織トロンボプラスチ
ンにて処理した試料を被検試料として用いて、蛇毒由来
のプロトロンビン活性化酵素で活性化した系と活性化し
なかった系について合成基質法を用いてそれぞれのトロ
ンビン活性量を測定し、両者の差を求めることにより、
血液試料中の異常プロトロンビンの量を極めて効率良く
高感度に測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血液試料中の異常プロト
ロンビンの新規な測定方法に関する。血液中にはその凝
固に関与するいくつかの凝固因子が存在し、プロトロン
ビンはその１つであり、肝臓で産生され、血中に放出さ
れる。正常な状態にある場合、血液中には異常プロトロ
ンビンはほとんど存在せず、プロトロンビンのみが存在
するが、ビタミンＫ欠乏状態、抗凝固剤投与時、肝癌等
の肝疾患時においては、プロトロンビン中のグルタミン
酸残基が全くカルボキシル化されていないか、部分的に
のみカルボキシル化されている異常プロトロンビン（す
なわちＰＩＶＫＡ II ）が血中に放出されることが知ら
れており、異常プロトロンビンの測定方法はそれらの診
断に有用とされている。
ロンビンの新規な測定方法に関する。血液中にはその凝
固に関与するいくつかの凝固因子が存在し、プロトロン
ビンはその１つであり、肝臓で産生され、血中に放出さ
れる。正常な状態にある場合、血液中には異常プロトロ
ンビンはほとんど存在せず、プロトロンビンのみが存在
するが、ビタミンＫ欠乏状態、抗凝固剤投与時、肝癌等
の肝疾患時においては、プロトロンビン中のグルタミン
酸残基が全くカルボキシル化されていないか、部分的に
のみカルボキシル化されている異常プロトロンビン（す
なわちＰＩＶＫＡ II ）が血中に放出されることが知ら
れており、異常プロトロンビンの測定方法はそれらの診
断に有用とされている。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＰＩＶＫＡ II を測定する方法と
しては、二次元交叉免疫電気泳動法（Laurell C.B. Ana
l Biochem 10. 358 〜360 (1965)) 、特異抗体を用いた
競合ラジオイムノアッセイ法（Rita,A. The New Englan
d J.Medicine 305 No.5 242 〜248(1981))、ラテックス
凝集法（特公昭６２−５７２１）、ポリクローナル抗体
を用いたエンザイムイムノアッセイ法、モノクローナル
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法（特開昭６０
−６０５５７）、トロンボテスト及びノルモテストを用
いたＰＩＶＫＡ Index法（Owren PA血液と脈管81〜22(1
977)) 、スタフィロコアグラーゼを用いた合成基質法、
血漿を測定試料とし活性化にEchis carinatus 蛇毒あ
るいはその蛇毒中のプロトロンビン活性化酵素を用いた
場合のトロンビン活性と組織トロンボプラスチンを用い
た場合のトロンビン活性との差から測定する方法（臨床
病理、臨時増刊 70. 88〜99(1987)) 等がある。
しては、二次元交叉免疫電気泳動法（Laurell C.B. Ana
l Biochem 10. 358 〜360 (1965)) 、特異抗体を用いた
競合ラジオイムノアッセイ法（Rita,A. The New Englan
d J.Medicine 305 No.5 242 〜248(1981))、ラテックス
凝集法（特公昭６２−５７２１）、ポリクローナル抗体
を用いたエンザイムイムノアッセイ法、モノクローナル
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法（特開昭６０
−６０５５７）、トロンボテスト及びノルモテストを用
いたＰＩＶＫＡ Index法（Owren PA血液と脈管81〜22(1
977)) 、スタフィロコアグラーゼを用いた合成基質法、
血漿を測定試料とし活性化にEchis carinatus 蛇毒あ
るいはその蛇毒中のプロトロンビン活性化酵素を用いた
場合のトロンビン活性と組織トロンボプラスチンを用い
た場合のトロンビン活性との差から測定する方法（臨床
病理、臨時増刊 70. 88〜99(1987)) 等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】二次元交叉免疫電気泳
動法はＰＩＶＫＡ II の存在を直接的に証明できる。し
かし定性的なものでしかなく、しかも手技が繁雑で時間
を要すため、日常検査には問題がある。特異抗体を用い
た競合ラジオイムノアッセイ法は、いまだ実用的ではな
く、使用施設が限られ、又、ＰＩＶＫＡ II 特異抗体の
精製が繁雑であり、特異抗体の大量作成が困難であると
いう欠点がある。
動法はＰＩＶＫＡ II の存在を直接的に証明できる。し
かし定性的なものでしかなく、しかも手技が繁雑で時間
を要すため、日常検査には問題がある。特異抗体を用い
た競合ラジオイムノアッセイ法は、いまだ実用的ではな
く、使用施設が限られ、又、ＰＩＶＫＡ II 特異抗体の
精製が繁雑であり、特異抗体の大量作成が困難であると
いう欠点がある。
【０００４】ラテックス凝集法は、短時間で測定できる
という利点はあるものの半定量的であり、高値検体の場
合、定量操作を繰り返さなければならず、コスト高にな
るという欠点がある。又、測定操作を手技で行なわなけ
ればならないため、多数の検体を測定する場合には問題
がある。ポリクローナル抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイ法は、反応に時間を要すと共に、測定に際し
て、専用の機器を必要とするという欠点がある。モノク
ローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法は、
反応に時間を要し、手技が繁雑であり、多数の検体を測
定する場合には専用の機器を必要とする等の欠点があ
る。
という利点はあるものの半定量的であり、高値検体の場
合、定量操作を繰り返さなければならず、コスト高にな
るという欠点がある。又、測定操作を手技で行なわなけ
ればならないため、多数の検体を測定する場合には問題
がある。ポリクローナル抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイ法は、反応に時間を要すと共に、測定に際し
て、専用の機器を必要とするという欠点がある。モノク
ローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法は、
反応に時間を要し、手技が繁雑であり、多数の検体を測
定する場合には専用の機器を必要とする等の欠点があ
る。
【０００５】トロンボテスト及びノルモテストを用いる
ＰＩＶＫＡ Index 法は、組織トロンボプラスチンの種
類、力価等で標準曲線が異なり、又、測定手技が繁雑で
時間を要するという問題がある。更に、感度、特異性の
面で他法に劣るため、現在はあまり用いられていない。
スタフィロコアグラーゼを用いた合成基質法は、ＰＩＶ
ＫＡ II 中のグルタミン酸残基のカルボキシル化の程度
により活性化物質であるスタフィロコアグラーゼに対す
る活性化量が異なり、測定値が異なるという問題点があ
る。血漿を測定試料としたトロンビン活性化試薬の違い
によりＰＩＶＫＡ II を産出する方法は、感度、手技の
繁雑さ、汎用の自動分析機による測定が困難である等の
問題点がある。上述の如く、現在知られているＰＩＶＫ
Ａ II 測定法には種々の問題点がある。
ＰＩＶＫＡ Index 法は、組織トロンボプラスチンの種
類、力価等で標準曲線が異なり、又、測定手技が繁雑で
時間を要するという問題がある。更に、感度、特異性の
面で他法に劣るため、現在はあまり用いられていない。
スタフィロコアグラーゼを用いた合成基質法は、ＰＩＶ
ＫＡ II 中のグルタミン酸残基のカルボキシル化の程度
により活性化物質であるスタフィロコアグラーゼに対す
る活性化量が異なり、測定値が異なるという問題点があ
る。血漿を測定試料としたトロンビン活性化試薬の違い
によりＰＩＶＫＡ II を産出する方法は、感度、手技の
繁雑さ、汎用の自動分析機による測定が困難である等の
問題点がある。上述の如く、現在知られているＰＩＶＫ
Ａ II 測定法には種々の問題点がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる従来技術の問題点
を鑑み、より簡便に、より迅速に、より高感度に、そし
てより正確に異常プロトロンビンの測定を可能とするこ
とを目的として、我々が鋭意研究を重ねた結果、あらか
じめ組織トロンボプラスチンを用いて試料中に存在する
正常プロトロンビンのみを活性化してトロンビンに変換
せしめた血液試料を測定試料として用いて、この試料に
蛇毒から精製されたプロトロンビン活性化酵素を更に加
えても、試料中で生成するトロンビン−α2 マクログロ
ブリン複合体などのトロンビン−阻害物質複合体にプロ
トロンビン活性化酵素が何んら影響することなく試料中
のトロンビン活性に変動を与えないことを見い出し、従
ってあらかじめ組織トロンボプラスチンで処理した前記
測定試料を被検試料として用いて、プロトロンビン活性
化酵素で活性化した系と活性化しなかった系について合
成基質法を用いてそれぞれのトロンビン活性量を測定
し、両者の差を求めることにより、試料中の異常プロト
ロンビン量を高感度に求めることが可能であり更には汎
用の自動分析機による大量検体の測定が可能であるこ
と、又、被検試料として血清を用いることにより、大幅
に測定感度を向上させ得ることを見い出し、本発明を完
成するに至った。即ち、本発明は、組織トロンボプラス
チンを用いて血液試料中の正常プロトロンビンのみを活
性化してトロンビンにあらかじめ変換せしめた血液試料
を被検血液試料として用い、該被検血液試料に、異常プ
ロトロンビンの活性化酵素もしくはそれを成分として含
む活性化剤を加えて、該被検血液試料中に残存する異常
プロトロンビンを活性化し、次いで合成基質を用いてト
ロンビン活性を測定して、血液試料中の正常プロトロン
ビン及び異常プロトロンビン由来の全トロンビン活性値
（Ａ値）を求め；他方、上記被検血液試料に異常プロト
ロンビンの活性化酵素もしくはそれを成分として含む活
性化剤を加えることなく、そのまま合成基質を用いてト
ロンビン活性を測定して、血液試料中の正常プロトロン
ビンのみから変換されたトロンビン活性値（Ｂ値）を求
め；次いで、Ａ値とＢ値との差から血液試料中の異常プ
ロトロンビンを定量することを特徴とする異常プロトロ
ンビンの測定方法である。
を鑑み、より簡便に、より迅速に、より高感度に、そし
てより正確に異常プロトロンビンの測定を可能とするこ
とを目的として、我々が鋭意研究を重ねた結果、あらか
じめ組織トロンボプラスチンを用いて試料中に存在する
正常プロトロンビンのみを活性化してトロンビンに変換
せしめた血液試料を測定試料として用いて、この試料に
蛇毒から精製されたプロトロンビン活性化酵素を更に加
えても、試料中で生成するトロンビン−α2 マクログロ
ブリン複合体などのトロンビン−阻害物質複合体にプロ
トロンビン活性化酵素が何んら影響することなく試料中
のトロンビン活性に変動を与えないことを見い出し、従
ってあらかじめ組織トロンボプラスチンで処理した前記
測定試料を被検試料として用いて、プロトロンビン活性
化酵素で活性化した系と活性化しなかった系について合
成基質法を用いてそれぞれのトロンビン活性量を測定
し、両者の差を求めることにより、試料中の異常プロト
ロンビン量を高感度に求めることが可能であり更には汎
用の自動分析機による大量検体の測定が可能であるこ
と、又、被検試料として血清を用いることにより、大幅
に測定感度を向上させ得ることを見い出し、本発明を完
成するに至った。即ち、本発明は、組織トロンボプラス
チンを用いて血液試料中の正常プロトロンビンのみを活
性化してトロンビンにあらかじめ変換せしめた血液試料
を被検血液試料として用い、該被検血液試料に、異常プ
ロトロンビンの活性化酵素もしくはそれを成分として含
む活性化剤を加えて、該被検血液試料中に残存する異常
プロトロンビンを活性化し、次いで合成基質を用いてト
ロンビン活性を測定して、血液試料中の正常プロトロン
ビン及び異常プロトロンビン由来の全トロンビン活性値
（Ａ値）を求め；他方、上記被検血液試料に異常プロト
ロンビンの活性化酵素もしくはそれを成分として含む活
性化剤を加えることなく、そのまま合成基質を用いてト
ロンビン活性を測定して、血液試料中の正常プロトロン
ビンのみから変換されたトロンビン活性値（Ｂ値）を求
め；次いで、Ａ値とＢ値との差から血液試料中の異常プ
ロトロンビンを定量することを特徴とする異常プロトロ
ンビンの測定方法である。
【０００７】以下にその詳細を述べる。本発明で用いる
被検試料はあらかじめ組織トロンボプラスチンで処理し
たものであり、具体的には以下のようにして調製され
る。血液試料（好ましくは血清）を、トリス０〜５００
mmole/l （好ましくは５５ミリモル）、塩化カルシウム
０．１〜１０mmole/l （好ましくは３mmole/l ）、ポリ
エチレングリコール６０００ ０〜１０％（好ましくは
３％）、塩化ナトリウム０〜５００mmole/l （好ましく
は１２０ミリモル）、組織トロンボプラスチン（好まし
くはヒト、動物、例えばうさぎなどの脳、肺、胎盤由来
のトロンボプラスチン）０．０１〜１mg/ml （好ましく
は０．１５mg/ml ）、血液凝固第５因子０〜１U/ml（好
ましくは０．１U/ml）ｐＨ７．０〜９．０（好ましくは
ｐＨ８．５）を含有するトロンボプラスチン試薬（以
下、ＴＰ試薬と略記する）に加え、好ましくは３７℃で
３０〜６０分間静置し、血液試料中の正常プロトロンビ
ンのみを完全に活性化してトロンビンに変換せしめて、
被検試料を作成する。
被検試料はあらかじめ組織トロンボプラスチンで処理し
たものであり、具体的には以下のようにして調製され
る。血液試料（好ましくは血清）を、トリス０〜５００
mmole/l （好ましくは５５ミリモル）、塩化カルシウム
０．１〜１０mmole/l （好ましくは３mmole/l ）、ポリ
エチレングリコール６０００ ０〜１０％（好ましくは
３％）、塩化ナトリウム０〜５００mmole/l （好ましく
は１２０ミリモル）、組織トロンボプラスチン（好まし
くはヒト、動物、例えばうさぎなどの脳、肺、胎盤由来
のトロンボプラスチン）０．０１〜１mg/ml （好ましく
は０．１５mg/ml ）、血液凝固第５因子０〜１U/ml（好
ましくは０．１U/ml）ｐＨ７．０〜９．０（好ましくは
ｐＨ８．５）を含有するトロンボプラスチン試薬（以
下、ＴＰ試薬と略記する）に加え、好ましくは３７℃で
３０〜６０分間静置し、血液試料中の正常プロトロンビ
ンのみを完全に活性化してトロンビンに変換せしめて、
被検試料を作成する。
【０００８】次いで被検試料に異常プロトロンビンの活
性化酵素もしくはそれを成分として含む活性化剤を加え
て、被検試料中に残存する異常プロトロンビンを活性化
せしめる。ここで活性化とは、異常プロトロンビンをト
ロンビン用合成基質と反応する性質を有する物質に変換
することを意味する。具体的には以下のようにして行
う。被検試料を、トリス０〜５００mmole/l （好ましく
は６０mmole/l ）、塩化ナトリウム０〜５００mmole 好
ましくは（９０mmole/l ）、Echis carinatus 蛇毒、
０．０００５〜１mg/ml （好ましくは０．００２５mg/m
l ）、或いはエカリン（Echis carinatus 蛇毒から精
製されたプロトロンビン活性化酵素。尚、Dispholidus
tysus , Oxyuranus scutellatus 又はNotechis
scutatusの蛇毒から精製されたものを用いることもでき
る。）０．０５〜１０mU/ml （好ましくは０．２mU/ml
、ｐＨ７．０〜９．０、好ましくはｐＨ８．５）を含
有する試薬（以下、Ｒ−１と略記する）中に加え、好ま
しくは３７℃で５分間反応して残存する異常プロトロン
ビン（ＰＩＶＫＡ II ）を活性化する。活性化後、トロ
ンビン測定用の公知合成基質を含有する基質試薬（例え
ば０．１〜１０mmole/l ）（以下、Ｒ−２と略記する）
を加え、初速度法を用いて色原体が有する吸収波長にお
ける吸光度変化（すなわち、基質水解速度）を求め、あ
らかじめ作成しておいた標準曲線からＰＩＶＫＡ II 由
来の活性を含む全トロンビン活性量（Ａ値）を求める。
性化酵素もしくはそれを成分として含む活性化剤を加え
て、被検試料中に残存する異常プロトロンビンを活性化
せしめる。ここで活性化とは、異常プロトロンビンをト
ロンビン用合成基質と反応する性質を有する物質に変換
することを意味する。具体的には以下のようにして行
う。被検試料を、トリス０〜５００mmole/l （好ましく
は６０mmole/l ）、塩化ナトリウム０〜５００mmole 好
ましくは（９０mmole/l ）、Echis carinatus 蛇毒、
０．０００５〜１mg/ml （好ましくは０．００２５mg/m
l ）、或いはエカリン（Echis carinatus 蛇毒から精
製されたプロトロンビン活性化酵素。尚、Dispholidus
tysus , Oxyuranus scutellatus 又はNotechis
scutatusの蛇毒から精製されたものを用いることもでき
る。）０．０５〜１０mU/ml （好ましくは０．２mU/ml
、ｐＨ７．０〜９．０、好ましくはｐＨ８．５）を含
有する試薬（以下、Ｒ−１と略記する）中に加え、好ま
しくは３７℃で５分間反応して残存する異常プロトロン
ビン（ＰＩＶＫＡ II ）を活性化する。活性化後、トロ
ンビン測定用の公知合成基質を含有する基質試薬（例え
ば０．１〜１０mmole/l ）（以下、Ｒ−２と略記する）
を加え、初速度法を用いて色原体が有する吸収波長にお
ける吸光度変化（すなわち、基質水解速度）を求め、あ
らかじめ作成しておいた標準曲線からＰＩＶＫＡ II 由
来の活性を含む全トロンビン活性量（Ａ値）を求める。
【０００９】他方、被検試料に異常プロトロンビンの活
性化酵素もしくはそれを成分として含む活性化剤を加え
ることなく、そのままトロンビン活性を測定する。具体
的には以下のようにして行う。同様に、被検試料をトリ
ス０〜５００mmole/l （好ましくは６０mmole/l ）、塩
化ナトリウム０〜５００mmole/l （好ましくは９０mmol
e/l ）、ｐＨ（７．０〜９．０（好ましくはｐＨ８．
５）を含有する試薬（以下、Ｒ−１′と略記する）中に
加え、好ましくは３７℃で５分間静置する。その後、前
記Ｒ−２を加え、初速度法を用いてそれぞれの色原体が
有する吸収波長における吸光度変化しすなわち、基質水
解速度）を求め、あらかじめ作成しておいた標準曲線か
らＰＩＶＫＡ II 由来の活性を含まないトロンビン活性
量（Ｂ値）を求める。
性化酵素もしくはそれを成分として含む活性化剤を加え
ることなく、そのままトロンビン活性を測定する。具体
的には以下のようにして行う。同様に、被検試料をトリ
ス０〜５００mmole/l （好ましくは６０mmole/l ）、塩
化ナトリウム０〜５００mmole/l （好ましくは９０mmol
e/l ）、ｐＨ（７．０〜９．０（好ましくはｐＨ８．
５）を含有する試薬（以下、Ｒ−１′と略記する）中に
加え、好ましくは３７℃で５分間静置する。その後、前
記Ｒ−２を加え、初速度法を用いてそれぞれの色原体が
有する吸収波長における吸光度変化しすなわち、基質水
解速度）を求め、あらかじめ作成しておいた標準曲線か
らＰＩＶＫＡ II 由来の活性を含まないトロンビン活性
量（Ｂ値）を求める。
【００１０】最後に、Ａ値からＢ値を差し引き、血液試
料中のＰＩＶＫＡ II 量を算出する。後述する実施例１
及び２より明らかなように、本発明のＰＩＶＫＡ II 測
定法によれば測定検体中のＰＩＶＫＡ濃度を鋭敏に反映
し、検体希釈系列中のＰＩＶＫＡ II 濃度を直線的正確
性をもちながら極低濃度まで高感度に測定できる。
料中のＰＩＶＫＡ II 量を算出する。後述する実施例１
及び２より明らかなように、本発明のＰＩＶＫＡ II 測
定法によれば測定検体中のＰＩＶＫＡ濃度を鋭敏に反映
し、検体希釈系列中のＰＩＶＫＡ II 濃度を直線的正確
性をもちながら極低濃度まで高感度に測定できる。
【００１１】
【実施例】以下に本発明を実施例により更に詳細に説明
する。 実施例１ (1) 試料の作成 ガラス試験管中に市販の抗凝固剤投与患者血漿１０００
μl を入れ、そこに２５mmole/l 塩化カルシウム１００
０μl を添加し、２５℃で２時間静置後、３０００回転
／分で１０分間遠心分離し、上清を得、健常人プール血
清で希釈系列を作り、試料とした。
する。 実施例１ (1) 試料の作成 ガラス試験管中に市販の抗凝固剤投与患者血漿１０００
μl を入れ、そこに２５mmole/l 塩化カルシウム１００
０μl を添加し、２５℃で２時間静置後、３０００回転
／分で１０分間遠心分離し、上清を得、健常人プール血
清で希釈系列を作り、試料とした。
【００１２】(2) 試薬の作成 トロンボプラスチン試薬（ＴＰ試薬） ｐＨ８．５（２５℃）５５mmole/l トリス緩衝液中、塩
化カルシウム３％、ポリエチレングリコール−６０００
３％、塩化ナトリウム０．７％、うさぎ脳トロンボプ
ラスチン０．１６mg/ml 、血液凝固第５因子０．１U/ml
からなる。 Ｒ−１ ｐＨ８．５（２５℃）の３６mmole/l トリス緩衝液中、
塩化ナトリウム０．７５％ エキスカリナタス蛇毒０．
００２５mg/ml からなる。 Ｒ−１′ ｐＨ８．５（２５℃）の３６mmole/l トリス緩衝液中、
塩化ナトリウム１０．７５％からなる。 Ｒ−２ 次にあげる基質液２容と呈色液１容を混合し、Ｒ−２と
した。 a. 基質液 ３mmole/l Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニ
ル−３−カルボキシ−４−ハイドロキシ−アニリド水溶
液からなる。 b. 呈色液 ７mg/ml クエン酸３ナトリウム、２．２mg/ml ３−シク
ロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、１３．５mg/ml
ペンタシアノアンミンフェロエート、ｐＨ１０．５から
なる。
化カルシウム３％、ポリエチレングリコール−６０００
３％、塩化ナトリウム０．７％、うさぎ脳トロンボプ
ラスチン０．１６mg/ml 、血液凝固第５因子０．１U/ml
からなる。 Ｒ−１ ｐＨ８．５（２５℃）の３６mmole/l トリス緩衝液中、
塩化ナトリウム０．７５％ エキスカリナタス蛇毒０．
００２５mg/ml からなる。 Ｒ−１′ ｐＨ８．５（２５℃）の３６mmole/l トリス緩衝液中、
塩化ナトリウム１０．７５％からなる。 Ｒ−２ 次にあげる基質液２容と呈色液１容を混合し、Ｒ−２と
した。 a. 基質液 ３mmole/l Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニ
ル−３−カルボキシ−４−ハイドロキシ−アニリド水溶
液からなる。 b. 呈色液 ７mg/ml クエン酸３ナトリウム、２．２mg/ml ３−シク
ロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、１３．５mg/ml
ペンタシアノアンミンフェロエート、ｐＨ１０．５から
なる。
【００１３】(3) 検量線の作成 健常者の血液中に含有されるプロトロンビンをトロンビ
ンに変換した場合の活性を１００％とし、２５％相当の
活性を有するトロンビン溶液を標準試料とした。続い
て、その希釈系列を、下記の測定Ａ法及びＢ法で測定す
ることにより、検量線を作成した。
ンに変換した場合の活性を１００％とし、２５％相当の
活性を有するトロンビン溶液を標準試料とした。続い
て、その希釈系列を、下記の測定Ａ法及びＢ法で測定す
ることにより、検量線を作成した。
【００１４】(4) 測定方法 測定試料の調製 (1) の試料１００μl をＴＰ試薬６００μl に添加後、
十分混和し、恒温槽中３７℃で３０分間静置し、それを
測定試料とした。 測定Ａ法 測定試料２０μl をＲ−１ ２５０μl に加え、３７℃
で５分間静置した後、Ｒ−２ １００μl を加え、７０
０nmにおける吸光度変化を初速度法により求め、標準試
料より作成した検量線から活性値Ａ（Ａ値）を求めた。 測定Ｂ法 測定Ａ法と同様の操作をＲ−１′を用いて行い、標準試
料より作成した検量線から活性値Ｂ（Ｂ値）を求めた。 ＰＩＶＫＡ II量の測定 Ａ値からＢ値を差し引き、ＰＩＶＫＡ II量を求めた。
結果は表１及び表２並びに図１及び図２に示した。尚、
表１及び図１は、抗凝固剤投与患者からの血清試料を高
濃度に含有し、健常人プール血清による希釈倍率の低い
希釈系列を用いた場合の結果を示し、表２及び図２は、
表１の希釈系列（１／５）を用いて、これを他の健常人
プール血清で更に希釈した場合の結果を示す。
十分混和し、恒温槽中３７℃で３０分間静置し、それを
測定試料とした。 測定Ａ法 測定試料２０μl をＲ−１ ２５０μl に加え、３７℃
で５分間静置した後、Ｒ−２ １００μl を加え、７０
０nmにおける吸光度変化を初速度法により求め、標準試
料より作成した検量線から活性値Ａ（Ａ値）を求めた。 測定Ｂ法 測定Ａ法と同様の操作をＲ−１′を用いて行い、標準試
料より作成した検量線から活性値Ｂ（Ｂ値）を求めた。 ＰＩＶＫＡ II量の測定 Ａ値からＢ値を差し引き、ＰＩＶＫＡ II量を求めた。
結果は表１及び表２並びに図１及び図２に示した。尚、
表１及び図１は、抗凝固剤投与患者からの血清試料を高
濃度に含有し、健常人プール血清による希釈倍率の低い
希釈系列を用いた場合の結果を示し、表２及び図２は、
表１の希釈系列（１／５）を用いて、これを他の健常人
プール血清で更に希釈した場合の結果を示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】実施例２ (1) 試料の作成 実施例１と同じ。 (2) 試薬の作成 トロンボプラスチン試薬（ＴＰ試薬） 実施例１と同じ。 Ｒ−１ ｐＨ８．５（２５℃）の３６mmole/l トリス緩衝液中、
塩化ナトリウム０．７５％、エカリン（Echis carina
tus 蛇毒中から精製したプロトロンビン活性化酵素）
１．０mU/ml からなる。 Ｒ−１′ 実施例１と同じ。 Ｒ−２ ３．５mmole/l Ｄ−フェニルアラニル−ピペコリル−
アルギニル−４−ニトロ−アニリド水溶液からなる。
塩化ナトリウム０．７５％、エカリン（Echis carina
tus 蛇毒中から精製したプロトロンビン活性化酵素）
１．０mU/ml からなる。 Ｒ−１′ 実施例１と同じ。 Ｒ−２ ３．５mmole/l Ｄ−フェニルアラニル−ピペコリル−
アルギニル−４−ニトロ−アニリド水溶液からなる。
【００１８】(3) 検量線の作成 実施例１と同じ (4) 測定 測定試料の調製 実施例１と同じ 測定Ａ法 実施例１と同様の操作を測定波長４１５nmを用いて行な
い、標準試料により作成した検量線から活性値Ａ（Ａ
値）を求めた。 測定Ｂ法 測定Ａ法と同様の操作をＲ−１′を用いて行ない、標準
試料より作成した検量線から活性値Ｂ（Ｂ値）を求め
た。 ＰＩＶＫＡ II量の測定 Ａ値からＢ値を差し引き、ＰＩＶＫＡ II量を求めた。
結果は表３及び表４並びに図３及び図４に示した。尚、
表３及び図３は、抗凝固剤投与患者からの血清試料を高
濃度に含有し、健常人プール血清による希釈倍率の低い
希釈系列を用いた場合の結果を示し、表４及び図４は表
３の希釈系列（１／５）を用いて、これを他の健常人プ
ール血清で更に希釈した場合の結果を示す。
い、標準試料により作成した検量線から活性値Ａ（Ａ
値）を求めた。 測定Ｂ法 測定Ａ法と同様の操作をＲ−１′を用いて行ない、標準
試料より作成した検量線から活性値Ｂ（Ｂ値）を求め
た。 ＰＩＶＫＡ II量の測定 Ａ値からＢ値を差し引き、ＰＩＶＫＡ II量を求めた。
結果は表３及び表４並びに図３及び図４に示した。尚、
表３及び図３は、抗凝固剤投与患者からの血清試料を高
濃度に含有し、健常人プール血清による希釈倍率の低い
希釈系列を用いた場合の結果を示し、表４及び図４は表
３の希釈系列（１／５）を用いて、これを他の健常人プ
ール血清で更に希釈した場合の結果を示す。
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】実施例１及び２における測定は自動分析機
（日立７０５０）を用いて行なった。
（日立７０５０）を用いて行なった。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、これまで繁雑な操作が必
要であったＰＩＶＫＡ IIの測定が容易に、正確に、し
かも高感度で行なえるようになり、又、専用機を必要と
せずに汎用の自動分析機による大量検体の測定が可能と
なった。
要であったＰＩＶＫＡ IIの測定が容易に、正確に、し
かも高感度で行なえるようになり、又、専用機を必要と
せずに汎用の自動分析機による大量検体の測定が可能と
なった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において高濃度でＰＩＶＫＡ II量の
測定をした結果を示す。
測定をした結果を示す。
【図２】実施例１において低濃度でＰＩＶＫＡ II量の
測定をした結果を示す。
測定をした結果を示す。
【図３】実施例２において高濃度でＰＩＶＫＡ II量の
測定をした結果を示す。
測定をした結果を示す。
【図４】実施例２において低濃度でＰＩＶＫＡ II量の
測定をした結果を示す。
測定をした結果を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】 組織トロンボプラスチンを用いて血液試
料中の正常プロトロンビンのみを活性化してトロンビン
にあらかじめ変換せしめた血液試料を被検血液試料とし
て用い、 該被検血液試料に、異常プロトロンビンの活性化酵素も
しくはそれを成分として含む活性化剤を加えて、該被検
血液試料中に残存する異常プロトロンビンを活性化し、
次いで合成基質を用いてトロンビン活性を測定して、血
液試料中の正常プロトロンビン及び異常プロトロンビン
由来の全トロンビン活性値（Ａ値）を求め；他方、上記
被検血液試料に異常プロトロンビンの活性化酵素もしく
はそれを成分として含む活性化剤を加えることなく、そ
のまま合成基質を用いてトロンビン活性を測定して、血
液試料中の正常プロトロンビンのみから変換されたトロ
ンビン活性値（Ｂ値）を求め；次いで、Ａ値とＢ値との
差から血液試料中の異常プロトロンビンを定量すること
を特徴とする異常プロトロンビンの測定方法。 - 【請求項２】 組織トロンボプラスチンがヒト又は動物
の各種臓器由来である請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 活性化酵素が、Echis carinatus , Di
spholidus tysus, Oxyuranus scutellatus 又はNo
techis scutatusの蛇毒から精製されたプロトロンビン
活性化酵素、または黄色ブドウ球菌由来のプロトロンビ
ン活性化酵素である請求項１又は２記載の測定方法。 - 【請求項４】 組織トロンボプラスチンが、ヒト又は動
物の脳、肺、胎盤由来である請求項１から３のいずれか
１項記載の測定方法。 - 【請求項５】 血液試料が血清である請求項１から４の
いずれか１項記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4063698A JP2570053B2 (ja) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | 異常プロトロンビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4063698A JP2570053B2 (ja) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | 異常プロトロンビンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260998A true JPH05260998A (ja) | 1993-10-12 |
| JP2570053B2 JP2570053B2 (ja) | 1997-01-08 |
Family
ID=13236861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4063698A Expired - Fee Related JP2570053B2 (ja) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | 異常プロトロンビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2570053B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5649394A (en) * | 1979-09-28 | 1981-05-02 | Kiichi Asai | Preparation of blood coagulation factor 5, and determination of abnormal prothrombinase activity |
-
1992
- 1992-03-19 JP JP4063698A patent/JP2570053B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5649394A (en) * | 1979-09-28 | 1981-05-02 | Kiichi Asai | Preparation of blood coagulation factor 5, and determination of abnormal prothrombinase activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2570053B2 (ja) | 1997-01-08 |
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