用于测量存在于生物学流体样品中的微颗粒的纤溶酶活性的方法及用途
本发明的目标在于用于测量存在于生物学流体,特别是处于流动状况下的生物学流体的样品中,或者存在于组织提取物中的微颗粒,特别是循环微颗粒的纤溶酶活性的方法,所述方法可以用作诊断方法或用作对治疗进行追踪的方法。
由于细胞膜的出芽而导致的微颗粒已经在各种细胞模型中和在许多病理状态中被描述为细胞的激活和/或凋亡的可靠标志物。
具体而言,本发明人最初描述了,内皮细胞响应于炎性刺激而释放这些微颗粒,以及在呈现出血栓形成风险的患者中内皮循环微颗粒的量增加。此后,在不同的病理状态例如冠状动脉综合征,肾功能不全,糖尿病,抗磷脂综合征(APLS),血栓性血小板减少性紫癜(TTP)或镰状细胞病,其中微颗粒的存在反映了内皮功能障碍并且为预后不良的指示的病症之中描述了升高的内皮循环微颗粒的水平。
因为微颗粒表达来源于它们所源自的细胞的各种生物活性组分,所以它们可以呈现出广泛范围的生物学活性,所述生物活性能够调节内皮细胞或血细胞的功能,影响血管的内环境稳定,和参与炎症反应或血管发生。
例如,微颗粒,特别是循环微颗粒,呈现出在凝血因子的装配和激活中所牵涉的促凝血磷脂表面。
同样地,微颗粒特别是循环微颗粒参与凝血酶的产生是由于它们在血管腔隙中表达、转移或诱导组织因子的能力而引起的。
在止血平衡的主要调节剂中,纤溶酶原激活系统是用于溶解纤维蛋白凝块的主要生理学途径。这个途径还通过帮助细胞外基质的组分的蛋白水解而促进血管发生。
纤溶酶原向活性纤溶酶的转化依赖于两种丝氨酸蛋白酶:组织纤溶酶原激活物(t-PA:组织型纤溶酶原激活物),其在血管中主要牵涉纤维蛋白溶解;和尿激酶(u-PA:尿激酶型纤溶酶原激活物),其通过与其特异性受体uPAR结合而牵涉细胞外周蛋白水解。
由uPA所诱导的纤溶酶产生和由此导致的基质金属蛋白酶(MMP)的激活有助于细胞穿过间质基质的迁移,并且参与诸如组织重塑、转移性侵袭和血管发生的过程。
纤溶酶原的不受控制的和/或过度的激活可能通过诱导细胞脱离和/或细胞凋亡而具有有害的后果。因此,意识到,调节在细胞特别是内皮细胞的表面上纤溶酶的表达在血管内环境稳定的调节中具有至关重要的重要性。
因此,通过阅读上文,可以意识到在下列方面的益处:一方面能够评估在生物学流体中,特别是在处于流动状况下的生物学流体,非常特别是血液中,或者在组织提取物中,微颗粒,特别是循环颗粒的“纤溶酶活性”的产生;和另一方面能够调节这种活性。
“生物学流体”意指任何可提取的体液,包括例如血液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡液(BAF)、尿液、滑液、母乳、唾液、泪液、精液、腹水、胸腔积液、羊膜液。
“处于流动状况下的生物学流体”意指天然地在身体内或在身体外流动的任何体液,包括例如循环血液、母乳、尿液、唾液、泪液、精液、月经流出物和任何其他浆液性和/或粘液性流出物。
在组织提取物的来源中,可以提及动脉粥样化斑块或任何其他通过外科手术获得的组织。
在本文中,术语“纤溶酶活性”应当理解为包含微颗粒(特别是循环微颗粒)的生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体)的样品产生纤溶酶的能力,无论应用何种机制。
作为诊断方法,在包含微颗粒(特别是循环微颗粒)的生物学流体样品中测量“测试样品的纤溶酶活性”的值,并且与在获自被称为“正常”(即不呈现病理学状况)的个体的对照样品中这一相同能力的测量相比较,如果其显著大于对照的纤溶酶活性值,那么将会反映,例如但不限于,对于个体来说具有或多或少升高的例如遭受由于增加的动脉粥样化斑块的不稳定性而引起的血管意外的风险,对于患有癌症的个体来说具有或多或少升高的遭受转移性侵袭的风险,或者对于个体来说具有或多或少升高的遭受脑血管意外及其对于大脑功能的有害后果的风险。如果“测试样品的纤溶酶活性”的这个值小于对照的纤溶酶活性值,那么它将会例如反映对于其血液进行了测试的个体来说具有增加的血栓形成风险。
作为治疗的追踪,在来自正进行治疗的个体的生物学流体样品(特别是处于流动状况下的生物学流体)的微颗粒(特别是循环微颗粒)中测量“测试样品的纤溶酶活性”的值,并且与在治疗前或在治疗早期获自同一个体的对照样品中这一相同能力的测量相比较,所述“测试样品的纤溶酶活性”的值使得能够追踪所述个体根据施用给其的治疗所作出的应答的演变。
然而,依然存在有对于下列方面的需要:即用于患者所承受的与其血液的太强或太弱的纤溶酶活性相关的风险的简单、有效且可靠的测试,或者用于追踪治疗(其旨在调节个体的生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体)的微颗粒(特别是循环微颗粒)的纤溶酶活性)的演变的简单测试。
提供此类测试是本发明的目的之一。
事实上,在长期工作后,令人惊讶地,本发明人以其知识首次显示,存在于个体的生物学流体,特别是处于流动状况下的生物学流体,特别是血液中的循环微颗粒具有赋予它们产生纤溶酶的能力的生物学活性。
基于该发现,本发明的目标在于用于测量事先抽取的生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体,特别是血液)的样品的微颗粒(特别是循环微颗粒)的纤溶酶活性的方法,其中
-在第一步骤中,分离出存在于所述样品中的微颗粒,特别是循环微颗粒,
-在第二步骤中,通过任何合适的方式来测量在步骤1中分离出的所述微颗粒产生纤溶酶的能力,和
-在第三步骤中,将在步骤2中获得的测量结果与在相同条件下对于对照相同生物学流体的样品所进行的相同测量的结果相比较。
根据本发明的一种变化形式,所述对照相同生物学流体可以为与所测试的生物学流体相同但来源于至少一个被认为健康(即不呈现病理学状况,至少不呈现其生物学流体被测试的个体所遭受的病理学状况)的个体的生物学流体,从而使得能够就被认为正常的值而言来评估所述个体的风险。
根据本发明的另一种变化形式,所述对照相同生物学流体可以为与所测试的生物学流体相同、来源于同一个体但在提供了测试样品的那次取样之前例如在治疗开始前的取样中获得的生物学流体,以便能够建立对于例如在治疗过程中微颗粒产生纤溶酶的能力的演变的追踪。
根据本发明,该方法的第一步骤(分离出存在于样品中的微颗粒,特别是循环微颗粒)可以根据与此类微颗粒的分离相容的任何程序来进行。例如,可以提及高速离心或者生物捕获技术,不论捕获支持物是什么(例如,抗体,例如膜联蛋白V的抗体)。
依照根据本发明的方法的第一步骤的一种优选的变化形式,微颗粒(特别是循环微颗粒)可以通过在这样的程序中的一系列离心和超速离心来进行分离,根据所述程序,
-在步骤1A中,在2-6℃,优选地3-5℃的温度下,以1000g-2000g,优选地1200g-1800g的速度,使体积为500μl-5ml,优选地1ml-2ml的事先抽取的生物学流体,特别是处于流动状况下的生物学流体,例如血液的样品离心5分钟-20分钟,优选地10-15分钟的时间;
-在步骤1B中,在2-6℃,优选地3-5℃的温度下,以10000g-20000g,优选地12000g-15000g的速度,使在步骤1A中获得的上清液离心1分钟-5分钟,优选地2-3分钟的时间;
-在步骤1C中,在2-6℃,优选地3-5℃的温度下,以15000g-25000g,优选地18000g-22000g的速度,使在步骤1B中获得的上清液离心45-120分钟,优选地60-100分钟的时间;
-在步骤1D中,将在步骤1C中获得的粒状沉淀接纳在体积为250μl-4ml,优选地1-2ml的磷酸缓冲盐水(PBS)中,并且在2-6℃,优选地3-5℃的温度下,以15000g-25000g,优选地18000g-22000g的速度,使该混合物离心45-120分钟,优选地60-100分钟的时间;
-在步骤1E中,将在步骤1D中获得的粒状沉淀接纳在体积为250μl-4ml,优选地1-2ml的磷酸缓冲盐水(PBS)中,并且在2-6℃,优选地3-5℃的温度下,以15000g-25000g,优选地18000g-22000g的速度,使该混合物离心45-120分钟,优选地60-100分钟的时间;
-在步骤1F中,将在步骤1E中获得的粒状沉淀接纳在体积为20μl-500μl,优选地50-100μl的磷酸缓冲盐水(PBS)中。
在步骤1F中获得的微颗粒(特别是循环微颗粒)的悬浮液可以立即用于分析,或者可以优选地贮存于-80℃。
根据本发明,该方法的第二步骤(测量微颗粒,特别是循环微颗粒产生纤溶酶的能力)可以直接对于在第一步骤结束时获得的微颗粒的量来进行。优选地,根据本发明,该方法的第二步骤可以对于在第一步骤结束时获得的微颗粒的确定的量来进行,所述量可以为10000-1000000个微颗粒,优选地100000-300000个微颗粒。在这种情况下,根据本发明的方法可以包括对在第一步骤结束时获得的微颗粒进行计数的另外步骤(步骤1bis),所述计数步骤在根据本发明的方法的第一步骤和第二步骤之间发生。
根据本发明,所述计数步骤可以根据任何已知的微颗粒计数方法来进行。有利地,微颗粒的计数可以通过流式细胞术来进行,其中根据在现有技术中常规使用的方案,例如在法国专利申请FR-A-2795820中所描述的那些,或者通过基于微颗粒的促凝血活性的检测测试(Zymuphen MP-activity,Hyphen BioMed)或蛋白质含量测定来进行。优选地,根据本发明,通过流式细胞术来对微颗粒进行计数。
根据本发明,该方法的第二步骤,即在步骤1中分离出的所述微颗粒(特别是循环微颗粒)产生纤溶酶的能力的测量,可以通过测量在所述微颗粒上自发存在的纤溶酶的量或者通过测量能够由这些微颗粒产生的纤溶酶的量来进行测定。
纤溶酶的所述测量可以通过任何已知的方法来进行。
依照根据本发明的方法的步骤2的一种变化形式,在微颗粒(特别是循环微颗粒)上自发存在的纤溶酶的量的测量可以通过任何已知的方法,例如使用抗纤溶酶(抗纤溶酶原)抗体(例如TC12040,Technoclone,Austria或产品3641,American Diagnostica)的免疫学测量(FASEB J 2003,17:1301-3)(ELISA或Western印迹),或者通过经由使用纤溶酶的选择性生色底物(例如CBS0065,Stago)在405nm处读取样品的吸光度而施行的分光光度法来进行。
依照根据本发明的方法的步骤2的另一种变化形式,能够由微颗粒(特别是循环微颗粒)产生的纤溶酶的量的测量可以根据ThrombHaemost 2004;92:1066-75中所描述的程序来进行,在所述程序中,
-在步骤2-1中,向在根据本发明的方法的步骤1或步骤1bis中获得的微颗粒中,以0.1μM-2.0μM,优选地0.5μM-1μM的最终量添加纤溶酶原(有利地经纯化的),以及以0.50mM-1.0mM,优选地0.65mM-0.85mM的最终量添加纤溶酶的选择性生色底物,例如由STAGO公司(France)销售的(甲基-丙二酰基)-羟丙基精氨酸-对硝基苯胺((méthyl-malonyl)-hydroxypropylarginine-p-nitroanilide)(CBS0065);
-在步骤2-2中,例如在干燥箱中,使在步骤2-1中获得的混合物在25℃-45℃,优选地30℃-40℃的温度下温育30分钟-90分钟,优选地50-70分钟的时间,和
-在步骤2-3中,通过经由在405nM处读取样品的吸光度而施行的光度法来检测能够被产生的纤溶酶的量(例如,在96孔平板阅读器例如Dynex MR 700微量培养板阅读器中)。
根据步骤2-1的一种变化形式,纤溶酶的选择性底物可以为荧光底物,例如H-D-Val-Leu-Lys-7-氨基-4-甲基香豆素(Bachem,Bubendorf,Switzerland)或D-AFK-ANSNH-C4H9.2HB(HaematologicTechnologies Inc,Vermont USA)。
根据步骤2-2的一种变化形式,将在步骤2-1中获得的混合物放置在恒温于37℃的平板阅读器中,所述平板阅读器通过随着时间测量在405nm处的吸光度来测量纤溶酶形成的动力学。
根据本发明,该方法的第二步骤可以在与待施行的温育和测量相容的任何支持物上进行。在这方面,可以提及圆底杯形器或平底杯形器,例如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的48或96孔平板的杯形器。优选地,根据本发明的方法的步骤2在96孔平板的圆底杯形器或平底杯形器中进行。
根据本发明,能够由微颗粒(特别是循环微颗粒)产生的纤溶酶的量,或者在微颗粒(特别是循环微颗粒)上自发存在的纤溶酶的量的测量可以在25μl-150μl,优选地50μl-100μl的终体积中进行,例如使用以1.0-3.0mg/ml,优选地1.5-2.5mg/ml的浓度添加有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)来进行调整。每孔中待测试的微颗粒的数目可以为50000-400000个颗粒/孔,优选地100000-200000个颗粒/孔。有利地,当在圆底杯形器中进行测量时,终体积优选地为50μl,而当在平底杯形器中进行测量时,终体积优选地为100μl。根据本发明,将结果表示为“产生的纤溶酶的量/微颗粒数目”。
在生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体,非常特别是血液)的样品中,所述微颗粒(特别是所述循环微颗粒)代表了微颗粒的总群体,关于这些微颗粒先前已知晓,它们起源于细胞出芽,并且它们可以源自许多不同的细胞类型。在这方面,可以提及源自内皮细胞、造血细胞的微颗粒。
因此,根据它们所源自的细胞类型,微颗粒(特别是循环微颗粒)将会具有对于它们所源自的细胞类型来说固有的特征。在此基础上,可以根据其起源来分离微颗粒,从而产生不同的单一类型微颗粒的群体。然而,仅对特定类型的微颗粒施行纤溶酶活性的测量可以是有好处的。
因此,根据本发明的一个特别的实施方案,该方法还可以包括根据其起源来分离微颗粒的步骤1ter。该步骤可以在根据本发明的方法的第一步骤之后进行,即在所述方法的步骤1或步骤1bis之后,优选地在步骤1之后且在步骤1bis之前。
目的微颗粒的分离可以通过现有技术已知的任何方法来进行。在这方面,可以提及通过细胞计量术的细胞分选操作程序或者磁性免疫分离法。优选地,根据本发明,使用磁性免疫分离方法。
依照根据本发明的方法的另外一种变化形式,可以将在步骤1中分离出的微颗粒固定在支持物上,在所述支持物上将会进行步骤2。微颗粒的固定可以根据现有技术已知的任何方法来进行,特别是在国际申请WO-A-96/03655中所描述的那种。例如,可以通过使用由于识别所述微颗粒的表面的成分而能够固定微颗粒的化合物覆盖支持物的表面,来制备在根据本发明的方法的步骤2中使用的支持物。在这方面,可以提及识别促凝血磷脂的膜联蛋白V,或者对于膜的活性和/或功能性构象糖蛋白复合物GPIIb/GPIIIa特异的抗体,或者单核细胞或淋巴细胞的粘着受体LFA-1,或者内皮血栓调节蛋白,或者CD146。依照根据本发明的方法的另一种变化形式,可以使用聚阳离子例如聚-L-赖氨酸来固定微颗粒。
本发明的目标还在于存在于生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体)的样品中的微颗粒(特别是循环微颗粒)在用于测量生物学流体的所述样品的纤溶酶活性的方法中,特别是在先前所描述的用于测量纤溶酶活性的方法中的用途。
本发明的目标还在于存在于生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体)的样品中的微颗粒(特别是循环微颗粒)在诊断方法中的用途,所述诊断方法在所述生物学流体所源自的个体中诊断
-具有或多或少升高的遭受例如由于增加的动脉粥样化斑块的不稳定性而引起的血管意外的风险,或者
-对于患有癌症的所述个体来说具有或多或少升高的遭受转移性侵袭的风险,或者
-对于所述个体来说具有或多或少升高的遭受脑血管意外、其出血性并发症或其对于大脑功能的后果的风险,
-对于所述个体来说具有遭受血栓形成的风险,
-对于所述个体来说具有或多或少升高的患其中由微颗粒所进行的纤溶酶产生被增加的疾病的风险,所述疾病例如为纤维蛋白溶解过度或细胞外周蛋白水解。
优选地,根据本发明,所述诊断方法为先前所描述的用于测量纤溶酶活性的方法。
本发明的目标还在于存在于生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体)的样品中的微颗粒(特别是循环微颗粒)在用于追踪所述生物学流体所源自的个体对于治疗所作出的应答的方法中的用途。
优选地,根据本发明,所述用于对治疗进行追踪的方法为先前所描述的用于测量纤溶酶活性的方法。
此外,本发明人已可以显示,在生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体,例如血液)中所包含的、具有在本发明的意义内的纤溶酶活性的循环微颗粒(特别是源自内皮细胞的微颗粒),对于失活(特别是对于由在生物学流体中存在的蛋白水解酶的抑制剂所导致的中和或抑制)具有很大的抗性。这种性质赋予所述循环微颗粒以这样的能力,即经由生物学流体运输纤溶酶活性穿过生物体直至纤溶酶的存在发挥其活性的地点,而没有抑制风险,至少具有极大减少的抑制风险。在这方面已知,循环的天然纤溶酶在生物学流体中被快速抑制。因而,所述微颗粒可以被看作类似于纤溶酶活性的载体,这使得能够考虑就这样来使用它们(一旦经纯化或半纯化)。同样地,携带组织因子的微颗粒在先天性出血性疾病例如血友病的治疗中是潜在有用的(Nature Medicine 2003,9:1020-1025)。
根据本发明,“经纯化或半纯化”是表示,微颗粒在经历了至少一个纯化步骤后才进行使用。
因此,本发明的目标在于经纯化或半纯化的源自内皮细胞的微颗粒(特别是循环微颗粒)作为纤溶酶活性的载体的用途。
本发明的目标还在于经纯化或半纯化的微颗粒(特别是循环微颗粒,特别是源于内皮细胞的微颗粒)作为药物,特别是具有蛋白水解或抗血栓形成活性的药物的用途。
通过阅读下面的实施例(仅为了举例说明而给出,而丝毫不限制本发明)后,本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
实施例
实施例1:由处于培养中的内皮细胞的微颗粒所携带的纤溶酶活性的证明
1-A:内皮细胞的微颗粒的制备
将人微血管内皮系细胞HMEC-1(J.Invest.Dermatol.1992;99:683-90)在MCDB 131培养基(Invitrogen Life Technologies,CergyPontoise,France)中培养至亚汇合,所述MCDB 131培养基添加有10%不含微颗粒的胎牛血清(FCS)、10ng/ml重组人EGF(Upstate CellSignaling Solutions,Lake Placid,NY,USA)和1μg/ml氢化可的松(Sigma,St Quentin Fallavier,France)。
根据J.Clin.Invest.1999 Jul;104(1):93-102中所描述的条件,从用100ng/ml TNF-α(PeproTech Inc,Rocky Hill,NJ,USA)刺激了48小时的HMEC-1细胞的培养基中纯化出内皮微颗粒(EMP)。
将培养物的上清液在4300g下离心5分钟,以便从中清除细胞和漂浮的细胞碎片。
然后,将上清液于4℃在20000g下离心120分钟。
然后,EMP粒状沉淀用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤2次,并重悬浮于PBS中。通过缀合至异硫氰酸荧光素(FITC)(Abcys,Paris,France)的膜联蛋白V,来对EMP(稀释至1/100)的悬浮液的10μl等分试样进行标记。如先前在J.Thromb.Haemost.2004 Oct;2(10):1842-3和法国专利申请FR-A-2795820中所描述的,通过流式细胞术来对EMP进行计数。
1-B:EMP的固定
根据物理化学吸附原理,使EMP固定在聚阳离子表面上。
为此,将由PVC制成的96孔平板的圆底孔的壁和底部用25μg/ml聚-L-赖氨酸(Aldrich-Sigma)进行活化。然后,将不同浓度的在PBS中的EMP于4℃在事先经活化的孔中温育过夜。然后,对所述孔进行洗涤,并且在纤溶酶产生的测试中使用经固定的EMP。
1-C:纤溶酶产生的测试
1-C-1:方案
在由PVC制成的96圆底孔平板的孔中,将不同浓度的在添加有0.8%牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中的EMP悬浮液与50μl的1μM纤溶酶原和0.75mM(甲基-丙二酰基)-羟丙基精氨酸-对硝基苯胺(CBS0065,Stago,Asnières,France)(纤溶酶的选择性生色底物)的混合物一起进行温育。
将相同体积的来自EMP的最后一次洗涤的上清液用作对照。
将微量培养板放置在微量培养板阅读器中,并且于37℃,使用对于阅读多孔平板而言经适应调整的分光光度计(MX5000,Dynex),通过测量随着时间过去由于对硝基苯胺的释放而产生的在405nm处的吸光度的变化,来在9小时内追踪纤溶酶出现的动力学。
1-C-2:结果
这些测量的结果显示在下表中:
EMP/50μL |
A405nm/分钟 |
106 |
48.7 |
105 |
12.9 |
5×104 |
4.7 |
104 |
1.6 |
103 |
1.1 |
0 |
0.5 |
EACA:ε-氨基己酸,纤溶酶原与MP结合的抑制剂。
1-D:米氏常数的测量
1-D-1:对于处于悬浮状态下的EMP的测量
1-D-1a:方案
在由PVC制成的96圆底孔平板的孔中,在0.75mM(甲基-丙二酰基)-羟丙基精氨酸-对硝基苯胺(CBS0065,Stago,Asnières,France)(纤溶酶的选择性生色底物)存在下,在50μl的终体积中,将悬浮在添加有0.8%牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中的2×105个EMP与不同浓度的纤溶酶原(0-5μM)一起进行温育。
将相同体积的来自EMP的最后一次洗涤的上清液用作对照。
1-D-1b:结果
这些测量的结果显示在下表中:
Pg(μM) |
A405nm/分钟 |
5 |
36.8 |
2.5 |
31.8 |
1.25 |
25.9 |
0.62 |
21.8 |
0.31 |
18.2 |
0.18 |
16.4 |
0 |
0.4 |
通过应用米-曼方程,这些结果使得能够测定关于纤溶酶的特异产生的米氏常数:Km=0.122μM。
1-D-2:对于固定的EMP的测量
1-D-2a:方案
如上文所指明的(1-B微颗粒的固定),将微颗粒固定在孔中。
根据与关于处于悬浮状态下的EMP相同的方案,将纤溶酶原和生色底物添加至固定的微颗粒。
在微量培养板阅读器中,通过测量在405nm处的吸光度来检测纤溶酶形成的动力学。
这种变化形式使得能够在检测激活动力学后测量与固定的微颗粒结合的纤溶酶。为此,平板用PBSA进行洗涤,并且通过添加50μl/孔的0.325mM CBS0065并测量在405nm处的吸光度的变化来检测与固定的微颗粒结合的纤溶酶。
1-D-2b:结果
EMP/50μL |
A405nm/分钟 |
2×105 |
4.6 |
105 |
2.3 |
7.5×104 |
1.5 |
5×104 |
0.8 |
2.5×104 |
0.6 |
1-E:结论
这些结果表明,由微颗粒进行的纤溶酶形成随着添加至孔中的微颗粒的数目而变化,或者在固定浓度的微颗粒时随着所添加的纤溶酶原的浓度而变化。这些结果还表明,微颗粒的这种效用是由于存在于微颗粒上的纤溶酶原激活物的存在而引起的。
实施例2:在体内由微颗粒所携带的纤溶酶活性的证明
2-A:方案
从事先于呈现出具有血栓形成风险的自身免疫病理学状况的个体中获得的总血液样品开始,根据下述方法分离出微颗粒:
+(步骤1A)在4℃的温度下以1500g的速度使2ml所述血液样品离心10分钟;
+(步骤1B)在4℃的温度下以17500g的速度使在步骤1A中获得的上清液离心2分钟;
+(步骤1C)在4℃的温度下以17500g的速度使在步骤1B中获得的上清液离心90分钟;
+(步骤1D)将在步骤1C中获得的粒状沉淀接纳在1000μl磷酸缓冲盐水(PBS)中,并且在4℃的温度下以17500g的速度使该混合物离心90分钟;
+(步骤1E)将在步骤1D中获得的粒状沉淀接纳在1000μl磷酸缓冲盐水(PBS)中,并且在4℃的温度下以17500g的速度使该混合物离心90分钟;
+(步骤1F)将在步骤1E中获得的粒状沉淀接纳在50μl磷酸缓冲盐水(PBS)中,以用于贮存和以后的使用。
通过流式细胞术来对在步骤1F中如此获得的微颗粒进行计数。
在96孔平板(Vinyl alphanumeric U形底平板,Ref.2101,Thermo)的圆底杯形器中,在50μl的终体积(必要时,用以2mg/ml的终浓度添加有牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)进行调整)中,向事先获得的并且保存于以2mg/ml的终浓度添加有牛血清白蛋白的PBS中的200000个微颗粒之中,以0.5μM(或1μM)的终浓度添加经纯化的纤溶酶原(Américan Diagnostica,Hyphen)和以0.75mM的终浓度添加CBS0065(STAGO)。
在完成了在96孔平板中在50μl的终体积中向微颗粒之中添加纤溶酶原和生色底物后,将所述平板直接放置在恒温于37℃的光度计(MX5000,Dynex)中,以便在4-8小时内随着时间过去检测在405nm处的吸光度的变化。
在相同条件下平行地测量来源于没有血栓形成风险的受试者的对照样品的纤溶酶活性。相对于用各种不同浓度的纤溶酶(0-20nM)制作的参照曲线来计算由微颗粒产生的纤溶酶的量。
2-B:结果
P |
A |
P |
A |
P |
A |
P |
A |
P |
A |
P |
A |
1 |
1.35 |
5 |
3.5 |
9 |
0.4 |
13 |
1.5 |
17 |
3.75 |
21 |
1.5 |
2 |
1.8 |
6 |
1.0 |
10 |
0.7 |
14 |
1.05 |
18 |
7.5 |
22 |
0.9 |
3 |
0.7 |
7 |
0.6 |
11 |
1.2 |
15 |
1.8 |
19 |
6.5 |
|
|
4 |
0.5 |
8 |
2.8 |
12 |
9.05 |
16 |
2.15 |
20 |
0.85 |
|
|
A:吸光度(405nm/分钟);P=患者
2-C:结论
这些结果表明,从呈现出自身免疫疾病的受试者的血浆开始而分离出的循环微颗粒如在体外测试的原型颗粒一样产生纤溶酶。这些结果还表明,在体内产生的微颗粒的这种效用依赖于所添加的纤溶酶原的存在。