CN107109458B - 基于细胞的去纤维蛋白多核苷酸效力测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于细胞的用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物学活性的方法。特别地,本发明提供,通过在至少一种细胞毒性剂和一个或更个浓度的去纤维蛋白多核苷酸的存在下评估哺乳动物细胞的生存力,用于评估去纤维蛋白多核苷酸的效力的方法。该方法特别地可用于使包含去纤维蛋白多核苷酸的药物组合物标准化。
Description
背景技术
医学物质应该以恒定的比活性水平生产,以便能够实现安全递送。例如,生物分子例如肝素的分析,在批与批之间在链长度、分子量、组成、硫酸化程度等等方面具有可变性。从天然物质中提取的其它物质也需要被标准化。参见例如美国专利号7,575,886。一种这样的物质是去纤维蛋白多核苷酸。去纤维蛋白多核苷酸是从哺乳动物器官中提取的长度不一的单链多核苷酸的异质混合物。
存在可以用来评估去纤维蛋白多核苷酸的生物学活性的试验,包括纤维蛋白平板试验和关于优球蛋白溶解时间的血栓弹力图记录(Prino G.等人,Indagini preliminarisull'attivitfibrinolitica,nell'animale e nell'uomo,di una nuova sostanzapresente in diversi organi animali,Simposio Internazionale:La ricercascientifica nell'industria farmaceutica in Italia,Rome,1975年10月2-4-IIFarmaco,Ed.Prat.)(1969),24,552-561)、纤溶酶方法(美国专利号7,338,777)和优球蛋白方法(WO2013/190582)。尽管这些方法是有用的制药工具,然而所有这些基于去纤维蛋白多核苷酸的促纤维蛋白溶解性质的方法都涉及,对于去纤维蛋白多核苷酸在分离的蛋白质或酶上的活性的评估。
因此,在本领域中需要在细胞水平用来测定去纤维蛋白多核苷酸的生物学活性的新方法,其可以精确并且可靠地评估新批次的去纤维蛋白多核苷酸的功效(例如通过和参比去纤维蛋白多核苷酸标准制品比较),而不考虑所用的去纤维蛋白多核苷酸生产工艺。
发明概述
本发明部分地基于这样的发现:去纤维蛋白多核苷酸以剂量依赖性方式保护哺乳动物细胞免于特定细胞毒剂诱导的细胞毒性。本发明人利用此细胞保护作用,开发了基于细胞的方法用于评估去纤维蛋白多核苷酸批次的效力,并定义了量度单位以利于有效和安全施用。这样的方法尤其允许在去纤维蛋白多核苷酸生产方法期间进行质量控制、对通过不同的方法或来源生产的去纤维蛋白多核苷酸批次进行标准化、以及实现对患者一致的去纤维蛋白多核苷酸剂量给药。
附图简述
图1.通过MTT试验测定的、在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸时与氟达拉滨一起孵育的HMEC细胞的生存力。在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸(DF)(1μg/ml-100μg/ml)时,HMEC-1与10μg/ml氟达拉滨(F-Ara)一起孵育72小时,采用MTT试验测定所述的细胞的生存力。Student t检验:§p<0.01,F-ara 10μg/ml vs.对照(ctr);*p<0.05,用DF以1μg/ml处理的细胞vs.10μg/ml的F-ara处理的细胞;**p<0.001,10和100μg/ml的DF vs.10μg/ml的F-ara。
图2.通过CCK-8试验测定的,在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸时与阿霉素(doxorubicin)一起孵育的SK-HEP-1细胞的生存力。在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸(DF)(1μg/ml-100μg/ml)时,采用阿霉素(Dox)以0.1μg/ml孵育SK-HEP-1细胞持续72小时,并且采用CCK-8试验测定所述的细胞的生存力。Student t检验:§p<0.01,Dox 0.1μg/ml vs.对照(ctr);*p<0.01,用DF以50或100μg/ml处理的细胞vs.用Dox以0.1μg/ml处理的细胞。
图3.通过MTT试验测定的,在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸、AC或ACTG时,用氟达拉滨孵育的HMEC-1细胞的生存力。在存在或不存在不同浓度的、大约16kDa的随机合成的腺嘌呤-胞嘧啶(AC)寡核苷酸(1-500μg/ml)(图3A)、大约17kDa的随机合成的腺嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-胸腺嘧啶(ACGT)寡核苷酸(12.5-50μg/ml)(图3B)、或去纤维蛋白多核苷酸(5-100μg/ml)(图3C)时,采用氟达拉滨(F-Ara)以50μg/ml孵育HMEC-1细胞持续72小时,并且采用MTT试验测定所述的细胞的生存力。Student t检验:*p<0.01,F-ara 50μg/ml vs.对照(Ctr),**p<0.01F-ara 50μg/ml vs.去纤维蛋白多核苷酸。两种合成寡核苷酸都没有提供显著的保护作用。
图4.通过CCK-8试验测定的,在存在或不存在不同浓度的ACTG、tpA或谷胱甘肽时,采用氟达拉滨孵育的SK-HEP-1细胞的生存力。在不存在或存在(A-G)不同浓度的、大约17kDa的随机合成的腺嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-胸腺嘧啶(1.25-80μg/ml)、tPA(10-320IU/ml)、或谷胱甘肽(1.25-80μg/ml)时,采用氟达拉滨(F-ara)以10μg/ml孵育SK-HEP-1细胞持续72小时,采用CCK-8试验测定所述的细胞的生存力。Student t检验:*p<0.01,F-ara 10μg/ml vs.对照(Ctr)。ACGT、tPA和谷胱甘肽对F-ara诱导的细胞毒性均没有提供显著保护作用。
图5.在细胞保护试验中,比较标准的去纤维蛋白多核苷酸相对于酸胁迫的(图5A)和碱胁迫的(图5B)去纤维蛋白多核苷酸样品的剂量-反应曲线。使用PLA2统计分析程序(4-参数逻辑函数分析)处理原始吸光度数据。把细胞生存力指示剂染料(CCK-8)的吸光度绘制在Y轴上作为“反应”。把剂量绘制在X轴上并且在本试验中剂量是去纤维蛋白多核苷酸的2倍稀释系列(1.25–80μg/ml);STD代表参比标准去纤维蛋白多核苷酸。在各图中,较低的迹线(对应于受胁迫的样品)指示减小的效力。使用此统计分析程序,两种受胁迫的样品都未满足合格的统计标准。
图6.通过CCK-8试验测定的,在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸时,采用氟达拉滨孵育的SK-HEP–1细胞的生存力。在存在或不存在不同浓度的去纤维蛋白多核苷酸(DF)(1μg/ml-100μg/ml)时,采用氟达拉滨(F-Ara)以10μg/ml孵育SK-HEP-1细胞持续72小时,采用CCK-8试验测定所述的细胞的生存力。Student t检验:§p<0.01,F-ara 10μg/ml vs.对照(Ctr),以及对于用DF以>1μg/ml处理的细胞vs.用F-ara以10μg/ml处理的细胞。
图7.评估标准化的参比去纤维蛋白多核苷酸样品(标准)和具有未知生物学活性的去纤维蛋白多核苷酸样品之间的效力比。在氟达拉滨(F-ara)的存在(10μg/ml)下,使SK-HEP-1细胞暴露于6个系列稀释(1:2)的标准和样品去纤维蛋白多核苷酸,以提供80、40、20、10、5、2.5和1.25μg/ml的浓度。每一种浓度的标准和样品由4次重复组成。在37℃孵育72小时以后,采用CCK-8试验测定所述的细胞的生存力。对吸光度测定值进行统计分析,用于样品效力的确定(4-参数逻辑分析)。
发明详述
本发明提供,基于去纤维蛋白多核苷酸保护活细胞免于某些细胞毒性剂的作用的能力,用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物学活性的可靠方法。这种细胞保护作用对于去纤维蛋白多核苷酸用作医药产品是重要的。本方法允许将通过不同方法或来源获得的去纤维蛋白多核苷酸的活性标准化。本方法也允许确立和指定量度单位以利于去纤维蛋白多核苷酸的有效和安全施用。
在本发明的一个实施方案中,评估去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力的方法包括:(i)使哺乳动物细胞在培养中生长,(ii)采用包含至少一种细胞毒性剂和至少一种浓度的来自所述样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的溶液,孵育所述的细胞,(iii)在孵育期以后,测定所述细胞的生存力,和(iv)基于细胞生存力测定值,计算所述去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力。在一些实施方案中,本方法还包括:将所述的去纤维蛋白多核苷酸样品批次的细胞生存力与参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力进行比较,以及基于所述的比较,计算所述样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力。
为了本发明的目的,术语“效力”是指,去纤维蛋白多核苷酸的生物学活性的量度,特别地基于对去纤维蛋白多核苷酸保护活细胞免受细胞毒剂作用的能力的测量。去纤维蛋白多核苷酸(Merck索引,1996,序号2915;CAS序号83712-60-1)是一种天然来源的物质。它是通过从动物器官中提取而得到的低分子量聚脱氧核糖核苷酸的钠盐。已知去纤维蛋白多核苷酸具有在14和19kDa之间的分子量(MW),但是特定的测量技术显示:如果通过SEC-HPLC技术测定,去纤维蛋白多核苷酸具有大约16.1kDa±2.0kDa的平均分子量(MW);如果通过PAGE技术测定,去纤维蛋白多核苷酸具有大约17.6kDa±1.0kDa的MW;以及如果通过多角度激光散射技术测定,去纤维蛋白多核苷酸具有大约16.7kda±1.6kDa的MW。“Analysis ofAggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals”H.Mahler和W.Jiskoot(编辑.),2012John Wiley&Sons,Inc。
去纤维蛋白多核苷酸具有许多治疗性应用,包括用作血栓形成剂(美国专利号3,829,567)、治疗外周动脉病、治疗急性肾功能不全(美国专利号4,694,134)和治疗急性心肌局部缺血(美国专利号4,693,995)。新近,去纤维蛋白多核苷酸已经被用于治疗和预防窦状隙阻塞综合征/静脉闭塞性疾病(欧盟临床试验EudraCT:2004-000592-33、美国临床试验2005-01(ClinicalTrials.gov标识符:NCT00358501)。去纤维蛋白多核苷酸的其它用途被描述在下列专利和专利申请中,这些专利和专利申请在此通过全文引用并入:美国专利号3,770,720;3,829,567;3,899,481;4,693,134;4,693,995;4,938,873;4,985,552;5,081,109;5,116,617;5,223,609;5,646,127;5,646,268;5,977,083;6,046,172;6,699,985;6,767,554;7,338,777;8,551,967;8,771,663、美国专利公布号20080194506;20090131362;20110092576;20130231470;20140005256、美国专利申请号14/323,918;和WO 2013/190582。
可以使用本文中所描述的方法来评估通过不同的方法生产的或从不同的动物器官中提取的去纤维蛋白多核苷酸批次的效力。例如,在一些实施方案中,所述的去纤维蛋白多核苷酸样品批次是从牛组织例如牛的肺、肠或粘膜中提取的。在其它实施方案中,所述的去纤维蛋白多核苷酸样品批次是从猪组织例如猪的肺、肠或粘膜中提取的。去纤维蛋白多核苷酸样品批次也可以从来自其它动物物种(包括羊和马)的其它器官中提取。
在某些实施方案中,待通过本文中所描述的方法评估效力的去纤维蛋白多核苷酸样品批次是通过诸如描述在美国专利号4,985,552和5,223,609中的方法生产的,在此通过全文引用并入所述专利文献。特别地,采用这种方法得到的去纤维蛋白多核苷酸是对应于下式的随机序列的聚脱氧核糖核苷酸:
P1-5,(dAp)12-24,(dGp)10-20,(dTp)13-26,(dCp)10-20
其中:
P=磷酸基团
dAp=脱氧腺苷酸单体
dGp=脱氧鸟苷酸单体
dTp=脱氧胸苷酸单体
dCp=脱氧胞苷酸单体。
去纤维蛋白多核苷酸样品批次可以具有下列化学物理性质中的一种或多种或所有:电泳=均匀的阳极迁移率;在260±1nm处的消光系数E1cm 1%=220±10;消光比E230/E260=0.45±0.04;摩尔消光系数(涉及磷),ε(P)=7750±500;旋光度(rotary power)[α]D20°=53°±6;可逆增色度,以在天然DNA中的%指示,h=15±5;和0.95±0.5的嘌呤:嘧啶比率。
在某些实施方案中,待通过本发明所述方法评估效力的去纤维蛋白多核苷酸样品批次可能已经受过生理化学胁迫或疑似正暴露于生理化学胁迫,诸如高温、极端pH、过氧化氢等等。因此,也可以使用本发明所述的方法来评估已经在亚最佳条件下储存过或已经储存过延长的时间段的去纤维蛋白多核苷酸批次或包含去纤维蛋白多核苷酸的组合物的效力。在某些实施方案中,可以使用所述的方法来监测去纤维蛋白多核苷酸批次或包含去纤维蛋白多核苷酸的组合物的稳定性,例如用来预测储存期限。
本发明方法包括使哺乳动物细胞在培养中生长。在某些实施方案中,哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中,人细胞是人上皮细胞。在其它实施方案中,人细胞是人内皮细胞。在一个特定的实施方案中,人内皮细胞是人肝窦内皮细胞,例如SK-HEP-1细胞。在另一特定的实施方案中,人内皮细胞是人微血管内皮细胞,例如HMEC-1细胞。在另一特定的实施方案中,上皮细胞是角质形成细胞(例如HaCaT细胞)或肺泡上皮细胞(例如A549细胞)。可以从公认的保藏机构,例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)以及其它来源获得哺乳动物细胞。
用于使哺乳动物细胞在培养中生长的合适生长培养基是本领域中熟知的,并且例如公开在“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications”R.I.Freshney,2010,Wiley-Blackwell中。可以从专门的细胞供应商(例如:ATCC-LGC,MI,意大利;CDC,Atlanta,GA,美国),获得每一种类型的细胞的最佳培养基。在某些实施方案中,使哺乳动物细胞生长在补充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2.5μg/ml两性霉素B的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)中。在其它实施方案中,使哺乳动物细胞生长在补充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2.5μg/ml两性霉素B的RPMI 1640培养基中。在某些实施方案中,所述的生长培养基可以包含L-谷氨酰胺(例如2mM)、氢化可的松(例如10μg/ml)和表皮生长因子(例如10μg/ml)。
哺乳动物细胞的密度可以从大约5x 104个细胞/ml至大约5x 105个细胞/ml、从大约2.5x 104个细胞/ml至大约2.5x 105个细胞/ml、或从大约5x104个细胞/ml至大约2x105个细胞/ml。为了获得最佳的试验反应,在某些实施方案中,可以考虑细胞毒性剂的性质和用于试验的细胞类型来优化所述的细胞密度。例如,在多种实施方案中,其中把人内皮细胞用于所述的试验,特别合适的细胞密度为从大约2.5x 104个细胞/ml至大约2x105个细胞/ml,优选地大约5x 104个细胞/ml。这些细胞密度特别地适用于其中阿霉素或氟达拉滨作为细胞毒性剂的试验。
在本发明的另一个方面中,本发明方法包括,用包含细胞毒性剂和至少一种浓度的来自待评估的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的溶液,孵育培养中的哺乳动物细胞。正如本文中所用的那样,术语“细胞毒性剂”是指对细胞具有毒性效应(例如诱导细胞坏死、抑制细胞增长或细胞分裂、或诱导细胞凋亡)的化合物。化合物的细胞毒性可以由各种性质产生,其包括但不限于抗代谢物性质、烷基化性质、核酸嵌入性质、或细胞凋亡性质。
抗代谢物性质是化合物或其代谢物干扰生物分子例如DNA和RNA的正确合成的能力。具有抗代谢物性质的化合物的实例包括,核苷碱基类似物(例如嘌呤和嘧啶类似物)、核苷和核苷酸类似物、以及拮叶酸化合物。示例性的具有细胞毒性效应的核苷碱基和核苷类似物包括但是不限于,硫唑嘌呤(azathioprine)、硫嘌呤(thiopurine)(例如硫代鸟嘌呤(thioguanine)、巯基嘌呤(mercaptopurine))、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、6-氮尿嘧啶(6-azauracil)、clofarabine、nelarabine、克拉屈滨(cladribine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)和丁西他滨(decitabine)。拮叶酸剂的实例包括氨甲喋呤(methotrexate)、氨基蝶呤(aminopterin)、培美曲塞(pemetrexed)、普拉曲沙(pralatrexate)和raltitrexed。
烷基化性质是化合物或其代谢物将烷基转移到生物分子上或与生物分子内部的反应性基团(例如氨基、羧基、巯基和磷酸基)形成共价键的能力,其能够灭活或干扰它们的生物学功能。许多烷基化剂可以交联DNA链,损害DNA复制,这可以导致诱发细胞凋亡。烷基化剂的实例包括氮芥类(nitrogen mustards)(例如氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)和白消安(busulfan))、亚硝基脲类(nitrosoureas)(例如N-亚硝基-N-甲基脲(N-Nitroso-N-methylurea)、卡莫司订(Carmustine)、洛莫司汀(lomustine)和司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)以及链脲佐菌素(streptozotocin))、四嗪类(tetrazines)(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、mitozolomide和替莫唑胺(temozolomide))、氮丙啶类(aziridines)(例如噻替派(thiotepa)、mytomycin和diaziquone)以及顺氯氨铂类(cisplatins)(例如顺氯氨铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin))。
核酸嵌入性质是化合物或其代谢物插入DNA双螺旋(其能够引起突变)或插入RNA的螺旋结构区域内的能力。嵌入剂的实例包括溴化乙锭(ethidium bromide)、丝裂霉素(mitomycin)、放线菌素(actinomycin)、光辉霉素(plicamycin)、蒽环类(anthracyclines)(例如阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、valrubicin和米托蒽醌(mitoxantrone))、酞咪哌啶酮(thalidomide)和bleomicins。
细胞凋亡性质是化合物或其代谢物诱导程序性细胞死亡的能力。能够诱导细胞凋亡的一类具体化合物是抗微管剂,其干扰有丝分裂并且导致细胞周期停滞,从而诱导细胞凋亡。抗微管剂包括长春花生物碱(vinca alkaloids),例如长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、脱水长春花碱(vinorelbine)、脱乙酰长春花碱(vindesine)和vinflunine,以及紫衫烷类(taxanes),例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)。
拓扑异构酶抑制剂由于它们阻止DNA复制和转录的能力和/或通过引起DNA链断裂从而诱导细胞凋亡,也是细胞毒性的。拓扑异构酶抑制剂包括但是不限于伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、鬼臼亚乙苷(etoposide)、阿霉素(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊苷(teniposide)。
在本发明方法中使用的细胞毒性剂一般是合成的、半合成的或天然的化学化合物。所述的化合物可以具有一种或多种上面描述的性质。细胞毒性剂可以是任意一种本文中描述的化合物或其代谢物。在一些实施方案中,细胞毒性剂可以选自氟达拉滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、白消安、苯丙氨酸氮芥、顺氯氨铂、溴化乙锭、阿霉素、蒽环类、酞咪哌啶酮或其组合。在某些实施方案中,在本发明方法中使用的细胞毒性剂是氟达拉滨或它的活性代谢物、9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2-氟腺嘌呤(F-Ara-A)。在其它实施方案中,在本发明方法中使用的细胞毒性剂是阿霉素。
本领域技术人员通常已知的其它细胞毒性剂同样地适于使用在本发明方法中。例如,在一些实施方案中,细胞毒性剂减慢或停止细胞周期进展,和/或诱导细胞凋亡。这样类型的细胞毒性剂包括星形孢菌素(Staurosporine)、苯达莫司汀(Bendamustine)、卡莫司订(Carmustine)、伊马替尼(Imatinib)以及其盐(以Gleevec销售)、Ara-C、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)(例如吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin),以Mylotarg销售)、氮杂胞苷(Azacitidine)(以Vidaza销售)、丁西他滨(Decitabine)(以Dacogen销售)、伏立诺他(Vorinostat)(以Zolinza销售)和毒胡萝卜素(Thapsigargin)、H2O2和佛波醇肉豆蔻酯乙酯(Phorbol Myristate Acetate)。也参见在Healthcare Settings 2012,HHS,公布号2012-150中抗肿瘤药以及其它危险药物的NIOSH名单(http://www.cdc.gov/niosh/docs/ 2012-150/pdfs/2012-150.pdf)。
在本发明方法中使用的细胞毒性剂的浓度将会根据所用的特定的细胞毒性剂和哺乳动物细胞类型而变化。在其中氟达拉滨或F-ara-A作为细胞毒性剂的多种实施方案中,该细胞毒性剂以大约10μg/ml至大约50μg/ml的最终浓度存在于生长培养基中。在其中阿霉素作为细胞毒性剂的其它实施方案中,该细胞毒性剂以大约0.1μg/ml至大约10μg/ml的最终浓度存在于生长培养基中。
可以单独地或以2、3、4、5、6或更多种细胞毒性剂的组合方式使用细胞毒性剂。在某些实施方案中,对于单个去纤维蛋白多核苷酸样品批次,可以通过独立地评估其针对两种不同的细胞毒性剂的细胞保护效应来评价其效力。例如,通过采用第一细胞毒性剂(例如氟达拉滨)进行所述的方法,可以获得去纤维蛋白多核苷酸样品批次的第一效力值;以及通过采用第二细胞毒性剂(例如阿霉素)进行所述的方法,可以获得第二效力值。通过对所述的第一和第二效力值的数学比较,例如通过把这两个值平均或计算这两个值的比,可以确定去纤维蛋白多核苷酸样品批次的总效力。
在某些实施方案中,可以使用一组特定的培养条件来诱导对于哺乳动物细胞的细胞毒性,而不是利用一种或多种特定细胞毒性剂。例如,所述的方法可以包括,在至少一种浓度的去纤维蛋白多核苷酸存在下,使哺乳动物细胞暴露于诱导细胞凋亡的培养基,在孵育期以后测定所述的细胞的生存力,以及基于所述的细胞生存力测定值,计算去纤维蛋白多核苷酸的效力。诱导细胞凋亡的培养基可以包括具有酸性pH(例如大约2至大约6或大约4.5至大约6.5的pH)或碱性pH(例如大约7.5至大约10或大约8至大约9.5的pH)的培养基。诱导细胞凋亡的培养基也包括不含必需生长因子(例如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子)的培养基,因为生长因子的去除被认为是细胞凋亡的诱导者。正如本文中所用的那样,“诱导细胞凋亡的培养基”还可以指,处于特定的温度范围(例如大于37℃)或氧气浓度范围(小于5%氧气)的诱导细胞凋亡的培养基。诱导细胞凋亡的培养基或条件可以容易地由本领域普通技术人员针对在所述的方法中使用的特定的哺乳动物细胞类型进行调整。还可以使用紫外线或其它类型的辐射来诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,所述的孵育溶液,除了包含细胞毒性剂之外,还包含至少一种浓度的来自待评估的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸。来自所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸浓度(例如在包含细胞的培养基中的最终浓度)可以在从大约1μg/ml到大约1mg/ml、从大约1μg/ml至大约100μg/ml、从大约1.25μg/ml至大约80μg/ml、或从大约5μg/ml到大约50μg/ml的范围内。
在某些实施方案中,测试了多个浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸。例如,在一种实施方案中,单独地测试了至少两个不同浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸。在另一个实施方案中,单独地测试了至少三个不同浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸。在一个特定的实施方案中,单独地测试了至少四个不同浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸。来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的该多个浓度优选地在以上公开的范围之内。在一些实施方案中,通过1:2系列稀释储备溶液来配制来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的多个浓度。
在一些实施方案中,所述的方法进一步包括与去纤维蛋白多核苷酸样品批次同时地测试参比去纤维蛋白多核苷酸批次。典型地,在各种已知的浓度的去纤维蛋白多核苷酸下,测试参比去纤维蛋白多核苷酸批次。在一些实施方案中,可以测试参比去纤维蛋白多核苷酸批次的多个浓度。如同去纤维蛋白多核苷酸样品批次的多个浓度一样,可以通过按照预先确定的稀释因数系列稀释储备溶液来配制去纤维蛋白多核苷酸参比批次的多个浓度。来自参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的浓度优选地与来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的浓度在相同的浓度范围内。例如,来自参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的浓度(例如在包含细胞的培养基中的最终浓度)可以是从大约1μg/ml至大约1mg/ml、从大约1μg/ml至大约100μg/ml、从大约1.25μg/ml至大约80μg/ml、或从大约5μg/ml至大约50μg/ml。
在所述的方法的一些实施方案中,配制去纤维蛋白多核苷酸样品批次和去纤维蛋白多核苷酸参比批次的至少4个浓度,其中样品批次和参比批次的每个浓度各至少3次重复。
在某些实施方案中,所述的方法包括细胞毒性的阳性对照。例如,在相同的条件下,哺乳动物细胞与细胞毒性剂单独(即,没有任何去纤维蛋白多核苷酸)进行孵育。
在一些实施方案中,所述的方法包括细胞毒性的阴性对照。例如,在一个实施方案中,在相同的条件下,在没有任何去纤维蛋白多核苷酸和细胞毒性剂的溶液中孵育哺乳动物细胞。这样的溶液可以包含细胞生长培养基以及任选地任何赋形剂或溶剂。
在一个特定的实施方案中,在多孔微量滴定板(例如96孔)中,在有和没有去纤维蛋白多核苷酸存在下,孵育细胞毒性剂与哺乳动物细胞(参比和样品批次,阳性和阴性对照)。也可以在微量滴定板中进行随后的细胞生存力的测定。在某些有关的实施方案中,用细胞附着基质例如聚D-赖氨酸包被微量滴定板的孔。
可以就方法中所用的细胞毒性剂和细胞类型,优化用来获得可接受的试验反应的孵育期。本领域技术人员可以基于一般常识调节这些参数。
在方法的某些实施方案中,可以采用细胞毒性剂和来自样品和/或参比批次的去纤维蛋白多核苷酸孵育细胞,孵育时间从大约12至大约120小时、从大约24至大约96小时、从大约48至大约72小时、或从大约48至大约96小时。在一个实施方案中,孵育期是至少大约24小时。在另一个实施方案中,孵育期是至少大约48小时。在再一个实施方案中,孵育期是至少大约72小时。
用于特定的哺乳动物细胞类型的合适的孵育条件可以在一般实验室手册中找到,例如“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications”R.I.Freshney,2010,Wiley-Blackwell。孵育期期间的温度和%CO2的设定值是可以调节以优化试验反应的其它变量。根据本发明的一个实施方案,在大约35℃至大约39℃之间的温度,孵育哺乳动物细胞。在另一个实施方案中,在大约36℃至大约38℃之间的温度,孵育哺乳动物细胞。根据本发明的再一方面,在大约0至大约10%(v/v)的CO2浓度下孵育哺乳动物细胞,以保持用于细胞生长的培养基的最佳pH值。在另一个实施方案中,CO2浓度可以从大约1至大约5%。
在本发明方法的另一个方面中,在采用细胞毒性剂和来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸孵育以后,测定哺乳动物细胞的生存力。可以利用多种技术来评估细胞的生存力(参见例如Assay Guidance Manual,NCBI,2013,G.Sitta Sittampalam等人编辑,可在因特网上在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/下得到;Stoddart MJ.,Cellviability assays:introduction;Methods Mol Biol.2011;740:1-6和Riss等人,ASSAYand Drug Development Technologies,第2卷(1):51-62,2004,在此通过全文引用并入),本文中描述的任何特定的技术仅仅是举例说明性的。在一些实施方案中,通过使用商业可得试剂盒来评估细胞的生存力,例如细胞计数试剂盒8(Dojindo Molecular TechnologyInc.;Sigma-Aldrich)以及可以从Life Technologies(参见http:// www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/ assays-for-cell-viability-proliferation-and-function.html)和Thermo Scientific(参见http://www.piercenet.com/product/alamarblue-cell-viability-assay- reagent)获得的那些试剂盒。
可以与本发明方法一起使用的用于测定细胞生存力的一些合适方法包括评估膜完整性的方法、测量还原或氧化的试验、测量细胞ATP含量的方法、线粒体活性试验和胱天蛋白酶试验。评估膜完整性的方法(例如细胞溶解或膜渗漏试验)包括活体染料排除法,例如利用锥虫蓝、碘化丙锭、真曙红B或7-氨基放线菌素D的那些方法、乳糖脱氢酶试验,以及蛋白酶生物标志物的试验。这样的方法一般需要测量在胞外环境中胞内酶(例如乳糖脱氢酶)的存在或膜不透性染料在细胞内的存在,作为细胞膜受损的指征。
基于氧化还原的试验典型地是比色或荧光测定方法,其中某些类别的化合物(染料/着色剂)由于活细胞进行的生物化学反应而改变颜色或荧光。这些类型的试验的一个实例包括MTT试验,其中细胞氧化还原酶把四氮唑染料MTT溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓还原为不溶性甲其具有紫色。可以把其它密切相关的四氮唑染料用于相似的试验中以测量细胞的生存力。因此,在本发明方法的某些实施方案中,通过基于四氮唑染料的还原进行比色分析来测定细胞生存力。合适的四氮唑染料包括溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓(MTT)、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四氮唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑鎓(MTS)、以及水溶性的四氮唑鎓盐,例如WST-1和WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑鎓)。这样的技术是本领域中熟知的并且例如被描述在Mosmann,“Rapid colorimetric assay for cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicity assays,”J ImmunolMethods.1983年12月16;65:55-63中,在此通过全文引用。一个类似的基于氧化还原的用于测定细胞生存力的试验,利用荧光染料刃天青(7-羟基-3H-苯丙嗪-3-酮10-氧化物)。在活细胞中,刃天青被还原成高度红色的荧光试卤灵(resorufin)并且因此可以通过在所述染料的存在下测量荧光的增大来测定细胞生存力。
还可以通过测量细胞内过程的变化,例如细胞内自由基(例如活性氧、一氧化氮)、自由离子浓度(例如Ca2+、Mg2+、Zn2+)和膜电位方面的变化,来评估细胞生存力。用来监测和定量这样的变化的荧光指示剂是可以从各种来源商业获得的,例如可以从LifeTechnologies和Promega获得的基于荧光剂的试剂。一种这样的试验涉及利用钙黄绿素AM,其是一种可渗透细胞的染料,是细胞酯酶的底物。活细胞中的酶活性可以将钙黄绿素AM转变为荧光产物,从而允许通过荧光增大来测定活的细胞的数目。也已经把腺苷三磷酸(ATP)含量的定量用作细胞生存力的标记。通过使用例如光度计测定经由与萤光素酶的反应而产生的光量,可以测定细胞ATP含量。
在一些实施方案中,可以手工地测量细胞生存力,例如通过在合适的显微镜的帮助下或借助于选自分光光度计、分光荧光计、流式细胞仪或其组合的合适评估吸光度/荧光变化的装置,计算活细胞的数量。用于评估细胞生存力的其它技术是本领域技术人员已知的并且可以被采纳与本发明的方法一起使用。
根据用于评估细胞生存力的试验,细胞生存力量度可以是,包含细胞的溶液或培养基的吸光度或荧光的变化、活细胞的百分比或数目、或死细胞的百分比或数目。在一些实施方案中,可以将吸光度或荧光方面的变化转化为活细胞或死细胞的百分比或数目。例如,在多个实施方案中,由于染料或着色剂(例如锥虫蓝、真曙红B或碘化丙锭)渗透过受损的细胞膜而发生颜色或荧光的变化,在特定的波长下吸光度或荧光的增大指示死细胞数目的增大。在其它实施方案中,其中由于细胞反应(例如MTT试验、钙黄绿素AM试验)而发生颜色或荧光的变化,活细胞的数目与特定波长下吸光度或荧光的增大相关联。因此,在本发明方法的某些实施方案中,通过在与细胞毒性剂和去纤维蛋白多核苷酸一起孵育以后,测量包含哺乳动物细胞的溶液的吸光度或荧光来测定细胞生存力。在一个实施方案中,对于每一种浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸,测量细胞生存力(例如吸光度或荧光)(例如包含不同浓度的来自样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的微量滴定板的每一个孔的吸光度/荧光),并且相对于相应的去纤维蛋白多核苷酸浓度绘图而产生剂量-反应曲线。在一些实施方案中,剂量-反应曲线是S形曲线(即“S-形的”)。可以扩大测试的去纤维蛋白多核苷酸的浓度范围或添加额外数目的浓度以获得S形的剂量-反应曲线。
可以对称为原始数据的每一个样品(例如阳性和阴性对照、去纤维蛋白多核苷酸参比批次和去纤维蛋白多核苷酸样品批次)的吸光度或荧光读数或其它细胞生存力测定值(例如活细胞的数目或百分比;例如死细胞的数目或百分比),进行处理和进一步的统计分析。可以使用专用的软件进行统计分析,例如特别地用于生物试验评估而设计的软件,例如PLA 2(Stegmann Systems GmbH,德国),或备选地,定制用于统计学评价生物试验数据的商用现成电子数据表。
在某些实施方案中,本发明方法包括,将针对包含样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的样品测量的细胞生存力与针对参比批次的去纤维蛋白多核苷酸测量的细胞生存力进行比较。在一些实施方案中,在对样品批次的去纤维蛋白多核苷酸进行分析之前,获得参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值。可以把针对参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的在先测定值保存在参比数据库或计算机可读存储介质中。在某些实施方案中,参比批次的细胞生存力测定值代表从一组去纤维蛋白多核苷酸参比批次获得的细胞生存力测定值的平均值。因此,可以通过在先分析一个去纤维蛋白多核苷酸参比批次或一组去纤维蛋白多核苷酸批次,获得标准校正曲线;基于样品批次的细胞生存力测定值,通过与标准校准曲线比较,计算去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力。在其它实施方案中,与样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值同时获得参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值。例如,与去纤维蛋白多核苷酸参比批次的一系列浓度平行地运行去纤维蛋白多核苷酸样品批次的一系列浓度。
参比批次的去纤维蛋白多核苷酸优选地是具有已知的生物学活性(例如促纤维蛋白溶解活性、细胞保护活性)的标准化去纤维蛋白多核苷酸批次。例如,在一个特定的实施方案中,参比批次的去纤维蛋白多核苷酸具有在630–905单位/mg之间的细胞保护活性。标准化去纤维蛋白多核苷酸批次可以具有一种或多种下列特征:通过SEC-HPLC测定的在大约14至大约19kDa之间的平均分子量、大约207-233的消光系数(ε1%)、大约0.41–0.49的消光比(Emin/Emax)、大于大约0.80(例如大约0.80至大约1.50)的嘌呤与嘧啶比、大约7200至大约8400的摩尔消光系数(ε(P),涉及磷)、大约45°至大约60°的旋光度([α]D20°)、以及大约8至大约22的可逆增色性(以在天然DNA中的%指示(h))。在一些实施方案中,参比批次的去纤维蛋白多核苷酸是在GMP条件下生产的用于临床用途的去纤维蛋白多核苷酸批次。在其它实施方案中,参比批次的去纤维蛋白多核苷酸是可以从Gentium(Villa Guardia,意大利)获得的商业批次的去纤维蛋白多核苷酸。
在一些实施方案中,针对多个浓度的来自参比批次的去纤维蛋白多核苷酸,获得细胞生存力测定值而产生校准曲线。在一个实施方案中,校准曲线的产生包括,在已知的递增浓度的来自参比批次的去纤维蛋白多核苷酸下获得与样品有关的吸光度数据,统计加工这些数据而获得校准曲线,其代表在细胞毒性剂的存在下细胞生存力的增大和去纤维蛋白多核苷酸的剂量之间的相关性。在某些实施方案中,针对样品批次的去纤维蛋白多核苷酸测量的细胞生存力,与从参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值获得的校准曲线,进行比较,以确定样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力。
在一些实施方案中,从来自去纤维蛋白多核苷酸样品批次的细胞生存力测定值获得的剂量-反应曲线,与从参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值获得的校准曲线,进行比较。在这样的实施方案中,所述的剂量-反应曲线和所述的校准曲线可以是S形曲线(例如参见图7)。在两个曲线之间的差别是去纤维蛋白多核苷酸样品批次和去纤维蛋白多核苷酸参比批次之间生物学活性差别的函数。这种差别是去纤维蛋白多核苷酸的样品批次相比于参比批次的效力。在一个实施方案中,使用4-参数逻辑函数模型(4-PL,European Pharmacopoeia,第5.3.2节)来确定去纤维蛋白多核苷酸样品批次的剂量-反应曲线和去纤维蛋白多核苷酸参比批次的校准曲线之间的差别,以计算样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力。在另一个实施方案中,使用5-参数逻辑函数模型(5-PL,R.A.Dudley等人,“Guidelines for immunoassay data processing,”Clin.Chem.,1985,31:1264–1271)来确定去纤维蛋白多核苷酸样品批次的剂量-反应曲线和去纤维蛋白多核苷酸参比批次的校准曲线之间的差别,以计算样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力。
在一些实施方案中,可以针对另外的统计参数,评估从包含去纤维蛋白多核苷酸样品批次的样品的细胞生存力测定值获得的数据,以确保数据是有效的。例如,可以要求所述的数据满足某些统计学标准,例如由管理机构指令的那些统计标准。这样的检验可以包括线性度、平行度和线性回归的检验,显著性水平在例如0.05,例如F非线性度<F临界,F非平行度<F临界,以及F回归>F临界,分别地被详述在例如European Pharmacopoeia,第5.3.2节,2014和UnitedStates Pharmacopeia第(1034)章Analysis of Biological Assays,2014中。
可以将从上面的统计方法中计算出的去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力表示为,去纤维蛋白多核苷酸参比批次的百分比、单位重量的去纤维蛋白多核苷酸的保护活性单位、或其它单位(可以是或可以不是任意单位)。在一些实施方案中,去纤维蛋白多核苷酸保护单位是,在10μg/ml氟达拉滨的存在下在给定的试验条件下介导对SK-HEP-1细胞的半最大细胞保护作用的去纤维蛋白多核苷酸的浓度。在一个实施方案中,去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力表示为,相对于参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力的效力比。在某些实施方案中,使用下式计算去纤维蛋白多核苷酸样品批次的效力比:
效力比=C参比/C样品
其中C是获得相同的效应所需要的参比(ref)和样品(samp)去纤维蛋白多核苷酸物质的浓度。
本文中所描述的评估去纤维蛋白多核苷酸样品批次效力的方法可以用于药物组合物的制备中,该药物组合物包含去纤维蛋白多核苷酸,以调节包含在所述的组合物中的去纤维蛋白多核苷酸的数量,从而确保所述的组合物包含精确的和一致的剂量。因此,可以在生产过程期间使用本发明方法来评估在不同的位置、通过不同的方法或从不同来源制备的、不同批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力。
还可以使用本发明方法来监测去纤维蛋白多核苷酸批次或包含去纤维蛋白多核苷酸的药物组合物随时间流逝的稳定性。例如,可以通过本文中所描述的方法,周期性地跨时间(例如每月一次、一年两次、一年一次),或在暴露于极端条件以后,测定批次或组合物的效力,以监测去纤维蛋白多核苷酸的活性并且鉴定已经变质或降解的批次或组合物。
在下面的实施例中,更好地举例说明本发明的这些以及其它方面,然而不应把这些实施例认为是限定本发明。在本文中针对所有的目的,通过以全文引用的方式并入整个公开中引用的所有专利和非专利文献。
实施例
材料和方法
在本文下面提供的实施例中使用了下列材料。
仪器
配备有不同的发射和吸收滤光片的Victor 3微板读数器(Perkin Elmer,Milan,意大利),通过Wallac软件(Perkin Elmer,Milan,Italy)操作。
配备有用于分子生物学的无菌吸头的具有连续的容量调节的单和多通道移液器(Gilson,Milan,意大利)。具有温度和CO2控制的细胞培养箱(Thermo FischerScientific,Milan,意大利)。
HERAcell-150型组织培养用层流净化罩(Thermo Fischer Scientific,Milan,意大利)。
分析天平AX 26DR(Mettler,Milan,意大利)。
780型pH计(Metrohom Italia,Milan,意大利)。
细胞培养瓶,25和75cm2,通气帽(Corning Incorporated,NY,美国)。
聚D-赖氨酸包被或未包被的无菌透明96孔板(Sigma Aldrich,Milan,意大利)。
Neubauer计数室和光学显微镜(Carl Zeiss,Milan,意大利)。
真空培养基过滤除菌装置(Sigma Aldrich,Milan,意大利)。
计算机程序
微软Excel 2003.(微软公司,雷蒙德,华盛顿,美国)
PLA 2(Stegmann Systems GmbH,德国)
细胞
人微血管内皮细胞系(HMEC-1,CDC,Atlanta,GA,美国)
肝窦内皮细胞系(SK-HEP-1,ATCC,Manassas,VA,美国)
试剂和化学药品
去纤维蛋白多核苷酸(Gentium,意大利)
9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2-氟腺嘌呤,分析级(Sigma Aldrich,Milan,意大利),在附图和下面的实施例中被称为氟达拉滨或F-ara
阿霉素,分析级(Sigma Aldrich,Milan,意大利)
两性霉素B(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
凝胶,2%在水中,组织培养级(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
Dulbecco磷酸缓冲盐水(D-PBS)(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
无水乙醇(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
胎牛血清(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
青霉素-链霉素100X(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
MTT(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
CCK-8(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
锥虫蓝(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
Eagle极限必需培养基(EMEM)ATCC编号:30-2003(ATCC Manassas,VA,美国)
大约17Kda的寡核苷酸(ACGT)n(Sigma Genosys,Milan,意大利)
大约17Kda的寡核苷酸(AC)n(Sigma Genosys,Milan,意大利)
谷胱甘肽(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
人组织纤溶酶原激活物(tPA)(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
分子生物学级水(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)
用于SK-HEP-1的细胞生长培养基的制备
用于SK-HEP-1的细胞生长培养基是补充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、1x青霉素-链霉素和1x两性霉素B的Eagle极限必需培养基(EMEM)。从500ml的EMEM培养基中取出65ml并且添加50ml FBS、5ml 100x浓度的青霉素-链霉素储备液和10ml 50x浓度的两性霉素B储备液。使用培养基过滤除菌装置,将培养基过滤除菌。
用于HMEC-1的细胞生长培养基的制备
用于HMEC-1的细胞生长培养基是补充有10%(v/v)FBS、1x青霉素-链霉素和1x两性霉素B的RPMI 1640培养基。从500ml的RPMI 1640培养基中取出65ml并且添加50ml FBS、5ml 100x浓度的青霉素-链霉素储备液和10ml 50x浓度的两性霉素B储备液、2mM L-谷氨酰胺、10μg/ml氢化可的松。使用培养基过滤除菌装置,将培养基过滤除菌,并且添加无菌的表皮生长因子到10μg/ml的浓度。
SK-HEP-1培养和制备
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得人肝窦内皮细胞系SK-HEP-1,并且使用凝胶包被的组织培养瓶,在37℃在含5%CO2的加湿细胞培养箱中在完全EMEM培养基中培养。每2-3天,按照由ATCC提供的说明书,通过胰蛋白酶介导的脱壁,对所述的细胞进行传代培养。当培养物80-90%汇合时,把细胞系列地转移到培养瓶中并且在第+3至+10代之间用于保护试验。也就是说,超出从ATCC接收到的细胞的特征性传代数3至10代。
制备了用于细胞保护试验的SK-HEP-1的悬浮液并且将其计数。简单来说,用D-PBS洗涤所述的细胞,并且使用1ml胰蛋白酶溶液使其脱壁,并且再悬浮在完全培养基中,达到105、2x 105或4x 105个细胞/ml的细胞浓度。在锥虫蓝的存在下,使用Neubauer计数室,将细胞计数以评估培养物的生存力%。在细胞保护试验中所用的细胞培养物具有≥90%的生存力。
HMEC-1培养和制备
人微血管内皮细胞系(HMEC-1)是从Centers for Disease Control andPrevention(CDC)获得的,并且在37℃在包含5%CO2的加湿的细胞培养箱中被培养在完全的RPMI 1640培养基中。每2-3天通过胰蛋白酶介导的脱壁,将所述的细胞传代培养,并且当培养物80-90%汇合时,系列地转移到培养瓶中并且在+3至+10代之间用于保护试验。
制备了用于细胞保护试验的HMEC-1的悬浮液并且将其计数。简单来说,用D-PBS洗涤所述的细胞,并且使用1ml胰蛋白酶溶液使其脱壁,并且再悬浮在完全培养基中,达到105、2x 105或4x 105个细胞/ml的细胞浓度。在锥虫蓝的存在下,使用Neubauer计数室,将细胞计数以评估培养物的生存力%。在细胞保护试验中所用的细胞培养物具有≥90%的生存力。
储备溶液的制备
1.氟达拉滨
把10mg小瓶的氟达拉滨溶于1ml DMSO中以提供10mg/ml的溶液并且在4℃储藏。采用完全生长培养基把储备溶液1:1稀释,以提供5mg/ml的工作储存溶液。
2.去纤维蛋白多核苷酸
在使用的当天,制备去纤维蛋白多核苷酸储备溶液。把大约100mg去纤维蛋白多核苷酸药物物质精确地称重到50ml无菌试管中并且溶于20ml D-PBS,以提供5mg/ml的溶液。采用完全的生长培养基把该溶液1:10稀释,以提供0.5mg/ml的工作储存溶液,以用于产生浓度稀释系列。
3.组织纤溶酶原激活物(tPA)
把两个10μg小瓶的t-PA(每个小瓶大约400,000IU/mg)溶于2ml的D-PBS,以提供4000IU/ml的溶液并且在-80℃储藏。
4.ACGT寡核苷酸,
把1mg小瓶的ACGT寡核苷酸溶于2ml的D-PBS,以提供0.5mg/ml的溶液并且在4℃储藏。
5.谷胱甘肽
把100mg谷胱甘肽溶于20ml PBS并且采用完全生长培养基稀释1:10,达到0.5mg/ml的最终浓度。
6.阿霉素
把10mg小瓶的阿霉素溶于10ml DMSO并且在–80℃储藏。通过在完全培养基中稀释到200μg/ml来制备工作储存溶液。
板的准备
把以上面描述的浓度配制的50μl细胞悬浮液或用于空白的单独的培养基,置于聚D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板的孔中。把板置于细胞培养箱中放置3小时,然后把50μl攻击溶液添加到包含细胞的孔中。对于每一个试验条件使用三个或四个重复孔。例如,在表1中给出了,在存在或不存在去纤维蛋白多核苷酸时,包含氟达拉滨的溶液的制备。在把溶液添加到孔中以后,将板放回培养箱,并且在24、48或72小时以后评估细胞生存力。对于背景测定,把100μl完全培养基单独包括在3至4个重复的孔中。
表1.氟达拉滨和去纤维蛋白多核苷酸溶液的制备
(*)在添加50μL的细胞悬浮液和50μgL的所示溶液以后,在每一个孔中的最终浓度
使用MTT试验的细胞生存力
在所规定的孵育时间段以后,使用MTT试验测量每一个孔中的细胞生存力。MTT试验基于在活细胞中线粒体脱氢酶对四氮唑盐的切割,导致产生不溶的甲(formazan)染料。把10μl在D-PBS中的2mg/ml的MTT染料溶液添加到每一个孔中,然后孵育板3小时。然后将板离心并且吸出每个孔的液体。采用200μl的二甲基亚砜/乙醇混合物(1:1)溶解染料,并且在微板读数器上,在570-590nm处读取孔中的吸光度。在所有的试验中,也运行仅仅包含培养基和细胞毒性药物(氟达拉滨或阿霉素)的空白孔作为对照。
使用CCK-8试验的细胞生存力
在规定的孵育时间段以后,遵照生产商的说明书,使用CCK-8细胞计数试剂盒(Sigma Aldrich,Milan,意大利),测量每一个孔中的细胞生存力。试验基于由活细胞的脱氢酶活性对水溶性的四氮唑盐WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑)的还原作用。还原后的甲染料可溶于组织培养基中。甲的量与活细胞的数目成正比。CCK-8的检测灵敏度高于其它四氮唑盐例如MTT。不同于MTT,不需要溶解步骤并且因此所述的试验可以连续地进行测量。
简单来说,在规定的孵育时间以后,把10ml所提供的试剂添加到微量滴定板的每一个孔中并且将板放回培养箱。在3个小时以后,在450nm处测量吸光度,在590nm处进行本底校正。从试验样品中减去培养基空白的吸光度。
实施例1
本实施例显示,在生理相关浓度的氟达拉滨和去纤维蛋白多核苷酸下,针对氟达拉滨诱导的对于HMEC-1细胞的细胞毒性,去纤维蛋白多核苷酸的保护作用大小。
按照上述的方法培养HMEC-1细胞。使用500,000个细胞/ml的细胞密度用于所述的试验。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以100、10或1μg/ml的浓度,将去纤维蛋白多核苷酸加到微板孔中。每一个条件进行四次重复。在72小时以后,采用上面描述的MTT试验,评估HMEC细胞的生存力。去纤维蛋白多核苷酸以剂量依赖性方式保护细胞免受氟达拉滨诱导的细胞毒性,其中采用100μg/ml的去纤维蛋白多核苷酸,观察到大于50%的保护效应(图1)。
实施例2
本实施例显示,在生理相关浓度的阿霉素和去纤维蛋白多核苷酸下,针对阿霉素诱导的对于SK-HEP-1细胞的细胞毒性,去纤维蛋白多核苷酸的保护作用。
SK-HEP-1细胞按照上述的方法培养。使用大约50,000个细胞/ml的细胞密度用于所述的实验。细胞毒性剂是0.1μg/ml浓度的阿霉素。以100、50、20、10、5或1μg/ml的浓度,将去纤维蛋白多核苷酸加到微板孔中。每一个条件进行三个重复。按照上面描述的那样,在72小时以后,采用CCK-8试验试剂盒评估生存力。在50μg/ml或更大的浓度下,去纤维蛋白多核苷酸显著地保护SK-HEP-1细胞免受阿霉素诱导的细胞毒性(图2)。
实施例3
本实施例比较,去纤维蛋白多核苷酸和具有与去纤维蛋白多核苷酸相似的平均长度和碱基组成的合成寡核苷酸,针对氟达拉滨诱导的细胞毒性,所具有的保护作用。
按照上述的方法培养HMEC-1细胞。使用大约500,000个细胞/ml的细胞密度用于所述的实验。细胞毒性剂是50μg/ml浓度的氟达拉滨。以不同浓度把大约16kDa的合成寡核苷酸(腺嘌呤-胞嘧啶(AC)或大约17kDa的腺嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-胸腺嘧啶(ACGT)或去纤维蛋白多核苷酸添加到每一个孔中。
具体地,以1、10、100或500μg/ml的浓度把AC寡核苷酸添加到每一个孔中,而以12.5、25或50μg/ml的浓度把ACGT寡核苷酸添加到每一个孔中。以5、25、50或100μg/ml的浓度把去纤维蛋白多核苷酸添加到每一个孔中。每一个处理条件都进行一式三份重复。在24、48和72小时以后,采用MTT试验评估生存力。
如图3A和3B中所示,在72小时的孵育以后,针对氟达拉滨诱导的对于HMEC-1细胞的细胞毒性,AC寡核苷酸没有任何保护效应,ACGT寡核苷酸也没有任何保护效应。相比之下,去纤维蛋白多核苷酸展示了剂量依赖性的保护作用,保护细胞免受氟达拉滨诱导的细胞毒性(图3C)。
实施例4
在本实施例中描述的实验测试了合成的ACGT寡核苷酸、tPA和谷胱甘肽保护SK-HEP-1细胞免受氟达拉滨诱导的毒性的能力。
按照上述的方法使SK-HEP-1细胞生长和扩增。使用大约50,000个细胞/ml的细胞密度用于所述的实验。细胞毒性剂是10/ml浓度的氟达拉滨。以不同浓度把随机合成的寡核苷酸(ACGT)、tPA或谷胱甘肽添加到每一个孔中。具体地,以1.25、2.5、5、10、20、40或80/ml的浓度把ACGT寡核苷酸或谷胱甘肽添加到每一个孔中,以10、20、40、80、160或320IU/ml的浓度添加tPA。以一式三份重复进行每一个处理条件。在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估生存力。采用三种化合物中的任意一种都没有观察到对于SK-HEP-1细胞具有对抗氟达拉滨诱导的细胞毒性的保护作用(图4)。
实施例5
本实施例评估,对氟达拉滨诱导的细胞毒性,由于物理化学胁迫而已经被修饰的去纤维蛋白多核苷酸的保护作用。
通过使去纤维蛋白多核苷酸标准样品接受1)酸胁迫或2)碱胁迫,来胁迫去纤维蛋白多核苷酸样品。酸胁迫要求在大约80℃在具有大约3的pH的磷酸缓冲液中孵育标准去纤维蛋白多核苷酸样品18小时。碱胁迫涉及在大约80℃在具有大约12的pH的磷酸缓冲液中孵育标准去纤维蛋白多核苷酸样品18小时。在孵育期以后,采用磷酸或氢氧化钠,将溶液调节至中性。
按照上述的方法使SK-HEP-1细胞生长。使用大约50,000个细胞/ml的细胞密度用于所述的实验。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以80、40、20、10、5、2.5或1.25μg/ml的浓度,将标准去纤维蛋白多核苷酸(未修饰的)、酸胁迫的去纤维蛋白多核苷酸、或碱胁迫的去纤维蛋白多核苷酸,添加到各孔中。以一式三份重复进行每一个处理条件。
在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估细胞的生存力。针对未修饰的去纤维蛋白多核苷酸、酸胁迫的去纤维蛋白多核苷酸和碱胁迫的去纤维蛋白多核苷酸,构建剂量-反应曲线。在图5中显示了剂量-反应曲线的比较。在保护SK-HEP-1细胞免受氟达拉滨诱导的细胞毒性方面,酸胁迫的和碱胁迫的去纤维蛋白多核苷酸样品的效力都小于未修饰的去纤维蛋白多核苷酸(图5)。
实施例6
本实施例显示,在生理相关浓度的去纤维蛋白多核苷酸和氟达拉滨下,针对氟达拉滨诱导的对于SK-HEP-1细胞的细胞毒性,去纤维蛋白多核苷酸的保护效应的大小。
使SK-HEP-1细胞按照上述的方法生长和扩增。以大约50,000个细胞/ml的细胞密度把所述的细胞接种在聚D-赖氨酸包被的96孔微板中。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以100、50、40、20、10、5或1μg/ml的浓度,将去纤维蛋白多核苷酸添加到各孔中。每一个处理条件以一式4份重复的孔运行。在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估生存力。针对氟达拉滨诱导的细胞毒性,去纤维蛋白多核苷酸产生剂量依赖性细胞保护效应,其中采用40μg/ml或更大的去纤维蛋白多核苷酸浓度,获得大于80%的细胞存活(图6)。
实施例7
本实施例显示,应用基于细胞的保护试验,评估具有未知的生物学活性的去纤维蛋白多核苷酸样品的效力。
使SK-HEP-1细胞按照上述的方法生长和扩增。以大约50,000个细胞/ml的细胞密度,将所述的细胞接种在聚D-赖氨酸包被的微板中。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以80、40、20、10、5、2.5或1.25μg/ml的浓度把去纤维蛋白多核苷酸参比标准和去纤维蛋白多核苷酸试验样品添加到分开的孔中。对于每一个处理条件,运行四个重复的孔。在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估细胞的生存力。
对从去纤维蛋白多核苷酸参比标准样品和去纤维蛋白多核苷酸试验样品测量的吸光度,进行4-参数逻辑函数分析。也就是说,可以通过4-参数逻辑函数来描述参比和样品去纤维蛋白多核苷酸曲线的剂量-反应:
其中,υ是反应,α是上渐进线,δ是下渐近线,β是斜率因子,γ是样品曲线在x轴上的水平位置。通过计算相对于去纤维蛋白多核苷酸参比标准的效力比,确定了去纤维蛋白多核苷酸试验样品的效力。去纤维蛋白多核苷酸试验样品的效力比是1.157(图7)。
实施例8
本实施例评估,基于细胞的保护试验,去纤维蛋白多核苷酸效力测定的精度。使用不同批次的合格的培养基、细胞批次和移液装置,由不同的分析员在重复的试验中,测定相同的去纤维蛋白多核苷酸试验样品相对于去纤维蛋白多核苷酸参比标准的效力。
按照上述的方法使SK-HEP-1细胞生长和扩增。以大约50,000个细胞/ml的细胞密度,将细胞接种在聚D-赖氨酸包被的微板中。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以与在实施例7中所描述的相同的浓度系列,把去纤维蛋白多核苷酸参比标准和去纤维蛋白多核苷酸试验样品加到分开的孔中。对于每一个试验条件,运行四个重复的孔。在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估细胞的生存力。
对在每一个试验运行中针对每一个孔测量的吸光度,进行4-参数逻辑函数分析,并且如在实施例7中描述的那样,计算相对于去纤维蛋白多核苷酸参比标准的效力比。在表2中显示了在每一个试验运行中相同的去纤维蛋白多核苷酸试验样品的效力比。从表2中显示的在可变条件下出自不同分析员的效力测定值,所述试验具有高的精确度(7.8%相对标准偏差)和<3%的低偏差(bias)。
表2.在不同的试验轮次中,在不同的天和不同传代数的细胞上,相对于去纤维蛋白多核苷酸标准,分析相同的试验样品,证实所述试验的精准度。
实施例9
本实施例显示,对三个不同批次的去纤维蛋白多核苷酸和去纤维蛋白多核苷酸参比标准,比较基于细胞的保护试验所确定的效力。
按照上述的方法使SK-HEP-1细胞生长和扩增。以大约50,000个细胞/ml的细胞密度,把所述的细胞铺板在聚D-赖氨酸包被的微板中。细胞毒性剂是10μg/ml浓度的氟达拉滨。以80、40、20、10、5、2.5或1.25μg/毫升的浓度,把去纤维蛋白多核苷酸参比标准和来自三个分开批次的不同去纤维蛋白多核苷酸试验样品,加到分开的孔中。针对每一个试验条件,运行四个重复的孔。在72小时的孵育以后,采用CCK-8试验试剂盒评估细胞的生存力。
对每一个孔测量的吸光度,进行4-参数逻辑函数分析,并且如在实施例7中描述的那样,计算每一个批次的去纤维蛋白多核苷酸的效力比。在表3中显示了来自所述的三个批次的每一个去纤维蛋白多核苷酸试验样品相对于去纤维蛋白多核苷酸标准的效力比。
表3.分析的三个不同批次的去纤维蛋白多核苷酸相对于去纤维蛋白多核苷酸参比标准的效力比。
应该明白:所公开的发明不局限于所描述的特定的方法、实验规程和材料,因为这些都可以变化。也应该明白:在本文中所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的,并不意欲限定本发明的保护范围,本发明的保护范围仅由所附权利要求定义。
本领域技术人员将明了,或仅使用常规试验能够确定,本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。这些等同物意欲被包括在下面的权利要求范围内。
实施例10
添加直接地比较本发明方法与D3的方法的试验数据将会是有用的。
Claims (14)
1.量度样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法,其包括:
使哺乳动物细胞在培养中生长,
采用包含至少一种细胞毒性剂和至少一种浓度的来自所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的溶液孵育所述的细胞;
在孵育期以后,测定所述的细胞的生存力;和
将所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力与参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力进行比较;并且基于所述的比较,计算所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的生物活性;
其中所述至少一种细胞毒性剂是氟达拉滨、9 -β-D -阿拉伯呋喃糖基-2 -氟腺嘌呤(F-Ara-A)、或阿霉素。
2.权利要求1所述的方法,其中采用细胞毒性剂和至少四个不同浓度的来自所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸孵育所述的细胞,并且其中针对每一个所述的浓度,测定细胞生存力,以产生剂量-反应曲线。
3.权利要求1所述的方法,其中,将针对所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸测量的细胞生存力,与从参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的细胞生存力测定值所获得的校准曲线,进行比较。
4.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中计算所述的去纤维蛋白多核苷酸样品批次的生物活性包括,相对于参比批次的去纤维蛋白多核苷酸的生物活性,确定生物活性比。
5.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中所述的哺乳动物细胞是人内皮细胞、人上皮细胞、人肝窦内皮细胞、或人微血管内皮细胞。
6.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中所述的哺乳动物细胞以5×104个细胞/ml至5×105个细胞/ ml的密度存在。
7.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中来自所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸的至少一个浓度在1µg/ ml至100µg/ ml的范围内。
8.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中所述的孵育期是至少24小时、至少48小时或至少72小时。
9.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中测定细胞的生存力包括实施基于四氮唑染料还原的比色分析。
11.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中测定细胞的生存力包括在与所述的细胞一起孵育后,测定所述的溶液的吸光度。
12.权利要求1至3中任意一项所述的方法,其中所述的样品批次的去纤维蛋白多核苷酸是从牛组织或猪组织中提取的。
13.一种制备包含去纤维蛋白多核苷酸的药物组合物的方法,其中使用权利要求1至12中任意一项的方法测量去纤维蛋白多核苷酸的生物活性以:
a)调节组合物中包括的去纤维蛋白多核苷酸的量以确保组合物包含准确一致的剂量;和/或
b)测量在不同地点、通过不同方法、或不同来源制备的不同批次去纤维蛋白多核苷酸的生物活性。
14.一种监测去纤维蛋白多核苷酸批次或包含去纤维蛋白多核苷酸的药物组合物的稳定性的方法,其中使用权利要求1至13中任意一项的方法,测量批次或组合物中去纤维蛋白多核苷酸随时间推移的生物活性;任选地,其中,每月一次、每年二次、每年一次测量去纤维蛋白多核苷酸的生物活性,或者在暴露于极端条件后进行测量以监测去纤维蛋白多核苷酸的活性,或鉴定发生了降解或变质的批次或组合物。
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