KR20170094790A - 디피브로타이드의 효능을 세포-기반으로 측정하는 방법 - Google Patents

디피브로타이드의 효능을 세포-기반으로 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디피브로타이드의 생물학적 활성을 측정하기 위한, 세포-기반 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 적어도 1종의 세포독성제와 1개 이상 농도의 디피브로타이드의 존재하에서 포유동물 세포의 생존력을 평가함으로써 디피브로타이드의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 디피브로타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 표준화하는데 특히 유용하다.

Description

디피브로타이드의 효능을 세포-기반으로 측정하는 방법{CELLULAR-BASED METHOD FOR DETERMINING THE POTENCY OF DEFIBROTIDE}
의약용 물질은 변함없는 특이활성(constant specific activity) 수준으로 생산되어 이들이 안전하게 운반될 수 있도록 하여야 한다. 예를 들어, 헤파린과 같은 생물학적 분자에 대한 분석은 쇄의 길이, 분자량, 조성, 황화 정도 등의 측면에서 배치(batch)마다 변동성을 갖게 된다. 천연 물질로부터 추출되는 다른 물질들도 또한 표준화할 필요가 있다. 예를 들면, 미국 특허 제7,575,886호를 참조한다. 그러한 물질 중 하나가 디피브로타이드(defibrotide)이다. 디피브로타이드는 포유동물의 기관으로부터 추출되며, 다양한 길이의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 비균질(heterogeneous) 혼합물이다.
피브린 플레이트 테스트 및 유글로불린 용해(euglobulin lysis) 시간의 트롬보엘라스토그래피 기록법 (Prino G. et al., Indagini preliminari sull'attivitfibrinolitica, nell'animale e nell'uomo , di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 Oct. 1975-11 Farmaco, Ed. Prat.) (1969),24,552-561), 플라스민 방법 (미국 특허 제7,338,777호), 및 유글로불린법 (WO2013/190582)를 포함하여, 디피브로타이드의 생물학적 활성을 평가하는데 이용할 수 있는 분석법이 있다. 이들 방법은 유용한 약제 제조 도구이지만, 디피브로타이드의 프로-피브린용해 특성(pro-fibrinolytic property)을 기반으로하는, 이들 방법들은 모두 단리된 단백질 또는 효소에 대한 디피브로타이드의 활성 평가를 포함한다.
따라서, 사용되는 제조 공법과는 상관없이 새로운 배치의 디피브로타이드의 효능을, 예를 들면, 기준 디피브로타이드 표준 제제와 비교함으로써 평가하기 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하는 세포 컨텍스트로 디피브로타이드의 생물학적 활성을 측정하는 신규 방법에 대한 필요성(need)이 당해 기술 분야에 있다.
본 발명은 부분적으로, 디피브로타이드가 투여량-의존 방식(dose-dependent manner)으로 특정 세포독성제에 의해 유도되는 세포독성(cytotoxicity)으로부터 포유동물의 세포를 보호한다는 발견을 기반으로 한다.
본 발명자들은 이런 세포 보호 효과를 이용하였으며 디피브로타이드 배치의 효능을 평가하기 위한 세포-기반 방법을 개발하여 효과적이고 안전한 투여가 되도록 측정 단위를 정의하였다. 그러한 방법은 그 중에서도, 디피브로타이드 제조 과정 중 품질 관리, 상이한 방법 또는 원료로 생산된 디피브로타이드 배치의 표준화, 및 디피브로타이드를 사용하는 환자의 일관성이 있는 투약이 되도록 한다.
도 1은 MTT 분석법으로 측정한 바와 같은, 다양한 농도의 디피브로타이드의 존재 또는 부재하에서 플루다라빈(fludarabine)과 함께 배양한 HMEC 세포의 생존력(viability)을 도시한 것이다. HMEC-1을 10 ㎍/mL의 플루다라빈(F-Ara)과 함께 다양한 농도의 디피브로타이드(DF) (1 ㎍/mL-100 ㎍/mL)의 존재 또는 부재하에서 72시간 동안 배양시키고 세포의 생존력을 MTT 분석법으로 측정하였다. Student t-테스트: §p < 0.01 , F-ara 10 ㎍/mL vs. 대조물 (ctr); * p < 0.05, 1 ㎍/mL의 DF로 처리된 세포 vs. F-ara 10 ㎍/mL; ** p < 0.001, 10 및 100 ㎍/mL의 DF vs. F-ara 10 ㎍/mL.
도 2는 CCK-8 분석법으로 측정한 바와 같은, 다양한 농도의 디피브로타이드의 존재 또는 부재하에서 독소루비신(doxorubicin)과 함께 배양한 SK-HEP-1 세포의 생존력을 도시한 것이다. SK-HEP-1 세포를 0.1 ㎍/mL의 독소루비신(Dox)과 함께 다양한 농도의 디피브로타이드(DF) (1 ㎍/mL-100 ㎍/mL)의 존재 또는 부재하에서 72시간 동안 배양시키고 세포의 생존력을 CCK-8 분석법으로 측정하였다. Student t-테스트: §p < 0.01 , Dox 0.1 ㎍/mL vs. 대조물 (ctr); * p < 0.01, 50 또는 100 ㎍/mL의 DF로 처리된 세포 vs. Dox 0.1 ㎍/mL.
도 3은 MTT 분석법으로 측정한 바와 같은, 다양한 농도의 디피브로타이드, AC 또는 ACTG의 존재 또는 부재하에서 플루다라빈과 함께 배양한 HMEC-1 세포의 생존력을 도시한 것이다. HMEC-1 세포를 50 ㎍/mL의 플루다라빈(F-Ara)과 함께 다양한 농도의, 약 16 kDa의 랜덤 합성 아데닌-사이토신(AC) 올리고뉴클레오티드 (1-500 ㎍/mL) (도 3A), 약 17 kDa의 랜덤 합성 아데닌-사이토신-구아닌-티민(ACGT) 올리고뉴클레오티드 (12.5-50 ㎍/mL) (도 3B), 또는 디피브로타이드 (5-100 ㎍/mL)(도 3C)의 존재 또는 부재하에서 72시간 동안 배양시키고 세포의 생존력을 MTT 분석법으로 측정하였다. Student t-테스트: * p < 0.01 , F-ara 50 ㎍/mL vs. 대조물 (ctr); ** p < 0.01, F-ara 5 ㎍/mL vs. 디피브로타이드. 상기 합성 올리고뉴클레오티드 중 어느 것도 유의적인 보호가 없었다.
도 4는 CCK-8 분석법으로 측정한 바와 같은, 다양한 농도의 ACTG, tpA, 또는 글루타티온의 존재 또는 부재하에서 플루다라빈과 함께 배양한 SK-HEP-1 세포의 생존력을 도시한 것이다. SK-HEP-1 세포를 10 ㎍/mL의 플루다라빈(F-Ara)과 함께 다양한 농도의 (A-G), 약 17 kDa의 랜덤 합성 아데닌-사이토신-구아닌-티민(ACGT) 올리고뉴클레오티드 (1.25-80 ㎍/mL), tPA (10-320 IU/mL), 또는 글루타티온 (1.25-80 ㎍/mL)의 존재 또는 부재하에서 72시간 동안 배양시키고 세포의 생존력을 CCK-8 분석법으로 측정하였다. Student t-테스트: * p < 0.01 , F-ara 10 ㎍/mL vs. 대조물 (ctr). ACGT, tPA, 또는 글루타티온에 의한 F-Ara-유도된 세포독성으로부터 유의적인 보호가 없었다.
도 5는 세포 보호 분석법에서 표준 디피브로타이드 대 산-스트레스받은 (도 5A) 및 염기-스트레스받은 (도 5B) 디피브로타이드 샘플의 투여량 반응 곡선의 비교이다. 가공되지 않은(raw) 흡광도 데이터를 PLA2 통계 분석 프로그램 (4-파라미터 로지스틱 함수 분석법)을 사용하여 가공하였다. 세포 생존력 표시제 염료 (CCK-8)의 흡광도를 "반응"으로 Y-축에 플로팅한다. 투여량은 X-축에 플로팅하고 이 분석법에서는 디피브로타이드의 2-배 연속 희석법 (1.25-80 ㎍/mL)이다; STD는 기준 표준 디피브로타이드이다. 스트레스받은 샘플에 상응하는, 각 패널 중의 더 낮은 트레이스는 감소된 효능을 나타낸다. 상기 통계 분석 프로그램을 사용할 때, 스트레스받은 두 샘플 모두 수용의 통계 기준(statistical criteria of acceptance)을 만족시키지 못하였다.
도 6은 CCK-8 분석법으로 측정한 바와 같은, 다양한 농도의 디피브로타이드의 존재 또는 부재하에서 플루다라빈과 함께 배양한 SK-HEP-1 세포의 생존력을 도시한 것이다. SK-HEP-1 세포를 10 ㎍/mL의 플루다라빈(F-Ara)과 함께 다양한 농도의 디피브로타이드(DF) (1 ㎍/mL-100 ㎍/mL)의 존재 또는 부재하에서 72시간 동안 배양시키고 세포의 생존력을 CCK-8 분석법으로 측정하였다. Student t-테스트: p < 0.01, F-Ara 10 ㎍/mL vs. 대조물 (ctr) 및 >1 ㎍/mL의 DF로 처리된 세포 vs. F-Ara 10 ㎍/mL.
도 7은 표준화된 기준 디피브로타이드 샘플 (표준) 및 미지의 생물학적 활성이 있는 디피브로타이드의 샘플 간의 효능 비율의 평가를 도시한 것이다. SK-HEP-1 세포를 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 및 1.25 ㎍/mL의 농도를 얻기 위하여, 표준 및 샘플 피브로타이드의 6개의 연속 희석액(1:2)에 플루다라빈 (F-Ara)(10 ㎍/mL)의 존재하에서 노출시켰다. 각 농도의 표준 및 샘플은 4개의 복제물로 이루어져 있다. 37℃에서 72시간 배양시킨 후, 세포의 생존력을 CCK-8 분석법으로 측정하였다. 흡광도 측정치를 샘플 효능 측정을 위하여 통계적 분석에 제출하였다 (4-파라미터 로지스틱 분석).
본 발명은 특정 세포독성제의 효과로부터 살아있는 세포를 보호하는, 디피브로타이드의 능력에 기반하여 디피브로타이드의 생물학적 활성을 측정하기 위한, 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 세포 보호 효과는 의약품으로서 디피브로타이드의 용도에 있어서 중요하다. 본 방법은 상이한 방법 또는 원료로부터 수득한 디피브로타이드에 대해 활성이 표준화되도록 한다. 상기 방법은 또한 디피브로타이드의 효과적이고 안전한 투여가 되도록 측정 단위의 확립 및 안배(assignment)가 되도록 한다.
본 발명의 하나의 실시양태로, 디피브로타이드의 샘플 배치(sample batch of defibrotide)의 효능을 평가하는 방법으로, (i) 포유동물의 세포를 컬쳐에서 성장시키는 단계, (ii) 상기 세포를 적어도 1종의 세포독성제 및 상기 샘플 배치로부터 획득된 적어도 1개 농도의 디피브로타이드를 함유하는 용액과 함께 배양시키는 단계, (iii) 배양 기간(incubation period) 후 상기 세포의 생존력을 측정하는 단계, 및 (iv) 상기 세포 생존력 측정치를 기반으로, 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태로, 상기 방법이 디피브로타이드의 샘플 배치에 대한 세포 생존력을 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력과 비교하는 단계, 및 상기 비교를 기반으로 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 목적에 있어, 용어 "효능(potency)"은 디피브로타이드의 생물학적 활성의 측도(measure)를 언급하는 것으로, 특히 세포독성제의 효과로부터 살아있는 세포를 보호하는 디피브로타이드의 능력의 측도를 기반으로 한다. 디피브로타이드 (Merck Index, 1996, no. 2915; CAS number 83712-60-1)는 천연 기원의 물질이다. 이는 동물 기관으로부터 추출에 의해 수득되는 저분자량 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 나트륨 염이다. 디피브로타이드는 14에서 19 kDa 사이의 분자량(MW)을 갖는 것으로 알려져 있지만, 특이적 측정 기법은 디피브로타이드가 SEC-HPLC 기법으로 측정된 경우 대략 16.1 kDa±2.0 kDa의 평균 분자량(MW); PAGE 기법으로 측정된 경우 대략 17.6 kDa±1.0 kDa의 MW ; 및 다중-각도 레이져 광산란 기법(Multi-Angle Laser Light Scattering technique)으로 측정된 경우 대략 16.7 kDa±1.6 kDa의 MW를 갖는 것으로 나타났다. 다음 문헌을 참조한다: "Analysis of Aggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals" H. Mahler and W. Jiskoot (eds.), 2012 John Wiley & Sons, Inc. 디피브로타이드는 항혈전제로서의 용도 (미국 특허 제3,829,567호), 말초동맥병증(peripheral arteriopathies)의 치료, 급성신부전증(acute renal insufficiency)의 치료 (미국 특허 제4,694,134호), 및 급성 심근허혈증(acute myocardial ischaemia)의 치료 (미국 특허 제4,693,995호)의 용도를 포함하여, 수많은 치료적 적용(therapeutic application)을 갖는다. 더욱 최근에는, 디피브로타이드가 동모양혈관 폐색 증후군(sinusoidal obstruction syndrome)/정맥폐쇄질환의 치료 및 예방용으로 사용되었다 (EU clinical trial EudraCT:2004-000592-33, US clinical trial 2005-01 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT00358501). 디피브로타이드의 다른 용도가 하기 특허 및 특허출원에 기재되어 있으며, 이들은 각각 여기에서 참고로 전문 포함된다: 미국 특허 제3,770,720호; 제3,829,567호; 제3,899,481호; 제4,693,134호; 제4,693,995호; 제4,938,873호; 제4,985,552호; 제5,081,109호; 제5,116,617호; 제5,223,609호; 제5,646,127호; 제5,646,268호; 제5,977,083호; 제6,046,172호; 제6,699,985호; 제6,767,554호; 제7,338,777호; 제8,551,967호; 제8,771,663호, 미국 특허 공보 제20080194506호; 제20090131362호; 제20110092576호; 제20130231470호; 제20140005256호, 미국 특허 출원 제14/323,918호; 및 WO 2013/190582.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 상이한 방법으로 제조되거나 상이한 동물 기관으로부터 추출된 디피브로타이드 배치의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치가 소의 조직, 예컨대 소의 폐, 장 또는, 점막으로부터 추출된다. 다른 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치가 돼지의 조직, 예컨대 돼지의 폐, 장 또는, 점막으로부터 추출된다. 디피브로타이드 샘플 배치는 또한 양과 말을 포함한, 다른 동물 종으로부터의 다른 기관으로부터 추출될 수 있다.
특정의 실시양태로, 본 명세서에 기재된 방법으로 효능을 평가하고자 하는 디피브로타이드 샘플 배치가 미국 특허 제4,985,552호 및 제5,223,609호 (이들은 여기에서 둘다 전문 참고로 포함된다)에 기재된 것과 같은 공법으로 제조된다. 특히, 상기 공법으로 수득한 디피브로타이드는 랜덤한 서열을 갖는 하기 화학식에 상응하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드이다:
P1-5,(dAp)12-24,(dGp)10-20,(dTp)13-26,(dCp)10-20
여기에서
P=포스포릭 라디칼(phosphoric radical)
dAp=데옥시아데닐릭 모노머(deoxyadenylic monomer)
dGp=데옥시구아닐릭 모노머(deoxyguanylic monomer)
dTp=데옥시티미딜릭 모노머(deoxythymidylic monomer)
dCp=데옥시사이티딜릭 모노머(deoxycytidylic monomer).
디피브로타이드 샘플 배치는 하기와 같은 화학-물리적 특성 중 1개 이상 또는 모두를 가질 수 있다: 전기영동=균질한 양극 이동성(anodic mobility); 흡광계수, 260±1 nm에서 E1cm 1% = 220±10; 소광비, E230/E260 = 0.45±0.04; 몰흡광계수 (인에 대해서 언급됨), ε(Ρ)=7750±500; 회전력 [α]D20° =53°±6; 천연 DNA에서 %로 표시되는 흡광증가성(hyperchromicity), h = 15±5; 및 0.95±0.5의 퓨린:피리미딘 비.
특정의 실시양태로, 본 발명의 방법으로 효능을 평가하고자 하는 디피브로타이드 샘플 배치가 고온, 극한 pH, 과산화수소 등과 같은 물리화학적 스트레스에 시달렸거나 그러한 물리화학적 스트레스에 노출될 것이 의심될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 또한 사용하여 최적의 조건 이하(sub-optimum)에 또는 연장된 기간 동안 보관되었던 디피브로타이드 배치 또는 디피브로타이드를 포함하는 조성물을 평가할 수 있다. 특정의 실시양태로, 본 발명을 사용하여 디피브로타이드 배치 또는 디피브로타이드를 포함하는 조성물의 안정성을 모니터하는 것, 예를 들면, 유통기한(shelf-life)을 예측할 수 있다.
본 발명의 방법은 포유동물의 세포를 컬쳐에서 성장시키는 단계를 포함한다. 특정의 실시양태로, 상기 포유동물의 세포가 인간 세포이다. 일부 실시양태로, 상기 인간 세포가 인간의 상피세포이다. 다른 실시양태로, 상기 인간 세포가 인간의 내피세포이다. 하나의 특정의 실시양태로, 상기 인간의 내피세포가 인간의 간의 동모양혈관 내피세포, 예컨대 SK-HEP-1 세포이다. 다른 특정의 실시양태로, 상기 인간의 내피세포가 인간의 미세혈관 내피세포, 예컨대 HMEC-1 세포이다. 다른 특정의 실시양태로, 상기 상피세포가 케라틴세포(예, HaCaT 세포) 또는 폐포 상피세포 (예, A549 세포)이다. 포유동물의 세포는 공인된 수탁기관, 예컨대 American Type Culture Collection(ATCC) 뿐만 아니라 기타 공급처로부터 수득할 수 있다.
포유동물의 세포를 컬쳐에서 성장시키기에 적합한 성장 배지는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들면, 문헌: "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell에 개시되어 있다. 각 세포 타입에 최적인 배지는 세포의 특수화된 공급처 (예, ATCC-LGC, MI, Italy; CDC, Atlanta, GA, USA)로부터 수득할 수 있다. 특정의 실시양태로, 상기 포유동물의 세포를 10% (v/v) 태소혈청 (FBS), 100 단위/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2.5 ㎍/mL의 암포테리신 B가 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)에서 성장시킨다. 다른 실시양태로, 상기 포유동물의 세포를 10% (v/v) 태소혈청 (FBS), 100 단위/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 2.5 ㎍/mL 암포테리신 B가 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다. 특정의 실시양태로, 상기 성장 배지가 L-글루타민 (예, 2 mM), 하이드로코르티손 (예, 10 ㎍/mL), 및 표피성장인자 (예, 10 ㎍/mL)를 함유할수 있다.
포유동물 세포의 밀도는 약 5 x 104개 세포/mL 내지 약 5 x 105개 세포/mL, 약 2.5 x 104개 세포/mL 내지 약 2.5 x 105개 세포/mL, 또는 약 5 x104개 세포/mL 내지 약 2 x105개 세포/mL일 수 있다. 최적의 분석 반응을 얻기 위하여, 특정의 실시양태로, 세포 밀도를 세포독성제의 특성과 분석용으로 사용되는 세포 타입을 고려하여 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 내피세포가 분석용으로 사용되는 실시양태에서, 특히 적합한 세포 밀도의 범위는 약 2.5 x 104개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL, 바람직하게는 약 5 x104개 세포/mL이다. 이러한 세포 밀도는 독소루비신 또는 플루다라빈이 세포독성제인 분석에 특히 적합하다.
본 발명의 다른 양태로, 상기 방법이 컬쳐 중의 포유동물의 세포를 세포독성제와 평가 중인 샘플 배치로부터 획득된 적어도 1개 농도의 디피브로타이드를 포함하는 용액과 함께 배양시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포에 대해 독성 효과, 예컨대 세포 괴사를 유도하거나, 세포 성장 또는 세포 분화를 억제하거나, 세포의 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 효과를 갖는 화합물을 언급한다. 화합물의 세포독성은 항-대사물질 특성, 알킬화 특성, 핵산 끼어들기 특성(intercalating property), 또는 세포자멸 특성을 포함(하지만, 이들로 제한되지 않음)한, 다양한 특성으로부터 비롯될 수 있다. 항-대사물질 특성은 DNA 및 RNA와 같은 생분자의 적합한 합성을 방해하는, 화합물, 또는 이의 대사물질의 능력이다. 항-대사물질 특성이 있는 화합물의 예로, 핵염기 유사체 (예, 퓨린 및 피리미딘 유사체), 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체, 및 항엽산(antifolate) 화합물이 있다. 세포독성 효과를 가지는 핵염기와 뉴클레오시드 유사체의 예로는, 아자티오프린(azathioprine), 티오퓨린(thiopurines) (예, 티오구아닌(thioguanine), 머캅토퓨린(mercaptopurine)), 플루다라빈(fludarabine), 펜토스타틴(pentostatin), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 6-아자우라실(azauracil), 클로파라빈(clofarabine), 넬라라빈(nelarabine), 클라드리빈(cladribine), 사이타라빈(cytarabine), 플록스우리딘(floxuridine), 카페시타빈(capecitabine), 겜시타빈(gemcitabine), 아자시티딘(azacitidine), 및 데시타빈(decitabine)이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 항엽삽(antifolate)의 예로는 메토트렉세이트(methotrexate), 아미노프테린(aminopterin), 페메트렉세드(pemetrexed), 프랄라트렉세이트(pralatrexate), 및 랄티트렉세드(raltitrexed)가 있다.
알킬화 특성은 알킬 그룹을 생분자로 이전시키거나 생분자 내의 반응성 그룹 (예, 아미노, 카르복실, 술프하이드릴, 및 포스페이트 그룹)과 공유결합을 형성할 수 있는 화합물, 또는 이의 대사물질의 능력으로, 이들은 생분자의 생물학적 기능을 불활시키거나 방해할 수 있다. 수많은 알킬화제는 DNA 스트랜드와 가교-결합하여 DNA 복제를 손상시킬 수 있으며, 이는 세포자멸을 유도할 수 있다. 알킬화제의 예로 질소 머스타드 (예, 메클로르에타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 클로르암부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide) 및 부술판(busulfan)), 니트로소우레아(nitrosourea) (예, N-니트로소-N-메틸우레아, 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 및 세무스틴(semustine), 포테무스틴(fotemustine) 및 스트렙토조토신(streptozotocin)), 테트라진(tetrazines) (예, 다카르바진(dacarbazine), 미토졸로미드(mitozolomide) 및 테모졸로미드(temozolomide)), 아지리딘(aziridines) (예, 티오테파(thiotepa), 마이토마이신(mytomycin) 및 디아지쿠온(diaziquone)), 및 시스플라틴(cisplatin) (예, 시스플라틴, 카르보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin))이 있다.
핵산 끼어들기 특성(nucleic acid intercalating property)은 DNA 이중 헬릭스로 삽입할 수 있는, 화합물, 또는 이의 대사물질의 능력으로, 이는 돌연변이를 일으키거나 RNA의 나선 구조의 영역 내에 끼어들 수 있다. 끼어들기 화합물의 예로 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 미토마이신(mitomycin), 악티노마이신(actinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 안트라사이클린(anthracycline) (예, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valrubicin) 및 미톡스안트론(mitoxantrone)), 탈리도마이드(thalidomide) 및 블레오미신(bleomicin)이 있다.
세포자멸 특성(apoptotic property)은 프로그램된 세포 사멸(death)을 유도할 수 있는, 화합물, 또는 이의 대사물질의 능력이다. 세포자멸을 유도할 수 있는 화합물의 특정 부류의 화합물 중 하나가 미세관저해제(anti-microtubule agent)로, 이는 유사분열(mitosis)을 방해하여 세포 사이클의 진행을 막아, 이에 의해 세포자멸을 유도한다. 미세관저해제로는 빙카 알칼로이드(vinca alkaloids), 예컨대 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈오렐빈(vinorelbine), 빈데신(vindesine), 및 빈플루닌(vinflunine), 및 탁산(taxanes), 예컨대 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)이 있다.
토포이소머라제(topoisomerase) 억제제가 또한 DNA 복제와 전사를 방지할 수 있는 이들의 능력 및/또는 DNA 스트랜드 파괴를 유도하여, 세포자멸을 유도함으로써 세포독성이다. 토포이소머라제 억제제로는 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 에토포시드(etoposide), 독소루비신, 미톡스안트론 및 테니포시드(tenyposide)가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포독성제는 일반적으로 합성, 반-합성, 또는 천연 화학적 화합물이다. 상기 화합물은 상기 기재된 특성 중 1개 이상을 가질 수 있다. 상기 세포독성제는 본 명세서에 기재된 화합물 중 임의의 것 또는 이의 대사물질일 수 있다. 일부 실시양태로, 상기 세포독성제가 플루다라빈, 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 부술판, 멜팔란, 시스플라틴, 에티디움 브로마이드, 독소루비신, 안트라사이클린, 탈리도마이드, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 특정의 실시양태로, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포독성제가 플루다라빈 또는 이의 활성 대사물질, 9-베타-D-아라비노푸라노실-2-플루오로아데닌(9-beta-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine: F-Ara-A)이다. 다른 실시양태로, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포독성제가 독소루비신이다.
당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 알려져 있는 대안적 세포독성제가 본 발명의 방법에 사용하는데 있어 대등하게 적합하다. 예를 들어, 일부의 실시양태로, 상기 세포독성제가 세포 사이클 진행을 느리게하거나 정지시키고/시키거나 세포의 세포자멸을 유도한다. 그러한 타입의 세포독성제로 스타우로스포린(Staurosporine), 벤다무스틴(Bendamustine), 카르무스틴(Carmustine), 이마티닙(Imatinib) 및 이들의 염 (Gleevec으로 판매되고 있음), Ara-C, 겜투주맙(Gemtuzumab) (예컨대 겜투주맙 오조마이신, Mylotarg로 판매되고 있음), 아자시티딘(Azacitidine) (Vidaza로 판매되고 있음), 데시타빈(Decitabine) (Dacogen으로 판매되고 있음), 보리노스타트(Vorinostat) (Zolinza로 판매되고 있음), 및 탑시가르긴(Thapsigargin), H202, 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트(Phorbol Myristate Acetate)가 있다. 또한, 문헌: NIOSH list of Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Healthcare Settings 2012, HHS, Publication No. 2012-150 (http://www.cdc.gov/niosh/docs/2012-150/pdfs/2012-150.pdf)을 참조한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포독성제의 농도는 특정의 세포독성제 및 사용할 포유동물의 세포 타입에 따라 변화될 것이다. 플루다라빈 또는 F-Ara-A가 세포독성제인 실시양태에서, 세포독성제가 성장배지에 약 10 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL의 최종 농도로 존재한다. 독소루비신이 세포독성제인 다른 실시양태에서. 세포독성제가 성장배지에 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL의 최종 농도로 존재한다.
세포독성제는 단독으로 또는 2, 3, 4, 5, 6종 또는 그 이상의 독성제를 함께 사용할 수 있다. 특정의 실시양태로, 디피브로타이드의 단일 샘플 배치의 효능을, 2종의 상이한 세포독성제에 대한 이의 세포 보호 효과를 독립적으로 평가함으로써 평가할 수 있다. 일례로, 디피브로타이드 샘플 배치의 첫번째 효능 값은 첫번째 세포독성제 (예, 플루다라빈)을 사용하여 상기 방법을 수행함으로써 수득할 수 있고 두번째 효능 값은 두번째 세포독성제 (예, 독소루비신)를 사용하여 상기 방법을 수행함으로써 수득할 수 있다. 디피브로타이드 샘플 배치의 전체적인 효능은 상기 첫번째 및 두번째 효능 값의 수학적 비교로, 예를 들면, 상기 2개의 값의 평균을 내거나 상기 2개의 값의 비율을 계산함으로써 결정될 수 있다.
특정의 실시양태로, 특정의 세포독성제 또는 세포독성제들을 사용하기 보다는 특정 세트의 컬쳐 조건을 사용하여 포유동물 세포의 세포독성을 유도할 수 있다. 예를 들면, 예를 들어, 상기 방법은 포유동물의 세포를 적어도 1개 농도의 디피브로타이드의 존재하에서 세포자멸-유도 컬쳐 배지에 노출시키는 단계, 배양 기간 후 상기 세포의 생존력을 측정하는 단계, 및 측정된 세포 생존력을 기반으로 디피브로타이드의 효능을 계산하는 단계를 포함한다. 세포자멸-유도 컬쳐 배지는 산성 pH (예, 약 2 내지 약 6 또는 약 4.5 내지 약 6.5의 pH) 또는 염기성 pH (예, 약 7.5 내지 약 10 또는 약 8 내지 약 9.5의 pH)를 갖는 배지를 포함할 수 있다. 세포자멸-유도 컬쳐 배지는 또한 성장인자의 철회(withdrawal)가 세포자멸의 유도제로서 인식되기 때문에 필수 성장인자 (예, 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자, 혈소판-유래 성장인자)를 함유하지 않는 배지를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "세포자멸-유도 배지"는 또한 세포자멸을 유도하는 특정 온도 범위 (예, 37℃보다 큰) 또는 산소 농도 범위 (5% 미만의 산소)에서의 배지를 언급할 수 있다. 상기 세포자멸-유도 컬쳐 배지 또는 조건은 본 방법에 사용할 특정의 포유동물 세포 타입에 대해 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 조정될 수 있다. U.V. 또는 다른 타입의 방사선을 사용하여 세포자멸을 유도할 수 있다. 일부의 실시양태로, 상기 배양 용액이 세포독성제 외에 평가하에 있는 샘플 배치로부터 획득된 적어도 1개 농도의 디피브로타이드를 포함한다. 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 농도 (예, 세포-함유 배지 중 최종 농도)의 범위는 약 1 ㎍/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 1.25 ㎍/mL 내지 약 80 ㎍/mL, 또는 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL이다.
특정의 실시양태로, 상기 샘플 배치로부터 획득된 다수 농도의 디피브로타이드를 시험한다. 예를 들면, 하나의 실시양태로, 샘플 배치로부터 획득된 적어도 2개의 상이한 농도의 디피브로타이드를 따로 시험한다. 다른 실시양태로, 샘플 배치로부터 획득된 적어도 3개의 상이한 농도의 디피브로타이드를 따로 시험한다. 특정의 실시양태로, 샘플 배치로부터 획득된 적어도 4개의 상이한 농도의 디피브로타이드를 따로 시험한다. 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 다수 농도가 바람직하게는 상기 개시된 범위 내에 있다. 일부의 실시양태로, 샘플 배치로부터 획득된 다수 농도의 디피브로타이드는 스톡 용액(stock solution)의 연속적인 1:2 희석에 의해 제조된다.
일부의 실시양태로, 본 방법이 기준 디피브로타이드 배치를 상기 디피브로타이드 샘플 배치와 동시에 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 기준 디피브로타이드 배치는 전형적으로 여러 개의 공지된 농도의 디피브로타이드로 시험한다. 다수 농도의 기준 디피브로타이드 배치는, 일부의 실시양태로, 시험될 수 있다. 다수 농도의 디피브로타이드 샘플 배치에 대해서와 같이, 다수 농도의 디피브로타이드 기준 배치는 미리 결정된 희석 팩터(dilution factor)에 따라서 스톡 용액의 연속적 희석에 의해 제조될 수 있다. 기준 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 농도는 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드로부터의 농도와 동일한 농도 범위에 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 기준 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 농도 (예, 세포-함유 배지 중 최종 농도)는 약 1 ㎍/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 1.25 ㎍/mL 내지 약 80 ㎍/mL, 또는 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL일 수 있다.
상기 방법의 일부의 실시양태로, 적어도 4개 농도의 디피브로타이드 샘플 배치와 디피브로타이드 기준 배치를 샘플 배치와 기준 배치의 각 농도에 대해 적어도 3개의 복제물을 제조한다.
특정의 실시양태로, 상기 방법이 세포독성의 포지티브 대조물을 포함한다. 예를 들어, 포유동물의 세포를 동일한 조건하에서 세포독성제 단독으로 (즉, 어떠한 디피브로타이드도 없이) 배양시킨다.
일부의 실시양태로, 상기 방법이 세포독성의 네가티브 대조물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 실시양태로, 포유동물의 세포를 어떠한 디피브로타이드 또는 세포독성제가 없는 용액에서 동일한 조건하에서 배양시킨다. 그러한 용액은 세포 성장 배지와 선택적으로 임의의 비히클 또는 용매를 함유할 수 있다.
하나의 특정의 실시양태로, 디피브로타이드와 함께 및 없이 (기준 및 샘플 배치, 포지티브 및 네가티브 대조물) 세포독성제와 포유동물 세포의 배양은 다중-웰 미세역가 플레이트 (예, 96개-웰)에서 수행된다. 후속되는 세포 생존력의 측정 또한 상기 미세역가 플레이트에서 수행될 수 있다. 일부의 관련 실시양태로, 상기 미세역가 플레이트의 웰을 세포 부착 매트릭스, 예컨대 폴리-D-라이신으로 코팅한다.
허용가능한 분석 반응을 얻기 위한 배양 기간은 상기 방법에 사용되는 세포독성제 및 세포 타입과 관련하여 최적화할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 이러한 파라미터를 통상의 일반적인 지식을 기반으로 조정할 수 있다.
상기 방법의 특정의 실시양태로, 세포를 세포독성제 및 샘플 및/또는 기준 배치로부터 획득된 디피브로타이드와 함께 약 12 내지 약 120시간, 약 24 내지 약 96시간, 약 48 내지 약 72시간, 또는 약 48 내지 약 96시간 범위의 기간 동안 배양시킬 수 있다. 하나의 실시양태로, 상기 배양 기간이 적어도 약 24시간이다. 다른 실시양태로, 상기 배양 기간이 적어도 약 48시간이다. 또 다른 실시양태로, 상기 배양 기간이 적어도 약 72시간이다.
특정 포유동물 세포에 대해 적합한 배양 조건은 일반적인 실험실 매뉴얼, 예컨대 "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell에서 알 수 있다. 배양 기간 동안 온도와 %CO2에 대한 세트 포인트는 분석 반응을 최적화하기 위하여 조정될 수 있는 다른 변수이다. 본 발명의 하나의 실시양태에 따라서, 포유동물의 세포를 약 35℃ 내지 약 39℃ 범위의 온도에서 배양시킨다. 다른 실시양태로, 상기 포유동물의 세포를 약 36℃ 내지 약 38℃ 범위의 온도에서 배양시킨다. 본 발명의 추가 양태에 따라서, 포유동물의 세포를, 세포 성장에 있어 배지의 최적 pH를 유지하기 위하여 약 0 내지 약 10%(v/v) 범위의 CO2 농도에서 배양시킨다. 다른 실시양태로, CO2 농도가 약 1 내지 약 5%일 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 양태로, 포유동물 세포의 생존력을, 세포독성제 및 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드와의 후속 배양으로 결정한다. 다수의 기법을 이용하여 세포의 생존력을 평가하며 (예를 들면, 문헌: Assay Guidance Manual, NCBI, 2013, G. Sitta Sittampalam et al. Eds., available on the Internet at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/; Stoddart MJ., Cell viability assays: introduction; Methods Mol Biol. 201 l ;740: l-6 and Riss et al., ASSAY 및 Drug Development Technologies, Vol. 2(1 ): 51-62, 2004를 참조하며, 이 둘 모두 본 명세서에서 참고로 전문 포함된다), 본 명세서에 기재된 임의의 특정 기법은 단지 설명을 위함이다. 일부의 실시양태로, 세포 생존력을 상업적으로 입수할 수 있는 키트, 예컨대 Cell Counting Kit 8 (Dojindo Molecular Technology Inc.; Sigma-Aldrich), 및 Life Technologies (참조: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/assays-for-cell-viability-proliferation-and-function.html) 및 Thermo Scientific (참조: http://www.piercenet.com/product/alamarblue-cell-viability-assay-reagent)로부터 입수할 수 있는 것들을 사용하여 평가한다.
본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있는 세포 생존력 측정에 적합한 일부 방법으로 막의 완결성(integrity)을 평가하는 방법, 환원 또는 산화를 측정하는 분석법, 세포의 ATP 함량을 측정하는 방법, 미토콘드리아 활성 분석법, 및 카스파제(caspase) 분석법이 있다. 막의 완결성을 평가하는 방법 (예, 세포용해 또는 막 누설 분석법)에는 생체염색약(vital dye) 배출 방법, 예컨대 트립판 블루, 요오드화 프로피듐, 에리트로신 B 또는 7-아미노악티노마이신 D를 이용하는 것들, 락토오스 탈수소효소 분석법, 및 프로테아제 바이오마커(biomarker)에 대한 분석법이 포함된다. 그러한 방법들은 일반적으로 세포외 환경에서 세포내 효소의 존재 (예, 락토오스 탈수소효소) 또는 훼손된 세포막의 지표로서 세포내로 막침투할 수 있는 염료의 존재를 측정하는 단계를 수반한다.
산화환원(redox)-기반 분석법은 전형적으로 비색법 또는 형광법으로 여기서는 살아있는 세포에 의해 수행된 생화학적 반응의 결과로서 특정 부류의 화합물(염료/스테인)이 색상 또는 형광을 변화시킨다. 이러한 타입의 분석법 중 하나의 예로 MTT 분석법이 있으며 여기서는 세포의 산화환원효소가 테트라졸륨 염료 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 이의 불용성 포르마잔으로 환원시키며, 이는 보라색을 갖는다. 다른 밀접하게 관련된 테트라졸륨 염료를 유사한 분석법에 사용하여 세포의 생존력을 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 특정 실시양태로, 테트라졸륨 염료의 환원을 기반으로 하는 비색 분석법을 수행하여 세포 생존력을 측정한다. 적합한 테트라졸륨 염료로는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT), 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르복스아닐리드 (XTT), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 (MTS), 및 수용성 테트라졸륨 염, 예컨대 WST-1 및 WST-8 (2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨)이 있다. 그러한 기법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌: Mosmann, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays," J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65: 55-63에 기재되어 있고, 이들은 본 명세서에서 전문 참고로 포함된다. 세포 생존력을 측정하기 위한 유사한 산화환원-기반 분석법은 형광 염료인, 레사주린(resazurin) (7-하이드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥사이드)를 이용한다. 레사주린은 살아있는 세포에서 고도로 적색 형광성인 레소루핀(resorufin)으로 환원되며 이에 따라 상기 염료의 존재하에서 형광에서의 증가량을 측정함으로써 세포 생존력을 측정할 수 있다.
세포 생존력은 또한 세포내 과정에서의 변화량, 예컨대 세포내 자유 라디칼 (예, 반응성 산소종, 산화질소), 자유 이온 농도 (예, Ca2 +, Mg2 +, Zn2 +), 및 막 전위에서의 변화량을 측정함으로써 평가할 수 있다. 그러한 변화를 모니터하고 정량하는 형광 표시제(fluorescence indicator)는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수할 수 있으며, 예컨대 Life Technologies and Promega로부터 입수할 수 있는 형광-기반 시약이 있다. 그러한 분석법 중 하나는 칼세인 AM의 사용을 포함하는데, 이는 세포의 에스테라제에 대한 기질인 세포 투과성 염료이다. 살아있는 세포에서 효소 활성은 칼세인 AM을 형광 생성물로 전환시키며 이에 의해 형광에서의 증가에 의해 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있도록 한다. 아데노신 트리포스페이트(ATP) 함량의 정량이 또한 세포 생존력의 마커로 사용되고 있다. 세포의 ATP 함량은 예를 들면, 루미노미터(luminometer)를 사용하여 루시페라제 효소와의 반응을 통하여 생산되는 광의 양에 의해 측정될 수 있다.
일부의 실시양태로, 세포 생존력을 수동식으로, 예를 들어, 적합한 현미경을 사용하거나 분광광도계, 분광형광계, 유세포분석기 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 흡광도/형광 변화를 평가하는 적합한 장비에 의해 살아있는 세포를 계수함으로써 측정할 수 있다. 세포 생존력을 평가하기 위한 다른 기법이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있으며 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위하여 채택될 수 있다.
세포 생존력을 평가하기 위하여 사용되는 분석법에 따라서, 세포 생존력 측정치가 세포-함유 용액 또는 배지의 흡광도 또는 형광에서의 변화, 살아있는 세포의 퍼센트 또는 수, 또는 죽은 세포의 퍼센트 또는 수일 수 있다. 일부의 실시양태로, 흡광도 또는 형광에서의 변화를 살아있는 세포 또는 죽은 세포의 퍼센트 또는 수로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 색상 또는 형광에서의 변화가 훼손된 세포막을 투과하는 염료 또는 스테인 (예, 트립판 블루, 에리트로신 B 또는 요오드화 프로피듐)의 결과로 일어나는 실시양태에서, 특정 파장에서 흡광도 또는 형광에서의 증가는 죽은 세포의 수에서의 증가를 나타낸다. 색상 또는 형광에서의 변화가 세포 반응의 결과로 일어나는 (예, MTT 분석법, 칼세인 AM 분석법) 다른 실시양태에서, 살아있는 세포의 수는 특정 파장에서 흡광도 또는 형광에서의 증가와 상관된다. 따라서, 본 발명의 방법의 특정의 실시양태로, 세포독성제 및 디피브로타이드와 함께 배양시킨 다음 포유동물 세포를 함유하는 용액의 흡광도 또는 형광을 측정함으로써 세포 생존력이 측정된다. 하나의 실시양태로, 샘플 배치로부터 획득된 각 농도의 디피브로타이드에 대해 세포 생존력 (예, 흡광도 또는 형광) (예, 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드를 상이한 농도로 함유하는 미세역가 플레이트의 각 웰의 흡광도/형광)을 측정하고 대응하는 농도의 디피브로타이드에 대해 플로팅하여 투여량-반응 곡선을 생성시킨다. 일부의 실시양태로, 상기 투여량-반응 곡선이 시그모이드형 곡선 (즉, "S-형태)이다. 시험되는 디피브로타이드 농도의 범위는 시그모이드형 투여량-반응 곡선을 얻기 위하여 확대될 수 있거나 추가되는 농도의 추가적인 수일 수 있다.
가공되지 않은 데이터로 알려진, 각각의 샘플 (예, 포지티브 및 네가티브 대조물, 디피브로타이드 기준 배치 및 디피브로타이드 샘플 배치)에 대한 흡광도 또는 형광 판독치 또는 기타 세포 생존력 측정치 (예, 살아있는 세포의 수 또는 퍼센트; 예, 죽은 세포의 수 또는 퍼센트)는 가공되어 추가로 통계 분석할 수 있다. 예를 들어, PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Germany)와 같은 생체분석 평가용으로 특별하게 디자인된 것, 또는 달리, 생물학적 분석 데이터의 통계적 평가에 맞춰진 상용제품 스프레트시트(spreadsheet)와 같은 전용 소프트웨어가 퉁계적 분석을 위하여 사용될 수 있다.
특정의 실시양태로, 본 발명의 방법이 예를 들어 디피브로타이드의 샘플 배치를 함유하는 샘플에 대해 측정된 세포 생존력을 디피브로타이드의 기준 배치에 대해 측정된 세포 생존력과 비교하는 단계를 포함한다. 일부의 실시양태로, 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정치를 디피브로타이드의 샘플 배치의 분석 전에 수득하였다. 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 그러한 사전 측정치를 기준 데이터베이스 또는 컴퓨터 판독가능한 저장 매질에 보관할 수 있다. 특정의 실시양태로, 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정치가 디피브로타이드 기준 배치의 집단으로부터 수득한 세포 생존력 측정치의 평균을 나타낸다. 따라서, 디피브로타이드 샘플 배치의 효능은 디피브로타이드 기준 배치 또는 디피브로타이드 배치들의 집단의 사전 분석으로부터 수득한 표준 검량선(calibration curve)과 비교함으로써 샘플 배치에 대한 세포 생존력 측정치를 기본으로 계산할 수 있다. 다른 실시양태로, 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정치를 디피브로타이드의 샘플 배치에 대한 세포 생존력 측정치와 동일한 시간에 획득한다. 예를 들어, 디피브로타이드 샘플 배치에 대한 일련의 농도를 디피브로타이드 기준 배치에 대한 일련의 농도와 평행하게 수행한다.
디피브로타이드의 기준 배치가 바람직하게는 공지의 생물학적 활성 (예, 프로(pro)-섬유소용해 활성, 세포 보호 활성)을 갖는 표준화된 디피브로타이드 배치이다. 예를 들면, 하나의 특정의 실시양태로, 상기 디피브로타이드의 기준 배치가 630 - 905 단위/mg의 세포 보호 활성을 갖는다. 상기 표준화된 디피브로타이드 배치는 다음과 같은 특성 중 1개 이상을 가질 수 있다: SEC-HPLC에 의해 측정된 바, 약 14 내지 약 19 kDa의 평균 분자량, 약 207-233의 흡광계수(ε1%), 약 0.41 - 0.49의 소광비(Emin/Emax), 약 0.80 이상 (예, 약 0.80 내지 약 1.50)의 퓨린 대 피리미딘 비율, 약 7200 내지 약 8400의 몰소광계수 (ε(P), 인에 대해 언급됨), 약 45° 내지 약 60°의 회전력([α]D20°), 및 약 8 내지 약 22의 천연 DNA (h) 중 %로 표시되는, 가역적 흡광증가성(hyperchromicity). 일부의 실시양태로, 디피브로다이드의 기준 배치는 임상적 용도에 대한 GMP 조건 하에서 제조된 디피브로타이드 배치이다. 다른 실시양태로, 디피브로다이드의 기준 배치가 Gentium (Villa Guardia, Italy)로부터 입수할 수 있는 상업적 배치의 디피브로타이드이다.
일부 실시양태로, 기준 배치로부터 획득된 다수 농도의 디피브로타이드에 대한 세포 생존력 측정을 하여 검량선을 생성시킨다. 하나의 실시양태로, 검량선의 생성은 기준 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 공지의 상승 농도에서 샘플과 관련하여 흡광도 데이터를 수집(acquition)하고 그러한 데이터를 통계적으로 가공하여, 세포독성제의 존재하에서 세포 생존력에서의 증가와 디피브로타이드의 투여량 사이의 상관관계를 나타내는, 검량선을 수득하는 것을 포함한다. 특정의 실시양태로, 디피브로타이드의 샘플 배치에 대해 측정된 세포 생존력을 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정으로부터 수득한 검량선과 비교하여 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 측정한다.
일부의 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치에서의 세포 생존력 측정치로부터 수득한 투여량-반응 곡선을 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정으로부터 수득한 검량선과 비교한다. 그러한 실시양태에서, 투여량-반응 곡선과 검량선이 시그모이드형 곡선일 수 있다 (예를 들어, 도 7 참조). 상기 두 곡선 간의 차이는 디피브로타이드 샘플 배치와 디피브로타이드 기준 배치 간의 생물학적 활성에서의 차이의 함수이다. 상기 차이는 기준 배치에 비교되는 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능이다. 하나의 실시양태로, 4-파라미터 로지스틱 함수 모델 (4-PL, European Pharmacopoeia, section 5.3.2)을 사용하여 디피브로타이드 샘플 배치에 대한 투여량-반응 곡선과 디피브로타이드 기준 배치에 대한 검량선 사이의 차이를 측정하여 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산한다. 다른 실시양태로, 5-파라미터 로지스틱 함수 모델 (5-PL, R.A. Dudley et al., "Guidelines for immunoassay data processing," Clin. Chem., 1985, 31 : 1264-1271)을 사용하여 디피브로타이드 샘플 배치에 대한 투여량-반응 곡선과 디피브로타이드 기준 배치에 대한 검량선 사이의 차이를 측정하여 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산한다.
일부의 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치를 사용한, 샘플의 세포 생존력 측정으로부터 수득한 데이터를 추가적인 통계 파라미터에 대해 평가하여 상기 데이터가 유효한지 확실하게 한다. 예를 들어, 관리기관에 의해 규정된 것들과 같은 특정의 통계적 기준을 만족시키는데 상기 데이터가 요구될 수 있다. 그러한 테스트에는 Fnon -linearity < Fcritical, Fnon -parallelism < Fcritical, 및 FRegression > Fcritical 와 같이, 예를 들어 0.05의 유의 수준에서 선형성(linearity), 병렬성(parallelism), 및 선형회귀에 대한 시험이 포함될 수 있으며, 이들 각각에 대해서, 예를 들어, 문헌: European Pharmacopoeia, section 5.3.2, 2014 and United States Pharmacopeia Chapter (1034) Analysis of Biological Assays, 2014에 상세하게 설명되어 있다.
상기 통계적 방법으로부터 계산된 디피브로타이드 샘플 배치의 효능은 디피브로타이드 기준 배치의 퍼센트로, 디피브로타이드 중량 당 보호 활성 단위, 또는 임의적일 수 있거나 아닐 수 있는 다른 단위로 표시될 수 있다. 일부의 실시양태로, 디피브로타이드 보호 단위가 주어진 분석 조건하에 10 ㎍/mL의 플루다라빈의 존재하에서 SK-HEP-1 세포의 최대 세포-보호의 절반을 중재하는 디피브로타이드의 농도이다. 하나의 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치의 효능이 디피브로타이드의 기준 배치의 효능에 대한 효능 비율로 표시된다. 특정의 실시양태로, 디피브로타이드 샘플 배치에 대한 효능 비율(Potency Ratio)을 하기 식을 사용하여 계산한다:
효능 비율 = Cref / Csamp
여기에서,
C는 동일한 효과를 성취하는데 요구되는 기준(ref)과 샘플(samp) 디피브로타이드 물질의 농도이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 디피브로타이드 샘플의 효능의 평가 방법을 디피브로타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 사용하여 정확하고 일관성 있는 투여량을 포함하는 조성물이 되도록 조성물에 포함되는 디피브로타이드의 양을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 제조 과정 중에 사용하여 상이한 위치, 상이한 방법, 또는 상이한 원료로부터 제조되는 디피브로타이드의 상이한 배치의 효능을 평가할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 시간에 따른 디피브로타이드 배치 또는 디피브로타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 안정성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 배치 또는 조성물의 효능을 본 명세서에 기재된 방법으로 시간에 따라 주기적으로 (예, 한달에 한번, 2년에 한번, 1년에 한번) 측정하거나 극한 조건에 노출한 다음 디피브로타이드의 활성을 모니터하고 배치 또는 조성물이 열화되었거나 분해되었는지 확인할 수 있다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 하기 실시예에서 더 잘 설명될 것이나, 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 개시내용을 통하여 언급된 모든 특허 및 비-특허 문헌들은 모든 목적에 있어서 이들 전문이 본 명세서에서 참고로 포함된다.
실시예
재료 및 방법
하기 재료들이 이후 주어지는 실시예에 사용되었다.
장치
상이한 배출 및 흡수 필터가 장착되어 있는 Victor 3 마이크로플레이트 판독기 (Perkin Elmer, Milan, Italy),Wallac 소프트웨어(Perkin Elmer, Milan, Italy)에 의해 작동됨.
분자생물학용 멸균 팁(tip)이 장착되어 있고, 연속적으로 용적 조절이 되는 단일 및 다중-채널 피펫 (Gilson, Milan, Italy).
온도 및 CO2 조절이 되는 세포 배양기 (Thermo Fischer Scientific, Milan, Italy)
조직 배양용 라미나 플로우 후드(Laminar flow hood) 모델 HERAcell-150 (Thermo Fischer Scientific, Milan, Italy).
분석용 저울 AX 26 DR (Mettler, Milan, Italy).
pH 메터 모델 780 (Metrohom Italia, Milan, Italy).
세포배양 플라스크, 25 및 75 ㎠, 통풍용 캡 (Corning Incorporated, NY, USA).
폴리-D-라이신 코팅되거나 코팅되지 않은 멸균 투명 96개 웰 (Sigma Aldrich, Milan, Italy).
Neubauer 계수 챔버 및 광학현미경 (Carl Zeiss, Milan, Italy).
진공 매질 필터 멸균 유니트 (Sigma Aldrich, Milan, Italy).
컴퓨터 프로그램
Microsoft Excel 2003. (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., USA)
PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Germany)
세포
인간의 미세혈관 내피세포주 (HMEC-1, CDC, Atlanta, GA, USA)
간의 동모양혈관 내피세포주 (SK-HEP-1, ATCC, Manassas, VA, USA)
시약 및 화학물질
디피브로타이드 (Gentium, Italy)
9-베타-D-아라비노푸라노실-2-플루오로아데닌, 분석용 등급 (Sigma Aldrich, Milan, Italy), 도면 및 하기 실시예에서 플루다라빈 또는 F-Ara로 언급됨
독소루비신, 분석용 등급 (Sigma Aldrich, Milan, Italy)
암포테리신 B (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
디메틸 술폭사이드 (DMSO) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
젤라틴, 수중 2%, 조직배양 등급 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
듈베코의 인산염 완충 염수 (D-PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
무수 에탄올 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
태소 혈청 (FBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
페니실린-스트렙토마이신 100X (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
MTT (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
CCK-8 (Sigma Aldrich, Milan, Italy)
트립판 블루 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
이글의 최소 필수 배지 (EMEM) ATCC 번호: 30-2003 (ATCC Manassas, VA, USA)
약 17 kDa의 올리고뉴클레오티드 (ACGT)n (Sigma Genosys, Milan, Italy)
약 17 kDa의 올리고뉴클레오티드 (AC)n (Sigma Genosys, Milan, Italy)
글루타티온 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
분자생물학 등급 물 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
SK-HEP-1용 세포 성장 배지의 제조
SK-HEP-1용 세포 성장 배지는 10%(v/v)의 태소혈청(FBS), 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 1x 암포테리신 B가 보충된 Eagle의 최소 필수 배지 (EMEM)였다. 500 mL의 EMEM으로부터 65 mL을 회수하고 FBS 50 mL, 100x 농도의 페니실린-스트렙토마이신 스톡 5 mL 및 50x 농도의 암포테리신 B 스톡 10 mL를 첨가하였다. 배지 필터 멸균 유니트를 사용하여 상기 배지를 필터 여과하였다.
HMEC-1용 세포 성장 배지의 제조
HMEC-1용 세포 성장 배지는 10%(v/v) FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 1x 암포테리신 B가 보충된 RPMI 1640 이었다. 500 mL의 RPMI 1640으로부터 65 mL을 회수하고 FBS 50 mL, 100x 농도의 페니실린-스트렙토마이신 스톡 5 mL 및 50x 농도의 암포테리신 B 스톡 10 mL, 2 mM L-글루타민, 10 ㎍/mL의 하이드로코르티손을 첨가하였다. 배지 필터 멸균 유니트를 사용하여 상기 배지를 필터 여과하고 멸균 표피 성장인자를 10 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다.
SK-HEP-1 배양 및 제조
인간의 간의 동모양혈관 내피세포주 SK-HEP-1을 Americal Type Culture Collection (ATCC)로부터 입수하여 젤라틴-코팅된 조직배양 플라스크를 사용하여 37℃에 5% CO2를 포함하는 습화된 세포 배양기 내 완전 EMEM 배지에서 배양시켰다. ATCC에서 제공되는 지침에 따라서 2-3일마다 트립신 매개 탈착(trypsin mediated detachment)에 의해 세포를 계대배양(sub-culture)시켰다. 컬쳐가 80 내지 90% 컨플루언시(confluency)에 도달하였을 때 세포를 연속해서 컬쳐 플라스크로 옮기고 계대(passage) +3 내지 +10 사이에서 보호 분석용으로 사용하였다. 즉, ATCC로부터 수령한 세포의 특징화된 계대번호를 넘어서 3 내지 10 계대.
세포 보호 분석에 사용하기 위한 SK-HEP-1의 현탁액을 제조하여 계수하였다. 간략하면, 세포를 D-PBS로 세척하고, 1 mL의 트립신 용액을 사용하여 탈착시킨 다음 완전 배지에 105, 2 x 105 또는 4 x 105개 세포/mL의 세포 농도로 다시 현탁시킨다. 트립판 블루의 존재하에서 Neubauer 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하여 컬쳐의 생존력%를 평가하였다. 세포 보호 분석에 사용되는 세포 컬쳐의 생존력은 ≥90% 였다.
HMEC-1 배양 및 제조
인간의 미세혈관 내피세포주 (HMEC-1)를 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)로부터 입수하여 완전 RPMI 1640 배지에서 37℃에 5% CO2를 포함하는 습화된 세포 배양기에서 배양시켰다. 2-3일마다 트립신 매개 탈착에 의해 세포를 계대배양시키고 컬쳐가 80 내지 90% 컨플루언시에 도달하였을 때 세포를 연속해서 컬쳐 플라스크로 옮기고 계대 +3 내지 +10 사이에서 보호 분석용으로 사용하였다.
세포 보호 분석에 사용하기 위한 HMEP-1의 현탁액을 제조하여 계수하였다. 간략하면, 세포를 D-PBS로 세척하고, 1 mL의 트립신 용액을 사용하여 탈착시킨 다음 완전 배지에 105, 2 x 105 또는 4 x 105개 세포/mL의 세포 농도로 다시 현탁시킨다. 트립판 블루의 존재하에서 Neubauer 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하여 컬쳐의 생존력%를 평가하였다. 세포 보호 분석에 사용되는 세포 컬쳐의 생존력은 ≥90% 였다.
스톡 용액의 제조
1. 플루다라빈
10 mg 바이알의 플루다라빈을 1 mL의 DMSO에 용해시켜 10 mg/mL의 용액을 수득하여 4℃에서 보관하였다. 상기 스톡 용액을 완전 성장 배지를 사용하여 1:1로 희석하여 5 mg/mL의 연구용 스톡 용액을 수득하였다.
2. 디피브로타이드
디피브로타이드 스톡 용액은 사용하는 날에 제조하였다. 대략 100 mg의 디피브로타이드 약물을 50 mL 멸균 튜브중으로 정확하게 칭량하여 20 mL의 D-PBS에 용해시켜 5 mg/mL의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 완전 성장 배지를 사용하여 1:10으로 희석하여 일련의 농도 희석액을 생산하는데 사용되는 0.5 mg/mL의 연구용 스톡 용액을 수득하였다.
3. 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA)
2개의 10 ㎍ 바이알의 t-PA 내용물 (바이알 당 약 400,000 IU/mg)을 2 mL의 D-PBS에 용해시켜 4000 IU/mL의 용액을 수득하고 -80℃에 보관하였다.
4. ACGT 올리고뉴클레오티드
1 mg 바이알의 ACGT 올리고뉴클레오티드를 2 mL의 D-PBS에 용해시켜 0.5 mg/mL의 용액을 수득하여 4℃에 보관하였다.
5. 글루타티온
100 mg의 글루타티온을 20 mL의 PBS에 용해시키고 완전 성장 배지를 사용하여 0.5 mg/mL의 최종 농도로 1:10 희석시켰다.
6. 독소루비신
10 mg 바이알의 독소루비신을 10 mL의 DMSO에 용해시켜 -80℃에 보관하였다. 완전 배지에 200 ㎍/mL로 희석시켜 연구용 스톡을 제조하였다.
플레이트 침착(plate deposition)
상기 기재된 농도로 제조된, 50 ㎕의 세포 현탁액, 또는 블랭크용 단독 배지를 폴리-D-라이신 코팅된 96개-웰 미세역가 플레이트의 웰에 놓았다. 50 ㎕의 도전 용액을 세포-함유 웰에 첨가한 후 상기 플레이트를 세포 배양기에 3시간 동안 놓았다. 각 실험 조건에 대해 3 또는 4개의 복제(replicate) 웰을 사용하였다. 예를 들어, 디피브로타이드의 부재 또는 존재하에서 플루다라빈을 함유하는 용액의 제조가 표 1에 주여져 있다. 상기 용액을 웰에 첨가한 다음, 상기 플레이트를 다시 배양기에 넣고 24, 48 또는 72시간 후 세포 생존력을 평가하였다. 배경 측정의 경우, 100 ㎕의 완전 배지만 3 또는 4개의 복제 웰에 포함시켰다.
플루다라빈 및 디피브로타이드 용액의 제조
샘플 타입 디피브로타이드(*)(㎍/mL) 배지(㎕) 플루다라빈 스톡(㎕) 디피브로타이드 스톡(㎕)
네가티브 대조물 0 3486 14 0
디피브로타이드 샘플 1:1 1.25 3468.5 14 17.5
디피브로타이드 샘플 1:2 2.5 3451 14 35
디피브로타이드 샘플 1:4 5 3416 14 70
디피브로타이드 샘플 1:8 10 3346 14 140
디피브로타이드 샘플 1:16 20 3206 14 280
디피브로타이드 샘플 1:32 40 2926 14 560
디피브로타이드 샘플 1:64 80 2366 14 1120
블랭크 0 3500 0 0
(*) 50 ㎕의 세포 현탁액과 50 ㎕의 표시된 용액을 첨가한 후 각 웰의 최종 농도
MTT 분석법을 사용한 세포 생존력
명시된 기간의 배양 후, 각 웰 중 세포 생존력을 MTT 분석법을 사용하여 측정하였다. MTT 분석법은 생존 세포내 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 테트라졸륨 염의 청소(cleavage)로 불용성 포르마잔 염료가 생산되는 것에 기반한다. MTT 염료, 10 ㎕의 D-PBS 중 2 mg/mL 용액을 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 3시간 동안 배양시켰다. 이후, 플레이트를 원심분리시키고 각 웰을 흡입시켰다. 염료를 200 ㎕의 DMSO/에탄올(1:1) 혼합물로 용해시키고 웰 중의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 상에서 570-590 nm에서 판독하였다. 배지와 세포독성제 (플루다라빈 또는 독소루비신) 만을 함유하는 블랭크 웰을 또한 모든 실험에서 대조물로 처리하였다.
CCK-8 분석법을 사용한 세포 생존력
명시된 기간의 배양 후, 각 웰 중 세포 생존력을 제조업자의 지침에 따라서 CCK-8 세포 계수 키트 (Sigma Aldrich, Milan, Italy)를 사용하여 측정하였다. 상기 분석법은 생존 세포의 탈수소효소 활성에 의한, 수용성 테트라졸륨 염 WST-8 (2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨)의 환원을 기반으로 한다. 환원된 포르마잔 염료는 조직 배양 배지에 가용성이다. 포르마잔의 양은 생존 세포의 수에 직접 비례한다. CCK-8의 검출 감응도는 MTT와 같은 다른 테트라졸륨 염보다 더 높다. MTT와는 달리, 용해 단계를 필요로 하지 않으며, 따라서 이 분석법은 연속해서 측정될 수 있다.
간략하면, 명시된 배양 시간 후, 10 ㎕의 공급된 시약을 미세역가 플레이트의 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 배양기로 다시 보냈다. 3시간 후, 흡광도를 450 nm에서 측정하고 590 nm에서 배경 수정하였다. 배지 블랭크의 흡광도는 시험 샘플로부터 뺐다.
실시예 1
본 실시예는 플루다라빈 및 디피브로타이드의 생리학적으로 연관된 농도에서 HMEC-1 세포의 플루다라빈-유도된 세포독성에 대한 디피브로타이드의 보호 효과의 크기(magnitude)를 보여준다.
HMEC-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 배양시켰다. 500,000개 세포/mL의 세포 밀도를 분석용으로 사용하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 디피브로타이드는 100, 10 또는 1 ㎍/mL의 농도로 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다. 각 조건을 4개의 복제물로 대해 수행하였다. HMEC 세포의 생존력은 72시간 후 상기 기재된 MTT 분석법으로 평가하였다. 디피브로타이드는 플루다라빈-유도된 세포독성으로부터 세포를 투여량-의존성 방식으로 보호하였으며 100 ㎍/mL의 디피브로타이드의 경우 50% 이상의 보호 효과가 관찰되었다 (도 1).
실시예 2
본 실시예는 독소루비신 및 디피브로타이드의 생리학적으로 연관된 농도에서 SK-HEP-1 세포의 독소루비신-유도된 세포독성에 대한 디피브로타이드의 보호 효과의 크기를 보여준다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 배양시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도를 본 실험용으로 사용하였다. 세포독성제는 0.1 ㎍/mL 농도의 독소루비신이었다. 디피브로타이드는 100, 50, 20, 10, 5 또는 1 ㎍/mL의 농도로 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다. 각 조건을 3개의 복제물로 수행하였다. 생존력은 72시간 후 상기 기재된 CCK-8 분석 키트로 평가하였다. 50 ㎍/mL 이상의 농도에서, 디피브로타이드는 독소루비신-유도된 세포독성으로부터 SK-HEP-1 세포를 유의적으로 보호하였다 (도 2).
실시예 3
본 실시예는 디피브로타이드 및 디피브로타이드와 유사한 평균 길이와 염기 조성을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드의 플루다라빈-유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 비교한다.
HMEC-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 배양시켰다. 약 500,000개 세포/mL의 세포 밀도를 본 실험용으로 사용하였다. 세포독성제는 50 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 합성 올리고뉴클레오티드 (약 16 kDa의 아데닌-사이토신(AC) 또는 약 17 kDa의 아데닌-사이토신-구아닌-티민(ACGT)) 또는 디피브로타이드를 다양한 농도로 각 웰에 첨가하였다. 구체적으로, AC 올리고뉴클레오티트는 각 웰에 1, 10, 100 또는 500의 농도로 첨가하는 한편, ACGT 올리고뉴클레오티드는 각 웰에 12.5, 25 또는 50 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 디피브로타이드는 5, 25, 50 또는 100 ㎍/mL의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 각 처리 조건을 3회 중복 수행하였다. 생존력은 24, 48 및 72시간 후 MTT 분석법으로 평가하였다.
도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, AC 올리고뉴클레오티드 또는 ACGT 올리고뉴클레오티드 중 어떤 것도 72시간의 배양 후 HMEC-1 세포의 플루다라빈-유도된 세포독성에 대해 어떠한 보호 효과도 갖지 못했다. 대조적으로, 디피브로타이드는 플루다라빈-유도된 세포독성으로부터 세포의 투여량-의존적 보호를 나타냈다 (도 3C).
실시예 4
본 실시예에 기재된 실험은 플루다라빈-유도된 독성으로부터 SK-HEP-1 세포를 보호하는, 합성 ACGT 올리고뉴클레오티드, tPA, 및 글루타티온의 능력을 시험하였다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시키고 팽창시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도를 본 실험용으로 사용하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 랜덤한 합성 올리고뉴클레오티드 (ACGT), tPA, 또는 글루타티온을 각 웰에 다양한 농도로 첨가하였다. 구체적으로, ACGT 올리고뉴클레오티드 또는 글루타티온을 각 웰에 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 또는 80 ㎍/mL의 농도로 첨가하는 반면, tPA는 10, 20, 40, 80, 160, 또는 320 IU/mL의 농도로 첨가하였다. 각 처리 조건을 3회 중복 수행하였다. 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다. 상기 3종의 화합물 중 어느 것에 대해서도 플루다라빈-유도된 세포독성으로부터 SK-HEP-1 세포의 보호가 관찰되지 않았다 (도 4).
실시예 5
본 실시예는 물리화학적 스트레스의 결과로 변형된 디피브로타이드의 플루다라빈-유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 평가한다.
디피브로타이드 표준 샘플을 1) 산성 스트레스 또는 2) 염기성 스트레스에 노출시켜 디피브로타이드 샘플을 스트레스받게하였다. 산성 스트레스는 표준 디피브로타이드 샘플을 pH가 약 3인 인산염 완충액에 약 80℃에서 18시간 동안 배양시키는 것을 포함한다. 염기성 스트레스는 표준 디피브로타이드 샘플을 pH가 약 12인 인산염 완충액에 약 80℃에서 18시간 동안 배양시키는 것을 포함한다. 배양 기간 후, 인산 또는 수산화나트륨을 사용하여 용액을 중성으로 만들었다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도를 본 실험용으로 사용하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 표준 디피브로타이드(변형되지 않은 것), 산 스트레스에 노출시킨 디피브로타이드, 또는 염기성 스트레스에 노출시킨 디피브로타이드를 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 또는 1.25 ㎍/mL의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 각 처리 조건을 3회 중복 수행하였다.
세포의 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다. 변형되지 않은 디피브로타이드, 산-스트레스받은 디피브로타이드, 및 염기성-스트레스받은 디피브로타이드에 대해 투여량-반응 곡선을 작도하였다. 투여량-반응 곡선의 비교가 도 5에 나타나 있다. 플루다라빈-유도된 세포독성으로부터 SK-HEP-1 세포를 보호하는데 있어 산-스트레스 및 염기성-스트레스받은 디피브로타이드 둘 다 변형되지 않은 디피브로타이드보다 효능이 작았다 (도 5).
실시예 6
본 실시예는 생리학적으로 연관있는 농도의 디피브로타이드 및 플루다라빈에서 SK-HEP-1 세포의 풀루다라빈-유도된 세포독성에 대한 디피브로타이드의 보호 효과의 크기를 보여준다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시키고 팽창시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도로 상기 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 96개-웰 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 디피브로타이드를 각 웰에 100, 50, 40, 20, 10, 5 또는 1 ㎍/mL 농도로 첨가하였다. 각 처리 조건을 4개의 복제 웰에서 수행하였다. 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다. 디피브로타이드는 플루다라빈-유도된 세포독성으로부터 40 ㎍/mL 이상의 디피브로타이드 농도로 세포가 80% 이상 생존하는, 투여량-의존적 세포 보호 효과를 생산하였다 (도 6).
실시예 7
본 실시예는 미지의 생물학적 활성을 갖는 디피브로타이드 샘플의 효능을 평가하기 위한 세포-기반 보호 분석법의 적용을 보여준다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시키고 팽창시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도로 상기 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 96개-웰 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 디피브로타이드 기준 표준물과 디피브로타이드 테스트 샘플을 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 또는 1.25 ㎍/mL의 농도로 별개의 웰에 첨가하였다. 4개의 복제 웰을 각 처리 조건에 대해 수행하였다. 세포의 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다.
디피브로타이드 기준 표준 샘플과 디피브로타이드 테스트 샘플에 대해 측정된 흡광도를 4-파라미터 로지스틱 함수 분석하였다. 즉, 기준 및 샘플 디피브로타이드의 투여량-반응 곡선이 4-파라미터 로지스틱 함수로 설명될 수 있다:
Figure pct00001
여기에서, υ는 반응이고, α는 상부 점근선(asymptote)이며, δ는 하부 점근선이고, β는 기울기-팩터(slope-factor)이며, γ는 χ축상의 샘플 곡선의 수평 위치이다.
디피브로타이드 테스트 샘플의 효능은 디피브로타이드 기준 표준물에 대한 효능 비율을 계산함으로써 측정되었다. 디피브로타이드 테스트 샘플에 대한 효능 비율은 1.157이었다 (도 7).
실시예 8
본 실시예는 디피브로타이드 효능 측정의 세포-기반 보호 분석의 정확도를 평가한다. 동일한 디피브로타이드 테스트 샘플의 효능을 디피브로타이드 기준 표준물에 대해 다른 분석가에 의한 반복적인 분석으로, 상이한 배치의 검정받은 배지(qualified medium), 세포 배치 및 피펫 도구를 사용하여 측정하였다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시키고 팽창시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도로 상기 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 디피브로타이드 기준 표준물과 디피브로타이드 테스트 샘플을 실시예 7에 기재된 바와 동일한 일련의 농도로 별개의 웰에 가하였다. 각 실험 조건에 대해 4개의 복제 웰에서 수행하였다. 세포의 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다.
각각의 분석 수행에서 각 웰에 대해 측정된 흡광도를 4-파라미터 로지스틱 함수 분석하고 디피브로타이드 기준 표준물에 대한 효능 비율을 실시예 7에 기재된 바와 같이 계산하였다. 각각의 분석 수행에서 동일한 디피브로타이드 테스트 샘플의 효능 비율을 표 2에 표시하였다. 표 2에 나타낸 가변적 조건하에서 다른 분석가에 의한 효능 측정치로부터, 본 분석법은 높은 정확도 (7.8의 상대표준편차%)와 <3%의 낮은 바이어스(bias)를 갖는다.
본 분석법의 정확도는 디피브로타이드 표준물에 대해, 동일한 테스트 샘플을, 상이한 분석 수행으로, 상이한 날짜에 상이한 계대번호를 갖는 세포에 대해 분석함으로써 증명된다.
분석 수행 날짜(Day) 분석가 세포 계대번호 피펫 도구 세트 측정된 효능
1 1 1 1 #1 0.901
2 2 1 1 #2 0.998
3 2 1 2 #1 0.937
4 2 1 1 #1 1.087
5 2 1 2 #2 1.011
6 3 2 1 #1 1.057
7 3 2 2 #1 1.068
8 3 1 2 #1 0.944
9 4 2 1 #1 0.971
10 4 2 2 #1 1.11
11 5 2 1 #2 1.135
12 5 2 2 #2 1.13
실시예 9
본 실시예는 3개의 상이한 배치의 디피브로타이드와 디피브로타이드 기준 표준물에 대한 세포-기반 보호 분석법에 의해 측정된 효능의 비교를 보여준다.
SK-HEP-1 세포를 상기 언급된 절차에 따라서 성장시키고 팽창시켰다. 약 50,000개 세포/mL의 세포 밀도로 상기 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 세포독성제는 10 ㎍/mL 농도의 플루다라빈이었다. 디피브로타이드 기준 표준물과 3개의 별개의 배치에서의 디피브로타이드 테스트 샘플을 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 또는 1.25 ㎍/mL의 농도로 별개의 웰에 첨가하였다. 4개의 복제 웰을 각 실험 조건에 대해 수행하였다. 세포의 생존력은 72시간 배양 후 CCK-8 분석 키트로 평가하였다.
각 웰에 대해 측정된 흡광도를 4-파라미터 로지스틱 함수 분석하고 각 배치의 디피브로타이드에 대한 효능 비율을 실시예 7에 기재된 바와 같이 계산하였다. 3개의 배치에서의 각각의 디피브로타이드 테스트 샘플의, 디피브로타이드에 대한 효능 비율을 표 3에 표시하였다.
디피브로타이드 기준 표준물에 대해 분석된 3개의 상이한 배치의 디피브로타이드에 대한 효능 비율.
디피브로타이드 배치 선형성,
회귀 및
병렬성 테스트		 95%
신뢰구간		 효능
1080030021 통과 0.823-0.989 0.902
1080060117 통과 0.697-0.889 0.787
1080010016 통과 1.116-1.725 1.387
상기 개시된 발명은 구체적인 방법론, 프로토콜 및 재료들이 변화될 수 있기 때문에 기재된 것들로 제한되지 않음을 알아야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 오직 구체적인 실시양태를 설명할 목적이며 본 발명의 범주를 제한하고자 함이 아니라는 것을 알아야 하고, 본 발명은 첨부되는 특허 청구의 범위에 의해서만 제한될 것이다.
당해 분야의 숙련가는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대등한 수많은 것들을 인지하거나, 알아낼 수 있을 것이다. 그러한 대등한 것들은 하기 특허 청구의 범위에 포함시키고자 한다.
실시예 10
본 발명의 방법을 D3의 방법과 직접 비교하는 실험 데이터를 추가하는 것이 유용할 것이다.

Claims (15)

  1. 디피브로타이드의 샘플 배치(sample batch of defibrotide)의 효능을 평가하는 방법으로,
    포유동물의 세포를 컬쳐(culture)에서 성장시키는 단계;
    상기 세포를 "'적어도 1종의 세포독성제(cytotoxic agent)'와 '상기 샘플 배치에서 획득된 적어도 1개 농도의 디피브로타이드'를 함유하는 용액"과 함께 배양시키는 단계;
    배양 기간 후 세포의 생존력(viability)을 측정하는 단계; 및
    상기 세포의 생존력 측정치를 기반으로, 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산하는 단계;를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 세포독성제 및 상기 샘플 배치에서 획득된 적어도 4개 농도의 디피브로타이드와 함께 배양되고,
    상기 세포 생존력은 투여량-반응 곡선을 생성하기 위해 각 농도에 대해 측정되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 디피브로타이드의 샘플 배치에 대한 세포 생존력을 디피브로타이드의 기준 배치(reference batch of defibrotide)에 대한 세포 생존력과 비교하는 단계; 및
    상기 비교를 기반으로 디피브로타이드의 샘플 배치의 효능을 계산하는 단계;를 더 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 디피브로타이드의 샘플 배치에 대해 측정된 세포 생존력을 디피브로타이드의 기준 배치에 대한 세포 생존력 측정치로부터 수득한 검량선(calibration curve)과 비교하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디피브로타이드 샘플 배치의 효능을 계산하는 것은 디피브로타이드의 기준 배치의 효능에 대한 효능 비율을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물의 세포가 인간의 내피세포, 인간의 상피세포, 인간의 간 동모양혈관 내피세포(human liver sinusoidal endothelial cell), 또는 인간의 미세혈관 내피세포(human microvascular endothelial cell)인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 약 5 x 104개 세포/mL 내지 약 5 x 105개 세포/mL의 밀도로 존재하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포독성제가 플루다라빈(fludarabine), 9-베타-D-아라비노푸라노실-2-플루오로아데닌 (F-Ara-A), 또는 독소루비신(doxorubicin)인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    플루다라빈 또는 F-Ara-A가 약 10 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL의 농도로 용액에 존재하거나 독소루비신이 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL의 농도로 용액에 존재하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플 배치로부터 획득된 디피브로타이드의 적어도 1개 농도가 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 범위에 있는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 기간이 적어도 24시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 72시간인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 생존력을 측정하는 것은 테트라졸륨 염료의 환원을 기반으로 하는 비색법(colorimetric assay)을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 테트라졸륨 염료가 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 또는 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 생존력을 측정하는 것은 세포와 배양시킨 다음 용액의 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디피브로타이드의 샘플 배치가 소의 조직 또는 돼지의 조직으로부터 추출되는 것인 방법.
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