BR112014031934B1 - método com base em euglobulina para determinar a atividade biológica de defibrotide - Google Patents

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Abstract

MÉTODO COM BASE EM EUGLOBULINA PARA DETERMINAR A ATIVIDADE BIOLÓGICA DE DEFIBROTIDE. É divulgado um método para determinar a atividade biológica de defibrotide, que compreende as etapas de: a) colocar em contato defibrotide, euglobulina de mamífero e um substrato específico para a plasmina que, pela reação com a plasmina, fornece um produto mensurável; e b) medir a quantidade de produto formado em tempos sucessivos, para determinar deste modo a atividade biológica do defibrotide. Formulações líquidas de defibrotide também são divulgadas, preferivelmente soluções aquosas, tendo uma atividade biológica definida e, em particular, tendo uma atividade de 25 a 35 IU/mg de defibrotide, preferivelmente de 27,5 a 32,5 IU/mg e, mais preferivelmente, de 28 a 32 IU/mg.

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a um método para determinar a atividade biológica de defibrotide e, mais especialmente, diz respeito a um método enzimático indireto para determinar a atividade biológica de defibrotide.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[0002] Defibrotide (Merck Index, 1996, no. 2915) é uma substância de origem natural que é obtida pela extração de órgãos animais e que é constituída pelo sal sódico de polidesoxirribonucleotideos tendo um peso molecular baixo. Defibrotide foi o objeto de numerosas investigações farmacológicas que têm sugerido que a mesma fosse aplicada em terapia como um agente antitrombótico (Pat. U.S. No. 3.829.567).
[0003] Além disso, defibrotide também tem sido usado com êxito no tratamento de arteriopatias periféricas, na insuficiência renal aguda (Pat. U.S. No. 4.694.134) ou na isquemia miocárdica aguda (Pat. U.S. No. 4.693.995).
[0004] Defibrotide está correntemente passando por testes clínicos para ser usado para o tratamento e prevenção de doença venosa oclusiva (VOD).
[0005] Como outras substâncias biológicas que são obtidas pela extração, defibrotide também é submetida a uma variabilidade limitada de composição que é típica dos biopolímeros naturais. Um exemplo clássico desta situação é fornecido pela heparina cuja variabilidade de lote para lote em termos de comprimento de cadeia, peso molecular, composição, grau de sulfatação, etc. é bem conhecida. A consequência disto é que as mesmas quantidades em peso de defibrotide de fato não seriam equivalentes do ponto de vista de uma atividade biológica específica.
[0006] O processo de extração, isolação e purificação por si não pode garantir reprodutibilidade absoluta do produto, precisamente devido à sua natureza biopolimérica intrínseca.
[0007] Entretanto, se bem controlada, é possível reduzir esta variabilidade: para este propósito, estudos têm sido feitos de processos industriais padronizados para isolar defibrotide pela extração a partir de órgãos, tais como, por exemplo, aquele descrito na Patente dos Estados Unidos Pat. U.S. No. 4.985.552.
[0008] O produto obtido de acordo com o processo mencionado acima é caracterizado pela determinação de alguns parâmetros físico-químicos específicos, tais como, por exemplo, mobilidade eletroforética, o coeficiente de extinção, potência rotativa ótica e massa molecular relativa à média de massa. Entretanto, estes parâmetros dependem basicamente da estrutura do defibrotide e não são capazes de fornecer informação sobre a sua atividade biológica.
[0009] Até onde sabemos, os únicos métodos que foram relatados para serem usados até agora para avaliar a atividade biológica do defibrotide são o teste da placa de fibrina e o registro tromboelastográfico do tempo de lise da euglobulina [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari suH attività fibrinolitica, nell’animale e nell’uomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell’industria farmacêutica in Italia, Roma, 2 a 4 Out. 1975 — II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24, 552-561] e o método com base na plasmina divulgado na Pat. U.S. No 7.338.777, aqui incorporada por referência.
[0010] Entretanto, o registro tromboelastográfico do método mencionado acima do tempo de lise da euglobulina é caracterizado por complexidade experimental considerável, pela reprodutibilidade e precisão insatisfatórias e, no caso específico do registro tromboelastográfico, por uma linearidade de resposta limitada às faixas de concentração muito restritas.
[0011] Como para o método com base em plasmina, a atividade enzimática de plasmina é normalmente determinada pelos vários testes padrões in vitro. Um dos métodos mais habitualmente usados é a determinação pela espectrofotometria ou fluorimetria dos compostos cromogênicos ou fluorogênicos que são liberados pela ação de plasmina sobre substratos adequados [Haemostasis, (1978), 7, 138-145], Os substratos peptídicos tendo a fórmula A1-A2-A3-X são no geral usados em que A1 e A2 são aminoácidos que são predominantemente não polares, A3 é lisina ou arginina e X representa o composto liberado mensurável, por exemplo, para- nitroanilina (pNa) ou 2-naftilamina (NA) [Haemostasis, (1978), 7, 146-149], Além dos substratos peptídicos mencionados acima, sucesso foi alcançado usando outros, compostos mais simples, tais como, por exemplo, p-nitrobenzil-p-toluenossulfonil-L- arginina [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].
[0012] A taxa na qual o composto X é liberado dentro do meio de incubação é proporcional à atividade (Unidades/mg) de plasmina presente na amostra. O método divulgado na Pat. U.S. No 7.338.777 é assim fundamentado na descoberta de que, nos testes de avaliação de plasmina descritos acima, defibrotide aumenta a taxa de liberação de composto X proporcionalmente à sua concentração.
[0013] Entretanto, um tal método é conduzido em tampão TRIS sem qualquer outro ativador/inibidor de plasma/soro. Portanto, o procedimento não reflete a condição fisiológica nem acuradamente simula o mecanismo de ação de defibrotide in vivo.
[0014] Até agora, portanto, nenhum método ve rd ade ira mente válido, preciso e reprodutível foi descrito e validado para determinar a atividade biológica de defibrotide refletindo em um modo acurado do mecanismo de ação do produto em um sistema biológico complexo (in vivo).
[0015] Nós desenvolvemos um método simples e confiável para determinar a atividade biológica de defibrotide, que permite que as amostras obtidas pela extração sejam controladas e, portanto, possibilita que preparações medicinais com base no defibrotide sejam padronizadas.
[0016] O método ao qual a presente invenção diz respeito possibilita que a atividade biológica específica de defibrotide seja determinada em comparação com um padrão de referência com um alto grau de precisão e exatidão. Descrição resumida dos desenhos
[0017] A FIG. 1 é uma plotagem mostrando as cinéticas de liberação de pNA do substrato S-2251, por meio da fração de euglobulina de mamífero que é ativada e não ativada com defibrotide (concentração de 0 a 50 μg/ml, 0 a 100 min).
[0018] A FIG. 2 é uma plotagem ilustrando o sigmóide que surge em relação a um padrão e amostra de teste de defibrotide.
[0019] A FIG. 3 é uma plotagem mostrando a “absorbância versus o tempo” das preparações padrão (ex.: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) identificando uma faixa linear adequada (ex.: de 30 a 35 min).
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0020] A presente invenção, portanto, diz respeito a um método para determinar a atividade biológica especifica de amostras de defibrotide, método este que compreende as etapas de: a) colocar em contato defibrotide, euglobulina e um substrato especifico para a plasmina que, pela reação com a plasmina, fornece um produto mensurável e b) medir a quantidade de produto formado em tempos sucessivos.
[0021] O método da invenção é um método in vitro indireto para determinar a atividade de defibrotide, que está fundamentado nas interações funcionais entre defibrotide e euglobulina.
[0022] A euglobulina é aquela fração de globulina sérica que é insolúvel em água destilada, mas solúvel em soluções salinas.
[0023] A euglobulina contém fibrinogênio, PAI-1, ativador plasminogênico de tecido (tPA), plasminogênio, e a um grau menor alfa 2-antiplasmina e também fator VIII.
[0024] Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que defibrotide catalisa a hidrólise de plasminogênio em plasmina. Consequentemente, quando defibrotide é incubado com euglobulina e um substrato específico para plasmina, tal como um peptideo da fórmula A1-A2-A3-X como divulgado pela Haemostasis, (1978), 7, 138-149, aqui incorporada por referência, a taxa na qual o composto X é liberado dentro do meio de incubação aumenta proporcionalmente com a concentração do próprio defibrotide.
[0025] Em outros termos, defibrotide catalisa a hidrólise de plasminogênio contido na euglobulina em plasmina; plasmina esta que reage enzimaticamente com o substrato específico para plasmina, preferivelmente um substrato cromogênico, para fornecer um produto mensurável.
[0026] O método da presente invenção assim compreende ainda as etapas de: c) determinar a taxa de liberação do produto mensurável durante o curso da reação enzimática tanto de uma amostra padrão quanto de uma amostra de teste de defibrotide; d) correlacionar, matematicamente e/ou graficamente, a taxa de liberação com a concentração de defibrotide correspondente para se obter a atividade biológica da amostra de teste de defibrotide.
[0027] A amostra de defibrotide usada para a determinação de acordo com a presente invenção é no geral preparada pela extração de órgãos de acordo com procedimentos conhecidos, tais como descritos, por exemplo, na Pat. U.S. No. 4.985.552 que já foi mencionada e que é também aqui incorporada por referência.
[0028] Um lote de defibrotide normal industrialmente fabricado foi escolhido como a amostra de referência (padrão) e foi usado para preparar as curvas de calibração de acordo com o método da presente invenção.
[0029] No geral, o presente método fornece medições precisas e acuradas de defibrotide mesmo na presença de contaminantes, tais como, por exemplo, RNA, heparina, defibrotide degradado (defibrotide do qual purina ou pirimidina foram removidas) ou etanol, contanto que os mesmos estejam em concentrações, no geral menores do que 10 % em peso, como, por exemplo, de modo a não prejudicar o sistema.
[0030] Além de permitir a determinação de defibrotide, o método também permite a determinação de outras substâncias biologicamente equivalentes derivadas de defibrotide, tais como, por exemplo, defibrotide desaminado ou, mais simplesmente, defibrotide desnaturado/degradado pela combinação de condições físico-químicas.
[0031] O presente método é suficientemente sensível para detectar concentrações de defibrotide mais baixas ou iguais a 2,5 μg/ml (concentração final no sistema de determinação) e, no geral, expressa boa correlação até os valores de concentração máxima mais altos do que ou igual a 1000 μg/ml.
[0032] A euglobulina usada é no geral qualquer fração de euglobulina de mamífero, tal como, por exemplo, euglobulina bovina, porcina, de coelho ou humana, com uma preferência para euglobulinas humana e de bovino.
[0033] Entretanto, embora a fração de euglobulina seja o sistema enzimático de escolha, o uso de outros sistemas enzimáticos equivalentes, tais como, por exemplo, plasma e soro diluídos (até 1:10 com tampões), combinações artificialmente criadas ou isoladas de plasminogênio, tPA, uPA, PAI-1&2 alfa 2 antiplasmina e os sistemas enzimáticos semelhantes que são química e biologicamente relacionados e têm funcionalidade similar, caem dentro do escopo da presente invenção.
[0034] No método da presente invenção, o substrato para a plasmina pode ser entendido como sendo qualquer substrato específico para plasmina que, sob as condições do método, libera um produto de hidrólise detectável X.
[0035] Dependendo da natureza do grupo detectável X, sistemas alternativos de detecção habitualmente conhecidos pela pessoa habilitada na técnica podem ser adotados igualmente bem. Os sistemas de detecção espectrofotométricos ou fluorimétricos são particularmente vantajosos, especialmente os sistemas espectrofotométricos.
[0036] Os substratos no geral usados são aqueles que são específicos para o ensaio de plasminogênio-plasmina. É preferível usar peptideos da fórmula A1-A2- A3-X, em que A1 e A2 são aminoácidos que são predominantemente não polares, A3 é lisina ou arginina e X é o grupo detectável. Os exemplos destes substratos são Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa ou piroGlu-Phe-Lys-pNa em que o grupo X detectável pela espectrofotometria é para-nitroanilina (pNA). Outros substratos adequados, por exemplo, Val-Gly-Arg-2NA, contêm 2-naftilamina, que é mensurável pela fluorimetria. Um substrato particularmente preferido é o composto H-D-Valil-L- Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina (H-D-Val-Leu-Lys-pNA).
[0037] Os substratos específicos usados para determinar a atividade de defibrotide na fração de euglobulina são no geral comercialmente disponíveis.
[0038] O método de determinação da presente invenção é realizado colocando- se a amostra de defibrotide em solução de euglobulina, em um pH e molaridade específicos.
[0039] Em particular, as frações de euglobulina obtidas a partir de plasma de mamífero são reconstituídas dissolvendo-se e diluindo-se a euglobulina ao volume original do plasma gerador com tampão salino (ex.: a quantidade de fração de euglobulina obtida a partir de 10 ml de plasma são dissolvidos e reconstituídos para 10 ml com tampão salino no pH entre 7 e 8).
[0040] Entretanto, com relação às concentrações de substrato de 0,3 a 4 mM, preferivelmente de 2,5 a 3,5 mM e vantajosamente de 3 mM, são no geral usadas no caso de um substrato cromogênico, enquanto que concentrações de 0,05 a 0,15 mM são usadas no caso de um substrato fluorogênico.
[0041] O método de determinação da invenção, como outros métodos enzimáticos, é sensível ao pH do meio.
[0042] De fato, no geral o mesmo não pode ser aplicado em valores extremos de pH onde o sistema enzimático seria inativado.
[0043] Também é preferível que o pH do meio não sofra variação em momento nenhum durante o período quando as medições estão sendo tomadas, e portanto a fração de euglobulina é reconstituída com sistemas de tampão selecionados daqueles normalmente usados para os testes biológicos. Os sistemas de tampão adequados podem ser, por exemplo, tampão de fosfato, tampão de citrato ou tampão de cloridreto de tris(hidroximetil)aminometano e cloreto de sódio (TRIS- NaCI). A reconstituição da fração de euglobulina é preferivelmente realizada com TRIS-NaCI.
[0044] No presente método é usualmente preferido manter o pH do meio em uma faixa de aproximadamente de 7 a 8, mais preferivelmente em aproximadamente 7,4 a 7,6.
[0045] Além disso, é preferido manter a concentração do sistema de tampão em uma faixa de 10 a 200 mM, preferivelmente em aproximadamente 50 mM. Mais especificamente para o TRIS-NaCI as concentrações devem ser de 50 mM para TRIS e 150 mM para o cloreto de sódio.
[0046] O método da invenção para determinar a atividade biológica de defibrotide, soluções de amostra de defibrotide são diluídas diretamente na fração de euglobulina, depois o substrato cromogênico ou fluorogênico é adicionado. Em particular, de modo a permitir as medições é preferível preliminarmente diluir/dissolver o defibrotide em tampão de TRIS-NaCI de modo a se obter uma solução de estoque precursora de ambos, amostra e padrão. A partir das soluções de estoque precursoras a amostra e o padrão são diluídos, pela diluição em série, em volume definido da fração de euglobulina até que a faixa de concentração analítica que é de cerca de 1 a 1000 μg/ml de defibrotide.
[0047] Um parâmetro importante no presente método de determinação é a temperatura. É preferível que a mesma temperatura seja mantida por toda a duração das medições e para todas as amostras determinadas, tanto com respeito à construção das curves de referência quanto durante o estágio de medição. Para esta finalidade, é preferível usar aparelho controlado por temperatura e também, onde necessário, é possível proceder com vários conjuntos de medições, mudando a posição das amostras apropriadamente de modo a garantir que o sistema tenha homogeneidade térmica máxima.
[0048] No geral, este método de determinação é aplicado em uma faixa de temperatura, por exemplo, de 25 a 40 °C, preferivelmente de 35 a 39 °C, e ainda mais preferivelmente a 37 °C.
[0049] De acordo com a presente invenção, as medições da concentração de composto X liberado no meio pela ação do defibrotide começam quando todos os reagentes foram adicionados e continua por um tempo predeterminado e em uma frequência predeterminada como uma função da natureza química de X e do sistema de detecção.
[0050] Similarmente a outros métodos de determinação biológica, o método da invenção também fornece um estágio de calibração e um estágio de medição que são preferivelmente realizados na mesma microplaca de modo a reduzir tanto quanto possível a incidência de variabilidade experimental.
[0051] O estágio de calibração compreende a aquisição dos dados de absorbência com respeito às amostras em concentrações crescentes conhecidas de defibrotide (padrão), o reprocessamento estatístico destes dados e a extrapolação das curvas de calibração, que expressam a correlação entre o aumento na taxa da reação enzimática da invenção e a concentração de defibrotide presente na fração de euglobulina. No estágio de medição, devido à correlação obtida no estágio de calibração, é possível determinar as atividades biológicas desconhecidas das amostras de defibrotide com base nos valores de absorbância medidos e processados sob as mesmas condições.
[0052] Em mais detalhes, o protocolo experimental no geral fornece a preparação de várias amostras, tanto padrão quanto desconhecido, em várias concentrações conhecidas de defibrotide. As amostras de defibrotide são preparadas pela diluição progressiva das soluções mãe de acordo com um fator de diluição predeterminado.
[0053] No presente método, é preferido preparar pelo menos 5 concentrações do padrão e 5 concentrações da amostra a ser testada, preparando pelo menos 4 réplicas para cada concentração do padrão e, similarmente, para cada concentração da amostra de teste, no geral para diluições 1:2 sucessivas de soluções mãe.
[0054] As concentrações tanto do padrão quanto da amostra de teste de defibrotide são no geral de 0,1 a 1000 μg/ml.
[0055] As concentrações da amostra de teste são preferivelmente da mesma ordem de magnitude como as concentrações do padrão.
[0056] De acordo com a ilustração acima, as medições para cada concentração são preferivelmente realizadas em 1 microplaca onde a posição de cada amostra, do padrão e da amostra de teste, respectivamente, na concentração correspondente é preferivelmente alternada. De acordo com este esquema para o arranjo das amostras, que é explicado em mais detalhes na parte experimental, para cada concentração tanto do padrão quanto da amostra de teste de defibrotide, pelo menos 4 valores de absorbância são medidos de cada vez.
[0057] O conjunto de medições descrito acima é tomado em tempos predeterminados, isto quer dizer, antes de tudo no tempo t0, isto quer dizer, quando todos os componentes foram adicionados, antes que a reação enzimática da invenção tenha começado, e subsequentemente em intervalos precisos e por um período de tempo suficiente para adquirir os dados necessários.
[0058] Preferivelmente, as medições de absorbância são continuadas até um máximo de 90 minutos, com leituras tomadas a cada 1 a 10 minutos. Mais vantajosamente, as leituras são tomadas a cada minuto. As leituras fotométricas de absorbância são realizadas em um comprimento de onda que depende da natureza do grupo detectável X liberado no curso da reação hidrolítica enzimática. No caso específico em que X é p-NA, a absorbância é medida a 405 nm.
[0059] As leituras de absorbância do padrão e amostras de defibrotide desconhecidas, conhecidas como dados brutos, no geral originam diretamente do mesmo aparelho que fornece a operação de leitura; elas são arranjadas na forma de tabela em uma tal maneira que um valor de absorbância é expressado de cada vez e bem.
[0060] Os dados brutos são depois processados, usando, por exemplo, a Spread Sheet—Microsoft Excel®. Esta primeira operação de processamento leva ao cálculo da absorbância média e do desvio padrão associado, de cada vez e para cada conjunto de leituras, cada conjunto compreendendo pelo menos 4 réplicas para cada concentração tanto de padrão quanto de amostra de teste de defibrotide.
[0061] Outro processamento estatístico dos dados é realizado com software comercialmente disponível para a determinação de ensaio biológico como descrito por Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2a ed. Ch. Griffin, Londres e Farmacopéias relevantes.
[0062] Para ser mais preciso, de acordo com a presente invenção, a determinação do ensaio biológico de defibrotide pode ser realizado usando modelo de linha paralela (parallel line modeí), modelo de razão de declive (slope ratio model) e modelos de curva logística de quatro parâmetros (four-parameter logistic curve models) como definidos, por exemplo, pela relevante “European Pharmacopoeia General text 5.3, Statistical Analysis”.
[0063] Como ilustrado na FIG. 1, colocando-se o tempo na abscissa e a absorbância na ordenada, as linhas retas serão obtidas cuja inclinação “b” será proporcional à taxa de reação enzimática: aumentando-se a concentração de defibrotide, a taxa de hidrólise e, proporcionalmente, o valor de “b” aumentará. Finalmente, os valores de inclinação, calculados como descrito acima para cada conjunto de réplicas de defibrotide padrão e defibrotide da amostra de teste, são correlacionados com a concentração de defibrotide à qual eles dizem respeito. A transformação matemática adequada da abscissa (isto é, log da concentração de defibrotide) pode ser usada no lugar do valor real.
[0064] Graficamente, esta correlação dá origem a um sigmóide para o padrão e um sigmóide para a amostra de teste (FIG. 2); as porções centrais da sigmóide têm duas linhas retas que são no geral paralelas e a distância entre as quais é uma função da diferença na atividade biológica entre a amostra de teste e o padrão. Este intervalo é usado para a determinação da potência usando o modelo da linha paralela como descrito por Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2a ed. Ch. Griffin, Londes.
[0065] Para uma determinação mais específica, os modelos de curva logística de quatro parâmetros são usados e neste caso a curva sigmóide inteira tanto da amostra quanto do padrão, é usada para o cálculo da potência biológica relativa da amostra.
[0066] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, as soluções padrão e as soluções das amostras de defibrotide a serem determinadas são introduzidas dentro dos respectivos poços da microplaca. A fração da euglobulina é preparada no momento de uso e é o meio de diluição da solução de estoque de defibrotide. Finalmente, a solução contendo o substrato cromogênico é adicionada. A microplaca é depois colocada na leitora regulada com termostato e, depois de agitação rápida, as leituras da absorbância do sistema são tomadas em intervalos predeterminados e durante o período predeterminado de tempo. Os dados brutos obtidos são depois processados, determinando assim as atividades desconhecidas das amostras de defibrotide.
[0067] Como deve ser avaliado a partir dos exemplos que seguem, o método de acordo com a presente invenção permite que se obtenha as formulações líquidas de defibrotide, preferivelmente soluções aquosas, tendo uma atividade biológica definida e, em particular, tendo uma atividade de 25 a 35 IU/mg de defibrotide, preferivelmente de 27,5 a 32,5 IU/mg e, mais preferivelmente, de 28 a 32 IU/mg.
[0068] As formulações líquidas de defibrotide são preferivelmente comercializadas na forma de recipientes, mais preferivelmente frascos, contendo 200 mg de defibrotide em 2,5 ml de solução aquosa tamponada (preferivelmente em um pH de 6,5 a 8,5, mais preferivelmente de 7 a 8), a ser diluída antes do uso; consequentemente, quando a atividade biológica é avaliada com o método da presente invenção, cada recipiente apresenta uma atividade de defibrotide de 5000 a 7000 IU, preferivelmente de 5500 a 6500 IU, mais preferivelmente de 5600 a 6400.
[0069] Estes e outros aspectos da invenção serão melhor ilustrados nos exemplos que seguem que, entretanto, não devem ser considerados como limitando a invenção. EXEMPLOS
[0070] Os materiais que seguem foram usados nos exemplos dados aqui:
[0071] Aparelho
Figure img0001
PROGRAMAS & SOFTWARE
[0072] o Microsoft Excel® (Microsoft Corporação, Redmond, Wash., USA)
[0073] Substâncias
[0074] o Defibrotide (Gentia)
[0075] o Substrato cromogênico S-2251 (Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milan, Itália)
[0076] o Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS)-NaCI, (Sigma-Aldrich, Milan, Itália)
[0077] o HCI 1N (Carlo Erba reagenti, Milan, Itália)
[0078] o NaOH 1N (Carlo Erba reagenti, Milan, Itália)
[0079] o Plasma Bovino (Tebu Bio Italia, Magenta (Ml), Itália)
[0080] o Ácido Acético Glacial (Carlo Erba reagenti, Milan, Itália) SOLUÇÕES
[0081] o TRIS-NaCI (Preparação de 1 L): Dentro de um béquer de 1 L transferir quantitativamente 6,06 g de TRIS-HCI e 2,2 g de NaCI. Dissolver em 500 ml de água purificada e ajustar o pH para 7,4 com cerca de 40 ml de HCI 1N. Transferir quantitativamente a solução para dentro de um frasco volumétrico de 1 L e diluir a solução até o volume com água purificada. Armazenar a solução em refrigerador (2 a 8 °C)
[0082] o Substrato Cromogênico S2251 (CAS 63589-93-5) 3 mM (Preparação de 15,2 ml): Dissolver cerca de 25 mg de substrato cromogênico com 15,2 ml de água purificada. Armazenar a solução em refrigerador (2 a 8 °C)
[0083] o Euglobulinas bovinas (Preparação de 10 ml). Em um recipiente com uma capacidade mínima de 300 ml introduzir 240 ml de água purificada gelada e sob agitação adicionar 10 ml de plasma bovino. Ajustar o pH a 5,3 ±0,1 com ácido acético a 1 %. Deixar sedimentar de 2 a 8 °C por 1 a 16 horas. Remover a solução de sobrenadante claro por sifonamento e coletar o precipitado por centrifugação a 2.800 rpm por 5 minutos e 4 °C. Colocar o precipitado em suspensão dispersando mecanicamente (por exemplo, por meio de uma vareta de vidro de laboratório) em 5 ml de água purificada gelada, agitar por cerca de 5 min e coletar o precipitado pela centrifugação a 2.800 rpm por 5 minutos e 4 °C. Dispersar o precipitado mecanicamente em cerca de 10 ml de TRIS-NaCI; para facilitar a dissolução do precipitado triturar as partículas do precipitado com um instrumento adequado (por exemplo, vareta de vidro de laboratório). Armazenar a suspensão obtida de 2 a 8 °C por não menos do que 1 hora e não mais do que 6 horas antes do seu uso. Soluções padrão e de amostra de defibrotide Solução de estoque de referência
[0084] Dentro de um frasco volumétrico de 20 ml transferir quantitativamente cerca de 100 mg de padrão de referência de defibrotide acuradamente pesado. Dissolver o pó com cerca de 10 ml de TRIS-NaCI e acertar o volume com o mesmo solvente. Diluir 1:4 a solução obtida com TRIS-NaCI de modo a se obter uma solução RS de defibrotide de cerca de 1,25 mg/ml.
[0085] Solução de estoque de amostra
[0086] Dentro de um frasco volumétrico de 20 ml transferir quantitativamente cerca de 100 mg de amostra de defibrotide acuradamente pesada. Dissolver o pó com cerca de 10 ml de TRIS-NaCI e acertar o volume com o mesmo solvente. Diluir 1:4 a solução obtida com TRIS-NaCI de modo a se obter uma solução de amostra de defibrotide de cerca de 1,25 mg/ml.
[0087] Preparação das soluções de referência e amostra a) Defibrotide 125 μg/ml: diluir 1:10 a solução de estoque de defibrotide (Referência e Amostra) com TRIS NaCI (correspondendo a 50 μg/ml dentro do poço da placa). Dentro de um tubo de Eppendorf transferir quantitativamente 500 μl da solução de preparada e mistura com 500 μl de euglobulina. Fechar o tubo e armazenar em água gelada. b) Defibrotide 62,5 μg/ml: diluir a solução 1:2 (a) com TRIS NaCI (correspondendo a 25 μg/ml dentro do poço da placa). Dentro de um tubo Eppendorf transferir quantitativamente 500 μl da solução preparada e misturar com 500 μl de euglobulina. Fechar o tubo e armazenar em água gelada. c) Defibrotide 31,25 μg/ml: diluir a solução (b) 1:2 com TRIS NaCI (correspondendo a 12,5 μg/ml dentro do poço da placa). Dentro de um tubo de Eppendorf transferir quantitativamente 500 μl da mistura de solução preparada e misturar com 500 μl de euglobulina. Fechar o tubo e armazenar em água gelada. d) Defibrotide 12,5 μg/ml: diluir 1:2,5 a solução (d) com TRIS NaCI (correspondendo a 5 μg/ml dentro do poço da placa). Dentro de um tubo Eppendorf transferir quantitativamente 500 μl da solução preparada e misturar com 500 μl de euglobulina. Fechar o tubo e armazenar em água gelada. Solução em branco
[0088] Misturar 1 volume de euglobulinas com 1 volume de solução de TRIS NaCI (ex.: 500 μl + 500 μl) Deposição de placa
[0089] De acordo com o esquema de deposição proposto (ver a Tabela 1 abaixo) adicionar em cada poço da placa 200 μl de solução padrão ou amostra ou branco. Nota esquema de deposição diferente pode ser usado de acordo com a disponibilidade e configuração das pipetas automáticas. Entretanto não menos do que 4 deposições para cada solução de amostra e referência deve ser usada para o ensaio.
[0090] Imediatamente antes da incubação da placa dentro da leitora de microplaca adicionar em cada poço 50 μl de substrato Cromogênico. Tabela 1
Figure img0002
[0091] S1, S2, S3, S4: Solução de Referência deposição 1, deposição 2, deposição 3, deposição 4,
[0092] U1, U2, U2, U5: Solução de Amostra deposição 1, deposição 2 deposição 3, deposição 4,
[0093] Ca, Cb, Cc etc.: Concentração de referência e amostra de defibrotide a, b, c etc. Solução em Branco BLK CÁLCULO E RESULTADOS
[0094] A partir da plotagem cinética “absorbância versus tempo” das preparações padrão (ex.: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) identificar uma faixa linear adequada (ex.: de 30 a 35 min, ver a figura 3). .
[0095] Identificação da faixa cinética linear (A@405 nm vs tempo).
[0096] Calcular para cada preparação do padrão e da amostra a resposta do ensaio (Inclinação) na faixa de tempo pré-definida como segue.
Figure img0003
[0097] Em que:
[0098] Aa são os valores de Absorbância no Tempo Ta (30 min da plotagem acima)
[0099] Ab é o valor de Absorbância no Tempo Tb (35 min da plotagem acima)
[00100] Reportar o valor obtido em um formato tabular como relatado na tabela 2. Tabela 2
Figure img0004
[00101] A plotagem das respostas para a substância a ser examinada e para o padrão contra os logaritmos da concentração e calcular a atividade da substância a ser examinada usando p modelo da linha paralela como definida pelo capítulo 5.3.2 relevante da edição corrente da Ph. Eur.
[00102] Não menos do que 3 diluições em série consecutivas da referência e da amostra devem ser usadas (por exemplo concentração de defibrotide 5 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, ou 5 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, ou 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml). Análise da variação
[00103] A análise da variação é realizada de acordo com a seção 5.3.2.3 da edição corrente da Ph. Eur. e Finney DJ (1964) Statistical Method in Biological Assay . 2a ed. Teste quanto à Validade 1) O termo regressão linear é significante, isto é, a probabilidade calculada é menor do que 0,05. Se este critério não é atingido, não é possível calcular 95 % de C.l. 2) O termo de não paralelismo não é significante, isto é, a probabilidade calculada é menor do que 0,05. 3) O termo para a não linearidade não é significante, isto é, a probabilidade calculada é menor do que 0,05. Critérios de aceitação
[00104] 4) A potência estimada não é menor do que 90 % e não maior do que 111 % da potência estabelecida.
[00105] 5) Os limites de confidência (P = 0,95) da potência estimada não são menores do que 80 % e não maiores do que 125 % da potência estabelecida. Cálculo
Figure img0005
em que:
[00106] -R: Resultado da amostra obtida pela análise do modelo de linha paralela
[00107] -Potência Padrão: Potência estabelecida do Padrão (Ul/mg na substância seca)
[00108] -Cone. Padrão: Concentração do Padrão (mg/ml na substância seca)
[00109] -Cone, da Amostra: Concentração da Amostra (mg/ml na substância seca) Ensaio aplicado às formulações de defibrotide
[00110] O ensaio divulgado acima foi usado para determinar a atividade biológica de formulações líquidas contendo 200 mg de defibrotide em 2,5 ml (80 mg por ml) e tendo a composição qualitativa e quantitativa relatada na tabela 3. Tabela 3
Figure img0006
[00111] Os resultados são relatados na tabela 4. Tabela 4
Figure img0007
Figure img0008
Usado como Padrão de Referência

Claims (14)

1. Método para determinar a atividade biológica de defibrotide, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) colocar em contato defibrotide, euglobulina de mamífero e um substrato específico para a plasmina que, pela reação com a plasmina, fornece um produto mensurável; e b) medir a quantidade de produto formado em tempos sucessivos, para determinar deste modo a atividade biológica do defibrotide.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a euglobulina é uma euglobulina de mamífero.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a euglobulina é euglobulina humana, de coelho ou bovina.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a plasmina que reage com o substrato específico para a plasmina é liberada pelo plasminogênio contido na euglobulina.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato específico para a plasmina é um substrato cromogênico.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato específico para a plasmina é um composto de fórmula A1-A2-A3-X em que A1 e A2 são aminoácidos não polares, A3 é lisina ou arginina e X é o produto mensurável.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o produto mensurável X é selecionado do grupo que consiste em para-nitroanilina e 2- naftilamina.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o substrato específico para a plasmina é H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o produto mensurável X é medido por espectrofotometria ou por espectrofluorimetria.
10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a euglobulina de mamífero é reconstituída até o mesmo volume do plasma de origem ou diluída até 1:10 com tampão adequado e o substrato cromogênico/fluorogênico tem uma concentração de 2,5 a 3,5 mM, preferivelmente de 3 mM.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito método é realizado em um meio de reação que é uma solução aquosa tamponada a um pH de 7 a 8, preferivelmente a um pH de 7,4.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura é mantida de 35 a 39 °C, preferivelmente a 37 °C.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração do substrato específico para a plasmina é de 0,3 a 4 mM, preferivelmente de 2,5 a 3,5 mM, mais preferivelmente de 3 mM.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: c) determinar a taxa de liberação do produto mensurável durante o curso da reação enzimática tanto de uma amostra padrão quanto de uma amostra de teste; d) correlacionar, matematicamente e/ou graficamente, a taxa de liberação com a concentração de defibrotide correspondente para se obter a atividade biológica da amostra de teste de defibrotide.
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