JP2002512508A

JP2002512508A - Ｄｎａメチルトランスフェラーゼゲノミック配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2002512508A
Application number: JP53606198A
Authority: JP
Inventors: スズィフ，モシェ; ビギー，パスカル; ラムチャンダニ，シャム
Original assignee: マクギル・ユニヴァーシティ
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2002-04-23
Also published as: CA2291595A1; AU8125098A; WO1998054313A2; WO1998054313A3; US6221849B1; EP0985035A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ゲノミックDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子由来の核酸配列を含む組換え核酸を提供する。本発明は、さらに、そのような核酸配列に関する配列情報を提供する。さらに、本発明は、ゲノミックDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子またはそのRNA転写物の特定の領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。最後に、本発明は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを、分析用および診断用手段として、トランスジェニック植物および動物の研究並びに遺伝子治療アプローチのための有力な因子として、および有力な治療用作用薬として使用するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡメチルトランスフェラーゼゲノミック配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチド発明の背景発明の分野本発明は、遺伝子発現の変調に関する。特定すれば、本発明は、DNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の遺伝子発現の変調、および酵素DNAメチルトランスフェラーゼにより制御された遺伝子発現の変調に関する。関連分野の要約遺伝子発現の制御は、様々な細胞プロセスおよびそれらの基礎となる生化学経路を理解するための重要性の増大したアプローチとなりつつある。そのような理解は、科学の知識を豊富にして、そのような経路において如何なる常軌逸脱が重大な疾患状態を導き得るかについての新しい発見を導く助けとなる。最終的には、そのような発見がこれらの疾患の効果的な治療処置の開発を導くことができる。特に興味のある細胞プロセスの一つの典型は、如何にして細胞がその遺伝子の発現を制御するかということである。常軌逸脱した遺伝子発現は、広範囲の受け継いだ遺伝障害に必須であるらしく、多くの癌および他の疾患にも関与してきた。遺伝子発現の制御は複雑なプロセスであり、そしてこのプロセスの多くの側面が理解されないままでいる。このプロセスのミステリーの一つは、多細胞生物を構成する全ての組織において遺伝情報が同じであるにも拘わらず、ゲノムによりコードされる機能の発現が別の組織においては著しく異なるという事実に存在する。いくつかの場合に、組織−特異的転写因子がこの現象において役割を担うことが知られている。(Maniatis et al.，Science 236:1237-1245(1987);Ingarham e t al.，Annual Review of Physiology 52:773-791(1990)を参照されたい)。しかしながら、転写因子のみの作用では容易に説明できないいくつかの重要なケースが存在する。例えば、Midgeon，Trends Genet．10:230-235(1994)は、Ｘ−不活性化が不活性Ｘ−染色体に存在する遺伝子の対立遺伝子の不活性化を含むのに対して、該活性Ｘ−染色体上の該対立遺伝子は発現され続けることを教示する。さらに、Peterson and Sapienza，Annu．Rev．Genet．27:7-31(1993)は、一方の親から受け継いだ遺伝子の対立遺伝子が活性であり、他方の親から受け継いだ他方の対立遺伝子が不活性である、「親刷込み(parental imprinting)」を記載する。これらの両者においては、両方の対立遺伝子が同じ転写因子を含む環境に存在するが、一方の対立遺伝子が発現されて他方が沈黙である。即ち、転写因子以外の何かがこれらの現象に関与するはずである。研究者は、どのタイプの「発生遺伝学情報」がゲノムの発現パターンの、この追加の制御に関与するかについて探索している。Holliday，Philos．Trans．R． Soc．Lond．B．Biol．Sci．326:329-338(1990)は、そのような発生遺伝における DNAメチルトランスフェラーゼの可能な役割を論じる。DNAは、遺伝子配列によりコードされない修飾のセットを含むが、別の酵素機構を用いて共有結合によりDN Aに付加される。これらの修飾はCpGジヌクレオチド中のシトシン塩基の５位のメチル化の形態をとる。多くの研究は、そのような修飾が遺伝子発現の制御に関与するのはもっともであることを示唆するが、その正確な役割は解明されないままである。例えば、Lock et al.，Cell 48:39-46(1987)は、高メチル化とＸ−不活性化のタイミングがメチル化の原因の役割と一致するか否かについての疑問を生じさせる。同様に、Bartolomei et al.，Genes Dev．7:1663-1673(1993)およびB randeis et al.，EMBO J．12:3669-3677(1993)は、親刷込みにおけるメチル化の役割に関するタイミングと原因の疑問を開示する。遺伝子発現におけるDNAメチル化の役割の存在する研究の欠点のいくつかは、研究を指示するために現在利用可能な手段に存在する。多くの研究は、５−アザＣを用いることによりDNAメチル化を阻害した。しかしながら、５−アザＣはDNA メチル化以外の他の細胞機構に複数の作用を有するヌクレオシドアナログであり、即ち、これらの研究から得られたデータの解釈を困難にする。同様に、５−アザｄＣはDNAへの組込みに際して機構に基づく阻害剤を形成するが、DNA上にDNA メチルトランスフェラーゼ（以後、DNA MeTaseと呼ぶ）のトラッピングを起こすことができて、データの解釈を曖昧にするかもしれない毒性をもたらす。より最近、Szyf et al.，J．Biol．Chem．267:12831-12836(1995)は、癌細胞に対するメチル化の効果を研究するための、DNAMeTase遺伝子に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を用いた、より有望なアプローチを開示する。Sz yf and von Hofe，米国特許第5,578,716号は、腫瘍源性を阻害するための、DNA MeTase遺伝子に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示する。これらの発展は、多くの細胞プロセスにおけるメチル化の役割を探索するための強力な新しい手段を提供した。さらに、それらは、DNAメチル化を変調できる治療用化合物の開発のための有望な新しいアプローチを提供してきた。これらのアプローチに対する一つの制限は、DNA MeTase酵素の半減期のために、それらの効果が迅速ではないことである。即ち、DNA MeTaseの発現は変調されるが、残余のDNA MeTase酵素が分解されるまではDNAをメチル化し続けうることである。ポリメラーゼ関連DNA MeTaseのmRNAもしばらくは生き残り、追加の翻訳を可能にして追加のDNA MeTase酵素を生成する。よって、そのプロセシングとポリソームとの対合の前に核内でDNA MeTaseのRNAのイントロン領域に対して作用できる新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する要求が存在する。そのようなオリゴヌクレオチドの開発は、DNA MeTaseのRNAの非コード領域に関する配列情報を得ることを必要とする。発明の簡単な概要本発明は、ゲノミックDNAメチルトランスフェラーゼ（DNA MeTase）由来の核酸配列を含む組換え核酸を提供する。本発明は、ゲノミックDNA MeTase遺伝子に相補な核酸配列を含む組換え核酸配列も提供する。本発明は、さらに、そのような核酸配列のための配列情報を提供する。さらに、本発明は、ゲノミックDNA Me Tase遺伝子またはそのRNA転写物の特定の標的領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。最後に、本発明は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを、分析用および診断用手段として、トランスジェニック植物および動物の研究並びに遺伝子治療アプローチのための有力な因子として、および有力な治療用作用薬として使用するための方法を提供する。第１の側面において、本発明は、ゲノミックDNA MeTase遺伝子のヌクレオチド配列から選択された少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む新規な組換え核酸配列を提供する。ゲノミックDNA MeTase遺伝子のセンス鎖の配列を図１に示す。ゲノミックDNA MeTase遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド配列も、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８として配列表に記載する。第２の側面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８として配列表に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも一つのヌクレオチド配列に相補な新規組換え核酸配列を提供する。第３の側面において、本発明は、DNA MeTaseの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはDN A MeTaseをコードするRNAまたは二重鎖DNAの特定の標的領域に相補である。好ましくは、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはひとつまたは複数の修飾されたヌクレオシド内部連結を含み、そして任意に、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたは２'−Ｏ−置換リボヌクレオシド、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでよい。本発明のこの側面による特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む。第４の側面において、本発明は、腫瘍細胞の成長を含む細胞成長におけるDNA MeTaseの役割を調査する方法を提供する。本発明のこの側面による方法において、興味のある細胞型を本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドに接触させて、 DNA MeTaseの細胞における発現の阻害をもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞周期における異なる点において、または興味のある細胞型の成長において、DNA MeTaseの役割を決定するために、細胞成長促進剤あるいは阻害剤と共に投与することができる。第５の側面において、本発明は、ヒトを含む哺乳類に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することからなる、腫瘍の成長の阻害方法を提供する。本発明のこの側面による方法において、治療上有効な量の本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、その体内に腫瘍細胞を有する、ヒトを含む哺乳類に治療上有効な期間投与する。図面の簡単な説明図１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８として配列表に記載されたヌクレオチド配列を含むDN A MeTase遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。コーディング領域内のヌクレオチドを太字で示す。添えられた数字は、Yen et al．（Nucleic Acids Res ．9:2287-2291（1992）およびYoder et al．（J．Biol．Chem．271:31092-31097 (1996)）によるDNA MeTaseのcDNAのナンバリングに対応する。図２は、本発明のオリゴヌクレオチドとDNA MeTase酵素の間の複合体形成を同定するための実験における、オートラジオグラフ（パネルＡ，ＢおよびＤ）およびウエスタンブロット（パネルＣ）を表す。複合体形成は煮沸により復帰させて、SAMとは独立であった。図３は、核抽出物中におけるDNA MeTase活性を阻害する、本発明の代表的な非制限の合成オリゴヌクレオチドの能力をグラフにより表す。図４パネル（Ａ）(ヒトDNA MeTase遺伝子の物理マップおよびクローン化されたゲノミック挿入物)は、ヒトDNA MeTase遺伝子の制限マップおよびファージクローンを示す。スクリーニングに使用するためのcDNAプローブは、各プローブにより識別されたファージ（ファージの名前を線の上に示す）に含まれるゲノミック断片を表す線の下に矢印で示す。矢印の下の数字は、各プローブに含まれるcDNA 配列の５'および３'末端を示す。cDNAは、Yoder et al.，1996におけるとおりに数字を付す。ゲノミック挿入物は、NotI消化によりファージから単離して、NotI により直鎖状化されたｐブルースクリプトＳＫ＋内にサブクローン化した。サブクローンを制限酵素（Ｘ＝XbaI，Ｂ＝BamHI，Ｈ＝HindIII）により消化して、サザンブロットを行い、そしてエクソン特異的³²Ｐ標識オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはcDNAプローブにハイブリダイズさせることにより、ヒトDNA MeTase 遺伝子のスケール制限マップを作成した。図４パネル（Ｂ）は、ヒトDNA MeTase遺伝子のエクソン−イントロン構造を示す模式的描写である。パネル（Ａ）に示すサブクローンのエクソンを配列決定することにより、エクソン−イントロンの境界を決定した。エクソンは垂直の棒として描写して、上に数字を付し、イントロンは太い水平な棒として示す。特定の機能ドメインをコードするエクソンの領域を描写するが、NLSは核局在シグナル、FTRは複製中心標的化領域、Znは亜鉛結合ドメイン、AdoMet結合はＳ−アデノシル−メチオニン結合モチーフ、Pro-Cysはプロリン−システイン触媒モチーフ、触媒ドメインは全てのCpGメチルトランスフェラーゼに保存された領域を示す。提案された開始コドンのエクソン位置はATG。図４パネル（Ｃ）は、PCR分析により決定されてサザンブロット分析により確認されたエクソンの位置を示す。ヒトDNA MeTaseのmRNAの別のセグメントをコードする断片を、以下のcDNAプローブへのハイブリダイゼーションにより可視化した：１．第１エクソンを含むプローブ．２．エクソン３−５を含むプローブ（公知cDNAのヌクレオチド415−740に及ぶ開始）．３．エクソン７−20を含むプローブ．４．エクソン30−40を含むプローブ。cDNAプローブをエクソン−イントロン構造のマップの下に示すが、点線は核プローブにまたがるエクソンの境界を描写する。各制限酵素により可視化された断片は別々の陰矢印により示す。可視化された断片の大きさは矢印の隣に示す。各プローブにより可視化された断片の大きさはゲノミックファージの制限酵素分析により予測された大きさに相当する。図５は、ヒトDNA MeTase遺伝子のエクソン−イントロンの境界および公知のヒトmRNAに対応する配列のエクソン配置を示す模式的描写である(Yen et al.，199 2；Yoder et al.，1996)。エクソン−イントロン境界は、図４パネル（Ａ）に記載されたゲノミック断片のエクソンの配列決定により決定した。境界を周囲にもつイントロン配列を示す。保存されたスプライスアクセプター（３'イントロン）およびドナー（５'イントロン）部位を太く示す。NLSは核局在シグナル(cDNA 位置：817−874)、FTRは複製中心標的化配列(cDNA位置：1195−1938)、Znは亜鉛結合ドメイン(cDNA位置：2194−2310)、AdoMetはＳ−アデノシル−メチオニン結合モチーフ(cDNA位置：3670−3687)、Pro-Cysはプロリン−システイン触媒モチーフ(cDNA位置：ドメインIV中の3910−3915)、ドメインVI(cDNA位置：4003−406 5)、ドメインVIII(cDNA位置：4123−4197)、ドメインIX(cDNA位置：4863−4935) 、ドメインＸ（cDNA位置：4948−5022)。触媒ドメインはシトシン−５メチルトランスフェラーゼにおいて保存された領域(cDNA位置：3649−5083)。ヒトDNA Me TaseのcDNAのヌクレオチドのナンバリングは（Yoder et al.，1996）におけるとおりである。好ましい態様の詳細な説明本発明は遺伝子発現の変調に関する。特定すれば、本発明は、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNA MeTase）をコードする遺伝子の遺伝子発現の変調、および酵素DNA MeTaseにより制御された遺伝子発現の変調に関する。本明細書にて記した特許および刊行物は当業者の知識の範囲内であり、引用により全体を編入する。本発明は、ゲノミックDNA MeTase遺伝子からの核酸配列を含む組換え核酸を提供する。本発明は、さらに、そのような核酸配列のための配列情報を提供する。さらに、本発明は、そのような情報の不在下では標的化できない、ゲノミックDN A MeTase遺伝子またはそのRNA転写物の特定の標的領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。最後に、本発明は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを、分析用および診断用手段として、トランスジェニック植物および動物の研究並びに遺伝子治療アプローチのための有力な因子として、および有力な治療用作用薬として使用するための方法を提供する。第１の側面において、本発明は、ゲノミックDNA MeTase遺伝子のヌクレオチド配列から選択された少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む新規な組換え核酸配列を提供する。ゲノミックDNAMeTase遺伝子のセンス鎖の配列を図１に示す。コーディング領域を太字の配列として示す。一つの好ましい態様において、本発明による組換えDNA分子は、複製可能なベクター中の、図１に示され、そして、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に相当する、ヌクレオチド配列から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む。本明細書において使用されるとおり、用語「複製可能なベクター」は少なくとも一つの細胞種において複製可能な核酸ベクターを意味する。多くのそのような複製可能なベクターが当業界においてよく知られている(例えば、Molecular Cloning，2d Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照されたい)。追加の好ましい態様において、本発明による組換えDNA分子は、複製可能なベクター中の、図１に示され、そして配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に記載されたヌクレオチド配列少なくとも一つに相当するヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補である、ヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、複製可能なベクターは発現ベクターである。用語「発現ベクター」は、一つの態様において、ひとつまたは複数のペプチドにその配列の一部または全部の翻訳を指示することができる、複製可能なベクターである。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中で自律複製可能であるか、または宿主細胞DNA中へ組込まれることになってよい。該発現ベクターは図１に示されたヌクレオチド配列を発現できる宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。さらに別の好ましい態様において、発現ベクターなる用語は、一つまたは複数の転写物へのその配列の一部または全部の転写を指示することができるベクターを意味する。本発明のこの態様によるベクターは宿主細胞中で自律複製するか、または宿主細胞DNAに組込まれることになってよい。該ベクターは図１に示すヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列の転写が可能な宿主細胞を形質転換するのに使用できる。組換えDNA分子および発現ベクターおよび宿主細胞を形質転換するためのそれらの使用法は、当業界においてよく知られている(例えば、Mol ecular Cloning，2d Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照されたい)。さらに別の態様において、本発明は、本発明による組換えDNA分子を含む宿主細胞も提供する。本発明によれば、宿主細胞なる用語は、本発明のヌクレオチド配列を発現する細胞を意味する。本発明のこの第１の側面は、DNA MeTase酵素またはその断片を製造するための方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、本発明のヌクレオチド配列を発現するための適切な培養媒体中で宿主細胞を培養することからなる。結果として、本発明の宿主細胞はDNA MeTase酵素またはその断片を生成し、この明細書において詳細に記載されたとおり、親和性結合により宿主細胞と培養媒体から便利なように分離してよい。DNA MeTase酵素の断片を次に標準の免疫手法により、DN A MeTase酵素のエピトープに特異的な抗体を産生するために使用することができる。そのような抗体は、DNA MeTase抗体を精製するため、あるいは慣用の免疫手法において該酵素を定量するのに使用できる。第２の側面において、本発明は、ゲノミックDNA MeTase遺伝子の少なくとも一部に相補な核酸配列を含む新規組換え核酸分子を提供する。ゲノミックDNA MeTa seのセンス鎖の配列を図１に示す。コーディング領域は太字配列として示す。本発明の目的のためには、「相補」は生理条件下で、ゲノミック領域、遺伝子、またはそのRNA転写物にハイブリダイズする能力を有するのに十分相補であることを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは、相補鎖間の塩基特異的水素結合の通常の結果であり、好ましくはワトソン−クリックまたはフーグステン塩基結合を形成するが、水素結合の他のモデル、並びに塩基スタッキングもハイブリダイゼーションを導くことができる。実際の要件として、そのような相補性は特定のDNA MeTase遺伝子発現阻害の観察から推察できる。一つの好ましい態様において、本発明による組換えDNA分子は、複製可能なベクター中の、図１に示されるヌクレオチド配列の少なくとも一部に配列相補性を有し、そして配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に記載されたヌクレオチド配列少なくとも一つに相補な核酸を含む。別の好ましい態様において、複製可能なベクターは発現ベクターである。本発明のこの側面のために適切な複製可能ベクターおよび発現ベクターは、一般に、本発明の第１の側面のために論じられたとおりの、同じくよく知られた材料である。さらに別の態様において、本発明は、本発明による組換えDNA分子を含む宿主細胞を提供する。本発明のこの第２の側面は、トランスフェクトされた細胞またはトランスジェニック動物中においてDNA MeTase酵素の発現を阻害する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、本発明のこの側面によるヌクレオチド配列を発現するための適切な培養媒体中で宿主細胞を培養することからなる。結果として、本発明の宿主細胞はDNA MeTase酵素のレベル低下を生じる。第３の側面において、本発明は、DNA MeTaseの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA MeTaseをコードするRNAまたは二重鎖DNAの特定の標的領域に相補である。「特定の標的領域」なる用語は、本発明により提供された配列情報無しには標的化されることができない配列を意味するのに使用される。特に、そのような特定の標的化領域は、図１に示される核酸配列の非コード領域の一部を含む。もっとも好ましくは、そのような特定の標的化領域は、そのような非コード配列の約２から約50ヌクレオチドからなる。そのような特定の標的化領域は、限定ではなく、DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子由来の、イントロン配列、非翻訳５'および３'領域並びにイントロン−エクソン境界を含む。特定の態様において、上記標的領域はさらにDNA MeTase遺伝子由来のコーディング領域を含んでよい。本発明によるDNA MeTaseをコードするRNAまたは二重鎖DNAの特定の標的領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい非限定例を表１に示す。そのような特定の標的領域に相補な追加の好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示すヌクレオチド配列を含む約21から約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。そのような特定の標的領域に相補なさらに追加の好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示すヌクレオチド配列を含む約13から約19ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、または２'−Ｏ−置換リボヌクレオシド残基、あるいはそれらの任意の組み合わせのポリマーを含む。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、約８から約50ヌクレオシド残基を有し、そしてもっとも好ましくは約12から約30ヌクレオシド残基を有する。ヌクレオシド残基は、多くの公知のヌクレオシド内結合により互いにカップリングされてよい。そのようなヌクレオシド内部結合は、限定ではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、ブリッジしたホスホロアミダイト、ブリッジしたメチレンホスホネート、ブリッジしたホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオチド内部結合を含む。特定の好ましい態様において、これらのヌクレオシド内部結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、またはホスホルアミデート結合、またはそれらの組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドなる用語は、化学修飾された塩基または糖を有するか、および／または限定ではないが親油性基、インターカレーティング試薬、ジアミンおよびアダマンタンを含む追加の置換基を有するそのようなポリマーも包含する。本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置換された」なる用語は、ペントースモイエティの２'位の、１−６の飽和または未飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基によるか、または２−６炭素原子を含む −Ｏ−アリールまたはアリル基による置換を意味し、但し、そのようなアルキル、アリールまたはアリル基は未置換であるか、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル、またはアミノ基により置換されていてよく；そのような２ '置換はヒドロキシ基(リボヌクレオシドを生成するため)、アミノまたはハロ基を伴ってよいが、２'−Ｈ基は伴わない。本発明のこの側面による特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む。本発明の目的のためには、「キメラオリゴヌクレオチド」は、１種類より多いヌクレオシド内部結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはホスホロジチオエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、好ましくは約２から約12ヌクレオチドおよびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート領域を含む。好ましくは、そのようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合、またはそれらの組み合わせから選択される、少なくとも３つ連続するヌクレオシド内部結合を含む。本発明の目的のためには、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種類より多いヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、リボヌクレオチドまたは２ '−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域を含み、好ましくは約２から約12の２'−Ｏ− 置換ヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。好ましくは、そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは少なくとも３つ連続したデオキシリボヌクレオシドを含むことになり、そしてリボヌクレオシド、２'−Ｏ−置換リボヌクレオシド、またはそれらの組み合わせも含むことになる。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドがDNA MeTaseの発現を阻害する能力を保持する限り、変更できる。これは、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、それら全てを本明細書において詳細に記載する、DNA MeTase酵素アッセイ、ソフトアガー成長アッセイ、またはインビボ腫瘍成長アッセイにおいて活性であるか否かを試験することにより容易に決定される。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈ−ホスホネート化学、ホスホルアミダイト化学、またはＨ−ホスホネート化学とホスホルアミダイト化学の組み合わせ（即ち、Ｈ−ホスホネート化学を数サイクル、そしてホスホルアミダイト化学を残りのサイクル）を含む、よく知られた化学アプローチを用いて適切な固相支持体上で便利なように合成してよい。適切な固相支持体は、固相オリゴヌクレオチド合成に用いられるあらゆる標準固相支持体、例えば孔制御ガラス（CPG）を含む(例えば、Pon，Methods in Molec．Biol．20:465(1993)を参照されたい)。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは様々な目的に有用である。例えば、それらは、実験的細胞培養または動物系においてDNAメチルトランスフェラーゼの活性を阻害し、そしてそのようなDNA MeTase活性を阻害する効果を評価するために使用されることにより、DNA MeTaseの生理機能の「プローブ」として使用することができる。これは、細胞または動物に本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与してあらゆる表現型効果を観察することにより、達成される。この用途において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは慣用的「遺伝子ノックアウト」のアプローチに好ましいが、それらが容易に使用できて、発生または分化の選択された段階においてDNA MeTase活性を阻害するために使用できるからである。即ち、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、発生の様々な段階におけるDNAメチル化を試験するためのプローブとして機能できる。最後に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、良性および悪性腫瘍および遺伝子発現の抑圧を含む他のヒト疾患に対する治療アプローチにおいて有用である。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗腫瘍利用性は本明細書のどこかに詳細に記載される。さらに、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、消失した遺伝子機能を提供して即ち疾患の兆候を改善するために沈黙した遺伝子を活性化するために使用してよい。例えば、疾患ベータ地中海貧血および鎌状細胞貧血は、成体ベータグロビン遺伝子の異常発現により引き起こされる。これらの疾患を罹患した殆どの患者はベータグロビンに関して正常なコピー数の胎児遺伝子を有する。しかしながら、胎児遺伝子は高メチル化されて沈黙である。胎児グロビン遺伝子の活性化は必要とされるグロビン機能を提供することができ、即ち、疾患の兆候を改善する。治療用用途に関しては、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意に、よく知られたあらゆる薬学上受容可能な担体または希釈剤と共に製剤化してよい。この製剤化はさらに、一つまたは複数のDNA MeTase阻害剤および／または一つまたは複数の追加の抗DNA MeTaseアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでよいか、またはあらゆるその他の薬学上活性な薬剤を含んでよい。第４の側面において、本発明は、腫瘍細胞の成長を含む細胞成長におけるDNA MeTaseの役割を調査する方法を提供する。本発明のこの側面による方法において、興味のある細胞種を本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドに接触させて、それにより細胞中においてDNA MeTaseの発現阻害をもたらす。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞周期の異なる点において投与できるか、あるいは興味のある細胞種の成長におけるDNA MeTaseの役割を決定するための細胞成長の促進剤または阻害剤と共に投与できる。第５の側面において、本発明は、ヒトを含む動物に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することからなる、腫瘍の成長阻害方法を提供する。本発明のこの側面による方法において、治療上有効な量の本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、その体内に少なくとも一つの腫瘍細胞を有する、ヒトを含む動物に治療上有効な期間投与する。本明細書において用いられる用語「腫瘍成長」は、腫瘍細胞の成長を意味するように使用される。「腫瘍細胞」は、新形成性（neoplastic）細胞である。腫瘍細胞は良性、即ち転移を形成しないで隣接の正常細胞に侵入したり破壊しない細胞であるか、または悪性、即ち、周囲の組織に侵入して転移を生じることができ、意図された除去後に再発するかもしれず、そして宿主の死をもたらすかもしれない。用語「治療上有効な量」および「治療有効な期間」は、腫瘍細胞の成長を低下させるために有効な投薬量および期間の公知の処置を意味するように用いる。好ましくは、そのような投与は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内または直腸内であるべきである。全身投与の場合、治療用組成物は約０．０１μＭから約１０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血液レベルを維持するのに十分な投薬量にて投与することが好ましい。局所投与に関しては、これよりはるかに低い濃度が効果的であるかもしれず、そしてはるかに高い濃度が寛容されるかもしれない。好ましくは、DNA MeTase阻害剤の全投薬量は１日あたりで患者あたり約０.１ｍｇオリゴヌクレオチドから１日あたりでｋｇ体重あたり約２００ｍｇオリゴヌクレオチドの範囲となる。別の態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド一つまたは複数を動物に投与し、本発明のこの側面は、ヒトを含む動物に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１つ以上を連続または同時に治療上有効な量においておよび治療上有効な期間投与することを含む。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに例示することを意図し、事実、限定ではない。実施例１ヒトおよびマウス細胞から調製された核抽出物中で測定されたＤＮＡＭｅＴａｓｅ発現の阻害標準細胞培養条件下で成長させた１Ｘ１０⁸の対数中期ヒトＨ４４６細胞またはマウスＹ１細胞から、核抽出物を調製する。DNA MeTaseのRNA転写物の非コード領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはランダマー（陰性対照）オリゴヌクレオチド１ｍｇ／ｍｌを付加した培地で細胞を処理した。細胞を回収してリン酸緩衝塩溶液（PBS）で２回洗浄して、次に細胞沈殿物を０.５ｍｌのバッファーＡ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０，１.５ｍＭＭｇＣｌ₂，５ｍＭＫＣｌ，０.５ｍＭＤＴＴ，０.５ｍＭＰＭＳＦおよび０.５％ノニデットＰ４０）に懸濁することにより、他の細胞成分から核を分離した。核はエッペンドルフマイクロ遠心分離管中で２，０００ＲＰＭにて１５分間４℃において遠心分離して沈殿させる。核はバッファーＡ中で１回洗浄して再沈殿し、次に０.５ｍｌのバッファーＢ（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０，０.２５％グリセロール、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂，０.５ｍＭＰＭＳＦ，０.２ｍＭＥＤＴＡ，０.５ｍＭＤＴＴおよび０.４ｍＭＮａＣｌ）に懸濁する。懸濁した核は氷上で１５分間インキュベートし、次に１５，０００ＲＰＭで回転させて核残渣を沈殿させる。上清中の核抽出物を沈殿から分離して、DNA MeTase活性のアッセイに用いる。各アッセイに関して、３通り実施し、３μｇの核抽出物を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)，１０ｍＭＥＤＴＡ，２５％グリセロール、０.２ｍＭＰＭＳＦ，および２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むバッファー中で、メチルドナーとして０.５μ ＣｉのＳ−［メチル］−³Ｈアデノシル−Ｌ−メチオニン（７８.９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む、合成の３３−塩基対のヘミメチル化DNA分子基質０.１μｇを含む反応混合物中で使用する。該反応混合物を１時間３７℃においてインキュベートすることにより、DNA MeTaseの初期速度を測定する。反応は１０％のＴＣＡを加えてDNAを沈殿させることにより停止し、次にサンプルを４℃において１時間インキュベートし、そしてＴＣＡ沈殿物をＧＦＣフィルター（フィッシャー、ハンプトン、ＮＨ）を通して洗浄する。対照は、核抽出物不在下で反応混合物とインキュベートしたDNA、およびDNA不在下で反応物とインキュベートした核抽出物である。フィルターを５ｍｌシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアル中に入れて、DNAに取り込まれたトリチウム化メチル基を標準法によりβ− シンチレーションカウンターで計数する。DNA MeTase発現の阻害を測定するため、オリゴヌクレオチド処理した細胞からの核抽出物の比活性を未処理細胞からの抽出物の比活性と比較する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞の処理は核抽出物中のDNA MeTase活性の低下をもたらす。実施例２細胞に蓄積したアンチセンスオリゴヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準法を用いて³²Ｐで標識する。ウエルあたり３００，０００のＹ１の細胞を６ウエル組織培養プレート中においた。標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、最終濃度１μＭで加える。当業界においてよく知られた方法によるトリプシン処理により、異なる時間点において細胞を回収して、PBSでよく洗浄することにより、取り込まれなかった化合物を除去する。細胞沈殿物は、２０μｌのバッファーＲＩＰＡ（０.５％デオキシコール酸、０.１％ＳＤＳ，１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ中）に懸濁する。ホモジェネートを４℃において３０分間インキュベートして、次にマイクロ遠心分離管中で最大速度にて３０分間回転し、その後、上清を新しい遠心分離管に移す。１μｌのフェノールと１μｌのクロロホルムを加えることにより、２μｌの上清をフェノール−クロロホルムで抽出し、上清を混合して有機層と水層をマイクロ遠心分離管中の１５，０００ＲＰＭにおける１０分間の遠心分離により分離する。水層を抽出して２０％ポリアクリルアミド−尿素ゲル上に負荷する。可視化はオートラジオグラフによる。結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが時間依存様式においてふさぐ（take up）ことを証明する。実施例３アンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞における細胞性ＤＮＡメチル化の分析核抽出物をランダマーオリゴヌクレオチド処理細胞から、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞から（１μＭオリゴヌクレオチド）実施例１に記載されたとおりに調製する。DNA沈殿物を０．５ｍｌのDNA抽出バッファー（０.１５ＭＮａＣｌ，１％ＳＤＳ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０，５ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、１００μｇのプロテイナーゼＫを加えて、上清を５０℃において１６時間インキュベートする。DNAを、０.２５ｍｌのフェノールおよび０ .２５ｍｌのクロロホルムを加えることによりフェノール−クロロホルム中に抽出する。上清を混合して、有機層と水層を１０分間の１５，０００ＲＰＭにおけるマイクロ遠心分離管中の遠心分離により分離する。１ｍｌの無水エタノールを水層に加えて、DNAを遠心分離管にて１５分間１５，０００ＲＰＭにて遠心分離することにより沈殿させる。DNAを１００μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０，１ｍＭＥＤＴＡに懸濁する。２μｇのDNAを３７℃において１５分間０.１ユニットのＤＮａｓｅ，２．５μ ｌの³²Ｐ−α−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アマシャム、クリーブランド、ＯＨ）とインキュベートし、次に２ユニットのコンバーグDNAポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ）を加えて、反応混合物をさらに２５分間３０℃においてインキュベートする。５０μｌのＨ₂Ｏを次に加えて、マイクロスピンＳ−３００ＨＲカラム（ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）を通して回転させることにより、取り込まれなかった放射活性を除去する。標識されたDNA（２０μｌ）を７０μｇのマイクロコッカルヌクレアーゼ（ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）により、製造者の薦めるバッファー中で１０時間３７℃において消化する。等量の放射活性をＴＬＣホスホセルロースプレート（メルク、ダームシュタット、ドイツ）に負荷して、３'モノヌクレオチドを一方向において６６：３３：１イソブチル酸／Ｈ₂Ｏ／ＮＨ₄ＯＨでクロマトグラフィーにより分離する。クロマトグラムをＸＡＲフィルム（イーストマンコダック、ロチェスターＮＹ）に露出して、オートラジオグラムをレーザー濃度計（スキャナリティックス、ＣＳＰＩ，ビレリカ、ＭＡ）によりスキャンする。シトシンおよび５− メチルシトシンに相当するスポットを定量して、非メチル化ＣＧジヌクレオチドのパーセンテージを測定する。結果は、ランダマー処理細胞に比してアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞中の非メチル化ＣＧジヌクレオチドのパーセンテージの全体の低下を示すと予測される。特定の遺伝子の脱メチル化を査定するために、J．Biol．Chem．270:12690-126 96(1995)に一般的に記載されたとおりの手法を実施する。簡単に言えば、ゲノミックDNA（１０μｇ）を抽出して２５ユニットのHindIIIによる消化に供して、次に２５ユニットのMspI（ＣＧメチル化非感受性）あるいは２５ユニットのHpaII （ＣＧメチル化感受性）の何れかにより８時間３７℃において消化する。消化されたDNAを１.５％アガロースゲル上で分離して、特定のプローブを用いたサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションに供する。結果は、試験細胞中で通常は大量に（heavily）メチル化される遺伝子がメチル化されることになり、一方試験細胞中で通常は大量にメチル化されない遺伝子のメチレーションレベルが顕著に影響されないことを示すと予測される。実施例４アンチセンスオリゴヌクレオチドによる腫瘍成長の阻害Ｙ１またはＨ４４６細胞を６ウエルプレート上に８００００細胞／ウエルの密度でプレートする。DNA MeTaseの非コード領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート（約０.５から２０μＭ）を上記細胞に加える。次に、細胞を回収して、３，０００の生存細胞をソフトアガーにプレートするが、 Freedman and Shin，Cell 3:355-359(1974)に記載されるとおりである。プレーティングの２週間後に、ソフトアガー上に形成されたコロニーの数を目視により計数する。活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、コロニーの数の投薬量依存性低下が観察される。あるいは、６から８週齢のＬＡＦ−１マウス（ジャクソン研究所、バーハーバー、ＭＥ）を周辺エリアに２Ｘ１０⁶Ｙ１細胞にて皮下注射する。３日後、マウスにDNA MeTase非コード領域に相補な、１−５ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを注射する。この投薬は２日おきに繰り返す。１カ月後、マウスを犠牲にして腫瘍の大きさを標準プロトコルにより測定する。（例えば、Ramchandani et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 94:684-689(1997) を参照されたい。）活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ランダム化または逆アンチセンス配列で処理した対照に比して腫瘍の大きさの顕著な低下が観察される。実施例５ＤＮＡＭｅＴａｓｅ酵素の親和性結合 DNA MeTase酵素の親和性結合を証明するため、配列５'-CTGAAmCGGATmCGTTTCGA TCUGTTCAG-３'を有する結合基質ヘアピンオリゴヌクレオチドを４μＭ濃度にて供給した。該ヘアピンオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼおよびガンマ³²Ｐ−γ−ＡＴＰ（３００ｍＣｉ／ｎｍｏｌ，５０μＣｉ）(ニューイングランドバイオラブズ、ビバリー、ＭＡ)を用いて製造者に薦められたとおりに標識した。Ｇ−５０セファデックススピンカラム（ファルマシア、アップサラ、スエーデン）を通すことにより、標識されたオリゴヌクレオチドを取り込まれなかった放射活性から分離した。標識したヘアピンオリゴヌクレオチド（５００ｎＭ）を実施例１に記載されたとおりに調製した核抽出物５μｇとインキュベートした。DNA MeTase活性アッセイのために使用したのと同じバッファー中でインキュベーションを３７℃において３０分間行った。複合体形成が共因子SAMに依存するか否かを決定するため、SAMの存在下および不在下の両方で反応を実施した。次に、負荷染料（０.３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.８，０.２％ＳＤＳ，１０％グリセロール、２８ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび２４μｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を加えて、サンプルを標準手法に従い、４％スタッキングゲルを有する５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後に、１９０ｋＤａに移動する複合体の可視化のために、ゲルをオートラジオグラフに露出した。別に、DNA MeTase−特異的抗血清を用いたウエスタンブロッティングのため、ゲルをＰＶＤＦ膜（アマシャムライフサイエンス、バッキンガムシア、英国）に、電気転写装置（バイオラッド、ハーキュレス、ＣＡ）を用いて２５０ミリアンペアで２．５時間、電気転写バッファー（３.０３ｇ／ｌＴｒｉｓ塩基、１４.４ｇ／１グリシン、１ｇ／ｌＳＤＳ，ｐＨ８.３）中で電気転写した。５ｍＭＴｒｉｓ塩基、２００ｍＭＮａＣｌ，０.５％ツイーン−２０および５％ドライミルクを含むバッファー中で、膜を１時間ブロックした。ウサギ抗血清を、標準手法（例えば、Molecular Cloning，2d Edit ion，Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい）に従い、ヒトおよびマウスのDNA MeTaseの触媒ドメインに見いだされるペプチド配列（アミノ酸ＧＱＲＬＰＱＫＧＤＶＥＭＬＫＧＧＰＰＣ）に対して生じさせた。該抗血清を１：２００希釈において膜に加えて、１時間インキュベートした。膜をブロッキングバッファーで洗浄して、次にヒツジ抗−ウサギ二次抗体（アマシャム、クリーブランド、オハイオ）の１：５０００希釈と、さらに１時間反応させた。次に、膜を１０分間ブロッキングバッファーで３回洗浄して、抗−DNA MeTase活性と反応するバンドを、製造者のプロトコルに従いＥＣＬ検出キットを用いて視覚化した(アマシャム、クローブランド、オハイオ)。結果は、１９０ｋＤａ複合体がオートラジオグラフおよびウエスタンブロッティングの両者により検出されることを証明したから(図２を参照されたい)、１９０ｋＤａ複合体がヘアピンオリゴヌクレオチドとDNA MeTase酵素の間に形成されることが強く示唆される。ヒトおよびマウスのDNA MeTaseの触媒ドメインに見いだされた別のペプチド（アミノ酸ＧＧＰＰＣＱＧＦＳＧＭＮＲＦＮＳＲＴＹ）に対して生じさせた抗血清を用いた後の実験（Ramchandani et al．前記を参照されたい）が、同じ結果を確証した。これらの結果は、さらに、そのような複合体の形成が共因子ＳＡＭとは独立であることを証明したが、何故ならば何も存在しなかったからである。さらに、データは、複合体形成が３０分以内に達成されることを示したことから、即ち、そのような複合体形成が別の細胞サンプル中のDN A MeTaseレベルに関するアッセイおよび親和性結合によりメチルトランスフェラーゼを精製する方法を提供する。実施例６処理された細胞の分析酵素活性プロファイルを実施して、本発明の合成オリゴヌクレオチドが、DNA メチルトランスフェラーゼ発現を阻害する能力を定量した。Ａ５４９細胞(ＡＴＣＣ)、およびＴ２４細胞（ＡＴＣＣ）を標準細胞培養技術に従い成長させた。次に、細胞を２４時間、DNA MeTaseのRNA転写物の特定の標的領域に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスクランブルされた（陰性対照）オリゴヌクレオチド２５０ｎＭと１０μｇ／ｍｌリポフェクチンを含む生育培地により処理した。次に、細胞を回収して、ＰＢＳで２回洗浄して、エッペンドルフマイクロ遠心分離管中で２，０００ＲＰＭにて１５分間４℃において遠心分離することにより沈殿させた。核をバッファーＡで１回洗浄して、再度沈殿させて、次に０．５ｍｌのバッファーＢ（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０，０.２５％グリセロール、１ .５ｍＭＭｇＣｌ₂，０.５ｍＭＰＭＳＦ，０.２ｍＭＥＤＴＡ，０.５ｍＭＤＴＴおよび０.４ｍＭＮａＣｌ）に懸濁した。懸濁した核を氷上で１５分間インキュベートして、次に１５，０００ＲＰＭにて回転することにより核残渣を沈殿させた。上清中の核抽出物を沈殿から分離して、DNA MeTase活性のアッセイに用いた。各アッセイに関しては、３通りに実施して、３μｇの核抽出物を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭＥＤＴＡ，２５％グリセロール、０.２ｍＭＰＭＳＦ，および２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むバッファー中で、メチルドナーとして０.５μＣｉのＳ−［メチル−³Ｈ］アデノシル −Ｌ−メチオニン（７８.９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む、合成の３３−塩基対のヘミメチル化DNA分子基質０.１μｇを含む反応混合物中で使用した。該反応混合物を１時間３７℃においてインキュベートすることにより、DNA MeTaseの初期速度を測定した。反応は１０％のＴＣＡを加えてDNAを沈殿させることにより停止し、次にサンプルを４℃において１時間インキュベートし、そしてＴＣＡ沈殿物をＧＦＣフィルター（フィッシャー）を通して洗浄した。対照は、核抽出物不在下で反応混合物とインキュベートしたDNA、およびDNA不在下で反応物とインキュベートした核抽出物であった。フィルターを５ｍｌシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアル中に入れて、DNAに取り込まれたトリチウム化メチル基を標準法によりβ−シンチレーションカウンターで計数した。様々な合成オリゴヌクレオチドで処理した細胞からの核抽出物の比活性を標準化、即ち比較するために、 DNA MeTaseおよびＧ３ＰＤＨの両活性を測定した。図３は、示されたとおりの２６の異なる合成オリゴヌクレオチドで処理したＡ５４９細胞において観察された、DNA MeTase酵素活性を示す。同様に、Ｔ２４細胞を用いた場合の結果を観察した。スクランブルして合成したオリゴヌクレオチドで処理した細胞において観察された活性のパーセンテージとして値を表示したことに注意されたい。結果は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞の処理は核抽出物中のDNA MeTase活性の低下をもたらすことを示す。実施例７インビボにおける腫瘍成長の阻害１０から１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（タコニック研究所、グレイトバーリントン、ＮＹ）の周辺エリアにおいて２Ｘ１０⁶の予め馴化したＡ５４９ヒト肺カルシノーマ細胞を皮下に注射した。これらの細胞の馴化は、ヌードマウスの同じ株における最少の３連続腫瘍移植により実施した。次に、約２５ｍｇの腫瘍断片を切り出して、マウスにおいて、フォレーネ（Forene）麻酔（アボット、ジェネバ、スイス）下で左の周辺エリアに皮下埋め込みした。腫瘍が平均１００ｍｍ³に達したとき、尾の血管への毎日のボーラス注入により本発明のオリゴヌクレオチドを２ｍｇ／Ｋｇ含むオリゴヌクレオチド塩溶液調製物でマウスを静脈処理した。オリゴヌクレオチドの最適な最終濃度は、標準プロトコルにより投薬応答実験により確立する。腫瘍の体積は注入後隔日、標準法により計算した。(例えば、Meyer et al.，Int．J．Cancer 43:851-856(1989))。本発明のオリゴヌクレオチド処理は、ランダム化または逆アンチセンス配列で処理した対照に比して、腫瘍重量および体積における顕著な低下を引き起こした(データは示さず)。さらに、DNA MeTase酵素の活性を測定したところ、ランダマー処理対照に比して顕著に低下したことがわかった。これらの結果は、本発明によるオリゴヌクレオチドがDNA MeTase酵素活性および腫瘍の成長を阻害できることを示す。実施例８ＤＮＡＭｅＴａｓｅ遺伝子の編成と構造ヒトDNA MeTase遺伝子の染色体編成に関する情報は、（ａ）オンコジーンの進行および発生のプロセスにおけるDNA MeTase遺伝子の発現の制御の基礎となる機構の包括的分析（例えば、有力な別のスプライシング産物である、イントロンのゲノミック領域におけるエンハンサーとプロモーターのような制御因子の分析）のため、および（ｂ）本発明によるアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドをデザインするために有用である。完全なヒトDNA MeTase遺伝子にわたるオーバーラッピングDNA断片を得るために、公知のヒトDNA MeTaseのcDNAを含むいくつかのcDNA断片をRT-PCRにより生成し（mRNA源ヒーラおよびＡ５４９細胞）(図４Ａ)、そしてプローブとして用いることにより、ラムダＦＩＸII（ストラタジーン）中において肺および胎盤からのヒトゲノミックDNAライブラリーをスクリーンした。cDNAプローブは公知ヒトcDNA配列の全体にわたった(Yen et al.，199 2およびYoder et al.，1996)。ゲノミック挿入物をNotI消化によりファージから単離して、NotI直鎖状化ｐブルースクリプトＳＫ＋ヘサブクローン化した。サブクローンを制限酵素により消化し(Ｘ＝XbaI，Ｂ＝BamHI，Ｈ＝HindIII)、サザンブロットして、エクソン特異的³²Ｐ標識オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは cDNAプローブにハイブリダイズさせることにより、ヒトDNA MeTase遺伝子のスケール制限マップを作成した。サブクローンのエクソンを配列決定することにより、エクソン−イントロンの境界を決定した。イントロンの大きさは、DNAの配列決定(１５０ｂｐ未満のイントロンに関して)、５'および３'周辺エクソン配列をプライマー源として用いたPCR（２Ｋｂ未満のイントロンに関して）およびＡに示した酵素を用いた制限酵素サザンブロット分析(データ示さず)、および制限酵素を確認するために各特定のエクソンのためのオリゴヌクレオチドを用いる、何れかにより決定した。より大きなイントロン（＞２Ｋｂ）に関しては、ファージ挿入物の制限酵素分析およびエクソン特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いた異なる制限断片に対するエクソンのマッピングにより、エクソン間の距離を評価した(図４Ａの物理マップを参照されたい)。ファージDNAの制限酵素分析により得た物理マップ（図４Ａ）を、ヒトゲノミックDNAの制限酵素−サザンブロット分析により確認した。ゲノミックDNAを上記のとおりに（Sambrook et al．198 9）ヒト肺カルシノーマＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１８５）およびヒト膀胱カルシノーマ細胞：Ｔ２４（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−４）から調製し、制限エンドヌクレアーゼXbaI (Ｘ)，BamHI(Ｂ)，またはHindIII(Ｈ)により消化し、１.５％アガロースゲル上で電気泳動して、サザンブロットした。ヒトDNA MeTaseのmRNAの異なるセグメントをコードする断片を以下のプローブへのハイブリダイゼーションにより可視化した：１．第１エクソンを含むプローブ．２．エクソン３−５を含むプローブ( 公知cDNAのヌクレオチド415−740の間から始まる)．３．エクソン７−20を含むプローブ．４．エクソン30−40を含むプローブ。cDNAプローブはエクソン−イントロン構造のマップの下に示され、点線は各プローブにまたがるエクソンの境界を描写する。各々の制限酵素により視覚化された断片は異なる陰矢印により示される。視覚化され断片の大きさは、矢印の隣に示す。各々のプローブにより視覚化された断片の大きさは、ゲノミックファージの制限酵素分析により予測された大きさに相当する。異なるファージの物理マップにより予測された断片（図４Ａ）を、ゲノミックDNAのサザンブロット中のcDNAプローブを用いて視覚化した(図４Ｃ、矢印は、各DNAプローブにより視覚化された制限酵素断片、およびそれらの大きさを示す)。PCR分析により決定されたエクソンの位置はサザンブロット分析により確認した。以下のプライマーを用いることによりPCRにより関連イントロン境界および大きさをマップした：エクソン４から５：センス：5'-aaacgggaa ccaagcaagaa；アンチセンス：5'-tgagatgtgatggtggttt；エクソン５から６：センス：5'-ctgaaccttcacctagcccc；アンチセンス：gatggactcatccgatttgg；エクソン６から７：センス：5'-ccctgccaaacggaaacctc；アンチセンス：5'-gttctctg gatgtaactcta；エクソン７から８：センス：agacgtagagttacatccag；アンチセンス：5'-gctctttcaggttcttctgc；エクソン９から10：センス：5'-aagaaaagagactc cgaagt；アンチセンス：tttctcgtctccatcttcgt；エクソン１０から１１：センス：5'-gtcagcccttaggagctgtt；アンチセンス：5'-ggaaacagctatgaccatg(Ｍ13リバースプライマー）；エクソン１１から１２：センス：5'-gatgagaagaagcacagaag ；アンチセンス：5'-tcatcctcgtctttttcatcagaa；エクソン１２から１３：センス：5'-ttctgatgaaaaagacgaggatga；アンチセンス：5'-cattaccatctgctttggat；エクソン１３から１４：センス：5'-aggagaagagacgcaaaacg；アンチセンス：5'- agttca tgactgttttggcg；エクソン１７から１８：センス：5'-gtactgtaagcacggtcacc；アンチセンス：5'-aggtgctgaagccgatgagg；エクソン１８から１９：センス：5'- tggatcactggctttgatgg；アンチセンス：5'-ctcgatcttgttgatcaggt；エクソン２１から２２：センス：5'-aggcgagcccaggcgaggcg；アンチセンス：5'-cgctcttggc aagcctgcttg；エクソン２２から２３：センス：5'-gtgtcagcagcctgagtgtg；アンチセンス：5'-ctccgacccaagagatgcga；エクソン２３から２４：センス：gtcccaa tatggccatgaag；アンチセンス：5'-gctagatacagcggttttgagg；エクソン２４から２５：センス：5'-cgtcaagactgatgggaagaagagt；アンチセンス：5'-ctccatggccc agttttcgg；エクソン２５から２６：センス：5'-gtcacggcgctgtgggagga；アンチセンス：5'-ttgaacttgttgtcctctgt；エクソン２６から２７：センス：5'-gaccta cttctaccagctgt；アンチセンス：5-ttgaacgtgaaggcctcagg；エクソン２７から２８：センス：5'-ctctactactcagccaccaa；アンチセンス：5'-tagaacttgttgacccgg a；エクソン２８から２９：センス：5'-tgagactgacatcaaaatcc；アンチセンス： 5'-cgaggaagtagaagcggtg；エクソン２９から３０：センス：5'-cgagtgcgtccaggt gtact；アンチセンス：5'-cttccctttgtttccagggc；エクソン３１から３２：センス：5'-gaagggcaagcccaagtccc；アンチセンス：5'-agccatgaccagcttcagca；エクソン３２から３３：センス：5'-tgctgaagctggtcatggct；アンチセンス：5'-cctg cagcacgccgaaggtg；エクソン３３から３４：センス：5'-tccttcaagcgctccatggt ；アンチセンス：5'-tagtctgggccacgccgtac；エクソン３４から３５：センス：5 '-ccggtcagtacggcgtggcc；アンチセンス：5'-agatctccagtgccgaggct；エクソン３５から３６：センス：5'-tgagctcgggtcctttccgg；アンチセンス：5'-tccacgca ggagcagacccc；エクソン３６から３７：センス：5'-tcagacggcaccatggccag；アンチセンス：5'-cttgcccatgggctcggggt；エクソン３７から３８：センス：5'-ct ctatggaaggctcgagtg；アンチセンス：5'-cggtgcttgtccaggatgtt；エクソン３８から３９：センス：5'-ctgacacctaccggctcttc；アンチセンス：5'-ggcactctctcg ggctttgg；エクソン３９から４０：センス：5'-ggagatcaagctttgtatgt；アンチセンス：5'-gtccttagcagcttcctcct。以下のイントロンは：エクソン２から３；３から４；１４から１５：１５から１６；１９から２０；２０から２１；３０から３１を配列決定することにより、決定した。以下のイントロンは、エクソン：１から２(以下のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる：エクソン１：5'-cgcctgcggacatcg tcgggcagc；Ｔ３：5'-aattaaccctcactaaaggg；Ｔ７：5'-gtaatacgactcactataggg c)；８から９(以下のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる：エクソン：８：5'-gctctttcaggttcttctgc；エクソン９：5'-aagaaaagagactccgaagt)；１６から１７（以下のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる：エクソン１６： 5'-tgagccacagatgctgacaaa；エクソン１７：5'-gtactgtaagcacggtcacc）を制限マッピングすることにより決定した。クローニング、配列決定およびマッピング実験の結果は、ヒトDNA MeTaseに関する５.２キロベースのcDNAが、４０のエクソンと３９のイントロンとして、完全に保存されたスプライスアクセプターおよびドナー部位（図５）を伴い、６０キロベースの染色体１９ｐ１３.２−１３.３上に（図４Ｂ）編成されることを証明する。この遺伝子は、したがって、Ｒｂ（７０ｋｂ）およびアポリポプロテインＢ（７９.５ｋｂ）に類似の「より大きな遺伝子」として分類されうる。 DNA MeTaseの機能性ドメインは大きなイントロンにより隣のドメインから分離された、多くの小さなエクソンとイントロンとして共にグループ分けされるらしい(図４Ｂ)。第１に、エクソン６−８は、核局在シグナルをコードし、そしてエクソン２−８を含み大きなイントロン１および８（それぞれ１２および１１キロベース）を周辺に有する単離クラスター内に存在する。第２に、複製座（FTR）に酵素を標的化するために必須と記載された領域がエクソン１３−２０によりコードされる。これらのエクソンは２つの別の染色体領域上に編成されて、エクソン１３−１６は第１領域を構成し、エクソン１７−２０は第２領域を構成し、そして大きなイントロン１６（６０００塩基）により分離される。第３に、亜鉛結合に必須の領域がエクソン２２によりコードされ、そしてそのゲノム編成において、エクソン２３を伴い、大きな周囲のイントロン２１および２３により分離される。第４に、該酵素の触媒ドメインがエクソン３０−３９によりコードされる。公知のCpGメチルトランスフェラーゼの全ての触媒ドメインは、１、４、６、８、９および１０が触媒活性に必須の１０の保存されたモチーフを共有する。保存されたモチーフ１は、エクソン３１に完全に含まれて、AdoMet結合ペプチドをコードする。保存されたモチーフ４はエクソン３２に完全に含まれて、メチル転移を触媒するPro-Cysモチーフを含む。第１に、２つの仮定の翻訳開始コドンが存在し(図４Ｂ)、それらが存在するエクソンの編成は、それらが明らかに異なる構造上のモチーフを形成することを暗示する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソン−クリックハイブリダイゼーションにより標的エクソン−イントロン境界にハイブリダイズして、スプライス連結を効果的にマスクする。このアプローチがDNA MeTaseのための成功裏に開発されうることの自信が存在するが、なぜならば該遺伝子はアンチセンスオリゴヌクレオチド開発のための７８の唯一のイントロン−エクソン連結部を提供するからである(図５)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 9/10 5/10 Ａ０１Ｈ 5/00 9/10 Ａ０１Ｋ 67/027 // Ａ０１Ｈ 5/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＡ０１Ｋ 67/027 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラムチャンダニ，シャムカナダ国オンタリオエル２ジェイ・２エイ８，ナイアガラ・フォールズ，ヒルクレスト・クレッセント 5843 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．複製可能なベクター中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に記載されたヌクレオチド配列から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子。２．複製可能なベクターが発現ベクターである、請求項１記載の組換えDNA分子。３．請求項２記載の組換えDNA分子を含む宿主細胞。４．請求項３記載の宿主細胞を適切な培養媒体中において培養するが、その際、宿主細胞がDNAメチルトランスフェラーゼ酵素を生成し、そして宿主細胞と培養媒体からDNAメチルトランスフェラーゼ酵素を分離することからなる、DNAメチルトランスフェラーゼ酵素を製造する方法。５．複製可能なベクター中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に記載されたヌクレオチド配列から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子。６．複製可能なベクターが発現ベクターである、請求項５記載の組換えDNA分子。７．染色体記載の組換えDNA分子を含む宿主細胞。８．約８から約100ヌクレオチドを有し、そしてDNAメチルトランスフェラーゼをコードするRNAの特定の標的領域に相補な、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害するオリゴヌクレオチド。９．約８から約100ヌクレオチドを有し、そして配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に記載されたヌクレオチド配列の特定の標的領域に相補な、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害するオリゴヌクレオチド。１０．約２１から約３５ヌクレオチドを有し、DNAメチルトランスフェラーゼ発現を阻害し、そして配列番号３９。配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０に記載されたヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。１１．約13から約19ヌクレオチドを有し、DNAメチルトランスフェラーゼ発現を阻害し、そして配列番号３９。配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０に記載されたヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。１２．ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、ブリッジしたホスホロアミダイト、ブリッジしたメチレンホスホネート、ブリッジしたホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオチド内部結合からなる群から選択される、少なくとも一つのヌクレオチド内部結合を有する、請求項８記載のオリゴヌクレオチド。１３．ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート領域からなるキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。１４．リボヌクレオチドまたは２'−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。１５．その体内に少なくとも一つの腫瘍細胞を有する哺乳類に、治療上有効な期間請求項８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療上有効な量投与することからなる、ヒトを含む哺乳類の腫瘍成長を阻害する方法。１６．治療上有効な期間請求項９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療上有効な量哺乳類に投与することからなる、請求項１５記載の方法。