PT1456404E

PT1456404E - Método para determinação da actividade biológica de defibrotida

Info

Publication number: PT1456404E
Application number: PT02795074T
Authority: PT
Inventors: Laura Ferro; Roberto Porta; Franco Cattaneo
Original assignee: Gentium Spa
Priority date: 2001-12-17
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2010-12-03
Also published as: PL373243A1; DE60237639D1; DK1456404T3; IS7312A; HRP20040548A2; EP1325962A1; ZA200404656B; UA80104C2; HK1077332A1; NO20042972L; AU2002360945B2; CA2468877A1; EP1456404A2; IL162511A0; AR037870A1; ES2349509T3; JP2005512547A; CN1612938A; KR100912424B1; RS63104A

Description

ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método para determinação da actividade biológica de defibrotida" 0 presente invento refere-se a um método para determinação da actividade biológica de defibrotida e, mais especificamente, refere-se a um método enzimático indirecto para determinação da actividade biológica de defibrotida.

CAMPO TÉCNICO DO INVENTO A defibrotida (Merck Index, 1996, n.° 2915) é uma substância de origem natural que é obtida por extracção a partir de órgãos animais e que é constituída pelo sal sódico de polidesoxirribonucleótidos possuindo um baixo peso molecular. A defibrotida foi objecto de numerosas investigações farmacológicas que sugeriram que fosse aplicada em terapia como agente antitrombótico (US 3829567).

Adicionalmente, a defibrotida foi também utilizada com sucesso no tratamento de arteriopatias periféricas, em insuficiência renal aguda (US 4694134) ou em isquemia do miocárdio aguda (US 4693995) .

Tal como outras substâncias biológicas que são obtidas por extracção, a defibrotida está também sujeita a uma variabilidade limitada de composição que é típica dos biopolímeros naturais. Um exemplo clássico desta situação é proporcionado pela heparina cuja variabilidade de lote para lote em termos de comprimento da cadeia, peso molecular, composição, grau de sulfatação, etc. é bem conhecida. A consequência disto é que as mesmas quantidades por peso de defibrotida podem de facto não ser equivalentes do ponto de vista de uma actividade biológica específica. 0 processo de extracção, isolamento e purificação não pode per se assegurar reprodutibilidade absoluta do produto, precisamente devido à sua natureza biopolimérica intrínseca. No entanto, se bem controlado, é possível reduzir a sua variabilidade: para esse fim, foram feitos estudos de 2 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ processos industriais padronizados para isolamento de defibrotida por extracção a partir de órgãos, tais como, por exemplo, o descrito na patente dos Estados Unidos US 4985552. 0 produto obtido de acordo com o processo acima mencionado caracteriza-se pela determinação de alguns parâmetros fisico-quimicos específicos, tais como, por exemplo, mobilidade electroforética, o coeficiente de extinção, potência óptica de rotação e hipercromicidade reversível. No entanto, esses parâmetros dependem basicamente da estrutura da defibrotida e não são capazes de proporcionar informação sobre a actividade biológica desta.

Tanto quanto sabemos, os únicos métodos que foram relatados como sendo utilizados até agora para avaliar a actividade biológica da defibrotida são o teste de placa de fibrina e o registo tromboelastográfico do tempo de lise da euglobulina (Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., "Indagini preliminari sull'attività fibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presetite in diversi organi animali", Simposio Intemazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmacêutica in Italia, Roma, 2-4 de Outubro de 1975 - II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24: 552-561). No entanto, os métodos acima mencionados caracterizam-se por considerável complexidade experimental, por insatisfatória reprodutibilidade e precisão e, no caso específico do registo tromboelastográfico, por uma linearidade de resposta limitada a intervalos de concentração muito restritos.

Portanto, até agora, não eram conhecidos métodos verdadeiramente válidos, precisos e reprodutíveis para determinação da actividade biológica de defibrotida. 0 documento US-A-4234682 descreve um método de determinação de heparina utilizando um ensaio óptico baseado na clivagem de um substrato cromogénico por trombina.

Desenvolvemos um método simples e de confiança para determinação da actividade biológica da defibrotida, que permite que as amostras obtidas por extracção sejam controladas e permite portanto que preparações medicinais baseadas em defibrotida sejam padronizadas. 3 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ Ο método ao qual ο presente invento se refere permite que a actividade biológica especifica da defibrotida seja determinada em comparação com um padrão de referência com um elevado grau de precisão, velocidade e reprodutibilidade.

DESCRIÇÃO DO INVENTO 0 presente invento refere-se portanto a um método para determinação da actividade biológica especifica de amostras de defibrotida, cujo método compreende os passos de: a) pôr em contacto defibrotida, plasmina e um substrato especifico para a plasmina que, através de reacção com a plasmina, proporciona um produto mensurável e b) medição da quantidade de produto formado em tempos sucessivos, em que o substrato especifico para a plasmina é um composto de fórmula

Ai-A2-A3-X em que Ai e A2 são aminoácidos não polares, A3 é lisina ou arginina e X é o produto mensurável, e em que a concentração do substrato para a plasmina é de 0,3 a 4, de preferência de 2,5 a 3,5 mM, de maior preferência de 3 mM, caracterizado por compreender os passos de: a') determinação da velocidade de libertação do produto mensurável X durante o curso da reacção enzimática, para cada amostra de defibrotida, tanto do tipo padrão como de teste b') correlação, matematicamente e/ou graficamente, das velocidades de libertação acima mencionadas com as correspondentes concentrações de defibrotida c') obtenção das actividades biológicas das amostras de teste de defibrotida. O método do presente invento é um método in vitro indirecto para determinação da actividade de defibrotida, que se baseia nas interacções funcionais entre a defibrotida e a plasmina. 4 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

Sabe-se da literatura que a plasmina é uma enzima proteolítica na cascata da coagulação/fibrinólise capaz de clivar a fibrina, o fibrinogénio e outras proteínas plasmáticas. A actividade enzimática da plasmina é normalmente determinada através de vários testes in vitro padrão. Um dos métodos mais vulgarmente utilizados é a determinação através de espectrofotometria ou fluorimetria dos compostos cromogénicos ou fluorogénicos que são libertados através da acção da plasmina em substratos adequados (Haemostasis, (1978), 7: 138-145). Substratos peptídicos possuindo a fórmula Ai-A2-A3-X são geralmente utilizados em que Ai e A2 são aminoácidos que são predominantemente não polares, A3 é lisina ou arginina e X representa o composto mensurável libertado, por exemplo para-nitroanilina (pNa) ou 2-naftilamina (NA) (Haemostasis, (1978), 7, 146-149). Para além dos substratos peptídicos acima mencionados, foi alcançado sucesso utilizando outros compostos mais simples tais como, por exemplo, p-nitrobenzil-p-toluenossulfonil-L-arginina (Haemostasis, (1978), 7: 105-108).

Nesses testes, a velocidade à qual o composto X é libertado para o meio de incubação é proporcional à actividade biológica (Unidades Internacionais) de plasmina presente na amostra.

Foi agora descoberto, e este é o princípio sobre o qual o presente invento se baseia, que nos testes de avaliação de plasmina descritos acima, defibrotida aumenta a velocidade de libertação do composto X proporcionalmente à sua concentração. O método ao qual o presente invento se refere proporciona primeiro que tudo o contacto da amostra de defibrotida, da plasmina e do substrato para a plasmina. A amostra de defibrotida utilizada para a determinação de acordo com o presente invento é geralmente preparada por extracção a partir de órgãos de acordo com procedimentos conhecidos, tal como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos US 4985552 que foi já mencionada. 5 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

Um lote de defibrotida fabricada industrialmente normal foi escolhido como amostra de referência (padrão) e foi utilizado para preparar as curvas de calibração de acordo com o método do presente invento.

Em geral, o presente método proporciona medições precisas e exactas de defibrotida mesmo na presença de contaminantes, tais como, por exemplo, ARN, heparina, defibrotida degradada (defibrotida da qual foi removida purina ou pirimidina) ou etanol, desde que estejam em concentrações geralmente inferiores a 10% do peso, para não prejudicar o sistema.

Para além de permitir a determinação de defibrotida, o método permite também a determinação de outras substâncias biologicamente equivalentes derivadas de defibrotida, tais como, por exemplo, defibrotida desaminada ou, mais simplesmente, defibrotida desnaturada através de aquecimento. O presente método é suficientemente sensível para detectar concentrações de defibrotida inferiores ou iguais a 0,1 pg/ml (concentração final no sistema de determinação) e, geralmente, expressa uma boa correlação até valores máximos de concentração superiores ou iguais a 100 pg/ml. A plasmina utilizada é geralmente qualquer plasmina de mamífero, tal como, por exemplo, plasmina bovina, suína ou humana, com preferência para a plasmina humana.

No entanto, embora a plasmina seja a enzima de escolha, a utilização de outros sistemas enzimáticos equivalentes, tais como, por exemplo, precursores de plasmina, tais como plasminogénio, ou enzimas análogas a plasmina que são quimicamente aparentadas e têm uma funcionalidade semelhante, recai dentro do âmbito do presente invento.

No método do presente invento, o substrato para a plasmina pode ser entendido como sendo qualquer substrato específico para plasmina que, sob as condições do método, liberta um produto de hidrólise X detectável.

Dependendo da natureza do grupo X detectável, podem ser igualmente bem adoptados sistemas alternativos de detecção 6 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ vulgarmente conhecidos dos peritos na arte. Sistemas de detecção espectrofotométricos ou fluorimétricos são particularmente vantajosos, especialmente os sistemas espectrofotométricos.

Os substratos geralmente utilizados são uns que são específicos para a plasmina. É preferível utilizar péptidos da fórmula Ai-A2-A3-X, em que Ai e A2 são aminoácidos que são predominantemente não polares, A3 é lisina ou arginina e X é o grupo detectável. Exemplos desses substratos são Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa ou pyroGlu-Phe-Lys-pNa nos quais o grupo X detectável através de espectrofotometria é para-nitroanilina (pNA). Outros substratos adequados, por exemplo Val-Gly-Arg-2NA, contêm 2-naftilamina, que é mensurável através de fluorimetria. Um substrato particularmente preferido é o composto H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina (H-D-Val-Leu-Lys-pNA).

As plasminas e os substratos específicos utilizados para determinação de defibrotida estão geralmente comercialmente disponíveis. 0 método de determinação do presente invento é realizado através da colocação dos reagentes e da amostra de defibrotida em solução aquosa, a um pH e uma molaridade específicos.

Em particular, a concentração da plasmina pode variar, habitualmente de 0,0016 a 0,20 U.I./ml, de preferência de 0,0064 a 0,050 U.I./ml, e ainda de maior preferência é de aproximadamente 0,0125 U.I./ml.

No entanto, em relação ao substrato para a plasmina, são geralmente utilizadas concentrações de 0,3 a 4 mM, de preferência de 2,5 a 3,5 mM e vantajosamente de 3 mM, no caso de um substrato cromogénico, enquanto que no caso de um substrato fluorogénico são utilizadas concentrações de 0,05 a 0,15 mM. O método de determinação do presente invento, tal como outros métodos enzimáticos, é sensível ao pH do meio. 7 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

De facto, não pode ser geralmente aplicado a valores de pH extremos onde o sistema enzimático estaria inactivado. É também preferível que o pH do meio não sofra variação em nenhum momento durante o período em que as medições estão a ser tomadas, e portanto a solução é geralmente tamponada com sistemas tampão seleccionados de entre os normalmente utilizados em testes de determinação de plasmina. Sistemas tampão adequados podem ser, por exemplo, tampão fosfato, tampão citrato ou tampão cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). A operação é de preferência realizada na presença de TRIS.

No presente método é habitualmente preferido manter o pH do meio num intervalo de aproximadamente de 7 a 8, de preferência a aproximadamente 7,4.

Adicionalmente, é preferido manter a concentração do sistema tampão num intervalo de 10 a 200 mM, de preferência a aproximadamente 50 mM. O método do presente invento para determinação de defibrotida proporciona a mistura da plasmina, do substrato para a plasmina, e da defibrotida. Em particular, para permitir que as medições proporcionadas pelo método sejam realizadas correctamente, é preferível adicionar a plasmina ou o substrato específico, ou ambos, à solução tamponada contendo a amostra de defibrotida antes do início do passo de medição. O substrato para a plasmina é de preferência adicionado por último.

Um parâmetro importante no presente método de determinação é a temperatura. É preferível que a mesma temperatura seja mantida ao longo de toda a duração das medições e para todas as amostras determinadas, tanto relativamente à construção das curvas de referência como durante o passo de medição. Para esse fim, é preferível utilizar aparelhos de temperatura controlada e também, quando necessário, é possível prosseguir com vários conjuntos de medições, mudando a posição das amostras apropriadamente para assegurar que o sistema tem máxima homogeneidade térmica. 8 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

Geralmente, este método de determinação aplica-se num intervalo de temperatura, por exemplo, de 25 a 40°C, de preferência de 35 a 39°C, e ainda de maior preferência a 37°C.

De acordo com o presente invento, a medição da concentração do composto X libertado no meio através da acção da plasmina começa quando todos os reagentes foram adicionados e continua durante um tempo predeterminado e a uma frequência predeterminada em função da natureza química de X e do sistema de detecção.

Semelhantemente a outros métodos de determinação biológica, o método do presente invento proporciona também um passo de calibração e um passo de medição que são de preferência realizados em paralelo para reduzir tanto quanto possível a incidência da variabilidade experimental. O passo de calibração compreende a aquisição dos dados de absorvância relativos às amostras a concentrações crescentes conhecidas de defibrotida (padrão), o reprocessamento estatístico desses dados e a extrapolação de curvas de calibração, que expressam a correlação entre o aumento na velocidade da reacção enzimática do presente invento e a concentração de defibrotida presente no meio. No passo de medição, devido à correlação obtida no passo de calibração, é possível determinar as actividades biológicas desconhecidas de amostras de defibrotida com base nos valores de absorvância medidos e processados sob as mesmas condições.

Em mais detalhe, o protocolo experimental proporciona geralmente a preparação de várias amostras, tanto padrão como desconhecidas, a várias concentrações conhecidas de defibrotida. As amostras de defibrotida são preparadas através de diluição progressiva das soluções originais de acordo com um factor de diluição predeterminado.

No presente método, é preferido preparar pelo menos 5 concentrações do padrão e 5 concentrações da amostra a testar, preparando 5 réplicas, ou de maior preferência 10 réplicas, para cada concentração do padrão e, semelhantemente, para cada concentração da amostra de teste, 9 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ geralmente para diluições sucessivas de 1:2 das soluções originais .

As concentrações tanto do padrão como da amostra de teste de defibrotida são geralmente de 0,1 a 100 pg/ml, de preferência de 0,3 a 50 pg/ml, mais vantajosamente de 0,5 a 8 pg/ml.

As concentrações da amostra de teste são de preferência da mesma ordem de grandeza que as concentrações do padrão.

De acordo com a ilustração de cima, as medições para cada concentração são de preferência realizadas em duas microplacas onde a posição de cada amostra, do padrão e da amostra de teste, respectivamente, na concentração correspondente é de preferência invertida de uma placa para a outra. De acordo com este esquema para a disposição das amostras, que é explicado em mais detalhe na parte experimental, para cada concentração tanto do padrão como da amostra de teste de defibrotida, são medidos de cada vez pelo menos 5 ou, de preferência, 10 valores de absorvância. O conjunto de medições acima descrito é tomado em tempos predeterminados, o mesmo é dizer, primeiro no tempo to, o mesmo é dizer, quando todos os componentes foram adicionados, antes da reacção enzimática do presente invento ter iniciado e subsequentemente a intervalos precisos e durante um período de tempo suficiente para adquirir os dados necessários.

De preferência, as medições de absorvância são continuadas até um máximo de 90 minutos, com leituras tomadas a cada 1-10 minutos. Mais vantajosamente, as leituras são tomadas no tempo t0 e, subsequentemente, de 20 a 50 minutos, todos os 5 minutos. As leituras fotométricas da absorvância são efectuadas a um comprimento de onda que depende da natureza do grupo X detectável no curso da reacção hidrolítica enzimática. No caso específico em que x é p-NA, a absorvância é medida a 405 nm.

As leituras de absorvância do padrão e de amostras de defibrotida desconhecidas, conhecidas como dados em bruto, geralmente têm origem directamente no mesmo aparelho que 10 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ proporciona a operação de leitura; são tabeladas de modo a que um valor de absorvância seja expresso para cada momento e poço.

Os dados em bruto são então processados, utilizando, por exemplo, a Folha de Cálculo-Microsoft Excel®. Esta primeira operação de processamento conduz ao cálculo da absorvância média e do desvio padrão associado, a cada momento para cada conjunto de leituras, compreendendo cada conjunto pelo menos 5 e de preferência 10 réplicas para cada concentração tanto do padrão como da amostra de teste de defibrotida. É realizado mais processamento estatístico dos dados com um programa do tipo Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, USA) que toma a relação matemática existente entre os valores de absorvância das amostras e o tempo, para cada conjunto de concentrações de defibrotida, para obter rectas cujo declive é proporcional à concentração de defibrotida.

Para ser mais preciso, no intervalo em que existe linearidade da resposta, de preferência de 20 a 50 minutos, e para cada um dos 5 ou, de preferência, 10 réplicas da mesma concentração, o programa calcula uma linha de regressão que se caracteriza por um coeficiente de regressão linear "b", por um coeficiente de determinação "r2" e pela intercepção "a".

As rectas produzidas de acordo com o presente procedimento têm geralmente uma boa correlação expressa por valores elevados de r2, geralmente não menos de 0,97, de preferência r2>0,99.

Os dados produzidos pelo programa podem ser reproduzidos como dados digitais tabelados ou podem ser representados graficamente, para cada conjunto de concentrações.

Tal como ilustrado na Figura 1, ao colocar o tempo nas abcissas e a absorvância nas ordenadas, serão obtidas rectas cujo declive "b" será proporcional à velocidade da reacção enzimática: através do aumento da concentração de defibrotida, a velocidade de hidrólise e, proporcionalmente, o valor de "b" aumentarão. Finalmente, os valores do declive, calculados tal como descrito acima para cada conjunto de réplicas de 11 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ defibrotida padrão e de defibrotida de amostras de teste, estão correlacionados com o logaritmo decimal da concentração de defibrotida com a qual se relacionam. Graficamente, essa correlação dá origem a uma sigmóide para o padrão e uma sigmóide para a amostra de teste (Figura 2); as porções centrais da sigmóide têm duas rectas que são geralmente paralelas e a distância entre as quais é uma função da diferença na actividade biológica entre a amostra de teste e o padrão.

Neste intervalo de linearidade, a potência da amostra de defibrotida desconhecida em comparação com a do padrão é determinada de acordo com a metodologia de determinação biológica de linhas paralelas descrita por Finney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2a ed. Ch. Griffin, London.

Essa metodologia pode ser aplicada quando, tal como no presente invento, a resposta biológica for uma função linear do logaritmo da concentração da substância a determinar e quando existir paralelismo e linearidade entre as rectas associadas ao padrão e, respectivamente, às concentrações desconhecidas. De preferência, o processamento estatístico dos dados, o cálculo da razão das potências e, assim, a determinação da actividade desconhecida de defibrotida são realizados utilizando suportes lógicos dedicados construídos com base na metodologia acima mencionada.

No entanto, o processamento de dados estatísticos, que, em análise química em geral e mais particularmente no presente método, permite que seja minimizada a incidência de erros e variabilidade experimental, não é vinculativo para o método do presente invento e representa simplesmente um método de avaliação dos resultados que é bem conhecido dos peritos na arte e que é vulgarmente utilizado no campo. 0 presente invento refere-se também a estojos para determinação da actividade biológica de defibrotida de acordo com o método do presente invento, compreendendo pelo menos: a) uma quantidade medida de um substrato para a plasmina tal como definido acima e b) uma quantidade medida de plasmina. 12 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ

Estojos preferidos compreendem de 20 a 30 mg de substrato específico para plasmina por unidade de plasmina, e mesmo de preferência 25 mg de substrato por unidade de plasmina. De acordo com o presente invento, estojos compreendendo H-D-Val-Leu-Lys-pNA, como substrato específico para plasmina, e plasmina humana, são particularmente vantajosos.

Os estojos de acordo com o presente invento podem também conter uma solução aquosa tamponada, de preferência uma solução tamponada com TRIS.HC1 50 mM, a pH 7,4. Opcionalmente, os estojos do presente invento compreendem também uma quantidade medida de defibrotida (padrão) para permitir medições de controlo.

Numa concretização preferida do presente invento, as soluções de padrão e as soluções das amostras de defibrotida a determinar são introduzidas nos respectivos poços das microplacas. A solução de plasmina é preparada no momento da utilização e é distribuída nos poços contendo defibrotida e, finalmente, é adicionada a solução contendo o substrato para a plasmina. A microplaca é então colocada no leitor com termostato e, após rápida agitação, as leituras da absorvância do sistema são tomadas a intervalos predeterminados e durante o período de tempo predeterminado. Os dados em bruto obtidos são então processados, determinando-se assim as actividades desconhecidas das amostras de defibrotida.

Esses e outros aspectos do presente invento serão melhor ilustrados nos seguintes Exemplos que, no entanto, não devem ser considerados como limitadores do presente invento.

EXEMPLOS

Os seguintes materiais foram utilizados nos Exemplos dados aqui:

Aparelhos - Detector para uma microplaca possuindo 96 poços MRX TCII (Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA), com termostato e equipado com um programa de cinética enzimática 13 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ - Microplacas possuindo 96 poços com uma base plana (Greiner L., Kremunster, Áustria, cat. 655101) - Pipetas com ajuste continuo do volume Pipetman P200 (30— 200 μΐ) e 8x200 (20-200 μΐ) e pontas de 200 μΐ de qualidade certificada (Gilson, Milão, Itália) - Medidor de pH PHM85 Radiometer (Analítica De Mori, Milão, Itália)

Programas

(g-, I - Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) - Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, USA)

Substâncias - Defibrotida (Gentium) - Plasmina humana, 1 unidade, P-4895 (Sigma Aldrich, Milão, Itália) - Substrato cromogénico S-2251, 820332-39 (Chromogenix

Instrumentation Laboratory S.p.A., Milão, Itália) - Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), 255285-9 (Sigma-Aldrich, Milão, Itália) - HC1 1 N 1090571000 (Merck) - NaOH 1 N 1091411000 (Merck)

Soluções

Tampão TRIS-HC1

Dissolvem-se 2,42 g de TRIS em água destilada e diluem-se até um volume de 100 ml. Adicionam-se 16 ml de HC1 1 N à solução seguidos de mais água destilada para dar um volume final de 400 ml. O pH desta última solução é de 7,40. Se os valores forem diferentes, o pH é corrigido para dar o valor desejado através da adição de HC1 1 N ou NaOH 1 N.

Solução de plasmina

Uma unidade (1 U.I.) de plasmina humana é dissolvida em 4 ml de tampão TRIS-HC1 a 0°C. Operando sempre em gelo, a 14 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ solução é então subdividida em alíquotas de 200 μΐ que são conservadas a -20°C em tubos de ensaio de plástico de 10 ml.

Solução do substrato cromogénico S-2251

Dissolvem-se 25 mg de S-2251 em 15,15 ml de água destilada e conserva-se a +4/+8°C.

Soluções padrão de defibrotida

Preparação das soluções padrão - Concentrações (Finais) de 0,1 a 100 pg/ml

Dissolvem-se 60 mg de defibrotida em 3 ml de tampão TRIS-HC1 e diluem-se de 1:15 com a solução tampão de TRIS-HC1. A solução assim obtida, possuindo uma concentração de 1,333 mg/ml, é sujeita a diluições sucessivas de 1:2 para obter soluções de defibrotida possuindo uma concentração de 666 pg/ml, 333 pg/ml e 166 pg/ml. Esta última solução, que é utilizada como solução-mãe, é ainda diluída para obter soluções possuindo concentrações de 83,33 pg/ml, 41,67 pg/ml, 33.33 pg/ml, 25 pg/ml, 16,66 pg/ml, 8,33 pg/ml, 5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1,66 pg/ml, 0,83 pg/ml, 0,5 pg/ml e finalmente 0,16 pg/ml. - Concentrações (Finais) de 0,5 a 8 pg/ml

Dissolvem-se 60 mg de defibrotida em 3 ml de tampão TRIS-HC1 e diluem-se de 1:1500 com a solução tampão de TRIS-HC1. A solução assim obtida, possuindo uma concentração de 13.33 pg/ml, é sujeita a diluições sucessivas de 1:2 para dar soluções de defibrotida possuindo uma concentração de 6,66 pg/ml, 3,33 pg/ml, 1,66 pg/ml e 0,83 pg/ml, respectivamente.

Procedimento

Tomam-se 150 pl de cada uma das soluções padrão de defibrotida descritas acima e introduzem-se nos poços das microplacas. 15 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ A solução de plasmina é então preparada rapidamente através de adição, a 0°C, de 3,8 ml de tampão TRIS-HC1 ao tubo de ensaio contendo 0,2 ml de solução de plasmina humana. O todo é agitado suavemente até ocorrer a dissolução, e 50 μΐ são tomados e introduzidos nos poços da microplaca, seguidos de 50 μΐ de S-2251 para cada poço. A microplaca, colocada no leitor MRX TCII regulado para 37°C, é agitada durante aproximadamente 10 segundos; as leituras de absorvância são realizadas a 405 nm, no momento inicial to e subsequentemente a cada dois minutos no intervalo de 10 a 20 minutos, de acordo com o programa de cinética enzimática.

Os dados experimentais medidos para concentrações de defibrotida de 0,1 a 100 pg/ml são então processados (programas Excel e Sigma Plot) e representados num gráfico (linhas de regressão) tal como mostrado como exemplo nas seguinte Figuras 1 e 2.

Os valores dos coeficientes angulares b (declive) das rectas correspondendo ao padrão e à amostra de teste de defibrotida (Figura 1) são representados em relação às concentrações de defibrotida (escala logarítmica) (Figura 2).

Tal como se pode observar a partir do gráfico, é obtida uma resposta linear que permite que seja identificada uma recta na porção central da curva. Nesse intervalo de linearidade, a potência da amostra de defibrotida desconhecida é determinada em comparação com o padrão, de acordo com a metodologia de determinação biológica de linhas paralelas já mencionada e descrita por Finney DJ, "Statistical Method in Biological Assay", 2a ed. Ch. Grriffin, London. Para que esta metodologia seja aplicável, é importante que haja, para além de linearidade, paralelismo entre as rectas que se referem ao padrão e, respectivamente, à defibrotida a testar. O teste para determinação da actividade biológica de uma amostra de defibrotida desconhecida, em comparação com a defibrotida padrão, é realizado de preferência através da utilização de concentrações que dão origem à porção rectilínea da sigmóide determinada acima. Em particular, são preferidas 16 ΕΡ 1 456 404/ΡΤ concentrações de padrão e de defibrotida desconhecida no intervalo de 0,5 a 8 pg/ml. A disposição, nos poços da placa, das réplicas das várias concentrações de defibrotida para o padrão e para a amostra a examinar é dada adiante.

Defibrotida padrão Amostra de teste 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B - 0, 5 8,0 4,0 2, 0 1,0 1,0 2, 0 4,0 8, 0 0, 5 - C - 1,0 0,5 8,0 4,0 2, 0 2, 0 4,0 8,0 0,5 1,0 - D - 2, 0 1,0 0, 5 8, 0 4,0 4,0 8, 0 0, 5 1,0 2, 0 - E - 4,0 2,0 1,0 0,5 8,0 8,0 0,5 1,0 2, 0 4,0 - F - 8, 0 4,0 2, 0 1,0 0,5 0,5 1,0 2, 0 4,0 8, 0 - G - H -

As soluções padrão de defibrotida são colocadas nas colunas 2-6 enquanto que as amostras de defibrotida a determinar são colocadas nas colunas 7-11, nas concentrações indicadas. Na segunda placa, as posições das amostras são de preferência invertidas. As colunas e linhas exteriores da microplaca não são utilizadas para o processo de determinação mas são enchidas com água para assegurar a máxima homogeneidade de temperatura em todo o sistema. A microplaca, colocada no leitor MRX TCII regulado para 37°C, é agitada durante aproximadamente 10 segundos; as leituras de absorvância são tomadas a 405 nm, no momento inicial t0 e subsequentemente a cada 5 minutos durante um periodo do 20° ao 50° minuto, de acordo com o programa de cinética enzimática.

Os valores de absorvância medidos são então processados (programas Excel e Sigma Plot), tabelados e representados num gráfico (linhas de regressão). ΕΡ 1 456 404/ΡΤ 17

Foi então possível calcular a razão das potências e determinar a actividade da amostra de defibrotida desconhecida em comparação com o padrão, utilizando o mesmo sistema de cálculo que o descrito acima.

Para fins de exemplo as Tabelas (1, 2 e 3) e os gráficos (Figuras 3, 4 e 5) referentes a amostras de defibrotida, testadas a uma concentração de 0,5 pg/ml, 2,0 pg/ml e 8,0 pg/ml, respectivamente, são dados adiante.

Lisboa, 2010-11-25

Claims

ΕΡ 1 456 404/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinação da actividade biológica de defibrotida, que compreende os passos de: a) pôr em contacto defibrotida, plasmina e um substrato especifico para a plasmina que, através de reacção com a plasmina, proporciona um produto mensurável e b) medição da quantidade de produto formada em momentos sucessivos, em que o substrato especifico para a plasmina é um composto de fórmula A1-A2-A3-X em que Αχ e A2 são aminoácidos não polares, A3 é lisina ou arginina e X é o produto mensurável, e em que a concentração do substrato para a plasmina é de 0,3 a 4, de preferência de 2,5 a 3,5 mM, de maior preferência de 3 mM, caracterizado por compreender os passos de: a') determinação da velocidade de libertação do produto mensurável X durante o curso da reacção enzimática, para cada amostra de defibrotida, tanto do padrão como do tipo de teste b') correlação, matematicamente e/ou graficamente, das velocidades de libertação acima mencionadas com as correspondentes concentrações de defibrotida c') obtenção das actividades biológicas das amostras de teste de defibrotida.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a plasmina é uma plasmina de mamífero, de preferência plasmina humana.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o produto mensurável X é seleccionado de entre para-nitroanilina 2-naftilamina.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o substrato para a plasmina é H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina. ΕΡ 1 456 404/ΡΤ 2/2
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a plasmina tem uma concentração de 0,0064 a 0,050 U.l./ml e o substrato para a plasmina tem uma concentração de 2,5 a 3,5 mM.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a concentração de plasmina é de 0,0125 U.l./ml e a concentração do substrato para a plasmina é de 3 mM.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o produto mensurável X é medido através de espectrofotometria.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio reaccional é uma solução aquosa tamponada a um pH de 7 a 8, de preferência a pH 7,4.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a temperatura do sistema é mantida de 35 a 39°C, de preferência a 37°C. Lisboa, 2010-11-25