ES2349509T3

ES2349509T3 - Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida.

Info

Publication number: ES2349509T3
Application number: ES02795074T
Authority: ES
Inventors: Laura Ferro; Franco Cattaneo; Roberto Porta
Original assignee: Gentium SRL
Current assignee: Gentium SRL
Priority date: 2001-12-17
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2011-01-04
Anticipated expiration: 2022-11-27
Also published as: RS63104A; EP1456404B1; ATE480637T1; KR100912424B1; HK1077332A1; DE60237639D1; CN1612938A; IS7312A; CA2468877A1; MXPA04005958A; US7338777B2; JP4348192B2; WO2003052130A3; AU2002360945B2; ZA200404656B; EP1456404A2; IL162511A0; HUP0402231A2; PT1456404E; AR037870A1

Abstract

Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida, que comprende las etapas de: a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible y b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos, en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en el que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado porque comprende las fases de: a') determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática, para cada muestra de defibrotida, del tipo tanto patrón como de ensayo; b') correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes; c') obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida.

Description

La presente invención se a refiere un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida y, más especialmente, se refiere a un método enzimático indirecto para determinar la actividad biológica de la defibrotida.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La defibrotida (Índice Merck, 1996, Nº 2915) es una sustancia de origen natural que se obtiene por extracción a partir de órganos animales y que está constituida por la sal sódica de polidesoxirribonucleótidos que tienen un bajo peso molecular. La defibrotida ha sido objeto de numerosas investigaciones farmacológicas que han sugerido que se aplique en terapia como agente antitrombótico (documento US 3.829.567).

Además, la defibrotida se ha usado también con éxito en el tratamiento de arteriopatías periféricas, en la insuficiencia renal aguda (documento US 4.694.134)

o en la isquémica miocárdica aguda (documento US 4.693.995).

Como otras sustancias biológicas que se obtienen por extracción, la defibrotida también está sujeta a una variabilidad de composición limitada que es típica de biopolímeros naturales. Un ejemplo clásico de esta situación se proporciona por la heparina, cuya variabilidad de un lote a otro en términos de longitud de cadena, peso molecular, composición, grado de sulfatación, etc. es bien conocida. La consecuencia de esto es que las mismas cantidades en peso de defibrotida podrían de hecho no ser equivalentes desde el punto de vista de una actividad biológica específica.

El proceso de extracción, aislamiento y purificación no puede asegurar por sí mismo una reproducibilidad absoluta del producto, precisamente debido a su naturaleza biopolimérica intrínseca. Sin embargo, si se controla bien, es posible reducir esta variabilidad: con este fin, se han realizado estudios de procesos industriales normalizados para aislar defibrotida por extracción a partir de órganos, tales como, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos US

4.985.552.

El producto obtenido de acuerdo con el proceso mencionado anteriormente se caracteriza por la determinación de algunos parámetros físico-químicos específicos, tales como, por ejemplo, movilidad electroforética, el coeficiente de extinción, potencia rotatoria óptica e hipercromicidad reversible. Sin embargo, esos parámetros dependen básicamente de la estructura de la defibrotida y no pueden proporcionar información sobre la actividad biológica de la misma.

Hasta donde sabemos, los únicos métodos que se ha descrito que se han usado hasta ahora para evaluar la actividad biológica de la defibrotida son el ensayo de placas de fibrina y el registro tromboelastográfico del tiempo de lisis de euglobulina. [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull’attività fibrinolitica, nell’animale e nell’uomo, di una nuova sostanza presetite in diversi organi animali, Simposio Intemazionale: La ricerca scientifica nell’industria farmaceutica in Italia, Roma, 2-4 Octubre 1975 -II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24.552-561). Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente se caracterizan por una complejidad experimental considerable, por una reproducibilidad y una exactitud poco satisfactorias y, en el caso específico del registro tromboelastográfico, por un linealidad de respuesta limitada a intervalos de concentración muy limitados.

Hasta ahora, por lo tanto, no se ha conocido ningún método verdaderamente válido, exacto y reproducible para determinar la actividad biológica de la defibrotida.

El documento US-A-4 234 682 describe un método de determinación de la heparina usando un ensayo óptico basado en la escisión de un sustrato cromogénico por trombina.

Se ha desarrollado un método simple y fiable para determinar la actividad biológica de la defibrotida, que permite que se controlen las muestras obtenidas por extracción y, por lo tanto, permite que se normalicen las preparaciones medicinales basada en defibrotida.

El método al que se refiere la presente invención permite que se determine la actividad biológica específica de defibrotida en comparación con un patrón de referencia con un alto grado de exactitud, velocidad y reproducibilidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere por lo tanto a un método para determinar la actividad biológica específica de muestras de defibrotida, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporcione un producto medible y

b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos. en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula

A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en la que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado por que comprende las fases de:

a’) determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática para cada muestra de defibrotida, tanto del tipo patrón como de ensayo;

b’) correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes;

c’) obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida.

El método de la invención es un método in vitro indirecto para determinar la

actividad de la defibrotida, que se basa en las interacciones funcionales entre la defibrotida y la plasmina.

Se sabe por la bibliografía que la plasmina es una enzima proteolítica en la cascada de la coagulación/fibrinolisis capaz de escindir la fibrina, el fibrinógeno y otras proteínas plasmáticas.

La actividad enzimática de la plasmina se determina normalmente por diversos ensayos in vitro convencionales. Uno de los métodos usados más comúnmente es la determinación por espectrofotometría o fluorimetría de los compuestos cromogénicos o fluorogénicos que se liberan por acción de la plasmina en sustratos adecuados [Haemostasis, (1978), 7, 138-145]. Se usan generalmente sustratos peptídicos que tienen la fórmula A1-A2-A3-X, en los que A1 y A2 son aminoácidos que son predominantemente no polares, A3 es lisina o arginina y X representa el compuesto liberado medible, por ejemplo, para-nitroanilina (pNa) o 2naftilamina (NA) [Haemostasis, (1978), 7, 146-149]. Además de los sustratos peptídicos mencionados anteriormente, se han logrado éxitos usando otros compuestos más simples tales como, por ejemplo, p-nitrobencil-p-toluenosulfonil-Larginina [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].

En esos ensayos, la velocidad a la que se libera el compuesto X en el medio de incubación es proporcional a la actividad (Unidades Internacionales) de la plasmina presente en la muestra.

Se ha descubierto ahora, y este es el principio sobre el que se basa la presente invención, que en los ensayos de evaluación de plasmina descritos anteriormente, la defibrotida aumenta la velocidad de liberación de compuesto X de forma proporcional a su concentración. El método al que se refiere la presente invención hace posible, en primer lugar, poner en contacto entre sí la muestra de defibrotida, la plasmina y el sustrato para la plasmina.

La muestra de defibrotida usada para la determinación de acuerdo con la invención se prepara generalmente por extracción a partir de órganos de acuerdo con procedimientos conocidos, tal como se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos US 4.985.522 que ya se ha mencionado.

Se seleccionó un lote de defibrotida normal fabricada industrialmente como muestra de referencia (patrón) y se usó para preparar las curvas de calibración de acuerdo con el método de la presente invención.

En general, el presente método proporciona mediciones exactas y precisas de la defibrotida, incluso en presencia de contaminantes tales como, por ejemplo, ARN, heparina, defibrotida degradada (defibrotida de la que se ha eliminado purina

o pirimidina) o etanol, con tal de que estén en concentraciones generalmente inferiores al 10% en peso, de modo que no se altere el sistema.

Además de permitir la determinación de la defibrotida, el método también permite la determinación de otras sustancias biológicamente equivalentes derivadas de la defibrotida, tales como, por ejemplo, defibrotida desaminada o, más simplemente, defibrotida desnaturalizada por calentamiento.

El presente método es suficientemente sensible para detectar concentraciones de defibrotida inferiores a o iguales a 0,1 µg/ml (concentración final en el sistema de determinación) y generalmente expresa una buena correlación hasta valores de concentración máximos superiores a o iguales a 100 µg/ml.

La plasmina usada es generalmente cualquier plasmina de mamífero, tal como, por ejemplo, plasmina bovina, porcina o humana, con una preferencia por plasmina humana.

Sin embargo, aunque la plasmina es la enzima de elección, el uso de otros sistemas enzimáticos equivalentes, tales como, por ejemplo, precursores de plasmina tales como plasminógeno, o enzimas análogas de plasmina que están químicamente relacionadas y tienen una funcionalidad similar, se incluye en el alcance de la presente invención.

En el método de la presente invención, puede entenderse que el sustrato para la plasmina es cualquier sustrato específico para la plasmina que, en las condiciones del método, libere un producto de hidrólisis detectable X.

Dependiendo de la naturaleza del grupo detectable X, pueden adoptarse igualmente bien sistemas de detección alternativos comúnmente conocidos por los expertos en la materia. Son particularmente ventajosos sistemas de detección espectrofotométricos o fluorimétricos, especialmente los sistemas espectrofotométricos.

Los sustratos usados generalmente son unos que son específicos para la plasmina. Es preferible usar péptidos de la fórmula A1-A2-A3-X, en la que A1 y A2 son aminoácidos que son predominantemente no polares, A3 es lisina o arginina y X es el grupo detectable. Son ejemplos de esos sustratos Val-Leu-Lys-pNa, Val-PheLys-pNa o pymGlu-Phe-Lys-pNa, en los que el grupo X detectable por espectrofotometría es para-nitroanilina (pNA). Otros sustratos adecuados, por ejemplo, Val-Gly-Arg-2NA, contienen 2-naftilamina, que puede medirse por fluorimetría. Un sustrato particularmente preferido es el compuesto H-D-Valil-LLeucil-L-Lisina-p-nitroanilina (H-D-Val-Leu-Lys-pNA).

Las plasminas y los sustratos específicos usados para determinar la defibrotida están generalmente disponibles en el mercado.

El método de determinación de la presente invención se lleva a cabo poniendo los reactivos y la muestra de defibrotida en solución acuosa a un pH y una molaridad específica.

En particular, la concentración de la plasmina puede variar, habitualmente de 0,0016 a 0,20 U.I./ml, preferiblemente de 0,064 a 0,050 U.I./ml y, aún más preferiblemente, es de aproximadamente 0,0125 U.I./ml.

Sin embargo, con respecto al sustrato para la plasmina, se usan generalmente concentraciones de 0,3 a 4 mM, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM y ventajosamente de 3 mM, en el caso de un sustrato cromogénico, mientras que se usan concentraciones de 0,05 a 0,15 mM en el caso de un sustrato fluorogénico.

El método de determinación de la invención, como otros métodos enzimáticos, es sensible al pH del medio.

De hecho, generalmente no puede aplicarse a valores de pH extremos en

los que el sistema enzimático se inactivaría.

También es preferible que el pH del medio no experimente variaciones en ningún momento durante el periodo en el que se están tomando mediciones y, por lo tanto, la solución generalmente se tampona con sistemas de tampón seleccionados de los usados normalmente en ensayos de determinación de plasmina. Los sistemas de tampón adecuados pueden ser, por ejemplo, tampón fosfato, tampón citrato o tampón clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). La operación se lleva a cabo preferiblemente en presencia de TRIS.

En el presente método, se prefiere habitualmente mantener el pH del medio en un intervalo de aproximadamente 7 a 8, más preferiblemente a aproximadamente 7,4.

Además, se prefiere mantener la concentración del sistema tampón en un intervalo de 10 a 200 mM, preferiblemente a aproximadamente 50 mM.

El método de la invención para determinar la defibrotida facilita que la plasmina, el sustrato para la plasmina y la defibrotida se mezclen. En particular, para permitir las mediciones proporcionadas por el método que se realizará correctamente, es preferible añadir la plasmina o el sustrato específico, o ambos, a la solución tamponada que contiene la muestra de defibrotida antes del inicio de la fase de medición. El sustrato para la plasmina se añade preferiblemente el último.

Un parámetro importante en el presente método de determinación es la temperatura. Es preferible que se mantenga la misma temperatura durante toda la duración de las mediciones y para todas las muestras determinadas, tanto con respecto a la construcción de las curvas de referencia como durante la fase de medición. Con este fin, es preferible usar un aparato de temperatura controlada y también, cuando sea necesario, es posible proceder con varios conjuntos de mediciones, cambiando la posición de las muestras apropiadamente para asegurar que el sistema tenga una homogeneidad térmica máxima.

Generalmente, este procedimiento de determinación se aplica en un intervalo de temperatura, por ejemplo, de 25 a 40ºC, preferiblemente de 35 a 39ºC

y, aun más preferiblemente, a 37ºC.

De acuerdo con la presente invención, la medición de la concentración de compuesto X liberado en el medio por acción de la plasmina comienza cuando se han añadido todos los reactivos y continúa durante un tiempo predeterminado y a una frecuencia predeterminada en función de la naturaleza química de X y del sistema de detección.

De forma similar a otros métodos de determinación biológica, el método de la invención también proporciona una fase de calibración y una fase de medición que se llevan a cabo preferiblemente en paralelo para reducir tanto como sea posible la incidencia de variabilidad experimental.

La fase de calibración comprende la adquisición de los datos de absorbancia en relación con las muestras a concentraciones crecientes conocidas de defibrotida (patrón), el reprocesamiento estadístico de esos datos y la extrapolación de las curvas de calibración, que expresa la correlación entre el aumento de la velocidad de la reacción enzimática de la invención y la concentración de defibrotida presente en el medio. En la fase de medición, debido a la correlación obtenida en la fase de calibración, es posible determinar las actividades biológicas desconocidas de muestras de defibrotida basándose en los valores de absorbancia medidos y procesados en las mismas condiciones.

Con más detalle, el protocolo experimental proporciona generalmente la preparación de varias muestras, tanto patrón como desconocidas, a diversas concentraciones conocidas de defibrotida. Las muestras de defibrotida se preparan por dilución progresiva de las soluciones madre de acuerdo con un factor de dilución predeterminado.

En el presente método, se prefiere preparar al menos 5 concentraciones del patrón y 5 concentraciones de la muestra a ensayar, preparando 5 repeticiones o, más preferiblemente, 10 repeticiones para cada concentración del patrón y, de forma similar, para cada concentración de la muestra de ensayo, generalmente para diluciones 1:2 sucesivas de soluciones madre.

Tanto las concentraciones de patrón como de muestra de ensayo de defibrotida son generalmente de 0,1 a 100 µg/ml, preferiblemente de 0,3 a 50 µg/ml, más ventajosamente de 0,5 a 8 µg/ml.

Las concentraciones de la muestra de ensayo son preferiblemente del mismo orden de magnitud que las concentraciones del patrón.

De acuerdo con la ilustración anterior, las mediciones para cada concentración se llevan a cabo preferiblemente en dos microplacas en las que la posición de cada muestra, el patrón y la muestra de ensayo, respectivamente, a su concentración correspondiente, se invierte preferiblemente de una placa a la otra. De acuerdo con este esquema para la disposición de las muestras, que se explica en más detalle en la parte experimental, para cada concentración de defibrotida tanto patrón como muestra de ensayo, se miden al menos 5 o, preferiblemente, 10 valores de absorbancia para cada tiempo.

El conjunto de mediciones descritas anteriormente se toman a tiempos predeterminados, es decir, en primer lugar a tiempo t0, es decir, cuando se han añadido todos los componentes, antes de que se haya iniciado la reacción enzimática de la invención y, posteriormente, a intervalos exactos y durante un periodo de tiempo suficiente para adquirir los datos necesarios.

Preferiblemente, las mediciones de absorbancia se continúan hasta un máximo de 90 minutos, tomándose lecturas cada 1-10 minutos. Más ventajosamente, las lecturas se toman a tiempo t0 y, posteriormente, de 20 a 50 minutos, cada 5 minutos. Las lecturas de absorbancia fotométrica se realizan a una longitud de onda que depende de la naturaleza del grupo detectable X liberado en el transcurso de la reacción enzimática hidrolítica. En el caso específico en el que X es p-NA la absorbancia se mide a 405 nm.

Las lecturas de absorbancia de las muestras de defibrotida patrón y desconocida, conocidas como datos sin procesar, se originan generalmente directamente a partir del mismo aparato que facilita la operación de lectura; se introducen en tablas de tal forma que se exprese un valor de absorbancia para cada tiempo y pocillo.

Los datos sin procesar se procesan después usando, por ejemplo, la Hoja de Cálculo de Microsoft Excel®. Esta primera operación de procesamiento conduce al cálculo de la absorbancia media y de la desviación típica asociada a cada tiempo y para cada conjunto de lecturas, comprendiendo cada conjunto al menos 5 y, preferiblemente, 10 repeticiones para cada concentración de defibrotida tanto patrón como muestra de ensayo.

Se lleva a cabo un procesamiento estadístico adicional de los datos con un programa del tipo Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, Estados Unidos) que toma la relación matemática existente entre los valores de absorbancia de las muestras y del tiempo, para cada conjunto de concentraciones de defibrotida, para obtener líneas rectas cuya pendiente es proporcional a la concentración de defibrotida.

Para ser más exactos, en el intervalo en el que existe linealidad de respuesta, preferiblemente de los 20 a 50 minutos, y para cada una de las 5 o, preferiblemente, 10 repeticiones de la misma concentración, el programa calcula una línea de regresión que se caracteriza por un coeficiente de regresión lineal “b”, por un coeficiente de determinación “r2” y por la intersección “a”.

Las líneas rectas producidas de acuerdo con el presente procedimiento tienen generalmente una buena correlación expresada por altos valores de r2, generalmente no inferiores a 0,97, preferiblemente r2 ≥ 0,99.

Los datos producidos por el programa pueden reproducirse como datos digitales introducidos en tablas, o pueden representarse gráficamente para cada conjunto de concentraciones.

Como se ilustra en la Figura 1, al poner el tiempo en el eje de abscisas y la absorbancia en el eje de ordenadas, se obtendrán líneas rectas cuya pendiente “b” será proporcional a la velocidad de la reacción enzimática: aumentando la concentración de defibrotida, la velocidad de hidrólisis y, proporcionalmente, el valor de “b” aumentará. Finalmente, los valores de la pendiente, calculados como se ha descrito anteriormente para cada conjunto de repeticiones de defibrotida patrón y de defibrotida de muestra de ensayo, están correlacionados con el logaritmo decimal de la concentración de defibrotida con la que están relacionados. Gráficamente, esa correlación da origen a una sigmoide para el patrón y a una sigmoide para la muestra de ensayo (Figura 2); las partes centrales de la sigmoide tienen dos líneas rectas que generalmente son paralelas y la distancia entre las mismas está en función de la diferencia de actividad biológica entre la muestra de ensayo y el patrón.

En este intervalo de linealidad, la potencia de la muestra de defibrotida desconocida en comparación con la de la patrón se determina de acuerdo con la metodología de determinación biológica de líneas paralelas descrita por Finney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2ª ed. Ch. Griffin, Londres.

Esa metodología puede aplicarse cuando, como en la presente invención, la respuesta biológica está en función lineal del logaritmo de la concentración de la sustancia a determinar y cuando existe paralelismo y linealidad entre las líneas rectas asociadas con el patrón y, respectivamente, concentraciones desconocidas. Preferiblemente, el procesamiento estadístico de los datos, el cálculo de la relación de potencia y, por lo tanto, la determinación de la actividad desconocida de la defibrotida se realizan usando programas informáticos especializados construidos basándose en la metodología mencionada anteriormente.

Sin embargo, el procesamiento de datos estadísticos que, en el análisis químico en general y en el presente método más particularmente, permite que se minimice la incidencia de errores y variabilidad experimental, no es vinculante para el método de la invención y simplemente representa un método de evaluar resultados que es bien conocido para el experto en la materia y que se usa comúnmente en el campo.

La presente invención también se refiere a kits para determinar la actividad biológica de la defibrotida de acuerdo con el método de la invención, que comprenden al menos:

a) una cantidad medida de un sustrato para la plasmina como se ha definido anteriormente y

b) una cantidad medida de plasmina.

Los kits preferidos comprenden de 20 a 30 mg de sustrato específico para plasmina por unidad de plasmina y, aún más preferiblemente, 25 mg de sustrato por unidad de plasmina. De acuerdo con la presente invención, son particularmente ventajosos kits que comprenden H-D-Val-Leu-Lys-pNA como sustrato específico para plasmina y plasmina humana.

Los kits de acuerdo con la presente invención también pueden contener una solución acuosa tamponada, preferiblemente una solución tamponada con TRIS.HCl 50 mM, a pH 7,4. Opcionalmente, los kits de la invención también comprenden una cantidad medida de defibrotida (patrón) para permitir mediciones de control.

En una realización preferida de la presente invención, las soluciones patrón y las soluciones de las muestras de defibrotida a determinar se introducen en los pocillos respectivos de las microplacas. La solución de plasmina se prepara en el momento de usarla y se distribuye en los pocillos que contienen defibrotida y, por último, se añade la solución que contiene el sustrato para la plasmina. Después, la microplaca se pone en el lector con termostato y, después de una agitación rápida, se toman lecturas de la absorbancia del sistema a intervalos predeterminados y durante el periodo de tiempo predeterminado. Los datos sin procesar obtenidos se procesan después, determinando de ese modo las actividades desconocidas de las muestras de defibrotida.

Esos y otros aspectos de la invención se ilustrarán mejor en los Ejemplos siguientes que, sin embargo, no deben considerarse limitantes de la invención.

EJEMPLOS

Los materiales siguientes se usaron en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria:

Aparato

-: Detector para una microplaca que tiene 96 pocillos MRX TCII (Dynex Technologies, Chantilly, VA, Estados Unidos), con termostato y equipado con un programa de cinética enzimática.

-: Microplacas que tienen 96 pocillos con una base plana (Greiner L., Kremunster, Austria, cat. 655101).

-Pipetas con ajuste continuo de volumen P200 (30-200 µl) y 8x200 (20-200 µl) y puntas de 200 µl de calidad certificada (Gilson, Milán, Italia).

-pH-metro PHM85 Radiometer (Analitica De Mori, Milán, Italia). Programas -Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, WA, Estados Unidos). -Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, Estados Unidos). Sustancias -Defibrotida (Gentium). -Plasmina humana, 1 unidad, P-4895 (Sigma Aldrich, Milán, Italia). -Sustrato cromogénico S-2251, 820332-39 (Chromogenix Instrumentation

Laboratory S.p.A., Milán, Italia). -Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), 255285-9 (Sigma-Aldrich, Milán,

Italia). -HCl 1N 1090571000 (Merck). -NaOH 1N 1091411000 (Merck).

Soluciones

Tampón TRIS-HCl

Se disuelven 2,42 g de TRIS en agua destilada y se diluyen en un volumen de 100 ml. Se añaden 16 ml de HCl 1N a la solución, seguido de más agua destilada para dar un volumen final de 400 ml. El pH de esta última solución es de 7,40. Si los valores son diferentes, el pH se corrige para dar el valor deseado por adición de HCl 1N o NaOH 1N.

Solución de plasmita

Se disuelve una unidad (1 U.I.) de plasmina humana en 4 ml de tampón TRIS-HCl a 0°C. Manipulándola siempre en hielo, la solución se subdivide después en alícuotas de 200 µl que se conservan a -20°C en tubos de ensayo de plástico de 10 ml.

Solución de sustrato cromogénico S-2251

Se disuelven 25 mg de S-2251 en 15,15 ml de agua destilada y se conservan a +4/+8°C.

Soluciones de defibrotida patrón

Preparación de las soluciones patrón

• Concentraciones (finales) de 0,1 a 100 µg/ml

Se disuelven 60 mg de defibrotida en 3 ml de tampón TRIS-HCl y se diluyen

1:15 con la solución de tampón TRIS-HCl. La solución obtenida de este modo, que tiene una concentración de 1,333 mg/ml, se somete a diluciones 1:2 sucesivas para dar soluciones de defibrotida que tengan una concentración de 666 µg/ml, 333 µg/ml y 166 µg/ml. Esta ultima solución, que se usa como solución madre, se diluye adicionalmente para obtener soluciones que tienen concentraciones de 83,33 µg/ml, 41,67 µg/ml, 33,33 µg/ml, 25 µg/ml, 16,66 µg/ml, 8,33 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,66 µg/ml, 0,83 µg/ml, 0,5 µg/ml y, finalmente, 0,16 µg/ml.

• Concentraciones (finales) de 0,5 a 8 µg/ml

Se disuelven 60 mg de defibrotida en 3 ml de tampón TRIS-HCl y se diluyen 1:1500 con la solución de tampón TRIS-HCl. La solución obtenida de este modo, que tiene una concentración de 13,33 µg/ml, se somete a 1:2 diluciones sucesivas para dar soluciones de defibrotida que tienen una concentración de 6,66 µg/ml, 3,33 µg/ml, 1,66 µg/ml y 0,83 µg/ml, respectivamente.

Procedimiento

Se toman 150 µl de cada una de las soluciones de defibrotida patrón descritas anteriormente y se introducen en los pocillos de las microplacas.

Después se prepara la solución de plasmina rápidamente añadiendo, a 0ºC, 3,8 ml de tampón TRIS-HCl al tubo de ensayo que contiene 0,2 ml de solución de plasmina humana. La totalidad se agita suavemente hasta que se produzca la disolución, y se toman 50 µl y se introducen en los pocillos de la microplaca, seguido de 50 µl de S-2251 para cada pocillo.

La microplaca, colocada en el lector MRX TCII ajustado a 37ºC, se agita durante aproximadamente 10 segundos; las lecturas de absorbancia se realizan a 405 nm, al tiempo inicial t0 y, posteriormente, cada dos minutos en el intervalo de 10 a 20 minutos, de acuerdo con el programa de cinética enzimática.

Los datos experimentales medidos para concentraciones de defibrotida de 0,1 a 100 µg/ml se procesan después (programas Excel y Sigma Plot) y se representan en una gráfica (líneas de regresión) como se muestra a modo de ejemplo en las Figuras 1 y 2 siguientes.

Los valores de los coeficientes angulares b (pendiente) de las líneas rectas correspondientes al patrón y a la muestra de ensayo de defibrotida (Figura 1) se representan con respecto a las concentraciones de defibrotida (escala logarítmica) (Figura 2).

Como puede observarse a partir de la grafica, se obtiene una respuesta lineal que permite que se identifique una línea recta en la parte central de la curva. En ese intervalo de linealidad, la potencia de la muestra de defibrotida desconocida se determina en comparación con la patrón, de acuerdo con la metodología de

5 determinación biológica de líneas paralelas mencionada anteriormente y descrita por Finney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2ª ed. Ch. Griffin, Londres. Para que esta metodología sea aplicable, es importante que exista, además de linealidad, paralelismo entre las líneas rectas en relación con el patrón y, respectivamente, con la defibrotida a ensayar.

10 El ensayo para determinar la actividad biológica de una muestra de defibrotida desconocida en comparación con defibrotida patrón se realiza preferiblemente usando concentraciones que dan origen a la parte rectilínea de la sigmoide determinada anteriormente. En particular, se prefieren concentraciones de

15 defibrotida patrón y desconocida en el intervalo de 0,5 a 8 µg/ml.

La disposición en los pocillos de la placa de las repeticiones de las diversas concentraciones de defibrotida para el patrón y para la muestra bajo examen se proporciona a continuación en la presente memoria.

20

Defibrotida patrón: Muestra de ensayo

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: - - - - - - - - - - - -

B: - 0,5 8,0 4,0 2,0 1,0 1,0 2,0 4,0 8,0 0,5 -

C: - 1,0 0,5 8,0 4,0 2,0 2,0 4,0 8,0 0,5 1,0 -

D: - 2,0 1,0 0,5 8,0 4,0 4,0 8,0 0,5 1,0 2,0 -

E: - 4,0 2,0 1,0 0,5 8,0 8,0 0,5 1,0 2,0 4,0 -

F: - 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 -

G: - - - - - - - - - - - -

H: - - - - - - - - - - - -

Las soluciones de defibrotida patrón se ponen en las columnas 2-6, mientras que las muestras de defibrotida a determinar se ponen en las columnas 7-11 a las concentraciones indicadas. En la segunda placa, las posiciones de las muestras se

25 invierten preferiblemente. Las columnas y filas externas de la microplaca no se usan para el proceso de determinación, pero se rellenan con agua para asegurar una homogeneidad de temperatura máxima en todo el sistema.

La microplaca, colocada en el lector MRX TCII ajustado a 37ºC, se agita

5 durante aproximadamente 10 segundos; las lecturas de absorbancia se toman a 405 nm, al tiempo inicial t0 y, posteriormente, cada 5 minutos durante un periodo del minuto 20 al minuto 50, de acuerdo con el programa de cinética enzimática.

Los valores de absorbancia medidos se procesan después (programas 10 Excel y Sigma Plot), se introducen en tablas y se representan en una grafica (líneas de regresión).

Después, era posible calcular la relación de potencia y determinar la actividad de la muestra desconocida de defibrotida en comparación con la patrón 15 usando el mismo sistema de cálculo que el descrito anteriormente.

A modo de ejemplo, se proporcionan a continuación en la presente memoria las Tablas (1, 2 y 3) y las gráficas (Figuras 3, 4 y 5) en relación con muestras de defibrotida ensayadas a una concentración de 0,5 µg/ml, 2,0 µg/ml y 8,0 µg/ml,

20 respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible y b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos, en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula

A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en el que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado porque comprende las fases de:

a’) determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática, para cada muestra de defibrotida, del tipo tanto patrón como de ensayo; b’) correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes; c’) obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida.
2.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la plasmina es una plasmina de mamífero, preferiblemente plasmina humana.
3.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto medible X se selecciona de para-nitroanilina y 2-naftilamina.
4.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato para la plasmina es H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina.
5.

Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la plasmina tiene una concentración de 0,0064 a 0,050 U.I./ml y el sustrato para la plasmina tiene una

concentración de 2,5 a 3,5 mM.
6.

Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la concentración de

plasmina es de 0,0125 U.I./ml y la concentración del sustrato para la plasmina es 3 5 mM.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto medible X se mide por espectrofotometría.

10 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de reacción es una solución acuosa tamponada a un pH de 7 a 8, preferiblemente a pH 7,4.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura del 15 sistema se mantiene a de 35 a 39ºC, preferiblemente a 37ºC.