RU2004121962A - Способ определения биологической активности дефибротида - Google Patents

Claims (17)

1. Способ определения биологической активности дефибротида, предусматривающий стадии

a) приведения в контакт дефибротида, плазмина и субстрата, специфичного для плазмина, который за счет реакции с плазмином обеспечивает измеряемый продукт, и

b) измерения количества образовавшегося продукта в последовательных временных точках.

2. Способ по п.1, в котором плазмин является плазмином млекопитающего, предпочтительно плазмином человека.

3. Способ по п.1, в котором субстратом, специфичным для плазмина, является соединение формулы

А₁-А₂-А₃-Х,

в которой А₁ и А₂ являются неполярными аминокислотами, А₃ является лизином или аргинином и Х является измеряемым продуктом.

4. Способ по п.3, в котором измеряемый продукт Х выбран из пара-нитроанилина и 2-нафтиламина.

5. Способ по п.3, в котором субстратом для плазмина является Н-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилин.

6. Способ по п.1, в котором плазмин имеет концентрацию от 0,0064 до 0,050 М.Е./мл, а субстрат для плазмина имеет концентрацию от 2,6 до 3,5 мМ.

7. Способ по п.6, в котором концентрация плазмина равна 0,0125 М.Е./мл, а концентрация субстрата для плазмина равна 3 мМ.

8. Способ по п.1, в котором измеряемый продукт Х измеряют при помощи спектрофотометрии.

9. Способ по п.1, в котором реакционной средой является водный раствор, забуференный до рН от 7 до 8, предпочтительно до рН 7,4.

10. Способ по п.1, в котором температуру этой системы поддерживают при 35-39°С, предпочтительно при 37°С.

11. Способ по п.1, в котором концентрация субстрата для плазмина равна от 0,3 до 4 мМ, предпочтительно от 2,5 до 3,5 мМ, более предпочтительно 3 мМ.

12. Способ по п.1, предусматривающий стадии

а) определения скорости высвобождения измеряемого продукта Х в ходе ферментативной реакции для каждого образца дефибротида как стандарта, так и тестируемого,

b) установления корреляции, математически и/или графически, вышеуказанных скоростей высвобождения с соответствующими концентрациями дефибротида,

c) получения биологических активностей анализируемых образцов дефибротида.

13. Набор для определения биологической активности дефибротида способом по любому из предыдущих пунктов, содержащий, по меньшей мере

a) измеренное количество субстрата для плазмина и

b) измеренное количество плазмина,

причем указанный набор содержит 20-30 мг субстрата, специфичного для плазмина, на единицу плазмина.

14. Набор по п.13, в котором субстратом для плазмина является H-D-Val-Leu-Lys-pNa, а плазмином является плазмин человека.

15. Набор по п.13, который содержит 25 мг специфичного субстрата на единицу плазмина.

16. Дефибротид, характеризующийся тем, что при подвергании способу по любому из пп.1-12 при концентрациях 0,5, 2,0 и 8,0 мкг/мл он обнаруживает кинетику высвобождения пара-нитроанилина, как показано на фигурах 3,4 и 5 соответственно, причем указанную кинетику высвобождения определяют при следующих экспериментальных условиях:

концентрация плазмина человека 0,0125 М.Е./мл;

субстрат Н-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилин;

концентрация субстрата 3 мМ;

буфер гидрохлорид трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4;

температура реакции 37°С;

спектрофотометрическая длина волны 405 нм.

17. Дефибротид, характеризующийся тем, что при подвергании способу по любому из пп.1-12 при следующих экспериментальных условиях:

концентрация плазмина человека 0,0125 М.Е./мл;

субстрат Н-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилин;

концентрация субстрата 3 мМ;

буфер гидрохлорид трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4;

температура реакции 37°С;

спектрофотометрическая длина волны 405 нм,

он дает кинетику высвобождения пара-нитроанилина (pNA) в соответствии с уравнением

pNA (мкМ/мин)=а+b log X,

где а=0,6908±0,0291.

b=0,31490±0,0437.

X=концентрация дефибротида (мкг/мл).