CN102695805B - 用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂盒及应用 - Google Patents
用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂盒及应用。该方法包括分别测定硒啉类化合物处理样品前后样品中的巯基含量，通过样品处理前后的巯基含量之差，计算样品的硫氧还蛋白还原酶活性。另外，本发明还公开了一种体内抗疾病水平的评价方法，该方法包括测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性，并计算氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的步骤。
Description
本申请依赖并要求2009年11月03日提交的中国专利申请200910207455.X的优先权，在此通过参考将其全部内容并入本文。
技术领域：
本发明属于酶活性检测领域，具体涉及一种用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂及应用。
背景技术：
我国每年大约有200万人患癌，150万人死于癌症，而且还在不断的增加，并逐渐呈年轻化趋势。癌症每年给我国造成的直接经济损失逾千亿元(摘自北京晨报2007/03/31)。据卫生部2007年报告，至2006年我国因肿瘤死亡的人数已达180万，较2005年高出30万。肿瘤发生的早期人体没有感觉和症状，所以只有早期体检才能早期发现。但是目前在临床上，80％以上的肿瘤病人是出现症状后才就医治疗，一经确诊即非早期，大多数病人都发生转移，已经失去手术机会；很多经过手术的肿瘤患者，也要采取反复的放、化疗以防止复发和转移。因此，及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物(Tumor marker，TM)作为一项重要指标，在肿瘤早期诊断当中发挥着越来越重要的作用。TM是由肿瘤组织产生，存在于肿瘤组织本身、或分泌至血液或其他体液、或因肿瘤组织刺激由宿主细胞产生的含量明显高于正常参考值的一类物质。TM在肿瘤的治疗监测和预后方面具有一定的应用价值。目前发现的肿瘤标志物已有一百多种，但这些肿瘤标志物主要是肿瘤形成后形成的抗体或蛋白，通过检测这些肿瘤标志物可以在一定程度上检测肿瘤的发生及其相关的异常增生等相关病症，但是这些标志物不能用于在肿瘤或增生发生前来预测机体内的抗肿瘤能力。因此，本领域迫切需要开发新的方法，用于评价肿瘤发病之前机体内的抗疾病能力，以此来预报机体抵抗肿瘤或异常增殖能力的大小。
硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。其中Trx作为一种生长因子，可以被许多细胞产生，也能被淋巴细胞、肝细胞和成纤维细胞以及许多癌细胞分泌。Trx的巯基氧化还原活性在维持细胞生理活性过程中有普遍而且重要的作用。
研究表明在氧胁迫的情况下，淋巴细胞和肿瘤细胞以及一些正常细胞当中的Trx、TrxR能够快速地调节和减缓氧胁迫的压力。在正常情况下，TrxR还原氧化态的Trx。在NADPH存在时，还原态的Trx作为PRDX的电子供体将过氧化氢还原成水。紫外线等产生的过氧化氢诱导TrxR的产生，然而，持久的过氧化氢高水平地诱导产生肿瘤抑制因子p53，反过来负调节TrxR，所以，TrxR活力在过氧化氢较好的控制下。从另一角度来说，TrxR活性越低，表明体内的肿瘤抑制因子p53的水平越高，p53的水平越高，机体就能越容易使肿瘤细胞趋向凋亡，所以对抗肿瘤的能力就越强，因此，TrxR活性的高低在一定程度上反映了体内的抗肿瘤水平。
目前，国际上采用硫代葡萄糖金(Aurothioglucose，参见式a)抑制法测定TrxR活性，其工作原理是：用5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定样品中的总还原能力；用硫代葡萄糖金抑制样品中TrxR的活性后，再用DTNB测定还原能力；计算样品前后两次还原能力的差值来测定样品中TrxR的活性。但是，硫代葡萄糖金缺乏特异性，对样品中的其他巯基物质也可发生封闭作用，不适用于直接测定血液或组织样品中的TrxR活性。例如，Hill KE等(Determination of thioredoxin reductase activity in rat liversupernatant.Anal Biochem.，1997，Nov1；253(1)：123-5)采用硫代葡萄糖金测定大鼠肝匀浆中的TrxR活性时，要先对肝匀浆进行透析处理，以除去其中的小分子巯基物质(如谷胱甘肽)后，再加入硫代葡萄糖金测定其TrxR活性。可见，其他小分子巯基物质(如谷胱甘肽)可干扰硫代葡萄糖金对TrxR的活性测定。另一研究结果表明，硫代葡萄糖金会增加血液中巯基物质与DTNB的反应速率(Hu ML，Dillard CJ，Tappel AL In vivo effects ofaurothioglucose and sodium thioglucose on rat tissue sulfhydryl levels andplasma sulfhydryl reactivity.Agents Actions.1988，Aug；25(1-2)：132-8)。
因此，亟待解决样品中TrxR活性检测时灵敏度低、特异性差的问题。
发明内容：
如上所述，TrxR的过量表达与疾病，特别是肿瘤的发生密切相关，因此，准确、可靠的检测组织中TrxR的含量或活性水平对于预报体内抵抗疾病如肿瘤等的能力极其重要，然而，目前TrxR活性检测方面存在诸多缺点，如需要对样品进行前处理，操作复杂、测定结果不可靠等等。
本发明的目的是提供用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂，所述试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂；和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物。
本发明的另一个目的是提供用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂。
本发明的另一个目的是提供用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法，所述方法包括：
1)利用所述的测定样品中总巯基含量的试剂测定样品中的总巯基含量；
2)利用所述的硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物与样品反应，然后利用1)中的方法测定样品中除硫氧还蛋白还原酶中的巯基之外的其它巯基的含量；
3)用1)中得到的样品中的总巯基含量减去2)中得到的样品中的其它巯基含量，计算得到样品中硫氧还蛋白还原酶的活性。
本发明的另一个目的是用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法，所述方法包括：
1)利用含5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的溶液与样品反应，然后通过紫外光测量样品中的吸光光度值；
2)向所述样品中加入所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，然后利用1)中的方法在相同的条件下测量样品中的吸光光度值；
3)用1)中得到的样品中的吸光光度值减去2)中得到的样品中的吸光光度值，计算得到样品中所述硫氧还蛋白还原酶的活性。
本发明的另一个目的是提供用于评价体内抗疾病水平的方法，所述方法包括：
1)采用上述方法测量样品中的硫氧还蛋白还原酶活性；
2)获得样品中的氧化应激水平；
3)获得所述氧化应激水平与所述硫氧还蛋白还原酶活性的比值；
4)当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为约1以下时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为约1以上至约10以下、并且所述氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值为5至10以上，如6以上、7以上、8以上、9以上或10以上，优选5以上时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为约1以上至约10以下、并且所述氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值为5以下时，体内抗疾病水平低；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为10-20以上，如9以上、10以上、11以上、12以上或15以上，但优选10以上时，体内抗疾病水平低。
另外，本发明还提供上述试剂在制备评价体内抗疾病水平的药品中的应用。
利用本发明的试剂或试剂盒可以在不对样品进行任何前处理的情况下，有效地测定样品中的TrxR活性，并且测量结果比利用硫代葡萄糖金测量的结果更准确、可靠。
研究表明，利用本发明的方法，通过测量样品中的TrxR或OS/TR而建立的以硫氧还蛋白系统的功能评价为主导，抗氧化能力/氧化应激水平为辅的综合评价系统，符合体内疾病发生的特点，结果表示利用本发明的方法评价的结果与临床体检的结果一致性达到80％以上，因此，本发明的方法能够更为准确和灵敏地预测机体内的抗疾病水平。
附图说明
图1乙烷硒啉对谷胱甘肽还原酶的抑制作用。
图2是谷胱甘肽对乙烷硒啉酶抑制作用的影响。
具体实施方式：
本发明采用TrxR的特异性抑制剂抑制TrxR活性，通过背景扣除法测定生物样品中的TrxR活性，来测定样品中TrxR的活性或含量。
本发明人进一步发现通过测定样品中的TrxR活性或含量，并结合样品中的氧化应激(Oxidative Stress，OS)水平与测量的TrxR的活性(TR)的比值，即OS/TR可以评价体内的抗疾病，特别是抗肿瘤水平。具体测定原理为：
5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)能被-SH基团还原，产生2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，而TNB在405-412nm处有强烈的紫外吸收，因此可以通过检测TNB的生成量来反映样品中的-SH含量。
生物样品中有多种成分含有-SH基团，直接用DTNB测量样品中的硫氧还蛋白还原酶会产生非常大的误差。然而，本发明人发现通式1或通式2的化合物，尤其是表1中的有机硒化合物I-XI可作为TrxR的特异性抑制剂特异性地与TrxR中的巯基发生反应，而很难与TrxR之外的巯基发生反应。利用本发明的化合物能够测定复杂体系，包括血液和组织匀浆液样品中的TrxR活性。
另外，考虑到疾病如异常增生发生时在体内产生多种生物、生理等复杂变化，通过测定单一检测指标来评价抗疾病水平的准确性非常有限，为了进一步提高预测定内抗疾病如抗肿瘤水平的可靠性，本发明人首次提出通过计算样品中的氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值，即OS/TR来机体内的抗疾病状况。
本发明中用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂至少含有测定样品中总巯基含量的试剂和上述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，其中所述“硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物”(下文有时称为：抑制剂)是指对硫氧还蛋白还原酶具有高度选择性的化合物，这类化合物能够特异性地与硫氧还蛋白还原酶结合，并抑制其中的巯基活性。优选的硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物为具有下述通式1或通式2所示结构的化合物，研究发现，本发明所使用的通式1或通式2的化合物，尤其是硒啉类化合物I-XI对TrxR具有强效的抑制作用。截至目前为止，该类化合物是报道的唯一具有特异性靶向TrxR的抑制剂，它可以有效地结合在TrxR的SeCys/Cys活性位点而发挥抑制作用，从而高度选择性地抑制TrxR，参见图1。
通式1，
其中：
X0为C或N；
X1为Se；
R1为氢，C1-C6烷基、C3-C7环烷基、
或Rg-OH；其中Ra、Rb、Re、Rf、Rg各自独立地为：C1-C6烷基；Rc，Rd各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基；R2和R3分别独立的选自：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
其中：
X0为C或N；
X1为Se；
R′1为C1-C12的亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚环己烷、亚环戊烷、-(CH2)mSS(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mN(CH3)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)m，m为1-6的整数，n为大于1的整数；
R′2、R′3、R′4和R′5各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
另外，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-XI对TrxR的抑制作用不受体系中其他巯基物质的干扰，具有高选择性。研究表明，即使样品体系中存在高浓度的其他巯基物质时，如0.5mM还原型谷胱甘肽，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-XI依然对TrxR表现高选择性的强抑制作用，参见图2。
本发明中最优选的硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物为以下化合物I-XI。
本发明中对于“测定样品中总巯基含量的试剂”并不特别限定，只要能够与巯基反应，并指示出样品中的含量即可。优选的“测定样品中总巯基含量的试剂”为5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
对于测定样品中总巯基含量的试剂和硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物可以以任何形式，如固体、粉末，溶液等形式提供。这两种成分可以以组合物的形式提供，但是优选以分别独立存在的形式提供。对于溶液形式的硫氧还蛋白还原酶活性的试剂或硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，并不特别限定它们的浓度，优选配制成1×工作液的浓度，更优选配制成5×工作液的浓度，最优选配制成10×工作液的浓度。
除了上述两种成分，对于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂还可含有其它成分，例如可以含有NADPH，也可含有对于测量硫氧还蛋白还原酶活性所需要的其它成分，如维持酶活性稳定的缓冲成分，包括K2HPO4等KH2PO4、EDTA和/或BSA等。
本发明中的“样品”是指来自生物的任何组织或分离自其中的部分，所述“样品”优选血液、体液、组织匀浆液，并最优选血液，其中所述血液可以是血清、血浆等组分。
本发明中所述的硫氧还蛋白还原酶活性(TR)是指以硫氧还蛋白还原酶中的巯基含量表示的活性，其中样品中的巯基含量通过巯基与DTNB反应产生的TNB在405nm处的吸光度来表示，所述硫氧还蛋白还原酶活性(TR)的计算方法为：其中，ΔA/min＝(ΔA样品-ΔA样品抑制剂)]/7min；ΔA样品＝A样品420s-A样品0s；ΔA样品抑制剂＝A样品抑制剂420s-A样品抑制剂0s，所得硫氧还蛋白还原酶活性，即每分钟每mL样品催化DTNB的纳摩尔量。
本发明中用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂盒中至少含有上述测定样品中总巯基含量的试剂和上述硫氧还蛋白还原酶抑制化合物，除此之外，还可含有其它测定所述酶活性所必需的成分，如缓冲液等。上述各种成分可以以任何形式包装于试剂盒，如分别装有上述不同试剂或化合物的瓶状容器等。另外，试剂盒可以任何形式提供，包括但不限于以方形的包装盒形式。
本发明中所述用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法中，测定样品中的总巯基含量可以采用任何已知的能够指示出总巯基含量的方法，包括测量巯基含量的直接方法，或通过能够表示出巯基含量的指标的间接方法，所述指标包括吸光光度值等。测定样品时，根据不同的样品，选择使用不同量的上述试剂或化合物，对此并不特定限定。
本发明中所述的评价体内抗疾病水平的方法中，所述氧化应激水平可以采用任何已知的测量方法来测定，如硫代巴比妥酸法，也可以利用本发明的测量TrxR的方法中测量的未加硫氧还蛋白还原酶特异性抑制剂时样品中的总ΔA，通过ΔA样品×224来计算。本发明中所述的OS/TR可以通过(ΔA样品×224)/TR来计算。
另外，当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为1附近或1以下时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为1附近或1以上至10附近或10以下、并且所述氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值为5附近或5以上时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为10附近或10以上时，体内抗疾病水平低。
本发明中所述的“疾病”包括但不限于异常增生等疾病，其中此处所述的异常增生包括肿瘤，还包括异常增生相关疾病，如医学良性增生、非典型性增生和恶性增生等，此外，异常增生还可以包括合并异常增生等。
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
血液中硫氧还蛋白还原酶活性的测定方法：
实施例1
1.酶标仪测定条件
在Ascent Software Version2.6控制的模式下，
振荡：时间5s，速度1020rpm；
测量模式：连续；
测量类型：动态；
时间间隔：30s；
测量次数：15；
波长：405nm。
在对实际血液样品进行分析时，每个分析批(Run)建立一条标准曲线，用以计算该分析批样品中待测物的浓度。
2.测定过程
2.1工作液的配制：取1M K2HPO4615ml、1M KH2PO4385ml混匀，调pH至7.0，内加EDTA2924mg、B SA200mg，溶解，4℃保存。
2.2抑制剂工作液(25μl)的配制：将20mM化合物I的储备液用工作液稀释至25μM，4℃避光保存。
2.3事先将酶标仪打开预热，设置其测量参数：先在1020rpm下振荡混匀5s，然后在波长405nm下连续测定吸光度，间隔30s，测量15次，总计时间7min。储存于-20℃的血样置于4℃解冻成液体，4℃储存的工作液和抑制剂工作液放在摇床上混匀。
2.4取96孔板，设置样品孔和抑制剂孔，每孔各设3组平行实验。
2.5样品孔、抑制剂孔各加入工作液60μl、40μl。
2.6抑制剂孔每孔加入20μl抑制剂工作液。
2.7样品孔、抑制剂孔各加入血样20μl。
2.896孔板立即包锡纸避光，于摇床上混匀5s，立即放入37℃中孵育30min。
2.9DTNB工作液和NADPH工作液的配制：按600μl工作液+1mg NADPH、4ml工作液+15.9mg DTNB的比例，避光，溶解，室温下于摇床上摇匀。
2.1037℃孵育结束后，室温下样品孔、抑制孔各加入NADPH工作液20μl，避光，于摇床上混匀5s。
2.11将96孔板放在酶标仪上，用排枪迅速向各孔加入100μlDTNB工作液，在确保没有气泡的前提下，按照上述酶标仪的测定条件开始测量。
实施例2-10
除了将实施例1中的化合物I分别变为表1所示的化合物II-XI以外，以与实施例1相同的方式测定相同的样品，所得结果如表1所示。
*：由于受试者血样有限，不能用11种化合物对同一样血样对进行TrxR活性测定，所以此处选用了体验结果均为健康的受试者的血样，在相同条件下进行TrxR活性测定，TrxR活性小于0，说明体内几乎不存在TrxR活性。
本发明的试剂与硫代葡萄糖金试剂的效果比较：
选择三位临床体检受试者，在相同条件下分别用硫代葡萄糖金抑制法和本发明的抑制性化合物I测定来自上述受试者的血液中的TrxR活性，所得结果如表2所示。
表2本发明的试剂与硫代葡萄糖金试剂的效果比较
从上述结果中可以看出，利用本发明测定的TrxR活性明显低于利用硫代葡萄糖金测定的TrxR活性，TrxR活性与体内异常增生水平相关，数值越高说明异常增生程度越高，身体健康偏离正常的程度可能越高，本发明的抑制剂由于能特异性抑制TrxR，因此其测定的结果会更符合实际，从而更可靠。
用于血液中硫氧还蛋白还原酶活性测定的试剂盒：
本发明的试剂盒(100test)可含有：
1.DTNB粉末49.8mg，避光，室温保存；
2.NADPH粉末4.2mg，避光，-20℃保存；
3.10×工作液(1M磷酸钾缓冲液，PH＝7.4，内含73.1mgEDTA，5mg BSA。)2mL，4℃保存；
4.TrxR抑制剂溶液(含有2.5mM选自化合物I-XI之一的抑制剂)，100uL，-20℃保存；
5.阳性对照：大鼠肝脏TrxR，300U/mg Unit，-20℃保存；
6.TNB标准品；
本发明试剂盒的使用方法：
1.取2mL的10×工作液(0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.4)用去离子水定容至20mL(内含73.1mg乙二胺四乙酸(EDTA)，5mg牛血清白蛋白(BSA))，得到1×工作液，室温下使用，可供100孔检测；
2.称取39.6mg DTNB溶解于10mL的1×工作液中，避光室温保存，现用现配；
3.称取4.2mg NADPH溶解于2ml的1×工作液中，避光4℃待用，临用前避光恢复至室温；
4.TrxR抑制剂工作液(25μM)：取10μl抑制剂储备液(2.5mM)，加入1×工作液，稀释至1mL，供50孔检测，室温下使用。
利用本发明试剂盒测定TrxR的操作步骤
1.取96孔板，板底洁净透明，在405nm处无干扰吸收；
2.样品孔加入：20μl样品+60μl0.1M磷酸钾缓冲液；
3.样品+抑制剂孔加入：20μl样品+20μl抑制剂工作液+40μl0.1M的1×工作液(0.05M磷酸钾缓冲液)；
4.将加样后的96孔板置于37℃，避光孵育1h；
5.向各个样品孔加入20μl的NADPH工作液后，再加入100μl的DTNB工作液，室温下，波长405nm处，立即记录初始吸光度值(A0s)并连续测定420s吸光度值(A420s)。各孔加样方式见表3。
表3加样方式
※根据TrxR活性决定，可不设阳性对照组。
另外，试剂盒还可以制备成200Test或50Test的包装。试剂盒中10×缓冲液应为无色透明的液体，放置时间长后容许少量可见的蛋白沉淀，为牛血清白蛋白的盐析沉淀，超声后可以溶解，不影响测定。TrxR活性抑制剂室温下为淡黄、类黄或无色透明澄清的溶液，低于DMSO熔点的温度储存时为固体，融化后使用。DTNB为干燥的浅黄色粉末，无潮湿结块，粉末颗粒均匀。NADPHNa4为干燥的白色或类白色无定形粉末。
机体内抗疾病水平的评价
采用本发明的试剂盒(含有化合物I)测定40例临床体检受试者的血液中硫氧还蛋白还原酶的活性，并根据上述计算式计算得到TR值与OS/TR的比值。通过将测得的数值与体检结果比较(参见表4)，发现：
A：当TR小于1左右时，体检状况良好，体内一般具有较高的抗肿瘤能力；
B：当TR为1左右至10左右，并且OS/TR大于5左右时，体检状况一般，但体检中未发现肿瘤，体内也具有较高的抗肿瘤能力；
C：当TR为1左右至10左右，并且OS/TR小于5左右时，或者当TR大于10左右时，体检结果中一般出现了肿瘤或出现早期症状，体内具有较低的抗肿瘤能力。
表4利用TR与OS/TR评价机体内抗肿瘤水平
另外，本发明人还比较了本发明的评价方法与临床诊断结果的一致性，具体为：从300例受试者中筛选出绝对临床正常(44例)，绝对临床评价异常增生(17例)和临床已诊断为肿瘤(20例)的三组人群，利用本发明的试剂盒分别评价了三组人群中的体内抗肿瘤水平，具体结果参见表5。
表5本评价方法与临床诊断结果的一致性比较结果
从上述结果可以明显看出，利用本发明的试剂盒测定的TR值和OS/TR比值与体检状况存在明显的一致性，其一致性均达到80％以上。因此，TR和OS/TR的比值可以作为体内抗肿瘤水平的一项指标，能够有效的评价机体内的抗肿瘤水平。
工业实用性
如上所述，根据本发明的TR测定方法及试剂盒，能够以优异的灵敏度检测样品，特别是血液等复杂样品中的TR，对于测定体内的抗肿瘤水平非常有用，另外本发明的试剂或方法还可以用于体内肿瘤发生风险的评估，以及肿瘤预后等医疗领域。
Claims (7)
1.测定试剂在制备用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂中的用途，所述测定试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂，和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物；
所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自由通式2表示的化合物、式V的化合物、式VI的化合物、式IX的化合物和式X的化合物组成的组，
其中：
X0为C；
X1为Se；
R'1为亚苯基或亚联苯基；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢或C1-C6烷氧基；
所述样品为血液、体液或组织匀浆液。
2.测定试剂在制备用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂盒中的用途，所述测定试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂，和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物；
所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自由通式2表示的化合物、式V的化合物、式VI的化合物、式IX的化合物和式X的化合物组成的组，
其中：
X0为C；
X1为Se；
R'1为亚苯基或亚联苯基；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢或C1-C6烷氧基；
所述样品为血液、体液或组织匀浆液。
3.测定试剂在制备评价体内异常增生疾病的药品或检测剂中的应用，所述测定试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂，和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物；
所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自由通式2表示的化合物、式V的化合物、式VI的化合物、式IX的化合物和式X的化合物组成的组，
其中：
X0为C；
X1为Se；
R'1为亚苯基或亚联苯基；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢或C1-C6烷氧基；
所述样品为血液、体液或组织匀浆液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中，测定样品中总巯基含量的试剂包括5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。
5.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物为
6.测定试剂在制备评价体内异常增生疾病的药品或检测剂中的应用，所述测定试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂，和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物；
所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自由通式2表示的化合物组成的组，
其中：
X0为C；
X1为Se；
R'1为C1-C12的亚烷基；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢或C1-C6烷氧基；且
所述样品为血液、体液或组织匀浆液。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物为
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