CN111748604A - 一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种快速、简便、经济地检测纯硫氧还蛋白还原酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶活性的新方法。利用水溶性的硫氧还蛋白还原酶底物(TRS)分子4‑氨基‑1,2‑二硫戊环类化合物,代替经典的硫氧还蛋白联用胰岛素终点法检测硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性,本发明所述的TRS检测TrxR活性的方法,具有很好的创新性性(首次发展的具有专一选择性的TRS分子;首次将其应用于TrxR活性的检测)、经济环保性(降低原有方法的成本),在体外纯TrxR、细胞内TrxR和体内组织TrxR活性检测方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学医药领域,具体而言,涉及一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法。
背景技术
硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)、硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)和NADPH组成。在生物体内TrxR从NADPH获取电子,使其内源性底物Trx处于还原状态,进而保证下游一系列氧化还原信号通路的正常运行(Trends PharmacolSci,2017,38:794-808.)。因此,Trx系统在调节生物体内氧化还原信号通路和维持正常的氧化还原水平中扮演非常重要的角色。
1977年人类首次从牛的组织中分离纯化出TrxR,并且发现哺乳动物的TrxR可以催化机体的许多生化反应(J Biol Chem,1977,252(13):4600-6.)。Stadtman等人于1996年从人的T-细胞及肺癌细胞中分离纯化出TrxR,并探知它是一种含硒的蛋白质(Proc NatlAcad Sci U S A,1996,93(3):1006-11.)。从此科学家对硫氧还原蛋白系统的研究也越来越热并取得了一定成果。比如研究发现Trx系统与多种疾病如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和老年性高血压等息息相关(Trends Pharmacol Sci,2017,38:794-808.)。TrxR和Trx的活性极有可能作为检测这些疾病的生物标志,所以发展检测TrxR活性的工具分子和方法很有临床意义。
经典的检测生物体内TrxR活性的方法是Trx联用的胰岛素(Insulin)终点法,该方法主要原理是,在待测样品中,通过额外引用过量的NADPH、Trx和胰岛素,使得TrxR还原Trx这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将Trx还原后,Trx进一步特异性将胰岛素还原生成巯基。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反应中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性(Methods Enzymol,1999,300,226-239.)。尽管该方法在研究TrxR生物功能和靶向TrxR的药物研发中得到广泛的应用,但是在该方法中所使用的Trx和胰岛素价格昂贵,在一定程度上限制了这一方法的应用。因此发展一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性的方法对TrxR的生物功能探究和靶向硫氧还蛋白系统的药物研发至关重要。
发明内容
为解决上述问题,本发明所述的一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性方法的设计思路为:设计一种能够快速且专一的识别TrxR的硫氧还蛋白还原酶底物(ThioredoxinReductase Substrate,TRS,图1)分子,利用TrxR结构中暴露于蛋白表面的硒半胱氨酸(Sec)将TRS中二硫键还原成巯基,最后利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定巯基,以反映体系中的TrxR活性。
为解决上述问题,本发明所述的一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,具体步骤如下:
(1)基于以上设计思路,设计能够识别TrxR的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。
(5)TRS分子检测TrxR活性方法的应用。
本发明方法与现有技术比较:
现有技术方法(图2A):经典的检测生物体内TrxR活性的方法是Trx联用的胰岛素(Insulin)终点法,该方法主要原理是,在待测样品中,通过额外引用过量的NADPH、Trx和胰岛素,使得TrxR还原Trx这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将Trx还原后,Trx进一步特异性将Insulin还原生成巯基。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反应中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性。该方法中所使用的Trx和胰岛素价格昂贵,在一定程度上限制了这一方法的应用。
本发明方法(图2B):我们利用水溶性的TRS分子4-氨基-1,2-二硫戊环类化合物,代替经典的Trx联用胰岛素终点法检测TrxR活性,该方法中不涉及Trx和Insulin,在很大程度上降低了检测成本。
本发明所述的TRS检测TrxR活性的方法,具有很好的创新性性(首次发展的具有专一选择性的TRS分子;首次将其应用于TrxR活性的检测)、经济环保性(降低原有方法的成本),在体外纯TrxR、细胞内TrxR和体内组织TrxR活性检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。但不应将此理解为对本发明方法的限制。
图1为TRS结构通式,R可以代表-CH3,-NH2,-COOH,-OH,CH2OH等给电子或者吸电子基团,我们所选取的检测TrxR活性的分子对TrxR具有很好的选择性。
图2现有检测TrxR方法(图2A)和本发明检测TrxR方法(图2B)的原理图。
图3为TRS对TrxR选择性的考察,本发明所呈现的TRS能很好地结合TrxR结构中498位的硒半胱氨酸(Sec)残基(图3A),当TrxR结构中498位的硒半胱氨酸残基被突为半胱氨酸(U498C TrxR)后,结合能力丢失(图3A);与谷胱甘肽(GSH)结合也很差(图3B),本发明所呈现的方法对TrxR具有很好地选择性。
图4本发明所呈现的方法对已知的TrxR抑制剂金诺芬(AF)抑制细胞内TrxR的活性检测具有很好的浓度依赖关系,说明该方法能很好地应用于TrxR活性的检测(图4A);该方法对敲低TrxR表达的HeLa细胞中的TrxR活性也具有很好检测,说明该方法能很好地应用于TrxR活性的检测(图4B)。
具体实施方式
实施例1:一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)设计并合成能够识别TrxR的TRS类分子。
二硫化合物是一类具有多种生物功能的氧化还原活性化合物。研究证明许多二硫化合物都是TrxR很好的底物。基于此本发明设计合成了一系列环状二硫化合物。
实例1的操作方法:
化合物1:在250mL圆底烧瓶中加入37%的甲醛溶液(81mL)和K2CO3(1g,7.2mmol),然后逐滴加入丙二酸二乙酯(80g,0.5mol),40至50分钟内加完。室温搅拌1h后加入160mL饱和硫酸铵溶液,用乙醚萃取,分离有机相,有机相用无水硫酸镁干燥1h,过滤,减压旋干有机溶剂后即得化合物1,无需进一步纯化,直接投入下一步反应。
化合物2:将化合物1-1(50g,0.23mol)和48%的氢溴酸(104mL,0.91mol)置于250mL圆底烧瓶中,于120℃加热回流14h。原料全部反应后,减压除去过量的氢溴酸,得到淡黄色固体。将此固体溶于50mL二氯甲烷中,水洗几遍,分离有机相,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,减压旋干即得化合物2,为白色固体(35.2g,产率94%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97(br,1H),6.18(s,1H),6.06(s,1H),4.27(s,2H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.0,138.2,129.2,30.8;ESI-MS(m/z):[M-H]-165.1.
化合物3:冰浴下,将化合物2(4.95g,30.0mmol)分散到100mL水中,然后分批加入20mL溶有碳酸钠(5.50g,52.0mmol)的水溶液。在此溶液中加入硫代乙酸(2.20mL,30.5mmol),将反应体系在冰浴中继续搅拌15min,然后用浓盐酸将反应溶液调到pH=1,用乙酸乙酯萃取(2×50mL)。分离有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,旋干溶剂得到化合物1-3(1.9g,产率40%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.94(br,1H),6.03(s,1H),3.77(s,2H),2.34(s,2H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ194.9,1714,135.6,130.5,30.3,29.4;ESI-MS(m/z):[M+Na]+182.9.
化合物4:在上一步得到的化合物3中加入硫代乙酸(3.25mL,45.0mmol),室温搅拌15h后将反应体系旋干即得化合物4,无需纯化直接投入下一步反应。
化合物5:此化合物根据已有文献合成[19],即将化合物4加入到200mL 10%的KHCO3水溶液中,氩气保护下室温搅拌5h。于冰浴下,用浓盐酸将反应体系调至pH=1,再用乙酸乙酯萃取(100mL×2),分离有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,旋干得到的粗产物用石油醚溶解后置于-80℃重结晶,过滤,得到白色透明的固体,即为化合物5。
化合物6:将化合物5(304mg,2mmol)溶于150mL二氯甲烷中。加入碳酸氢钠(504mg,6mmol)。然后分批加入碘单质(1.532g,6mmol)。混合溶液在室温下继续搅拌15min后,用饱和硫代硫酸钠溶液除去过量的碘,直至反应溶液变成无色。然后将反应体系调至pH=1,用二氯甲烷萃取(3×100mL)。合并有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,旋干后得到粗产物用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇/乙酸=100/2/1)得到黄色固体6(105mg,产率89%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.54-3.47(m,3H),3.38-3.31(m,2H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.4,50.7,41.5;ESI-MS(m/z):[M-H]-149.3.
化合物7:此化合物根据已有文献合成[22]。将硫单质(9.6g,300mmol)溶于45mL(900mmol)水合肼和5.5g(90mmol)乙醇胺的混合溶液中,加热至65℃。然后冷却至室温,逐滴加入19.35g(150mmol)1,3-二氯丙醇,室温搅拌2.5h。过滤得到聚合物,产物分别用水、甲醇、乙酸乙酯洗涤,干燥后直接投入下一步反应。将上一步得到的聚合物10g(82mmol)溶于102mL(2.05mol)水合肼和23g(0.41mol)氢氧化钾的混合溶液中。反应体系加热至80℃,在此温度下搅拌2.5h。冷却至室温,冰浴下,加入240mL预冷的浓盐酸,然后用乙酸乙酯萃取(100mL×3),分离有机相,无水硫酸钠干燥,旋干,粗产物用柱层析色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯=4/1)。得到化合物7(12.4g,产率86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.75-3.67(m,1H),3.50(d,J=5.0Hz,1H),2.81-2.67(m,4H),1.47(m,2H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ72.9,29.8;EI-MS m/z(%):124(M+,16),122(53),77(26),59(42),44(100).
化合物8的合成:化合物7(372mg,3mmol)溶于150mL二氯甲烷中,加入碳酸氢钠(756mg,9mmol)。然后分批加入碘单质(2.286g,9mmol)。混合溶液与室温下继续搅拌15min。用饱和的硫代硫酸钠溶液除去过量的碘,直至反应溶液变成淡黄色。分离二氯甲烷有机相,用无水硫酸钠干燥后得到化合物8的DCM溶液。与硫辛酸一样[23],化合物8非常容易聚合,因此一般储存于DCM溶液中,最好现用现做。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.28(d,J=4.5Hz,1H),4.80-4.74(m,1H),3.17(dd,J1=11.6Hz,J2=5.0Hz,2H),2.98(dd,J1=11.6Hz,J2=3.2Hz,2H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ75.47,46.24.EI-MS m/z(%):122(M+,100),106(13),78(40),58(39),47(38).
化合物9:室温下,将1g,11mmol的丝氨醇加入到40mL乙醇中,冰浴下缓慢滴加含有2.4g,11mmol的Boc2O的10mL乙醇溶液,加完后移至室温,继续搅拌4h,旋干乙醇得到白色固体,无需提纯直接投入下一步反应(1.9g,产率90%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.30(d,J=6.8Hz,1H),3.84-3.68(m,5H),2.73(s,2H),1.45(s,9H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ156.4,80.0,63.5,53.0,28.4;ESI-MS(m/z):[M+Na]+214.1.
化合物10:将1.91g化合物9加入到50mL无水二氯甲烷中,加入4.18mL三乙胺。冰浴下,缓慢滴加1.76mL甲烷磺酰氯。加完后移至室温,搅拌3h。加入蒸馏水猝灭反应,分离有机相,水洗两次,无水硫酸钠干燥,过滤,旋干即得白色固体10(3.3g,产率94%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.12(d,J=8.4Hz,1H),4.37-4.24(m,5H),3.08(s,6H),1.45(s,9H);13CNMR(100MHz,CDCl3)δ154.8,80.7,66.9,48.4,37.4,28.2;ESI-MS(m/z):[M+Na]+370.1.
化合物11:将化合物10(591mg)加入到11mL重蒸DMF中,加入773mg硫代乙酸钾,室温搅拌过夜。TLC监测原料消失后,倒入到饱和食盐水中,乙酸乙酯萃取,分离有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,旋干,用柱层析色谱分离(石油醚/乙酸乙酯=4/1)得到化合物11(528mg,产率86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.79(s,1H),3.86(s,1H),3.06(s,4H),2.33(s,6H),1.40(s,9H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ195.4,155.2,79.6,50.8,32.5,30.5,28.2;ESI-MS(m/z):[M+Na]+330.1.
化合物12:将1.26g化合物3-3加入到20mL乙醇中,加入10mL氢氧化钠水溶液(1M),室温搅拌1h,然后倒入100mL二氯甲烷中,逐滴加入0.1M碘的水溶液直至反应体系变成红色室温搅拌2h,加入饱和硫代硫酸钠水溶液直至溶液变成无色。分离有机相,水洗三次,无水硫酸钠干燥,柱层析色谱分离(石油醚/乙酸乙酯=10/1)提纯得到化合物12(336mg,产率76%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.07(s,1H),4.95(m,1H),3.22(dd,J1=11.2Hz,J2=4.8Hz,4H),3.09(d,J=11.2Hz,2H),1.44(s,9H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ154.7,80.0,56.4,44.9,28.3;ESI-MS(m/z):[M+Na]+224.0.
化合物13:将600mg化合物12加入到10mL盐酸饱和的乙酸乙酯溶液中,室温搅拌过夜,旋干溶剂得到淡黄色固体,得到化合物13。1H NMR(400MHz,D2O)δ4.54-4.50(m,1H),3.42-3.38(m,2H),3.32-3.28(m,2H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ57.2,43.6;ESI-MS(m/z):[M+H]+122.1.
实施例2:一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)设计能够识别TrxR的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
考察设计的分子对TrxR的响应,以选择专一识别TrxR的TRS。
实例2的操作方法:
TrxR与环状二硫化合物的作用直接通过NADPH的消耗来进行测定。NADPH的最大吸收波长为340nm,本发明测定了在反应10min内由于NADPH的消耗导致的A340处吸光度的变化。并计算出在反应最开始的3min内A340衰减的速率,以比较所设计的化合物对TrxR的选择性,得到目标TRS。
实施例3:一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)设计能够识别TrxR的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
考察设计的分子对谷胱甘肽(GSH)和TrxR的响应,以选择专一识别TrxR的TRS。在比较1,2-二硫戊环与TrxR的响应速率时,本发明发现带有氨基取代基的TRS反应速率明显快于带有羧基取代基的TRS,最终选择本方法适用的TRS,以建立方法。
实例3的操作方法:
采用NADPH联用谷胱甘肽还原酶(GR)的酶学法测定GSH活性。
TrxR与环状二硫化合物的作用直接通过NADPH的消耗来进行测定。NADPH的最大吸收波长为340nm,本发明测定了在反应10min内由于NADPH的消耗导致的A340处吸光度的变化。并计算出在反应最开始的3min内A340衰减的速率,以比较所设计的化合物对TrxR的选择性,得到目标TRS。
实施例4:一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)设计能够识别TrxR的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。
我们利用水溶性的TRS分子4-氨基-1,2-二硫戊环类化合物,在待测样品中,通过额外引用过量的NADPH、TRS,使得TrxR还原TRS这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将TRS还原后生成巯基类中间体。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反映中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性。
实例4的操作方法:
于96孔板中,依次加入20μg待测样品、2.6mM的EDTA(由于金属离子能够抑制TrxR的活性,加入EDTA可以排除环境中可能存在的金属离子的干扰)、660μM的NADPH和500μM的TRS(以不加TRS作为空白对照),混匀后放置于37℃孵育30min,然后每孔加入200μL含有1mM的DTNB的6M盐酸胍溶液(pH=8.0),孵育5min后测定412nm处的吸光度值,然后分别扣去背景值后以不加药物处理组的数值为100%计算实验组TrxR的相对活性。
实施例5:一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)设计能够识别TrxR的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
(4)终点TRS还原法检测TrxR活性的方法建立。
(5)终点TRS还原法检测TrxR活性的应用。
终点TRS还原法可以广泛应用于纯TrxR、细胞裂解液和体内组织裂解液中TrxR活性的检测。
实例5的操作方法:
以细胞裂解液为待测样品,1-3×106细胞(根据细胞种类)种于100mm培养皿中过夜贴壁,加指定浓度的药物,作用指定时间,收集细胞且用PBS洗2次,用RIPA buffer在冰上裂解细胞,Bradford法定量细胞内蛋白浓度,稀释统一蛋白浓度(最好每次操作都稀释至同一浓度,如2μg/μl)。于96孔板中,依次加入20μg待测细胞裂解液、2.6mM的EDTA(由于金属离子能够抑制TrxR的活性,加入EDTA可以排除环境中可能存在的金属离子的干扰)、660μM的NADPH和500μM的TRS(以不加TRS作为空白对照),混匀后放置于37℃孵育30min,然后每孔加入200μL含有1mM的DTNB的6M盐酸胍溶液(pH=8.0),孵育5min后测定412nm处的吸光度值,然后分别扣去背景值后以不加药物处理组的数值为100%计算实验组TrxR的相对活性。
Claims (9)
1.一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于快速、简便、经济地检测纯酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶的活性。
2.根据权利要求1所述,一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)基于以上设计思路,设计能够识别硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。
(5)TRS分子检测TrxR活性方法的应用。
3.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的能够识别TrxR的TRS类分子。
4.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的TRS类分子对TrxR响应考察,以选择理想的TRS。
5.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的TRS类分子对TrxR专一性考察,以选择理想的TRS。
6.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于:所述步骤(4)中的所选TRS分子检测TrxR活性的方法建立。
7.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法,其特征在于:所述步骤(5)中的TRS分子检测TrxR活性方法的应用。
8.根据权利要求1所述的TRS终点法设计思路所产生的新方法。
9.根据权利要求1所述的TRS终点法所产生的新用途。
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CN202010645541.5A CN111748604A (zh) | 2020-07-06 | 2020-07-06 | 一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法 |
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Citations (3)
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US7671211B1 (en) * | 1999-03-31 | 2010-03-02 | Arne Holmgren | Substrates for thioredoxin reductase |
CN102051406A (zh) * | 2009-11-03 | 2011-05-11 | 凯熙医药(武汉)有限公司 | 一种用于预报人体发生异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法 |
CN114886891A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-12 | 兰州大学 | 一类新结构类型的硫氧还蛋白还原酶抑制剂及用途 |
-
2020
- 2020-07-06 CN CN202010645541.5A patent/CN111748604A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Title |
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贾慧祎: "基于二硫键还原断裂的特异性识别硫氧还蛋白的荧光探针", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
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