CN108627469B - 一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法，属于酶活性检测领域。包括：配液，配置工作液、抑制剂溶液和混合试剂；加样本，将50uL‑70uL的工作液加入对照组反应杯；将50uL‑70uL抑制剂溶液加入实验组反应杯；向对照组反应杯和实验组反应杯分别加入10uL‑30uL的样本；温育，将对照组反应杯和实验组反应杯放置在预定温度的避光环境下孵育第一预定时间；其中，预定温度为30℃‑40℃；测定，分别向对照组反应杯和实验组反应杯加入100uL‑150uL的混合试剂后，在预定波长时测定吸光度值第二预定时间。本发明的检测方法能够适用于硫氧还蛋白还原酶活性的自动化检测。

Description

一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法

技术领域

本发明属于酶活性检测领域，具体涉及一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法。

背景技术

硫氧还蛋白还原酶(TR)测定项目为国内外首创的临床肿瘤检测项目。该项目可以填补异常增生类疾病诊断缺乏临床检验方法的空白。

TR检测设备能够应用于体检人群的肿瘤早期筛查，住院人群的肿瘤疗效监测，复发预警及健康管理等，具有极大的市场需求和发展潜力。

现有技术《专利ZL201080049877.X：用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂盒及应用》是基于人工分步逐步操作实现，如：手工操作酶标仪、手工加样、手工操作避光、手工放置摇床实现摇匀，手工加样等；其用样本的各种条件也是针对手工操作过程和用量设计。由于人工手工操作包括了人工加样误差大；各种操作非连贯，容易产生中间误差；操作时间长不利于大规模临床检测应用等多种需要改善的问题，有必要研制一种用于自动生化仪的人血硫氧还蛋白还原酶活性检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够节省检测时间和检测步骤的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法。

根据本发明实施例的一个方面，提供了一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法，包括：配液，配置工作液、抑制剂溶液和混合试剂；加样本，将50uL-70uL的工作液加入对照组反应杯；将50uL-70uL抑制剂溶液加入实验组反应杯；向对照组反应杯和实验组反应杯分别加入10uL-30uL的样本；本加样量是根据自动化的协同检测设备最佳工作所需要体积量设计。样本温育，在避光环境下，将对照组反应杯和实验组反应杯放置在30℃-40℃温度下孵育第一预定时间；测定，分别向对照组反应杯和实验组反应杯加入100uL-150uL的混合试剂；在预定波长下，测定第二预定时间段内的吸光度值。

进一步，配置工作液的步骤包括：按照1:1:2:4的比例取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液；将自动化的协同检测设备三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液混合均匀。

进一步，自动化的协同检测设备三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的PH为5.5-7.2，浓度为0.025-0.125mol/L；自动化的协同检测设备吗啉基丙磺酸的浓度为0.25mol/L；自动化的协同检测设备磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系的PH为2.2-8.0，浓度为0.2mol/L；自动化的协同检测设备磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液的PH为4.9-8.2，浓度为1-15mol/L。

进一步，自动化的协同检测设备配置抑制剂溶液的步骤包括：以1:1-1:5的比例混合自动化的协同检测设备工作液和抑制剂，形成自动化的协同检测设备抑制剂溶液；将自动化的协同检测设备抑制剂溶液混合均匀，自动化的协同检测设备抑制剂为硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物。

进一步，自动化的协同检测设备配置混合试剂的步骤包括：以1:4-1:8的比例混合自动化的协同检测设备试剂A和自动化的协同检测设备试剂B，形成自动化的协同检测设备混合试剂；将自动化的协同检测设备混合试剂混合均匀；自动化的协同检测设备A试剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)或取代6,6'-二硝基-3,3'-二硫代苯甲酸；自动化的协同检测设备B试剂为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

进一步，自动化的协同检测设备预定温度为30-40℃。

进一步，自动化的协同检测设备第一预定时间为8-20分钟。

进一步，自动化的协同检测设备第一预定时间为10分钟。

进一步，自动化的协同检测设备预定波长为405nm-450nm。

进一步，自动化的协同检测设备第二预定时间为20-30个周期。

本发明提供的一种人外周血硫氧还蛋白还原酶活性的检测方法，通过将试剂A和试剂B在自动化的协同检测设备上自动取样混合成混合试剂，经协同检测设备自动加入样本中进行混合、搅拌的操作，替代了分别添加试剂A和试剂B做手工重复混合、搅拌的工作，提高了工作效率。该检测方法通过对适用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备的样本/试剂体积的设定，能够符合运行的工作液体选择的方法要求，本发明的方法在上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上使用时，包括加样操作方法、避光操作要求方法、试剂混合的操作要求方法等针对驱动系统的智能指令方法规定。其中的智能指令如协同检测设备运行中每一周期组中周期数以及每一周期时间的规定，针对运行过程要求等都是和实现人外周血TR功能检测方法衔接的检测方法学。本发明的方法是适用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备实现TR酶学检测功能要求的方法，用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法。

附图说明

图1是本发明的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法的流程示意图；

图2是本发明的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法的结构示意图；

图3是本发明的本发明实施例的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法的流程示意图。

图4是本发明的本发明实施例的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法的又一种流程示意图1。

图5是本发明一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法步骤S1的流程图。

图6是本发明一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法步骤S2的流程图。

图7是本发明一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法步骤S3的流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

现有技术中“TR活性检测试剂盒”所采用的检测方法(以下简称初代检测方法)有三个的技术局限，因而无法适用于自动化的协同检测设备：

(1)耗时较长，检测效率较低。初代的检测方法允许同时完成8-12个样本的检测，完成时间约为1.5-2个小时。而硫氧还蛋白酶活性的协同检测设备要求每40-50个样本的检测要在1.5个小时内完成，否则临床样本会因为在仪器中放置时间过长而失效；因此初代检测方法在面对大规模，高通量的TR临床自动化检测中无法适用；

(2)检测步骤繁多。初代检测方法包括7个步骤和动作，这对于检测人员的人工检测并不困难，但对于自动化的协同检测设备来说过于繁琐，因此会显著增加设备的动作时间，降低检测效率；

(3)初代检测方法在操作过程中需要两名检测人员相互配合操作，而自动化的协同检测设备的设计目的是希望单一检测人员即可完整操作仪器，因此两者的需求也并不相符。

在详述本发明实施方案前，需说明的是，本发明中的试剂A为用于检测硫氧还蛋白还原酶活性的试剂，试剂B为用于检测硫氧还蛋白还原酶活性的试剂，工作液通常为缓冲液，主要用于检测硫氧还蛋白还原酶活性的缓冲液。

本发明中的试剂A、试剂B均为已经通过了国家食品药品监督管理局的专家认证和审核获得了医疗器械注册证(证号为鄂食药监械(准)字2013第2401815号及国食药监械(准)字2014第3400264)的《硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒》中的试剂A和试剂B，本发明中的工作液为上述《硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒》中的试剂D，本发明中抑制剂为上述《硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒》中的试剂C。

硫氧还蛋白还原酶(TR)是一种还原型辅酶II(NADPH)依赖的包含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结构域的二聚体硒酶，它和硫氧还蛋白、还原性辅酶II共同构成硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白还原酶在增生异常活跃的细胞中过量表达，该酶有启动细胞异常增生、启动凋亡抑制系统等与形成肿瘤密不可分的生理功能。TR活性与肿瘤的异常增生程度高度相关。因此，对硫氧还蛋白还原酶检测对肿瘤有重要的作用。

图1是本发明的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法的流程示意图。

如图1所示，一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法包括：

步骤S1,配液，配置工作液、抑制剂溶液和混合试剂。

具体的，工作液通常为缓冲液，该工作液并不特别限定其浓度，优选的配制成1X工作液浓度。

配制抑制剂溶液和混合试剂的步骤如下：

配置1.67mg/mL的试剂A；

配置10.29mg/mL的试剂B；

配置工作液；

其中，工作液配置过程为：按照1:1:2:4的比例取试剂三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TrisHCL(0.025-0.125mol/L,PH 5.5-7.2)，吗啉基丙磺酸(0.25mol/L)，磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系0.2mol/L，和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液1-15mol/L；其中，磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系的PH为2.2-8.0；磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液的PH为4.9-8.2；然后将TrisHCL(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液混合均匀。

配置抑制剂溶液；

具体的，以1:1-1:5的比例混合工作液和抑制剂，形成抑制剂溶液；将抑制剂溶液混合均匀；其中抑制剂为硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物。可以为化学单体硒啉类化合物。

其中，工作液和抑制剂混合的比例优选地为1：3的比例,在该比例下混合的工作液与抑制剂，是最经济的比例组合，即能对后续人外周血硫还蛋白还原酶活性检测更为准确，也是最为节约各试剂的组合。

以1:2-1:8的比例混合试剂A和试剂B，形成混合试剂；具体的，试剂A和试剂B的混合比例范围为1:2-1:8，优选的以1:4-5的比例来混合试剂A和试剂B，此时混合生成的混合试剂在检测时的准确度较高，其中，A试剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)或取代6,6'-二硝基-3,3'-二硫代苯甲酸；B试剂为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

将工作液混合均匀；将抑制剂溶液混合均匀；将混合试剂混合均匀。具体的，将混合均匀后的工作液、抑制剂溶液、混合试剂分别进行放置，通常放置在试剂槽中,以方便之后的检测。

步骤S2，加样本，将50uL-70uL的工作液加入对照组反应杯；将50uL-70uL抑制剂溶液加入实验组反应杯；向对照组反应杯和实验组反应杯分别加入10uL-30uL的样本；对照组反应杯和实验组反应杯间隔设置，例如：奇数编号的反应杯为对照组反应杯，偶数编号的反应杯为实验组反应杯。

具体的，向对照组反应杯和实验组反应杯加入的工作液的量是等同的，一般情况下测定一个样本时，在对照组反应杯和实验组反应杯一般加入50uL-70uL的工作液，优选的，向对照组反应杯和实验组反应杯加入50-60uL的工作液。优选的，向对照组反应杯和实验组反应杯加入等量的工作液，以使对照组和实验组的检测数据有可比较性，能对检测后的数据进行计算。

在使用本发明对硫氧还蛋白还原酶活性进行检测时，一般是1-16个样本为一组进行测定，每组样本的加样时间为约10分钟，即27个周期，每周期22.5秒，这组样本加样完后才能之后，就可以对本组样本进行温育，然后另一组样本再继续进行加样。

步骤S3，温育，在避光环境下，将对照组反应杯和实验组反应杯放置在30℃-40℃温度下孵育第一预定时间；其中，预定温度为30℃-40℃；第一预定时间为8-20分钟，优选的为10分钟。

具体的，加入样本之后，将对照组反应杯和实验组反应杯放置在30℃-40℃的温度下进行避光孵育为8-20分钟，优选的为10分钟，由于该检测方法可配合检测设备使用，在预定时间为10分钟时，可以实现在硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上的自动化检测。一组样本孵育时间到后，即可对本组样本进行测定。

步骤S4，测定，分别向对照组反应杯和实验组反应杯加入100uL-150uL的混合试剂；在预定波长下，测定第二预定时间段内的吸光度值。具体的，在对样本进行测定时，首先用加样针向对照组反应杯和实验组反应杯加入110uL-130uL的混合试剂，最优的，可在对照组反应杯和实验组反应杯加入120uL的混合试剂，在405nm-450nm的波长下连续测定样本的吸光度值7.5-11.25分钟，即20-30个周期。

本发明中将试剂A和试剂B进行混合后，进行一块搅拌，使其均匀混合后，在测定时，直接将混合试剂一块加入待测定的试剂中，实现了混合加样，比现有技术中单独对试剂A和试剂B分别搅拌，然后单独加样，省略了一部分的步骤，节省了检测的时间，且实现了在硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上自动化检测，提高了检测的效率。，其中，本发明中的样本是指来自生物的任何组织或分离自其中的部分，样本优选血液、体液、组织匀浆液，并最优选血液，其中血液可以是血清、血浆等组分。

本发明的检测方法可适用于“一种硫氧还蛋白酶活性的协同检测设备”，如图2所示，该设备的结构具体为：

检测设备包括：

壳体1，

容纳装置2，用于容纳样本和试剂(包括工作液/抑制剂溶液和混合试剂)，并在驱动系统(图中未示出)的驱动作用下，围绕轴心做周期性转动；其中，容纳装置2包括：样本试剂盘2-1和分别沿样本试剂盘2-1圆周方向均匀分布的样本管固定部件2-2、工作液/抑制剂溶液固定部件2-3和混合试剂固定部件2-4；样本管固定部件2-2可以是围绕样本试剂盘圆周方向设置的一圈具有若干个孔的环状结构部件，放置于样本试剂盘中能够置放样本管，例如：试管架，样本管固定部件上的孔优选为40个；工作液/抑制剂溶液固定部件2-3和混合试剂固定部件2-4的结构与样本管固定结构类似，分别用于置放工作液/抑制剂溶液瓶或混合试剂瓶，数量均优选为30或40个，每一个样本管固定部件2-2、每一个工作液/抑制剂溶液固定部件2-3和每一个混合试剂固定部件2-4均是以样本试剂盘的中心为圆心，且沿着样本试剂盘的半径由内至外依次分布。

反应装置3，在驱动系统的驱动作用下，围绕轴心做周期性转动；反应装置3包括：反应盘3-1和沿反应盘圆周方向均匀分布的多个反应杯固定部件3-2，反应杯固定部件3-2可以是围绕反应盘圆周方向设置的一圈具有若干个孔的环状结构部件，放置于反应盘中能够容纳或置放反应杯，例如：试管架，反应杯的数量为81个，可分为9组。

采样装置4，用于基于容纳装置2和反应装置3的周期性转动，从容纳装置2中采集试剂和/或样本放入反应装置3；采样装置4可选的为采样针；

驱动系统，与容纳装置2、反应装置3和采样装置4连接，用于控制容纳装置2、反应装置3和采样装置4执行相应的操作。

液压装置5，包括真空泵5-1、真空罐5-2和液路机构5-3，液路机构包括管道和设置于管道上的阀门，液路机构还与采样装置和自动清洗装置连接，

真空泵5-1，用于调节真空罐5-2内的气压，以使真空罐5-2内气压达到预设气压；

真空罐5-2，用于在预设气压下，控制液路机构动作，以对采样装置进行上升、下降和旋转的操作，和使液体进入或排出自动清洗装置。

自动清洗装置6，与液压装置5连接，用于基于液压装置5的控制，对反应装置3中的反应杯进行清洗；自动清洗装置6可以是清洗针，能够吸入液体至清洗针内部的容纳空间，进而释放至反应杯中对反应杯进行清洗，再将清洗后的废液从反应杯中吸走排出至废水池(图中未示出)，废水池可设置于检测设备外部。

搅拌装置7，与驱动系统连接，用于对试剂和样本形成的混合液进行搅拌，在各加样步骤完成后进行均匀搅拌。优选地，搅拌装置可以是搅拌针。

温控装置8，位于多个反应杯固定部件下方，用于控制反应杯固定部件内的反应杯的温度保持在设定的实验温度。具体地，温控装置8是温控槽，为槽状结构，使得81个反应杯能够均位于槽状结构内部，以保持反应过程中反应装置内部的环境温度保持在反应温度和孵育温度。

光电装置9，设置于壳体1上表面，用于控制光路和波长，为样本与试剂的反应过程提供光照，连续测定样本的吸光度值。光电装置为光电盒。

注射器10，设置于壳体1上表面。

其中，样本试剂盘上设置有样本试剂盘盖，以对样本圆盘进行封闭为TR活性检测提供实验环境；样本试剂盘盖上设置有样本采样孔、工作液/抑制剂溶液采样孔和混合试剂采样孔；反应盘上设置有第一加液孔和第二加液孔；样本采样孔、工作液/抑制剂溶液采样孔、混合试剂采样孔、第一加液孔和第二加液孔均位于以采样装置为圆心的同一个圆上，采样装置沿着圆的圆周在样本采样孔、工作液/抑制剂溶液采样孔、混合试剂采样孔、第一加液孔和第二加液孔之间做周期性运动。

具体地，第一加液孔和第二加液孔之间的间隔可以设置为少于每组反应杯数量的数量个反应杯的距离，优选地，第一加液孔和第二加液孔之间的间隔可以设置为7-11个反应杯的距离，更为优选地，是设置为8个反应杯的距离。

本发明实施例还包括上位机，上位机与液压装置和驱动系统连接，用于向液压装置和驱动系统发送操作指令，以使得驱动系统控制容纳装置2和反应装置3做周期性转动，当需要采样时，驱动系统接收上位机的指令，控制容纳装置转动，容纳装置每转动一格，都会有一个样本管固定部件、工作液/抑制剂溶液瓶固定部件和混合试剂瓶固定部件转动至分别对应样本试剂盘盖上设置的样本采样孔、工作液/抑制剂溶液采样孔和混合试剂采样孔的位置处，采样装置会在液压装置的控制下下降至样本管固定部件、工作液/抑制剂溶液瓶固定部件和混合试剂瓶固定部件中，进而从样本管、工作液/抑制剂溶液瓶或混合试剂瓶中采集样本、工作液/抑制剂溶液或混合试剂然后在液压装置的控制下上升，再移动至第一加液孔或第二加液孔的位置处，在液压装置的作用下下降，将采集的样本、工作液/抑制剂溶液或混合试剂放入第一加液孔或第二加液孔位置处的反应杯中，与此同时，反应装置转动一格，使得第一加液孔和第二加液孔分别对应下一个需要加液的反应杯，进而继续完成下一个周期的采集以及加液。

容纳装置，用于容纳样本和试剂，并在驱动系统的驱动作用下，围绕轴心做周期性转动；反应装置，用于容纳反应杯和实验杯，反应杯和实验杯在驱动系统的驱动作用下，围绕轴心做周期性转动；采样装置，用于基于容纳装置和反应装置的周期性转动，从容纳装置中采集试剂和/或样本放入反应装置；驱动系统，分别与容纳装置、反应装置和采样装置连接，用于控制容纳装置、反应装置和采样装置动作。

下面结合该检测设备对本发明的检测方法进行详细说明：

需说明的是，在使用本发明的方法对人外周血硫氧还蛋白还原酶的活性进行检测时，有时需要对照组和实验组两组进行检测，以便进行对照，检测本发明的准确性和快速性。

下面的方法即可适用于实验组也适用于对照组，其中检测方法包括：

图3和图4显示了本发明实施例的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测方法的流程示意图。

如图3和图4所示，一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测方法，包括：

S1，从第一周期开始，驱动系统控制采样装置从样本试剂盘中依次采集工作液/抑制剂溶液，并控制采样装置将采集的工作液/抑制剂溶液依次加入第一组反应杯，直至第一周期组结束；

具体地，如图5所示，步骤S1包括：

S11，在第一周期组的第一个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使得第一组反应杯中的第一个反应杯位于第一加液孔位置处；

S12，驱动系统控制采样装置转动至工作液/抑制剂溶液采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个工作液/抑制剂溶液瓶中采集工作液/抑制剂溶液；

S13，驱动系统控制采样装置转动至第一加液孔位置处，将采集的工作液/抑制剂溶液加入第一加液孔位置处的反应杯内；

S14，驱动系统控制采样装置和反应盘重复上述工作液/抑制剂溶液的加液步骤，直至第一组反应杯中的每一个反应杯均加入工作液/抑制剂溶液，第一周期组结束。

具体地，在第一周期组中，当反应盘转动两个预设角度时，样本试剂盘转动一个预设角度，直至第一周期组结束。优选地，每一个预设角度可以设置为两个反应杯固定部件的间隔，这样设置能够使得每转动一个预设角度就可以使得第一组反应杯中的每一个反应杯依序位于第一加液孔位置处；

S2，从第二周期组的第一个周期开始，每间隔两个周期，驱动系统控制采样装置从样本试剂盘中依次采集工作液/抑制剂溶液，并控制采样装置将采集的工作液/抑制剂溶液依次加入第二组反应杯；

从第二周期组的第二个周期开始，每间隔两个周期，驱动系统控制采样装置从样本试剂盘中依次采集样本，并依次控制采样装置将采集的样本加入第一组反应杯，直至第二周期组结束；

具体地，如图6所示，步骤S2包括：

S21，在第二周期组的第一个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使第二组反应杯中的第一个反应杯位于第一加液孔位置处；

S22，驱动系统控制采样装置转动至工作液/抑制剂溶液采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个工作液/抑制剂溶液瓶中采集工作液/抑制剂溶液，并控制采样装置转动至第一加液孔位置处，将采集的工作液/抑制剂溶液加入第一加液孔位置处的反应杯内；

S23，在第二周期组的第二个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使第一组反应杯中的第一个反应杯位于第二加液孔位置处；

S24，驱动系统控制采样装置转动至样本采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个样本管中采集样本，并控制采样装置转动至第二加液孔位置处，将采集的样本加入第二加液孔位置处的反应杯内；

S25，在第二周期组的第三个周期中，采样装置不动作；

具体地，在第二周期组的第三个周期中，反应盘可以转动，也可以不转动，若第二周期组的第三个周期选择不转动，则可以选择在下一周期中转动，但为了考虑程序控制的准确度以及方便性，反应盘优选地为不转动；以及若此周期中，样本试剂盘需要转动，则也可以选择在本周期转动或者在下一周期转动。

S26，按照上述第二周期组的三个周期的加液步骤循环地加液，直至第一组反应杯中的每个反应杯均加入样本，且第二组反应杯中的每个反应杯均加入工作液/抑制剂溶液，第二周期组结束。

S3，从第三周期组的第一个周期开始，驱动系统每间隔两个周期控制采样装置从样本试剂盘中依次采集工作液/抑制剂溶液，并控制采样装置将采集的工作液/抑制剂溶液依次加入第三组反应杯；

从第三周期组的第二个周期开始，驱动系统每间隔两个周期控制采样装置从样本试剂盘中依次采集样本，并控制采样装置将采集的样本依次加入第二组反应杯；

从第三周期组的第三个周期开始，驱动系统每间隔两个周期控制采样装置从样本试剂盘中依次采集混合试剂，并控制采样装置将采集的混合试剂依次加入第一组反应杯，直至第三周期组结束。

第三周期组结束时，第一组反应杯即加液结束，开始进入孵育时间。

具体地，如图7所示，步骤S3包括：

S31，在第三周期组的第一个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使得第三组反应杯中的第一个反应杯位于第一加液孔或第二加液孔位置处；

S32，驱动系统控制采样装置转动至工作液/抑制剂溶液采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个工作液/抑制剂溶液瓶中采集工作液/抑制剂溶液，并控制采样装置转动至第一加液孔或第二加液孔位置处，将采集的工作液/抑制剂溶液加入第一加液孔或第二加液孔位置处的反应杯内；

S33，在第三周期组的第二个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使得第二组反应杯中第第一个反应杯位于第一加液孔或第二加液孔位置处；

S34，驱动系统控制采样装置转动至样本采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个样本管中采集样本，并控制采样装置转动至第一加液孔或第二加液孔位置处，将采集的样本加入位于第一加液孔或第二加液孔位置处的反应杯内；

S35，在第三周期组的第三个周期中，驱动系统控制反应盘转动，使得第一组反应杯中的第一个反应杯位于第一加液孔或第二加液孔位置处；

S36，驱动系统控制采样装置转动至混合试剂采样孔位置处，从样本试剂盘的某一个混合试剂瓶中采集混合试剂，并控制采样装置转动至第二加液孔位置处，将采集的混合试剂加入第一加液孔或第二加液孔位置处的反应杯内；

S37，按照上述第三周期组的三个周期的加液步骤循环在第一组反应杯、第二组反应杯和第三组反应杯中的每个反应杯之间进行加液，直至第一组反应杯均加入混合试剂，第二组反应杯中均加入样本，第三组反应杯均加入工作液/抑制剂溶液，第三周期组结束。

S4，按照第三周期组的加液步骤进行循环，将工作液/抑制剂溶液、样本和混合试剂分别并依次加入每组反应杯，直至整盘检测完成或停止检测；

具体地，按照第三周期组的三个周期的加液步骤循环加液，直至所有反应杯中均加入工作液/抑制剂溶液、样本和混合试剂或停止检测。

步骤S4在实施时，具体是从第四周期组的第一个周期开始，每间隔两个周期，依次采集工作液/抑制剂溶液，并依次加入第四组反应杯；从第四周期组的第二个周期开始，每间隔两个周期，依次采集样本，并依次加入第三组反应杯；从第四周期组的第三个周期开始，每间隔两个周期，依次采集混合试剂，并依次加入第二组反应杯；

对于反应装置来说，只要反应装置在工作，即可重复上述步骤S3，需要说明的是，待每一组反应杯都加入了工作液/抑制剂溶液、样本和混合试剂之后，即开始发生反应，反应时间最长为22个周期(每个周期22.5s)，优选地，为20个周期，对该组反应杯来说，在这22个周期内，若该组反应杯转动至加液位置，则采样装置静置处于等待状态。待该组反应杯反应结束后，可通过上位机发送指令控制液压装置，进而控制自动清洗装置将反应杯中反应后的废液抽走，并对反应杯进行清洗，清洗完成后该组反应杯即可继续进行加入工作液/抑制剂溶液、样本和混合试剂的操作。

例如：对于第一组反应杯来说，第三周期组结束后，第一组反应杯内的包括工作液/抑制剂溶液、样本和混合试剂的混合液即开始发生反应，此时，在下一个周期内，若反应盘的第一组反应杯转动至加液位置，则采样装置静置处于等待状态。

本发明实施例中协同检测设备执行相应的测试流程，81个反应杯分为9组，每个反应共有74个测试周期，包括加入第一试剂至加入样本的27个周期，加入样本至加入第二试剂的27个周期，以及反应的20个周期，每个周期用时22.5秒，在本发明实施例中，

1)1-9周期(每个周期22.5s)：

在1-9周期的每个周期内，依次采集工作液/抑制剂溶液并依次加入1-9号反应杯中；

具体为：采样装置自工作液/抑制剂溶液采样孔位置处取工作液/抑制剂溶液(工作液或抑制剂溶液)，加入至反应装置的1号反应杯中，随即反应装置转动1格，花费1个周期(22.5s)；

连续重复上述动作共9次，将工作液/抑制剂溶液加入1-9号反应杯(此为第一组)中，共花费9个周期，反应杯转动9格；其中，反应装置每转动两次，容纳装置转动一次。即采样装置自样本试剂盘的每个工作液/抑制剂溶液瓶采集2次样本，然后容纳装置转动一次。

2)10-36周期(每个周期22.5s)：

在第10、13、16、19、22、25、28、31和34周期中，依次采集样本，并依次将样本加入1-9号反应杯；

在第11、14、17、20、23、26、29、32和35周期内，依次采集工作液/抑制剂溶液，并依次将工作液/抑制剂溶液加入10-18号反应杯；

在12、15、18、21、24、27、30、33和36周期内，采样装置不动作。

3)37周期开始：

从第37周期开始每间隔3个周期依次采集工作液/抑制剂溶液，并依次加入19-27号反应杯；从第38周期开始每间隔3个周期依次采集样本，并依次加入10-18号反应杯；从第39周期开始每间隔3个周期依次采集混合试剂，并依次加入1-9号反应杯。

具体地，是在第37周期，加入工作液/抑制剂溶液至19号反应杯；第38周期，加入样本至10号反应杯；第39周期，加入混合试剂至1号反应杯；第40周期，加入工作液/抑制剂溶液至20号反应杯；第41周期，加入样本至11号反应杯；第42周期，加入混合试剂至2号反应杯，依此循环，至整盘检测完成或停止检测；

可选的，在整盘检测完成后，前面已经反应结束的反应杯组可在清洗后进入下一轮检测。

在整个检测过程中，反应盘可以设置为是顺时针转动；

当反应盘为顺时针转动时，第一周期组的每个周期中反应盘为顺时针转动，对于第一组反应杯中的第一个反应杯来说，可以通过顺时针或逆时针转动将其转至位于第一加液孔或第二加液孔位置处进行加液，之后的检测过程中，如涉及到待加液的反应杯无法按照每一周期转动一个预设角度转动至第一或第二加液孔位置处时，都可以通过顺时针转动转至两个加液孔位置处，可选的，还可以是通过逆时针转动。

通过上述加液步骤以及周期时间的设定，还有两盘之间转动的配置，使得两个盘协同工作，对于1号反应杯来说，加入样本至加入混合试剂等待27个周期(约为10min)，符合TR活性检测的医学要求；根据上述方法实现对人血样本检测，实现了通过TR特异性抑制剂对人血样本背景减扣，从而保证检测方法符合TR酶活性检测结果与国家相关标准的一致性(正常人群TR检测数据小于4单位，肿瘤高相关人群TR检测数据大于12单位)。

本发明的优点在于：通过改进初代检测方法，使本发明专利的检测方法可以满足自动化检测的要求。具体为：

1)与已公开的TR活性检测技术方法(PCT/CN2010/078369)相比，显著减少孵育时间，单一样本的孵育时间从30min降低至10min，能够有效减少检测时间，使每40-50个样本的检测可以在1.5个小时内完成，实现协同检测设备的连续检测，满足硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备的检测通量和速度要求。

2)与已公开的TR活性检测技术方法(PCT/CN2010/078369)相比，显著减少了检测的动作步骤，从7个动作步骤缩减至3-4个动作步骤，优化检测步骤，缩减了仪器的动作时间并方便仪器程序操作，使单个检测人员可以独立操控仪器，完成整个检测流程。

3)本发明的检测方法能够适应配合硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备在TR临床自动化检测方面的动作要求，配置要求和指令要求；

4)经由本发明方法，在硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上完成临床TR活性检测，并经过特定软件(具体请见另一项申请专利：一种硫氧还蛋白还原酶活性的分析方法及系统)处理，能够成为临床医学认定的TR活性结果，并满足相应上市产品“TR活性检测试剂盒”及国家医疗器械注册产品标准的相关要求：YZB/国(Q/CVH 001-2011)；

5)本发明的检测设备和方法通过使用现有的“硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒”(证号为鄂食药监械(准)字2013第2401815号及国食药监械(准)字2014第3400264)，所产生的TR检测结果满足相应上市产品“TR活性检测试剂盒”及国家医疗器械注册产品标准的相关要求：YZB/国(Q/CVH 001-2011)。

本发明提供的一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法，通过将试剂A和试剂B在上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上自动取样混合成混合试剂，经硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备自动加入样本中进行混合、搅拌的操作，替代了分别添加试剂A和试剂B做手工重复混合、搅拌的工作，提高了工作效率。

本发明旨在提供一种用于协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法，通过对适用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备的样本/试剂体积的设定，能够符合运行的工作液体选择的方法要求，本发明的方法在上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备上使用时，包括加样操作方法、避光操作要求方法、试剂混合的操作要求方法等针对驱动系统的智能指令方法规定。其中的智能指令如协同检测设备运行中每一周期组中周期数以及每一周期时间的规定，针对运行过程要求等都是和实现人外周血TR功能检测方法衔接的检测方法学。本发明的方法是适用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备实现TR酶学检测功能要求的方法，用于上述介绍的一种硫氧还蛋白还原酶活性的协同检测设备的硫氧还蛋白还原酶活性检测方法。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (9)

1.一种硫氧还蛋白还原酶活性检测方法用于协同检测设备中的用途，其特征在于，包括：

配液，

配置工作液、抑制剂溶液和混合试剂；

所述工作液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液；

所述抑制剂溶液为所述工作液和抑制剂的混合溶液；所述抑制剂为硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物；

所述混合试剂包括试剂A和试剂B；所述试剂A为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)或取代6,6'-二硝基-3,3'-二硫代苯甲酸；所述试剂B为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；

加样本，所述样本为血液、体液或组织匀浆液；

将50uL-70uL的所述工作液加入对照组反应杯；

将50uL-70uL的所述抑制剂溶液加入实验组反应杯；

向对照组反应杯和实验组反应杯分别加入10uL-30uL的样本；

温育，

在避光环境下，将所述对照组反应杯和所述实验组反应杯放置在30℃-40℃温度下孵育第一预定时间；

测定，

分别向所述对照组反应杯和所述实验组反应杯加入100uL-150uL的混合试剂；

在预定波长下，测定第二预定时间段内的吸光度值；

所述加样本、温育、测定步骤经操作所述协同检测设备自动完成。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述配置工作液的步骤包括：

按照1:1:2:4的比例取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液；

将所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉基丙磺酸、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系和磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液混合均匀。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，

所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的PH为5.5-7.2，浓度为0.025-0.125 mol/L；

所述吗啉基丙磺酸的浓度为0.25mol/L；

所述磷酸氢二钠柠檬酸缓冲体系的PH为2.2-8.0，浓度为0.2mol/L；所述磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲溶液的PH 为4.9-8.2，浓度为1-15mol/L。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述配置抑制剂溶液的步骤包括：

以1:1-1:5的比例混合所述工作液和抑制剂，形成所述抑制剂溶液；

将所述抑制剂溶液混合均匀。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，所述配置混合试剂的步骤包括：

以1:4-1:8的比例混合所述试剂A和所述试剂B，形成所述混合试剂；

将所述混合试剂混合均匀。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第一预定时间为8-20分钟。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述第一预定时间为10分钟。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述预定波长为405nm-450nm。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第二预定时间为20-30个周期。

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