CN103675060B - 一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种微电极阵列，该微电极阵列包含具由细胞尺寸大小的微洞构成的微电极。通过将单细胞直接定位在含有细胞大小的微洞的微电极上，细胞膜中活化胆固醇与溶液中胆固醇氧化酶反应，在电极表面产生过氧化氢，引发可测量的鲁米诺电致发光，该发光强度与细胞膜中的活化胆固醇量相关。通过连接多通道转换器和电压发生器，在阵列中的微电极会被依次施加一个脉冲三角波电压，当在微电极表面加电压的时候，这个细胞或者微电极才能发光，利用光电倍增管PMT检测鲁米诺的化学发光强度，获取细胞膜中活化胆固醇的含量。在本微电极阵列中，单细胞被电压选择进行检测，有利于测量的自动化和分析通量。本发明可实现快速检测细胞膜中活化胆固醇的含量。

Description

一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用。

背景技术

细胞内部胆固醇的平衡对细胞功能有重要影响。尽管胆固醇主要分布于细胞膜，但也在脂筏或质膜微囊等神经鞘脂丰富的区域集中。这些区域的胆固醇比磷脂双分子层的胆固醇络合能力强，导致更高的化学活性（脱离倾向），因此它们通常被称为活化胆固醇。近期研究表明细胞膜活化胆固醇可诱导细胞胆固醇的运输，包括抑制胆固醇合成，降低胆固醇摄入量和增强胆固醇外排。因此，对细胞膜活化胆固醇全面的研究，尤其是在单细胞水平的研究，对研究细胞内胆固醇运输有极大意义。

环糊精和胆固醇氧化酶试剂已被用来分析细胞膜活化胆固醇。细胞膜活化胆固醇形成时，胆固醇与环糊精反应的速率和程度大大增加，能够有效的将细胞膜上的活化胆固醇溶解。因此可利用放射标记技术或色谱-质谱联用技术测定环糊精溶液中胆固醇的含量，获取细胞膜中活化胆固醇的信息。这种手段需要大量细胞，很难应用于单细胞胆固醇检测，不能研究细胞个体差异性。

胆固醇氧化酶是一种催化胆固醇反应生成胆甾烯酮和过氧化氢的酶，生成的过氧化氢可用amplex red或quinoneimine试剂盒方法检测。研究发现，胆固醇氧化酶和细胞接触后，仅仅与细胞膜中活化胆固醇反应，所以可用于研究细胞膜活化胆固醇和磷脂细胞膜模型。但是这种方法还是很难被用于单细胞检测。原因在于：虽然amplex red试剂盒方法检测过氧化氢的灵敏度可达50nM，但所需过氧化氢的总量却为皮摩尔级，这就需要最少几千个细胞，无法达到单细胞检测的能力。通过精密地安置光路可提高检测灵敏度来减少细胞量，但却要极为复杂的仪器装置，降低了仪器使用的通用性。

近期，修饰胆固醇氧化酶的微电极被用来检测单细胞细胞膜胆固醇。在这种方法中，微电极与单细胞的细胞膜接触，氧化细胞膜表面胆固醇，产生的过氧化氢被电极表面电压氧化产生电流，从而测得细胞膜胆固醇。此法可研究不同病变状态的单细胞，但是，该检测方法通量低，且需特殊的电化学装置，阻碍了其在生化领域的应用。所以，开发一种简单、经济的装置来检测单细胞细胞膜活化胆固醇是十分必要的。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用，可以实现对单细胞表面活化胆固醇的快速检测。

技术内容：为实现上述技术目的，本发明提出一种微电极阵列，该微电极阵列按照如下步骤制备：

（1）将铟锡氧化物玻璃用腐蚀液腐蚀成8-36块，用甩胶机在铟锡氧化物玻璃上均匀涂一层的SU-8光刻胶；

（2）将上述铟锡氧化物玻璃在电热板上先65℃-75℃软烤1-30min，再95℃-105℃软烤1-90min；

（3）通过氧化铁掩模片利用光刻系统对铟锡氧化物玻璃上的光刻胶进行紫外照射35s-55s，然后在电热板上先65℃-75℃软烤1-3min，再95℃-105℃软烤1-4min；

（4）将步骤（3）中得到的铟锡氧化物玻璃移入SU-8显影剂溶液中清洗1-20min，从而在铟锡氧化物玻璃分成的8-36块上均产生一个微洞和一个连接导线的开口；所述氧化铁掩膜片上涂覆有遮挡紫外线的材料，被遮挡紫外线材料遮挡的部分即为微洞和连接导线开口的部分，而掩膜片其他部分则没有遮挡紫外线的材料，因此，当紫外线照射时，含有遮挡紫外线的材料的部分没有曝光，该部分可以被SU8显影液洗去，ITO玻璃就会暴露出来导电，而不含遮挡紫外线的材料的部分则曝光，该部分SU-8光刻胶就会固化，不会被洗去。

（5）将上述含有微洞的铟锡氧化物玻璃在100℃-200℃硬烤20-60min；

（6）最后在铟锡氧化物玻璃上粘贴一个O型橡胶圈，形成一个细胞室，得到8-36微电极，即为一个微电极阵列；各个微电极通过上述连接导线的开口连接到多通道转换器上，然后再连接到电化学工作站上进行单细胞序列分析，O型圈内部盛放的细胞溶液为电解池溶液。

其中，步骤（1）中SU-8光刻胶的厚度为20μm-100μm，优选地为30μm。

步骤（1）中所述的腐蚀液为浓盐酸、浓硝酸和水的混合溶液，体积比为4:1:2

其中，步骤（4）中所述的微洞的直径为20μm-100μm，优选地为30μm。

本发明还提出了上述微电极阵列在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用。

利用所述微电极阵列检测单细胞表面活化胆固醇的步骤包括：

（1）将细胞接种于培养基中，37℃下在含5%(v/v)的CO2培养箱中培养12h，然后用胰蛋白酶从壁上消化下来；

（2）将含有细胞的培养基滴在微电极阵列上，使细胞分别导入到微洞中，然后将在SU-8层表面的细胞冲掉；

（3）将微洞中的细胞培养1-3h使其贴壁，用pH7.4的含有310mM蔗糖的0.5mM的磷酸盐缓冲溶液在37℃下在培养箱中培养0.5h-2.0h，使细胞活化；

（4）以培养有细胞的微电极阵列作为工作电极，通过电化学工作站和多通道转换器在微电极上加一个脉冲三角波电压，并以Ag/AgCl电极和一根Pt导线分别作为参比和对电极连接，在该电化学系统中，通道转换的最短时间为2s。其中用于发光检测的微电极阵列上的溶液为pH7.4的含有L012的磷酸盐缓冲液，优选地，为含有200μM L012的500μL PBS(100mM pH7.4)。在微电极阵列上加一个0.5-1.0V，扫描速度为1V/S的周期性电压来收集背景发光信号，然后向微电极阵列中加入1U/mL的胆固醇氧化酶，通过光电倍增管（PMT）检测发光。将胆固醇氧化酶加入前后在1.0V时的发光比作为发光率；L012是一种高度灵敏的化学发光物质，比鲁米诺具有更高的发光效率，当电压高于0.5V的时候可诱导L012和过氧化氢的发光。为减少分析时间以获得更高的分析量，我们选择扫描速度为1.0V/S，0.5-1.0V的周期性电压分析单细胞；

（5）用COMSOL3.5软件进行有限元模拟，模拟加入胆固醇氧化酶之后微洞中过氧化氢的分布规律。

其中，所述培养基为含10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)抗生素的DMEM高糖培养基，所述抗生素为青霉素和链霉素的混合物，其中青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100μg/ml。即培养基总体积是500ml，其中胎牛血清为50ml，青霉素和链霉素购入的为10000U/ml和10000μg/ml的混合溶液，加5ml入500ml中，相当于稀释100倍从而达到青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的浓度。

为使细胞表面产生更多的活化胆固醇，在步骤（1）中可以将所述细胞在含有2μg/ml的ACAT抑制剂溶液、37℃的环境下培养24h，然后导入微洞中。ACAT的抑制降低了细胞内胆固醇的酯化，产生了更多的活化胆固醇。

为进一步减少细胞内胆固醇的生物合成和活化细胞膜胆固醇，在步骤（1）中，所述细胞可以在含有2μg/ml的ACAT抑制剂溶液、37℃的环境下培养24h，然后再用100μM的美伐他汀处理24h，最后导入微洞中。美伐他汀可以抑制羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCoA)，从而减少细胞内胆固醇的生物合成，同时活化细胞膜胆固醇。

其中，上述细胞为Raw264.7细胞。

检测原理：首先将单细胞直接定位在含有细胞大小的微洞的微电极上，细胞膜中活化胆固醇与溶液中胆固醇氧化酶反应，在电极表面产生过氧化氢，引发可测量的鲁米诺电致发光，该发光强度与细胞膜中的活化胆固醇量相关。胆固醇氧化酶与细胞膜活化胆固醇的反应会在一分钟之内完成。微洞的结构减慢了过氧化氢向本体溶液中的扩散。过氧化氢的产生和扩散之间的平衡，形成了在一个持续的时间段内微电极表面过氧化氢的近稳态分布。通过连接多通道转换器和电压发生器（集成于电化学工作站中），阵列中的微电极会被依次施加一个脉冲三角波电压，当在微电极表面加电压的时候，这个细胞或者微电极才能发光，利用光电倍增管PMT检测鲁米诺的化学发光强度，获取细胞膜中活化胆固醇的含量。在本微电极阵列中，单细胞被电压选择进行检测，有利于测量的自动化和分析通量。

有益效果：本发明研制出一种微电极阵列用于检测单细胞表面活化胆固醇。通过依次快速检测每个细胞，将分析速度提高至3秒每细胞，远优于目前常用电化学单细胞分析速度（8个细胞每天）。在本发明的微电极阵列中，单细胞被电压选择进行检测，有利于测量的自动化和分析通量，可实现快速检测细胞膜中活化胆固醇的含量。

附图说明

图1为序列微电极阵列检测单细胞表面活化胆固醇示意图。

图2为制作微电极阵列的操作流程。

图3为在外加鲁米诺和电压情况下细胞内钙离子浓度变化图。

图4为胆固醇氧化酶加入前后微电极表面上单个细胞被检测的典型发光轨迹，PMT电压为700V。

图5中（A）为用有限元模拟微洞中过氧化氢扩散的模型，边界条件是：绝缘表面1-4，轴对称面表面5；（B）为在微电极表面随着时间推移的过氧化氢模拟浓度；（C）为不同疾病状态下细胞的模拟结果。

图6为ITO玻璃上400个微洞的平均发光率，PMT电压为700V，误差的条形图表示标准偏差（n=3）。

图7为2μM H₂O₂加入前后阵列中八个微电极的典型的发光轨迹，L012的浓度是200μM，PMT电压是700V。

图8中(A)为细胞经低离子强度溶液处理被活化后，胆固醇氧化酶加入前后八微电极的典型发光轨迹；（B）为64个单细胞的发光率分布，每个点代表一个细胞。

图9为64个（A）ACAT抑制过的细胞和（B）ACAT/HMGCoA抑制过的细胞发光率分布，每个点代表一个细胞。

具体实施方式

药品及仪器信息：

Raw264.7细胞从中国科学院上海生物研究所生物化学和细胞生物学学院获得的；SU-8光刻胶和SU-8显影剂溶液从Microchem公司(Newton,MA)购买；L012（8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d哒嗪-1,4（2H,3H）二酮）从光化工美国公司购买的；所有其他的化学药品都是从Sigma-Aldrich公司购买。缓冲溶液均经过杀菌处理。实施例1八微电极阵列的制备。

以制作八微电极为例，如图2所示，为制作八微电极的过程。首先，将铟锡氧化物（ITO）玻璃（2平方厘米）腐蚀（腐蚀液为体积比为浓盐酸：浓硝酸：水=4:1:2，其中，浓盐酸为分析纯，质量分数36%-38%，浓硝酸分析纯，质量分数65%(v/v)-68%）成八块，如图2A和B所示。用甩胶机在ITO玻璃上均匀涂一层大约30μm厚的SU-8光刻胶，之后在电热板上先65℃-75℃软烤1-30min，再95℃-105℃软烤1-90min，如图2C所示。ITO上的光刻胶通过一个氧化铁掩模片被光刻系统(JB-VIII,Pmled optoelectronics，China)紫外照射，然后在电热板上先65℃-75℃软烤1-3min，再95℃-105℃软烤1-4min。该氧化铁掩膜片上涂覆有遮挡紫外线的材料，被遮挡紫外线材料遮挡的部分即为微洞和连接导线开口的部分，而掩膜片其他部分则没有遮挡紫外线的材料，因此，当紫外线照射时，含有遮挡紫外线的材料的部分没有曝光，该部分可以被SU-8显影液洗去，ITO玻璃就会暴露出来导电，而不含遮挡紫外线的材料的部分则曝光，该部分SU-8光刻胶就会固化，不会被洗去。将得到的铟锡氧化物玻璃移入SU-8显影剂溶液中清洗1-20min，就会在腐蚀的每一块上都产生一个直径30μm的微洞和一个连接导线的开口，如图2D所示。把含有微洞的导电玻璃在80-120℃硬烤20-100min。最后，在ITO玻璃上粘贴一个O型环形成一个细胞室。细胞室里的八个微洞形成了单细胞分析的八微电极，如图2E所示。

Raw264.7细胞在含有培养基的瓶子里培养一夜。其中，培养基为含10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)抗生素的DMEM高糖培养基，抗生素为青霉素和链霉素的混合物，其中青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100μg/ml。即培养基总体积是500ml，其中胎牛血清为50ml，青霉素和链霉素购入的为10000U/ml和10000μg/ml的混合溶液（购买自Thermo Scientific的青霉素-链霉素100X溶液（HyClone^TM Penicillin-Streptomycin 100XSolution），加5ml入500ml中，相当于稀释100倍从而达到青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的浓度。

之后将细胞用胰蛋白酶从壁上消化下来，将一滴含有细胞的培养基滴在电极阵列上，将八个细胞导入八个微洞中，把在SU-8层表面的细胞冲掉。将微洞中的细胞培养3h使其贴壁，用含有310mM蔗糖的0.5mM的磷酸盐缓冲溶液（PBS，PH7.4）在37℃下处理1h，使细胞活化。对于用ACAT抑制的细胞，细胞在含有2μg/ml的ACAT抑制剂溶液，37℃的环境下培养24h,然后导入微洞中。

其他多微电极的步骤参照八微电极的制备方法制备。

实施例2发光检测。

以培养有细胞的ITO电极阵列作为工作电极。通过电化学工作站（CHI630E，CH仪器）和多通道转换器（CHI684，CH仪器）在微电极上加一个脉冲三角波电压，在这个电化学系统中通道转换的最短时间是2s。Ag/AgCl电极和一根Pt导线分别作为参比和对电极连接。用于发光检测的微电极阵列上的溶液是含有200μM L012的500μL PBS（100mM pH7.4）。最初，在ITO微电极上加一个0.5-1.0V，扫描速度为1V/S的周期性电压来收集背景发光信号。然后，向缓冲液中加入1U/mL的胆固醇氧化酶，在2s-120s内就能检测到发光。胆固醇氧化酶加入前后在1.0V时的发光比被称为是发光率。

在双氧水存在的情况下，我们采用扫描速度为1V/S，-1.0-1.0V的周期性电压诱导鲁米诺的电化学发光。为了提高数据质量，我们用鲁米诺的类似物L012代替鲁米诺。据报道，L012是一种高度灵敏的化学发光物质，比鲁米诺具有更高的发光效率。实验表明分别显示在有无过氧化氢存在的情况下，L012的电化学发光都强于同浓度的鲁米诺。发光强度的增加使PMT电压降到700V仍可得到一个干净的发光轨迹。发光轨迹显示，当电压高于0.5V的时候可诱导L012和过氧化氢的发光。为减少分析时间以获得更高的分析量，我们选择扫描速度为1.0V/S，0.5-1.0V的周期性电压分析以下的单细胞。

在单细胞分析前，把一个细胞导入一个微电极中，该细胞经过pH7.4的含有310mM蔗糖的0.5mM的磷酸盐缓冲溶液处理1h，以活化细胞膜胆固醇。图4所示为从一个微电极上收集到胆固醇氧化酶加入前后的电致化学发光轨迹。加入胆固醇氧化酶之后可以看到发光强度的增加，说明单细胞膜中活化胆固醇在微电极上是可测量的。一个循环周期后，光通常需要经历0.1-0.6s回到0；这种光与施加电压的不同步性可能是由电压结束之后鲁米诺或者氧自由基的残留引起的。这个时间间隔说明在分析相邻细胞间隔最少为0.6s，这也将作为多路转换器中通道转换的最短时间。我们采用一个商业化的多通道转换器说明了序列分析的可行性。通道转换的时间是2s，满足了序列分析的需要。综合分析时间和间隔时间，在我们的平台中，单细胞的分析量是3s/细胞，包括通道转换时间。

实施例3有限元模拟。

我们用COMSOL3.5软件（Comsol Inc.）模拟加入胆固醇氧化酶之后微洞中过氧化氢的分布规律。结果为图5所示。

实施例4鲁米诺和电压对细胞内钙离子浓度的影响。

若把鲁米诺电致发光应用于检测细胞膜活化胆固醇，鲁米诺和电压对细胞膜胆固醇运输的影响应该很小才行。由于细胞膜胆固醇与钙离子在细胞内的平衡有关，所以我们采用跟踪细胞内钙离子的浓度来分析鲁米诺和电压对细胞膜胆固醇的影响。首先，把细胞浸泡于100μM的鲁米诺5min，该时间约为每次细胞分析的时间。细胞加入鲁米诺前后的荧光强度如图3所示。荧光强度基本不变，表明细胞内钙离子不会因引入低浓度的鲁米诺而有影响。其次，要确定电压对细胞钙离子的影响。通过分别施加-0.5～0.5V和-1.0～1.0V电压加在电极上，图3显示荧光强度在加电压前后相近，表明鲁米诺和电压的引入不会对细胞钙离子产生影响，不会影响胆固醇运输。综上所述，我们检测过程中加入的鲁米诺和电压不会对细胞膜中胆固醇的含量产生影响。

实施例5单细胞序列分析。

对于单细胞分析来说，微电极上的单细胞是在不同的时间点被分析的。而保持情况一样是在序列分析中得到精确结果的前提。在本发明系统中，在第一分钟内，所有细胞细胞膜连续不断将活化胆固醇转化为过氧化氢，并从微电极表面扩散到本体溶液中；微洞的结构放慢了过氧化氢从微洞中扩散出来的速度。因此，在有限时间内，过氧化氢的产生和扩散可能就形成了微电极表面过氧化氢的近稳态分布。为了验证近稳定状态的存在，我们用有限元模拟和实验测量分析微洞中过氧化氢的分布规律。图5A显示了有限元模拟的区域。微洞的半径是15μm,深30μm，其底线代表微电极，微洞中的细胞半径和高度都是5μm。由于细胞膜活化胆固醇为0.33fmol，在第一分钟与胆固醇氧化酶反应，假定在这1分钟内0.33fmol的过氧化氢从细胞表面以恒定的速度释放出来，过氧化氢的扩散系数是1.5×10^-9m²/s。图5B显示了每秒钟上微电极上过氧化氢的模拟浓度。经计算在20-51s的时间内浓度波动的相对标准偏差是2.6%，显示了微电极表面过氧化氢的近稳态分布。不同疾病状态下细胞的模拟结果表明：微电极上过氧化氢的浓度会发生改变，但过氧化氢的半稳定状态的分布的时间长度是一样的，结果的如图5C所示。考虑到单细胞细胞膜活化胆固醇的异质性有40-50%那么大，序列分析的2.6%的误差是不显著的，可被看作是系统误差。因此我们可以利用序列分析方法进行快速单细胞分析。

我们进一步用实验来研究微电极上过氧化氢的浓度改变。由于细胞的差异性高，很难由几个单一细胞的测量结果来判断过氧化氢浓度的改变，因此需要分析相对大量的细胞，最大限度的减少细胞的差异性。为了实现这一目标测量，在ITO玻璃上将利用SU-8胶制备400个细胞大小的微洞。将单个细胞分别导入每一个微洞里，过氧化氢在这些微洞中的分布和在微电极阵列上分布是一样的。通过记录从ITO玻璃上发出的光，就可以收集400个细胞信号的总和，使得细胞的差异性不干扰实验结果，可得出了微电极上过氧化氢浓度变化的准确信息。在实验中，细胞导入微洞中概率是75%(v/v)。这个概率意味着大约300个细胞被导入到ITO玻璃上，其余大约100个微洞是空的。胆固醇氧化酶加入到阵列上后，其从本体溶液到细胞需要一定的扩散时间。为了简化测量，向本体溶液中加入过氧化氢，20s后就会观察到发光急剧增加；这个20s是过氧化氢从本体溶液到微电极的扩散时间，将被认为是胆固醇氧化酶的扩散时间。如图6所示，胆固醇氧化酶加入的40-80s的时间长度内，可以观察到发光的近稳定状态。在这个时间段内，发光的相对标准偏差为4.2%。扣除胆固醇氧化酶的扩散时间，近稳定状态分布的时间长度是20-60s，和模拟结果接近。模拟的结束点和实验结果的差异可能归因于模拟和实验的误差。在模拟中，假设在第一分钟过氧化氢的生成率为常数。然而，胆固醇氧化酶和胆固醇的反应速率可能涉及更多动力学过程，不是常数。在实验中，胆固醇氧化酶的扩散时间是以过氧化氢的扩散为基础的，这是不精确的，也会引入了测量误差。然而，模拟和实验结果都显示微电极上存在过氧化氢的近稳定状态分布，只有一个小的测量误差，这支持阵列分析的相对精度。在以下的单细胞序列分析中，胆固醇氧化酶加入本体溶液后40-80s的时间长度将作为分析时间区间。

实施例6微阵列中微电极的差异。

序列分析过程中，八微电极对于过氧化氢响应的差异，可在有200μM L012和2μMH₂O₂存在时的发光检测进行研究。图7所示为典型的发光曲线。加入过氧化氢之后，我们可以看到八个微电极都有一个发光的增加，这说明，阵列中所有的微电极都可用于检测。我们可以由三个微阵列24个微电极的测量结果计算出过氧化氢加入前后的发光比率，并且相对标准偏差是15.6%。这些微电极上发光率的一致性支持了阵列上单细胞的连续分析。这个实验偏差是由在微尺度的秩序下ITO导电层的不均匀性所造成的。实验中，我们用的ITO玻璃不是纯平面的，这导致微区SU-8层厚度不同。该层的不均匀性影响了洗片过程，造成了作为微电极的暴露面积大小不同。由于发光很大程度上取决于电极面积，暴露面积的差异引起了微电极上发光的差异。虽然我们采用发光率进行分析，计算过程中消掉了电极面积这一因素，但电极面积的差异仍会引起分析中额外的偏差。实施例7单细胞的连续分析。

单细胞连续分析中的细胞，首先经过低离子强度溶液预处理激活。八个细胞或者微电极的发光在200μM L012存在的情况下被连续记录下来，加入胆固醇氧化酶40s之后测定。图8A显示了胆固醇氧化酶加入前后八微电极的典型的发光轨迹。胆固醇氧化酶加入之后八个微电极发光的增强显示了八个单细胞表面活化胆固醇的序列分析。通道转换时发光降到0说明相邻细胞间没有信号干扰。分析八个细胞的总时间是22s，其中14s是通道转换时间。利用序列分析平台分析了64个单细胞，图8B所示为发光率的分布。经计算，平均发光率为1.86±0.73，相对标准偏差为39.2%。细胞的分布表明，64个细胞中有45个的发光率在1.0和2.0之间，这45个细胞的相对标准偏差为15%(v/v)。考虑到序列分析的误差和微电极的差异，该偏差说明这45个细胞的细胞膜活化胆固醇含有相似的含量。对于其他19个细胞，有14个细胞的发光率在2.0和3.0之间，5个在3.0和5.0之间。这19个细胞具有较高的表面活化胆固醇。虽然在少数细胞中活化胆固醇量的升高机理不是很清楚，但采用这种相对高通量平台研究细胞获取信息，对于理解细胞膜活化胆固醇差异性具有重要的意义。

为了进一步验证我们的序列分析平台，我们分析了用ACAT抑制剂抑制过的单细胞表面活化胆固醇。ACAT的抑制降低了细胞内胆固醇的酯化，产生了更多的活化胆固醇。胆固醇氧化酶加入后，培养有ACAT抑制过的单细胞的八微电极上所有发光增强，也支持了我们的序列分析方法。我们分析了64个用ACAT抑制过的单细胞，单细胞中活化的膜胆固醇分布如图9A所示。一般发光率在2.56±1.19，相对标准偏差为46.5%(v/v)。这和用低离子强度溶液刺激过的单细胞的分析结果是类似的，64个细胞中有45个细胞的发光比率在1.30和2.85之间，相对标准偏差为24.0%，另外的19个细胞有一个较宽的分布比（在2.85和6.0之间）。细胞内胆固醇池就是有很高比率的细胞拥有显示细胞异质性的活化细胞膜胆固醇，有一小部分细胞拥有导致细胞异质性的活化性更高的细胞膜胆固醇，结果表明，活化胆固醇含量上调后两组细胞仍然存在：一组具有绝大多数的细胞，该部分细胞表面活化胆固醇含量相近；另外一组具有较少的细胞，含有高的活化胆固醇量。对这些拥有高活化细胞的进一步研究，将会告诉我们细胞的差异性是由蛋白活性的不同还是蛋白质调控之后的反馈过程引起的。

用ACAT抑制过的细胞再用100μM的美伐他汀处理24h，抑制羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCoA)，减少细胞内胆固醇的生物合成和活化细胞膜胆固醇。图9B显示了用序列分析得到的64个经ACAT/HMGCoA处理过的单细胞发光率分布。平均发光率是1.99±0.68，相对标准偏差为34.2%。和从ACAT抑制过的细胞得到的发光率相比，用ACAT/HMGCoA处理过的细胞的发光率减少，这和用他汀类药物处理后，活化胆固醇量减少的结论保持一致。64个细胞中有48个细胞的发光率在1.02和2.28之间，相对标准偏差为20.5%(v/v)，表现了药物处理后大多数细胞活化细胞膜胆固醇的相对均匀性。另外16个细胞的发光率在2.28和4.0之间。药物处理后发现两组细胞的存在说明由药物引起的细胞膜活化胆固醇的减少没有改变细胞的分布。

本发明模拟和实验结果显示胆固醇氧化酶加入后微电极表面过氧化氢的近稳态分布，这支持了序列分析的测量精度。在22s内即可实现一个相对高通量的8细胞分析。从64个单细胞的分析结果显示，大部分细胞有相似的细胞膜活化胆固醇，然而，少数细胞有更多的细胞膜活化胆固醇，导致单细胞差异性。进一步的工作将致力于大规模生产微电极阵列，以达到更多细胞的序列分析。通过选择合适的芯片可以设计出一种新的多通道转换器，将通道转换时间缩短到0.6s，以至于能用40s的时间分析ITO玻璃上的25个细胞。而且，该平台将被扩展，使用适当的酶可以分析单细胞的膜脂质。胆固醇和单细胞质膜中相关脂质的质量，对于胆固醇和脂质之间的相互作用的理解有重要作用。同时，本方法不局限于对胆固醇的检测，而是可以通过选择合适的氧化酶，实现对单细胞中各种生物分子的快速检测。

Claims (10)

1.一种微电极阵列，其特征在于，该微电极阵列按照如下步骤制备得到：

(1)将铟锡氧化物玻璃用腐蚀液腐蚀成8-36块，用甩胶机在铟锡氧化物玻璃上均匀涂一层SU-8光刻胶；

(2)将上述铟锡氧化物玻璃在电热板上先65℃-75℃软烤1-30min，再95℃-105℃软烤1-90min；

(3)通过氧化铁掩模片利用光刻系统对铟锡氧化物玻璃上的光刻胶进行紫外照射35s-55s，然后在电热板上先65℃-75℃软烤1-3min，再95℃-105℃软烤1min-4min；

(4)将步骤(3)中得到的铟锡氧化物玻璃移入SU-8显影剂溶液中清洗1-20min，从而在铟锡氧化物玻璃分成的8-36块上均产生一个微洞和一个连接导线的开口；

(5)将上述含有微洞的铟锡氧化物玻璃在100℃-200℃硬烤20-60min；

(6)最后在铟锡氧化物玻璃上粘贴一个O型橡胶圈，形成一个细胞室，得到8-36微电极，即为一个微电极阵列，各个微电极通过上述连接导线的开口连接到多通道转换器上，然后再连接到电化学工作站上进行单细胞序列分析。

2.根据权利要求1所述的微电极阵列，其特征在于，步骤(1)中所述的腐蚀液为浓盐酸、浓硝酸和水的混合溶液，体积比为4∶1∶2。

3.根据权利要求1所述的微电极阵列，其特征在于，步骤(1)中SU-8光刻胶的厚度为1.5μm-250μm。

4.根据权利要求1所述的微电极阵列，其特征在于，步骤(4)中所述的微洞的直径为20μm-100μm。

5.权利要求1所述的微电极阵列在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用所述微电极阵列检测单细胞表面活化胆固醇的步骤包括：

(1)将细胞接种于培养基中，37℃下在含5％(v/v)的CO₂培养箱中培养12h，然后用胰蛋白酶从壁上消化下来；

(2)将含有细胞的培养基滴在微电极阵列上，使细胞分别导入到微洞中，然后将在SU-8层表面的细胞冲掉；

(3)将微洞中的细胞培养1-3h使其贴壁，用pH 7.4的含有310mM蔗糖的0.5mM的磷酸盐缓冲溶液在37℃下在培养箱中培养0.5h-2.0h，使细胞活化；

(4)以培养有细胞的微电极阵列作为工作电极，通过电化学工作站和多通道转换器在微电极上加一个脉冲三角波电压，并以Ag/AgCl电极和一根Pt导线分别作为参比和对电极连接，其中用于发光检测的微电极阵列上的溶液为含有L012的磷酸盐缓冲液或者含有鲁米诺的磷酸盐缓冲液，在微电极阵列上加一个0.5-1.0V，扫描速度为1V/S的周期性电压来收集背景发光信号，然后向微电极阵列中加入1U/mL的胆固醇氧化酶，通过光电倍增管检测发光，将胆固醇氧化酶加入前后在1.0V时的发光比作为发光率；

(5)用COMSOL 3.5软件进行有限元模拟，模拟加入胆固醇氧化酶之后微洞中过氧化氢的分布规律。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其中，所述培养基为含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)抗生素的DMEM高糖培养基。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述细胞在含有2μg/ml的ACAT抑制剂溶液、37℃的环境下培养24h，然后导入微洞中。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述细胞在含有2μg/ml的ACAT抑制剂溶液、37℃的条件下培养24h，然后再用100μM的美伐他汀处理24h，然后导入微洞中。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞为Raw264.7细胞。