CN104730067B - 一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磷脂的电致化学发光检测方法，包括如下步骤：(1)将待检测磷脂浸泡在低离子强度溶液中使磷脂活化，然后将活化后的磷脂用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；(2)将经步骤(1)处理后的待检测磷脂浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应l～2min以后，再次检测发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。本发明的方法可用于测定细胞表面磷脂，同时还可以测定单个细胞表面磷脂，检测灵敏度高、专一性好。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用。
背景技术
磷脂为两性分子，两端分别为含氮或磷的基团、疏水长烃链，在细胞信号和细胞凋亡中起到重要作用。根据不同碱基及脂肪酸的数量，磷脂可以分为卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)，其骨架由甘油组成。磷脂可以进行水解、羟基化、乙酰基化、磺化、活化等反应。
磷脂的代谢与甲基化循环相关，在生物体内磷脂可经各种磷脂酶水解为脂肪酸、磷酸、甘油和各种氨基醇。甘油可转变为磷酸二羟丙酮从而参与糖的代谢，磷酸，人们体内物质各种代谢不可缺少的物质，氨基醇可以参加体内磷脂再合成，胆碱还可以通过转甲基作用转变为其他组份。对于磷脂的合成，通过乙醇胺或胆碱与ATP作用生成磷酸乙醇胺或磷酸胆碱，再与CTP作用转变为胞二磷乙醇胺或胞二磷胆碱，接下来再与已经生成的甘油二酯合成相应的磷脂。
对于磷脂的分析，传统的分析方法检测方法有很多，如分光光度法测定磷元素，这是基于含钼试剂和磷脂进行显色反应产生蓝色产物；色谱技术如薄层色谱法、高效液相色谱法及气相色谱法也可用于磷脂的检测，与显色法对比，色谱法干扰少，方便快捷，可以将混合磷脂中各个组份分别分离出来并定量，同时可测磷脂在储存过程中是否发生水解和氧化；现在高效液相色谱法和质谱法联用是检测磷脂最常用的方法，Lewen Jia等(Jia L，Wang C，Kong H，et al.Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers ofmouse lgA nephropathy[J].Metabolomics，2006，2(2)：95-104)用质谱串联液相色谱四级杆复合线性离子阱，采用二醇色谱柱，通过调节流动相组成，实现了血浆中磷脂的快速分离，赵素敏等(赵素敏，郑虹，路鑫等，基于液相色谱与质谱联用的代谢组学及磷脂轮廓分析在糖代谢异常研究中的应用)利用高效液相与质谱联用分析到糖尿病血浆中代谢组学及磷脂轮廓原始谱图，根据模型及相关数据的分析筛选出差异性代谢物。尽管上面研究磷脂的方法已经很多了，但这些技术都无法应用于检测单细胞中的磷脂。鉴于细胞的个体差异性，能够检测出单个细胞表面的磷脂 分子含量，对于很多脂类疾病的研究具有重大意义。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种磷脂的电致化学发光检测方法，该方法可用于测定细胞表面磷脂，同时还可以测定单个细胞表面磷脂，检测灵敏度高、专一性好。
技术方案：为实现上述技术方案，本发明提出一种磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测磷脂浸泡在低离子强度溶液中使磷脂活化，然后将活化后的磷脂用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
(2)将经步骤(1)处理后的待检测磷脂浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，再次检测发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
其中，步骤(1)中，所述的低离子强度溶液为包含0.5mM磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)和310mM蔗糖的低离子强度溶液。
步骤(2)中，鲁米诺或L012的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3∶7。
具体地，所述的电致化学发光法的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O型圈内加入待检的磷脂和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I0；待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向O型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1～2min后继续记录发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
本发明进一步提供了一种细胞磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
(2)将经步骤(1)处理后的待检测细胞浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，利用电致化学发光法检测发光强度I1计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
优选地，步骤(1)中，所述的低离子强度溶液为包含0.5mM磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)和310mM蔗糖的低离子强度溶液。
步骤(2)中，鲁米诺或LO12的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3∶7。
其中，所述的电致化学发光法定的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O型圈内加入待检的细胞和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I0；待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向O型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1～2min后继续记录发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
本发明进一步提出了上述检测方法在检测单细胞表面磷脂上的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
(2)利用微加工技术，在ITO形成30μm的单洞，将步骤(1)处理后的单个细胞引入到单洞中，加入鲁米诺或L012的磷酸缓冲液，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，利用电致化学发光法检测发光强度I1计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
优选地，步骤(2)中，鲁米诺或L012的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3∶7。
发明原理：将磷脂在低离子强度溶液中浸泡使磷脂活化，然后使其与磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液反应，使之能够被转化为过氧化氢；过氧化氢与发光试剂鲁米诺或L012反应，通过电致化学发光检测其发光信号。电致化学发光是由电化学反应引发的，在一定电压条件下，产物由电子激发态跃迁回基态而发射出光，其发光位置在电极附近；电致发光强度与鲁米诺/L012和过氧化氢的浓度成正相关关系。为了实现单细胞的检测，我们利用微加工技术，在ITO玻璃电极表面制得一个微洞，微洞仅能容纳一个细胞，从而实现利用电化学发光对单个细胞细胞膜上磷脂的快速分析。细胞膜磷脂分析原理如下式所示：
有益效果：与现有技术相比，本发明的磷脂的电致化学发光检测方法操作简单，专一性强，在单个表面实现磷脂的检测，对于我们研究相关疾病的病理和后期药理非常重要，利用包含磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，将细胞表面磷脂转化为可电致化学发光检测的双氧水，加以检测，同时结合微电极阵列，首次实现对一个细胞上的磷脂进行检测，检测灵敏度高、专一性好。
附图说明
图1为磷脂的电致发光检测结果图，其中，为A卵磷脂与磷脂酶D和胆碱氧化酶反应产生H2O2的电致化学发光图；B为鞘磷脂与磷脂酶D、胆碱氧化酶反应产生H2O2的电致化学发光图；实验条件为：0.4μM卵磷脂与鞘磷脂，PMT电压为500V，扫描速度为1V/S，-1V～1V的电压下记录背景发光强度；
图2为多细胞磷脂电化学发光曲线；
图3为磷脂与PLD反应后的电致化学放光图；
图4为磷脂与胆碱氧化酶反应后的电致化学放光图；
图5为单细胞磷脂电化学发光检测结果，其中，A为单个细胞在加入磷脂酶D和胆碱氧化酶前后的电致化学发光曲线；B为10个细胞的分别分析结果。
具体实施方式
试剂：二棕榈酸磷脂酰胆碱(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，下面简称PC)，磷脂酶D(PLD)，胆碱氧化酶(choline-oxidase)，氯仿，DMSO，鲁米诺(luminol)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(以上均购自Sigma公司)；10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，过氧化氢，氢氧化钠(以上均购自国药集团化学试剂有限公司)；胰蛋白酶，胎牛血清，青霉素、链霉素，DMEM高糖培养基(以上均购自gibco公司)。
实施例1纯品磷脂的电致化学发光检测。
先用氯仿分散卵磷脂纯品，通风厨中氮气吹干，配置高浓度卵磷脂溶液，溶剂为pH＝7.4PBS，超声15min，使样品完全溶解。以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，ITO表面黏上一个O型圈，里面加入200μL待测溶液(包含200μM鲁米诺和1mM卵磷脂的PBS溶液)，ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I0；在记录信号时尽量保证没有强光照射仪器，避免光电倍增管测得发光强度误差，待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向溶液中加入7μL 5U/mL胆碱氧化酶和3uL的PLD(10U/ml)的混合溶液，等待反应1min后继续记录发光强度I1，比较前后发光强度变化I1/I0。检测结果如图1A，从图中可以得到，当加入磷脂酶D、胆碱氧化酶后，电化学发光信号明显增强，加酶前后信号比值为12.3；配置相同浓度的鞘磷脂纯品，向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶反应，检测结果如图1B，可以得到加入酶前后发光信号比值为1.7；从上面两个发光比值来看说说明磷脂酶D、胆固醇氧化酶对卵磷脂具有高度选择性、专一性。
实施例2细胞膜表面磷脂的电致化学发光检测。
(1)细胞膜磷脂活化：在ITO表面培养约7000Hela细胞(面积为半径1cm圆)，待细胞过夜贴壁生长后，利用含0.5mM磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)和310mM蔗糖的低离子强度溶液，37℃培养1h，使细胞膜表面磷脂活化，然后再用100mM PBS(pH 7.4)冲洗并浸泡。
(2)检测：取培养有细胞的ITO，吸掉低离子溶液，用PBS清洗3次，往里面加入190μL溶液(含200μM鲁米诺的PBS溶液)，ITO作为工作电极，Ag/Agcl和Pt分别作为参比电极和对电极，检测时扫描速度1V/S，电压为-1.0V～1.0V， 光电倍增管电压为600V，记录背景发光强度，待基线稳定后，加入7μL 5U/mL胆碱氧化酶和3μL PLD(0U/ml)的混合溶液，等待1min后继续记录发光强度，比较前后发光强度。在本发明的全文中，当电压为1.0V时，加入磷酸酶和胆碱氧化酶之前和之后的发光强度的比值被定义为信号，且该信号在文中被称为发光强度比值。
本发明通过采用低离子溶液处理贴壁培养待用的细胞，使细胞膜上脂分子活化，使细胞膜脂质分子的位置发生重新排列，从而增加细胞膜脂质分子的活性。实验中，Hela细胞于37℃恒温下，在低离子强度溶液中浸泡30min。溶液换为含200μM鲁米诺的100mM PBS溶液(pH 7.4)，来测量背景光强，接着在此溶液中分别加入3μL磷脂酶D和7μL胆碱氧化酶发光强度明显增加，如图2发光强度的增加，说明了磷脂酶D和胆碱氧化酶分别与细胞膜上的卵磷脂反应，产生过氧化氢，从而引发鲁米诺的电致化学发光。
对比例1：如上所述，实验中，Hela细胞于37℃恒温下，在低离子强度溶液中浸泡30min。溶液换为含200μM鲁米诺的100mM PBS溶液(pH 7.4)，来测量背景光强，接着在此溶液中分别加入3μL磷脂酶D，然后检测发光强度，结果如图3所示。
对比例2：如上所述，实验中，Hela细胞于37℃恒温下，在低离子强度溶液中浸泡30min。溶液换为含200μM鲁米诺的100mM PBS溶液(pH 7.4)，来测量背景光强，接着在此溶液中分别加入7μL胆碱氧化酶，然后检测发光强度，结果如图4所示。
结果表明，当分别只加入磷脂酶D或者胆碱氧化酶时，并没有信号响应。因此，只有在磷脂活化后，同时加入磷脂酶D和胆碱氧化酶后才能检测到信号相应。
细胞膜上被氧化的脂质分子的含量，是通过测量加入酶溶液之后的发光强度来计算的。此时产生的过氧化氢已经扩散到周围溶液中，溶液中过氧化氢的浓度与电极表面的过氧化氢浓度相等，通过鲁米诺电致化学发光强度计算得到的过氧化氢浓度为9±1μM。
实施例3单细胞表面磷脂的电致化学发光检测。
对于单细胞表面脂分子检测，首先利用针孔技术，使ITO表面形成30μm的单洞，把培养好的Hela细胞通过胰蛋白酶处理下来，离心，清洗，并加低离子 强度溶液浸泡，最后把单个细胞引入单洞中，单细胞引入前ITO单洞先要抽真空使得单洞中润湿，在显微镜下从一边加入稀释的细胞溶液，再从一边用吸水纸，保证把细胞引入环状单洞电极中，放入培养箱培养一段时间培养约1h，使细胞贴壁，贴壁后吸掉培养基细胞专用高糖培养基，加入190μL200μM鲁米诺的PBS溶液，从而实现单个细胞的分析，PMT电压值设为800V，为了减小电压增强对信号值造成的误差，我们取0.9-1.0V的发光强度为最终光强。
单个细胞导入到微洞中，采用相同的处理方法，使细胞膜上脂分子活化。检测过程如上所述，包括溶液换为含200μM鲁米诺的PBS溶液(pH 7.4)，来测量背景光强，接着在此溶液中加入3μL磷脂酶D(8-10U/ml)和7μL胆碱氧化酶(1-5U/ml)的混合溶液，发光强度明显增加，如图5A发光强度的增加，说明了磷脂酶D和胆碱氧化酶分别与细胞膜上的卵磷脂反应，产生过氧化氢和随后的电致化学发光，实现对单个细胞表面磷脂的检测。对10个细胞进行检测，检测结果如图5B所示。结果表明，不同的细胞表现出截然不同的表面磷脂含量，充分体现了单细胞在磷脂分布上的差异性，也为单细胞分析的重要性提供了实验证据。
磷脂是细胞膜的重要组成部分，对活化细胞，维持细胞代谢平衡、人体免疫力和再生力的增强等都发挥重要作用。在单个表面实现磷脂的检测，对于我们研究相关疾病的病理和后期药理非常重要。本方法利用包含磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，将细胞表面磷脂转化为可电致化学发光检测的双氧水，加以检测。同时结合微电极阵列，首次实现对一个细胞上的磷脂进行检测。
Claims (6)
1.一种磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测磷脂浸泡在低离子强度溶液中使磷脂活化，然后将活化后的磷脂用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用，其中，所述的低离子强度溶液为包含0.5mM磷酸缓冲液和310mM蔗糖的低离子强度溶液；
(2)将经步骤(1)处理后的待检测磷脂浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，再次检测发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0，所述的电致化学发光法的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O型圈内加入待检的磷脂和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I0；待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向O型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1～2min后继续记录发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，鲁米诺或LO12的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml。
3.一种细胞磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用，所述的低离子强度溶液为包含pH7.4的0.5mM磷酸缓冲液和310mM蔗糖的低离子强度溶液；
(2)将经步骤(1)处理后的待检测细胞浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，利用电致化学发光法检测发光强度I1计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0，所述的电致化学发光法定的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O型圈内加入待检的细胞和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I0；待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向O型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1～2min后继续记录发光强度I1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，鲁米诺或L012的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml。
5.权利要求3所述的检测方法在检测单细胞表面磷脂上的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
(2)利用微加工技术，在ITO形成30μm的单洞，将步骤(1)处理后的单个细胞引入到单洞中，加入鲁米诺或L012的磷酸缓冲液，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I0，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，利用电致化学发光法检测发光强度I1计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I1/I0。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，鲁米诺或L012的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml。
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