CN105277699B - 测试试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的药品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测试试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的药品中的应用，所述测试试剂包括分别独立存在的：(a)测定样品中总巯基含量的试剂；和(b)硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物。所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。本发明的检测试剂对于肺癌，乳腺癌、鼻咽癌和宫颈癌的不同的治疗阶段(如术前、术中和术后)和临床效果(CR、PR、SD、PD)具有明显的活性差异，数据分析显示具有统计学意义，因此，该检测试剂通过TR活性检测判断肿瘤的治疗效果，动态监测相关疾病进程。从而对于患者的不同治疗阶段提供了重大的指导意义，可以在临床上使用。
Description
技术领域
本发明属于酶活性检测领域，涉及一种测试试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的药品中的应用，所述的肿瘤包括肺癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌，所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。
背景技术
我国每年大约有200万人患癌，150万人死于癌症，而且还在不断的增加，并逐渐呈年轻化趋势。癌症每年给我国造成的直接经济损失逾千亿元(摘自北京晨报2007/03/31)。据卫生部2007年报告，至2006年我国因肿瘤死亡的人数已达180万，较2005年高出30万。肿瘤发生的早期人体没有感觉和症状，所以只有早期体检才能早期发现。但是目前在临床上，80％以上的肿瘤病人是出现症状后才就医治疗，一经确诊即非早期，大多数病人都发生转移，已经失去手术机会；很多经过手术的肿瘤患者，也要采取反复的放、化疗以防止复发和转移。因此，及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。
肿瘤标志物(Tumor marker，TM)作为一项重要指标，在肿瘤早期诊断当中发挥着越来越重要的作用。TM是由肿瘤组织产生，存在于肿瘤组织本身、或分泌至血液或其他体液、或因肿瘤组织刺激由宿主细胞产生的含量明显高于正常参考值的一类物质。TM在肿瘤的治疗监测和预后方面具有一定的应用价值。目前发现的肿瘤标志物已有一百多种，但这些肿瘤标志物主要是肿瘤形成后形成的抗体或蛋白，通过检测这些肿瘤标志物可以在一定程度上检测肿瘤的发生及其相关的异常增生等相关病症，但是这些标志物不能用于在肿瘤或增生发生前来预测机体内的抗肿瘤能力。因此，本领域迫切需要开发新的方法，用于评价肿瘤发病之前机体内的抗疾病能力，以此来预报机体抵抗肿瘤或异常增殖能力的大小。
硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR，TR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。其中Trx作为一种生长因子，可以被许多细胞产生，也能被淋巴细胞、肝细胞和成纤维细胞以及许多癌细胞分泌。Trx的巯基氧化还原活性在维持细胞生理活性过程中有普遍而且重要的作用。
研究表明在氧胁迫的情况下，淋巴细胞和肿瘤细胞以及一些正常细胞当中的Trx、TrxR能够快速地调节和减缓氧胁迫的压力。在正常情况下，TrxR还原氧化态的Trx。在NADPH存在时，还原态的Trx作为PRDX的电子供体将过氧化氢还原成水。紫外线等产生的过氧化氢诱导TrxR的产生，然而，持久的过氧化氢高水平地诱导产生肿瘤抑制因子p53，反过来负调节TrxR，所以，TrxR活力在过氧化氢较好的控制下。从另一角度来说，TrxR活性越低，表明体内的肿瘤抑制因子p53的水平越高，p53的水平越高，机体就能越容易使肿瘤细胞趋向凋亡，所以对抗肿瘤的能力就越强，因此，TrxR活性的高低在一定程度上反映了体内的抗肿瘤水平。
目前，国际上采用硫代葡萄糖金(Aurothioglucose，下式a)抑制法测定TrxR活性，
其工作原理是：用5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定样品中的总还原能力；用硫代葡萄糖金抑制样品中TrxR的活性后，再用DTNB测定还原能力；计算样品前后两次还原能力的差值来测定样品中TrxR的活性。但是，硫代葡萄糖金缺乏特异性，对样品中的其他巯基物质也可发生封闭作用，不适用于直接测定血液或组织样品中的TrxR活性。例如，Hill KE等(Determination of thioredoxin reductase activity in rat liversupernatant.Anal Biochem.，1997，Nov1；253(1):123-5)采用硫代葡萄糖金测定大鼠肝匀浆中的TrxR活性时，要先对肝匀浆进行透析处理，以除去其中的小分子巯基物质(如谷胱甘肽)后，再加入硫代葡萄糖金测定其TrxR活性。可见，其他小分子巯基物质(如谷胱甘肽)可干扰硫代葡萄糖金对TrxR的活性测定。另一研究结果表明，硫代葡萄糖金会增加血液中巯基物质与DTNB的反应速率(Hu ML,Dillard CJ,Tappel AL In vivo effects ofaurothioglucose and sodium thioglucose on rat tissue sulfhydryl levels andplasma sulfhydryl reactivity.Agents Actions.1988,Aug；25(1-2):132-8)。
申请人的申请CN102695805A中公开了用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法和试剂盒及应用，该文献尽管公开了该试剂评价体内抗肿瘤水平，并且公开了对于正常人：通常TR活性小于4U/mL，且OS/TR比值大于5；对于肿瘤患者：通常TR活性大于10U/mL(一般此时OS/TR比值小于5)；对于10U/mL≥TR活性＞4U/mL，OS/TR比值小于3U/mL，具有肿瘤患者的指标特点。但是没有具体涉及具体癌症是否适用或如何适用。
目前产品检测试剂(PCT/CN2010/078369)可用于人血的体外检测，方便、无创，易行。但在临床具体应用特别是针对临床各种肿瘤类型是否适合应用该类检测试剂尚无前期任何报道。现有技术中癌症(如肺癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌)的评价试剂也没有对于超早期的肿瘤进行预警监测，更没有公开对于术后的肿瘤的治疗检测。因此，应用TR活性检测试剂用于评价在各种如肿瘤，如肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和宫颈癌的药物应用效果以及手术治疗效果的跟踪评价，对于临床合理使用药物以及手术方法进行肿瘤治疗具有重要的作用和意义。
发明内容
如上所述，TrxR的过量表达与疾病，特别是肿瘤的发生密切相关，因此，准确、可靠的检测组织中TrxR的含量或活性水平对于预报体内抵抗疾病如肿瘤等的能力极其重要，本发明的检测试剂对于肺癌，乳腺癌、鼻咽癌和宫颈癌的不同的治疗阶段(如术前、术中和术后)和临床效果(CR、PR、SD、PD)具有明显的活性差异，数据分析显示具有统计学意义，因此，该检测试剂通过TR活性检测还能判断肿瘤的治疗效果，动态监测相关疾病进程。从而对于患者的不同治疗阶段提供了重大的指导意义，可以在临床上使用。
本发明通过如下技术方案实现：
(1)一种测试试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的药品中的应用，所述测试试剂包括分别独立存在的：
(a)测定样品中总巯基含量的试剂；和
(b)硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物。
根据本发明，所述肿瘤优选肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌。
根据本发明，所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。
根据本发明，所述临床治疗包括术前、术中和术后的监测。
根据本发明，如果TR活性大于10U/mL，数值显示为肿瘤患者；如果10U/mL≥TR活性≥4U/mL，数值显示具有肿瘤患者的指标特点。
更进一步地，当TR活性大于10U/mL时，OS/TR比值小于5；当10U/mL≥TR活性＞4U/mL时，OS/TR比值小于3U/mL。所述OS/TR的比值是根据正常人与肿瘤患者的测试统计后获得的。
如果治疗后TR活性水平仍然大于10U/mL，数值预示生长控制不理想。而且，临床如果为PD，则为数据一致。
如果治疗后TR活性水平小于4U/mL，数值预示生长控制在正常人水平，临床可以判断为SD、PR、CR等为一致；反之，为不一致。
其中CR为完全好转，PR为部分好转，SD为疾病稳定，PD为疾病进展。
本发明中，所述“硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物”(下文有时称为：抑制剂)是指对硫氧还蛋白还原酶具有高度选择性的化合物，这类化合物能够特异性地与硫氧还蛋白还原酶结合，并抑制其中的巯基活性。
根据本发明，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自下述通式1或通式2所示结构的化合物，
通式1中：
X0为C或N；
X1为Se；
R1为氢，C1-C6烷基、C3-C7环烷基、
其中Ra、Rb、Re、Rf、Rg各自独立地为：C1-C6烷基；Rc，Rd各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基；
R2和R3分别独立的选自：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
通式2中：
X0为C或N；
X1为Se；
R'1为C1-C12的亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚环己烷、亚环戊烷、-(CH2)mSS(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mN(CH3)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)m，m为1-6的整数，n为大于1的整数；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
研究发现，本发明所使用的通式1或通式2的化合物，尤其是硒啉类化合物Ⅰ-Ⅺ(具体结构见以下结构式)对TrxR具有强效的抑制作用。
截至目前为止，该类化合物是报道的唯一具有特异性靶向TrxR的抑制剂，它可以有效地结合在TrxR的SeCys/Cys活性位点而发挥抑制作用，从而高度选择性地抑制TrxR。
另外，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物Ⅰ-Ⅺ对TrxR的抑制作用不受体系中其他巯基物质的干扰，具有高选择性。研究表明，即使样品体系中存在高浓度的其他巯基物质时，如0.5mM还原型谷胱甘肽，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物Ⅰ-Ⅺ依然对TrxR表现高选择性的强抑制作用。
根据本发明，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物最优选选自以下化合物I-Ⅺ。
本发明中，所述“测定样品中总巯基含量的试剂”并不特别限定，只要能够与巯基反应，并指示出样品中的含量即可。优选的“测定样品中总巯基含量的试剂”为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
根据本发明，所述测定样品中总巯基含量的试剂和硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物可以以任何形式，如固体、粉末，溶液等形式提供。这两种成分优选以分别独立存在的形式提供。对于溶液形式的硫氧还蛋白还原酶活性的试剂或硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，并不特别限定它们的浓度，优选配制成1×工作液的浓度，更优选配制成5×工作液的浓度，最优选配制成10×工作液的浓度。
根据本发明，除了上述两种成分，对于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂还可含有其它成分，例如还含有NADPH(还原性辅酶II)或者对于测量硫氧还蛋白还原酶活性所需要的其它成分，如维持酶活性稳定的缓冲液成分，包括K2HPO4等KH2PO4、EDTA和/或BSA等。上述各种成分可以以任何形式包装于试剂盒，如分别装有上述不同试剂或化合物的瓶状容器等。
根据本发明，所述试剂盒可以任何形式提供，包括但不限于以方形的包装盒形式。
本发明还提供如下技术方案：
(2)一种测试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的试剂盒中的应用的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂，所述肿瘤优选肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌，所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。
(3)一种试剂盒，包括测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂和包装，所述试剂包括分别独立存在的：
测定样品中总巯基含量的试剂；和
硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物；
包装上记载采用所述试剂测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法以及评价临床肿瘤患者临床治疗监测的方法，所述方法包括：
1)利用TR检测试剂盒对临床血浆，血清或组织样本进行TR活性检测。
优选地，所述方法还包括如下步骤：
2)利用所述的硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物与样品反应，然后利用1)中的方法测定样品中除硫氧还蛋白还原酶中的OMA值(氧化代谢分析值)含量；
3)用1)中得到的样品中的TR活性比2)中获得的OMA即：TR/OMA
更优选地，所述方法包括：
1)利用含5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的溶液与样品反应，然后通过紫外光测量样品中的吸光光度值；
2)向所述样品中加入所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，然后利用1)中的方法在相同的条件下测量样品中的吸光光度值；
3)用1)中得到的样品中的吸光光度值减去2)中得到的样品中的吸光光度值，计算得到样品中所述硫氧还蛋白还原酶的活性。
最优选地，所述评价临床肿瘤患者临床治疗监测的方法包括：
1)采用上述方法测量样品中的硫氧还蛋白还原酶活性TR活性；
2)获得样品中的OMA数据；
3)获得所述氧化应激水平与所述硫氧还蛋白还原酶活性的比值；
4)对于肿瘤患者：如果TR活性大于10U/mL，数值显示为肿瘤患者；如果10U/mL≥TR活性≥4U/mL，数值显示具有肿瘤患者的指标特点。
如果治疗后TR活性水平为仍然大于10U/mL，数值预示生长控制不理想，临床如果为PD则为数据一致；
如果治疗后TR活性水平小于4U/mL，数值预示生长控制在正常人水平，临床可以判断为SD、PR、CR等为一致；反之，为不一致，
其中CR为完全好转，PR为部分好转，SD为疾病稳定，PD为疾病进展，所述肿瘤优选肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌，所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。
进一步地，当TR活性大于10U/mL时，OS/TR比值小于5；当10U/mL≥TR活性＞4U/mL时，OS/TR比值小于3U/mL。所述OS/TR的比值是根据正常人与肿瘤患者的测试统计后获得的。
(4)本发明还提供一种测试试剂在制备用于在术前、术中、术后检测癌症治疗进程的药物中的用途，所述测试试剂包括分别独立存在的：
(a)测定样品中总巯基含量的试剂；和
(b)硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物。
所述癌症是肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌。
发明的效果：
1.本申请实验表明TR活性水平可以对临床的肿瘤患者进行疗效监测，即对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案，在进行相关治疗前、中和/或后，进行TR活性监测，可以预知治疗的控制效果，同时对于手术后的肿瘤患者也可预知其术后复发以及其程度。
2.本申请实验表明肺癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌4种肿瘤均表现以上数据随临床控制评价一致性的特点，虽然不是100％一致，但是一致性表现比较高，和临床目前常用的其它指标相比如CEA(实施例6)，具有更好的灵敏度，TR能实时反映手术变化情况，即术前高，术后低，说明TR活性监测用于临床治疗监测具有比现有技术更好的效果。
3.已经是肿瘤的患者在其确诊的时候临床上已经给其明确了是肺癌、或者何种肿瘤，TR对于任何一种指定的肿瘤重要的是提供了一种用于临床治疗时的监测方法，明显优于现有的临床肿瘤标志物检测；方便于临床的CT/PET或者有创的镜检技术；可以个性化的用于各种治疗方案的辅助诊断评价。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，但本领域技术人员了解，下述实施例只是对本发明的进一步说明，并非限定本发明的实质。任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
本发明采用TrxR的特异性抑制剂抑制TrxR活性，通过背景扣除法测定生物样品中的TrxR活性，来测定样品中TrxR的活性或含量。
本发明人进一步发现通过测定样品中的TrxR活性或含量，并结合样品中的氧化应激(Oxidative Stress，OS)水平与测量的TrxR的活性(TR)的比值，即OS/TR可以评价体内的抗疾病，特别是抗肿瘤水平。具体测定原理为：
5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)能被-SH基团还原，产生2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，而TNB在405～412nm处有强烈的紫外吸收，因此可以通过检测TNB的生成量来反映样品中的-SH含量。
生物样品中有多种成分含有-SH基团，直接用DTNB测量样品中的硫氧还蛋白还原酶会产生非常大的误差。然而，本发明人发现通式1或通式2的化合物，尤其是表1中的有机硒化合物Ⅰ-Ⅺ可作为TrxR的特异性抑制剂特异性地与TrxR中的巯基发生反应，而很难与TrxR之外的巯基发生反应。利用本发明的化合物能够测定复杂体系，包括血液和组织匀浆液样品中的TrxR活性。
另外，考虑到疾病如异常增生发生时在体内产生多种生物、生理等复杂变化，通过测定单一检测指标来评价抗疾病水平的准确性非常有限，为了进一步提高预测定内抗疾病如抗肿瘤水平的可靠性，本发明人首次提出通过计算样品中的氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值，即OS/TR来机体内的抗疾病状况。
本发明中的“样品”是指来自生物的任何组织或分离自其中的部分，所述“样品”优选血液、体液、组织匀浆液，并最优选血液，其中所述血液可以是血清、血浆等组分。
本发明中所述的硫氧还蛋白还原酶活性(TR)是指以硫氧还蛋白还原酶中的巯基含量表示的活性，其中样品中的巯基含量通过巯基与DTNB反应产生的TNB在405nm处的吸光度来表示，所述硫氧还蛋白还原酶活性(TR)的计算方法为：其中，△A/min＝(△A样品-△A样品抑制剂)]/7min；△A样品＝A样品420s-A样品0s；△A样品抑制剂＝A样品抑制剂420s-A样品抑制剂0s，所得硫氧还蛋白还原酶活性，即每分钟每mL样品催化DTNB的纳摩尔量。
本发明中所述用于测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的方法中，测定样品中的总巯基含量可以采用任何已知的能够指示出总巯基含量的方法，包括测量巯基含量的直接方法，或通过能够表示出巯基含量的指标的间接方法，所述指标包括吸光光度值等。测定样品时,根据不同的样品，选择使用不同量的上述试剂或化合物，对此并不特定限定。
本发明中所述的评价体内抗疾病水平的方法中，所述氧化应激水平可以采用任何已知的测量方法来测定，如硫代巴比妥酸法，也可以利用本发明的测量TrxR的方法中测量的未加硫氧还蛋白还原酶特异性抑制剂时样品中的总△A，通过△A样品×224来计算。本发明中所述的OS/TR可以通过(△A样品×224)/TR来计算。
另外，当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为1附近或1以下时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为1附近或1以上至10附近或10以下、并且所述氧化应激水平与硫氧还蛋白还原酶活性的比值为5附近或5以上时，体内抗疾病水平高；当所述硫氧还蛋白还原酶的活性为10附近或10以上时，体内抗疾病水平低。
实施例1
血液中硫氧还蛋白还原酶活性的测定方法:
1.酶标仪测定条件
在Ascent Software Version2.6控制的模式下，
振荡：时间5s，速度1020rpm；
测量模式：连续；
测量类型：动态；
时间间隔：30s；
测量次数：15；
波长：405nm。
在对实际血液样品进行分析时，每个分析批(Run)建立一条标准曲线，用以计算该分析批样品中待测物的浓度。
2.测定过程
2.1工作液的配制：取1M K2HPO4615ml、1M KH2PO4385ml混匀，调pH至7.0，内加EDTA2924mg、BSA200mg，溶解，4℃保存。
2.2抑制剂工作液(25μl)的配制：将20mM化合物Ⅰ的储备液用工作液稀释至25μM，4℃避光保存。
2.3事先将酶标仪打开预热，设置其测量参数：先在1020rpm下振荡混匀5s，然后在波长405nm下连续测定吸光度，间隔30s，测量15次，总计时间7min。储存于-20℃的血样置于4℃解冻成液体，4℃储存的工作液和抑制剂工作液放在摇床上混匀。
2.4取96孔板，设置样品孔和抑制剂孔，每孔各设3组平行实验。
2.5样品孔、抑制剂孔各加入工作液60μl、40μl。
2.6抑制剂孔每孔加入20μl抑制剂工作液。
2.7样品孔、抑制剂孔各加入血样20μl。
2.896孔板立即包锡纸避光，于摇床上混匀5s，立即放入37℃中孵育30min。
2.9DTNB工作液和NADPH工作液的配制：按600μl工作液+1mg NADPH、4ml工作液+15.9mg DTNB的比例，避光，溶解，室温下于摇床上摇匀。
2.1037℃孵育结束后，室温下样品孔、抑制孔各加入NADPH工作液20μl，避光，于摇床上混匀5s。
2.11将96孔板放在酶标仪上，用排枪迅速向各孔加入100μl DTNB工作液，在确保没有气泡的前提下，按照上述酶标仪的测定条件开始测量。
实施例2
用于血液中硫氧还蛋白还原酶活性测定的试剂盒:
本发明的试剂盒可含有:
1.DTNB粉末49.8mg，避光，室温保存；
2.NADPH粉末4.2mg，避光，-20℃保存；
3.10×工作液(1M磷酸钾缓冲液，PH＝7.4，内含73.1mg EDTA，5mg BSA。)2mL，4℃保存；
4.TrxR抑制剂溶液(含有2.5mM选自化合物Ⅰ-Ⅺ之一的抑制剂)，100uL，-20℃保存；
5.阳性对照：大鼠肝脏TrxR，300U/mg XX Unit，-20℃保存；
6.TNB标准品；
所述的检测试剂可用于100次测试；
本发明试剂盒的使用方法：
1.取2mL的10×工作液(0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.4)用去离子水定容至20mL(内含73.1mg乙二胺四乙酸(EDTA)，5mg牛血清白蛋白(BSA))，得到1×工作液，室温下使用，可供100孔检测；
2.称取39.6mg DTNB溶解于10mL的1×工作液中，避光室温保存，现用现配；
3.称取4.2mg NADPH溶解于2ml的1×工作液中，避光4℃待用，临用前避光恢复至室温；
4.TrxR抑制剂工作液(25μM)：取10μl抑制剂储备液(2.5mM)，加入1×工作液，稀释至1mL，供50孔检测，室温下使用。
利用本发明试剂盒测定TrxR的操作步骤
1.取96孔板，板底洁净透明，在405nm处无干扰吸收；
2.样品孔加入：20μl样品+60μl0.1M磷酸钾缓冲液；
3.样品+抑制剂孔加入：20μl样品+20μl抑制剂工作液+40μl0.1M的1×工作液(0.05M磷酸钾缓冲液)；
4.将加样后的96孔板置于37℃，避光孵育1h；
5.向各个样品孔加入20μl的NADPH工作液后，再加入100μl的DTNB工作液，室温下，波长405nm处，立即记录初始吸光度值(A0s)并连续测定420s吸光度值(A420s)。
各孔加样方式见表3。
表1 加样方式
根据TrxR活性决定，可不设阳性对照组。另外，试剂盒还可以制备成200Test或50Test的包装。试剂盒中10×缓冲液应为无色透明的液体，放置时间长后容许少量可见的蛋白沉淀，为牛血清白蛋白的盐析沉淀，超声后可以溶解，不影响测定。TrxR活性抑制剂室温下为淡黄、类黄或无色透明澄清的溶液，低于DMSO熔点的温度储存时为固体，融化后使用。DTNB为干燥的浅黄色粉末，无潮湿结块，粉末颗粒均匀。NADPH Na4为干燥的白色或类白色无定形粉末。
实施例3
1、正常组和肿瘤组TR活性检测数据
表2 正常组和肿瘤组TR活性检测数据统计
2、正常组和肿瘤组比较检验(两个正态样本比较检验)F检验
TR(正常)～N(μTR(正常)，σ2 TR(正常))
TR(肿瘤)～N(μTR(肿瘤)，σ2 TR(肿瘤))
F＝(S2 TR(肿瘤)/σ2 TR(肿瘤))/(S2 TR(正常)/σ2 TR(正常))≈S2 TR(肿瘤)/S2 TR(正常)～F(n(肿瘤)-1，n(正常)-1)
计算F＝S2 TR(肿瘤)/S2 TR(正常)
判断F﹤Fα/2(n(肿瘤)-1，n(正常)-1)，P>α，两者无显著性差异
判断F≥Fα/2(n(肿瘤)-1，n(正常)-1)，P<α，两者有显著性差异
表3 常组和肿瘤组比较检验
3、正常组和肿瘤组比较检验(两个正态样本比较检验)u检验
均值比较检验：σ2 TR(肿瘤)，σ2 TR(正常)未知，大样本(n(肿瘤)>50，n(正常)>50)，u检验：
u＝((ˉTR(肿瘤)-ˉTR(正常))-(μTR(肿瘤)-μTR(正常)))/√(S2 TR(肿瘤)/n(肿瘤)+S2 TR(正常)/n(正常))≈(ˉTR(肿瘤)-ˉTR(正常))/√(S2 TR(肿瘤)/n(肿瘤)+S2 TR(正常)/n(正常))～N(0,1)
计算u＝(ˉTR(肿瘤)-ˉTR(正常))/√(S2 TR(肿瘤)/n(肿瘤)+S2 TR(正常)/n(正常))
判断|u|﹤uα/2，P>α，两者无显著性差异
判断|u|≥uα/2，P<α，两者有显著性差异
表4 正常组和肿瘤组比较检验(两个正态样本比较检验)u检验
4、正常组和肿瘤组TR检测结果讨论
根据目前采用《硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒(分光光度法)》进行的医院的肿瘤组(309)人和正常组667人血中TR活性(如表4)发现，肿瘤组和正常组间存在显著差异。显示本方法具有良好的使用价值。
表5 肿瘤组(309)人和正常组667人血中TR活性
SPSS 报告数据
TR检测ROC曲线分析讨论和结论
对人血样本正常组+肿瘤组(280)的TR活性检测结果进行SPSS的ROC曲线分析得如下报告和曲线。
结果1：各样本的平均值和95％置信区间如下表所示：
VAR00007(计算代码)
| 均值(Mean) | 样本数量(N) | 标准差(Std.Deviation) |
| 5.075075 | 976 | 8.0325754 |
结果2：ROC曲线是美国国家临床实验室标准化委员会于1995年批准用作实验室试验的临床准确性评价的准则，它将某试验的灵敏度及特异性联系起来，总的评价诊断的准确性，故是一种全面的、科学的评价检测项目的方法。ROC曲线如下图所示：ROC曲线下面积为0.83，说明与金标准相比，本方法具有较高的诊断价值[1，2]，由于本方法采用的金标准为临床CT或者病理诊断，而此标准为目前最高诊断标准，且仅针对人血样标本，具有方便和简捷特点，因此《硫氧还蛋白还原酶(TR)活性检测试剂盒(分光光度法)》用于与异常增生密切相关的肿瘤生长的临床血样检测具有重要的实用价值。
ROC曲线下面积
根据本组研究数据，由于肿瘤(金标准)组TR平均数据为11.05U/mL，95％置信的上限为12.16U/mL，因此建议，TR等于11或者大于12时候，异常增生可能与肿瘤具有高相关性，特别是不可逆的持续性高TR活性。
正常人群的TR通常具有较低的活性值，其平均值为2.32U/mL，置信上限为2.68，因此建议无肿瘤发生的正常人群一般TR活性为小于3的范围。如果考虑随机人群中有5-10％的肿瘤患者，该上限可能提高，因此界定TR4.0U/mL-TR11U/mL为不同程度的异常增生，TR活性数值越高表明体内异常增生的状态越活跃。
本研究中的肿瘤患者在盲法随机入组后发现，大部分患者都处于手术后、化疗或放疗或放化疗结合治疗中，分别单独统计该部分人群发现大部分放化疗和手术患者TR水平小于4U/mL，处在正常人TR水平范围，说明各种治疗方法对于TR活性有一定的对应关系。
临床研究提示，本检测对于各种临床常规的治疗手段进行相对风险比评价发现：TR活性对肿瘤的放疗中/后人群(RR：65％)、手术后人群(RR：53％)、化疗人群后人群(RR：57％)具有下降敏感性，由于多数患者都处在治疗中，随机研究获得的患者治疗后恢复状况信息有限，目前有限的对肿瘤治疗后TR活性和患者状况对应分析：115例肿瘤患者治疗进程跟踪，放疗中或后、化疗后、手术后等TR活性多数(80％以上)表现治疗的对应关系，即TR活性治疗后比治疗前下降明显。在放疗中或后(85％以上)、化疗后(75％以上)TR活性下降至正常人的TR活性范围。手术后总体下降但是不同病人下降程度不完全一样，可能和肿瘤手术的具体情况有关(未手术干净或转移)；新辅助手术前总体水平低于治疗前水平，但是治疗后与其他治疗方法比无显著差异。各种治疗手段的治疗后的TR活性无显著性差异(1.6结果所示)；病情控制状态的TR活性都在正常人的TR活性范围，说明TR活性与治疗有一致的对应关系。
因此作为肿瘤治疗辅助检测跟踪，TR活性检测具有重要的提示意义，特别是对于各种治疗后常规检测跟踪、复发跟踪，由于本检测指标是一个异常增生的酶活性，本身敏感且是启动所有肿瘤相关蛋白工作的上游调控酶，相对肿瘤相关的其他蛋白类检测指标提前，出现较早，因此检测角度独特、靠前；操作方便和常规；因而具有其重要的指标特点和功能意义。
由于目前国内外尚无同类产品用于临床人血样异常增生评价，且该评价与肿瘤发生的肿瘤生长控制具有内在联系，因此该检测手段具有重要的应用价值。
实施例4TR活性检测用于临床宫颈癌患者临床治疗监测
采用本发明的试剂盒(含有化合物Ⅰ)测定40例临床体检受试者的血液中硫氧还蛋白还原酶的活性，结果见表6：
表6 宫颈癌临床报告
结论：TR活性水平与肿瘤治疗控制临床评价一致72例/114例(63.16％)，不一致42例/114例(36.84％)。
实施例4
鼻咽癌患者血中TR活性检测(数据)——对鼻咽癌治疗的临床疗效监测和预测研究
表7 鼻咽癌患者血中TR活性检测(数据)
注1：放疗后复查鼻咽部MRI显示鼻咽及颈部病变较前好转
结论：
(1)TR活性水平与鼻咽癌临床疗效评价一致(含部分一致)77例/85例(90.58％)；
(2)TR活性水平与鼻咽癌临床疗效评价不一致8例/85例(9.41％)。
实施例5评价TR水平与肺癌的临床疗效
表8 TR水平与肺癌的临床疗效
临床试验肺癌多次追踪TR活性检测及临床疗效评价分析基本信息
结论：
TR活性评价与临床肺癌一致。
实施例6
乳腺癌患者血中TR活性检测(数据)——对乳腺癌治疗的临床疗效监测和预测研究
表9 乳腺癌患者血中TR活性检测(数据)
结论：
TR活性评价与临床乳腺癌的一致性。
实施例7
胸外科肺癌患者术前术后TR活性检测研究统计分析与结论
(1)统计分析描述——频数分析
表10 肺癌术前术后TR值的频数统计
| 阳性(≥8*) | 阴性(＜8*) | 合计 |
| 术前 | 33 | 32 | 65 |
| 术后 | 1 | 64 | 65 |
*良恶性肿瘤CUTOFF点为8
表11 肺癌术前术后CEA值的频数统计
| 阳性(≥5.0) | 阴性(＜5.0) | 合计 | |
| 术前 | 9 | 39 | 48 |
| 术后 | 5 | 43 | 48 |
结论1：通过肺癌术前术后的TR值和CEA值的频数统计分析可以发现，术前TR阳性人数有33人，真阳性率达到50.77％，而CEA真阳性率18.75％，而术后TR的真阴性率达到98.46％，而CEA的真阴性率只有89.58％，因此对于肺癌而言无论从术前还是术后，TR的灵敏度和特异度都优于CEA。
(2)统计分析描述——秩和检验
表12 肺癌术前术后TR值的秩和检验
经Wilcoxon秩和检验，肺癌患者术前术后的TR值有统计学差异(Z＝-6.36，P<0.0001)。
表13 肺癌术前术后CEA的秩和检验
经Wilcoxon秩和检验，肺癌患者术前术后的CEA值无统计学差异(Z＝-1.14，P＝0.25)
结论2：结合肺癌患者术前术后TR与CEA变化的秩和检验结果可知，TR在手术前后的变化具有统计学差异，而CEA在手术前后的阴阳性变化没有统计学差异，可说明TR相对于CEA更能实时反映手术变化情况。结合统计描述可知，CEA反映术前肿瘤组织生长情况的能力相对于TR差。
(3)统计分析描述——一致性比较
TR与CEA的一致性比较
a.术前TR与CEA的配对卡方检验结果
术前TR与CEA配对的数据共有48对，经校正的配对卡方检验(因20+5<40),得卡方值为7.84，相应的P值为0.005(P<0.05)，说明术前TR与CEA具有显著差异性。
b.术前TR与CEA的一致性系数
术前TR与CEA的一致性Kappa系数为-0.04，该系数经假设检验得P为0.71，不拒绝Kappa＝0的假设，即术前TR与CEA值无关联。
c.术后TR与CEA的配对卡方检验结果
术后TR与CEA配对的数据共有48对，经校正的配对卡方检验(因1+5<40),得卡方值为1.50，相应的P值为0.22(P>0.05)，说明术后TR与CEA无显著差异性。
d.术后TR与CEA的一致性系数
术后TR与CEA的一致性Kappa系数为-0.04，该系数经假设检验得P为0.73，不拒绝Kappa＝0的假设，即术后TR与CEA值无关联。
工业实用性
如上所述，根据本发明的TR测定方法及试剂盒，能够以优异的灵敏度检测样品，特别是血液等复杂样品中的TR，对于测定体内的抗宫颈癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌水平非常有用，另外本发明的试剂或方法还可以用于体内宫颈癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌发生风险的评估，以及宫颈癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌预后等医疗领域。
Claims (10)
1.一种测试试剂在制备评价临床肿瘤患者临床治疗监测的药品中的应用，所述测试试剂包括分别独立存在的：
(a)测定样品中总巯基含量的试剂；和
(b)硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌，
所述临床治疗包括对于各种临床化疗、放疗或者其它的临床治疗方案。
3.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，如果TR活性大于10U/mL，数值显示为肿瘤患者；如果10U/mL≥TR活性≥4U/mL，数值显示具有肿瘤患者的指标特点，
更进一步地，当TR活性大于10U/mL时，OS/TR比值小于5；当10U/mL≥TR活性＞4U/mL时，OS/TR比值小于3U/mL，所述OS/TR的比值是根据正常人与肿瘤患者的测试统计后获得的，
如果治疗后TR活性水平仍然大于10U/mL，数值预示生长控制不理想，而且，临床如果为PD，则为数据一致；
如果治疗后TR活性水平小于4U/mL，数值预示生长控制在正常人水平，临床可以判断为SD、PR、CR等为一致；反之，为不一致，
其中CR为完全好转，PR为部分好转，SD为疾病稳定，PD为疾病进展。
4.根据权利要求1-2任一项的应用，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自下述通式1或通式2所示结构的化合物，
通式1中：
X0为C或N；
X1为Se；
R1为氢，C1-C6烷基、C3-C7环烷基、
其中Ra、Rb、Re、Rf、Rg各自独立地为：C1-C6烷基；Rc，Rd各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基；
R2和R3分别独立的选自：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基；
通式2中：
X0为C或N；
X1为Se；
R'1为C1-C12的亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚环己烷、亚环戊烷、-(CH2)mSS(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mN(CH3)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)m，m为1-6的整数，n为大于1的整数；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
5.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自下述通式1或通式2所示结构的化合物，
通式1中：
X0为C或N；
X1为Se；
R1为氢，C1-C6烷基、C3-C7环烷基、
其中Ra、Rb、Re、Rf、Rg各自独立地为：C1-C6烷基；Rc，Rd各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基；
R2和R3分别独立的选自：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基；
通式2中：
X0为C或N；
X1为Se；
R'1为C1-C12的亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚环己烷、亚环戊烷、-(CH2)mSS(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mN(CH3)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)m，m为1-6的整数，n为大于1的整数；
R'2、R'3、R'4和R'5各自独立地为：氢、卤素、腈基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、SO3R、COOR、聚乙二醇、O-SO3R或O-PO3RR，其中R可以为氢、C1-C6烷基或芳基，其中芳基可以为苯基或苯并基。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物选自下述化合物I-Ⅺ任一项：
7.根据权利要求1-2或5-6任一项的应用，其特征在于，所述测定样品中总巯基含量的试剂是能够与巯基反应、并指示出样品中的含量的试剂，所述试剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述测定样品中总巯基含量的试剂和硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物可以固体、粉末，溶液形式提供。
9.根据权利要求1-2或5-6或8任一项的应用，其特征在于，所述测定样品中硫氧还蛋白还原酶活性的试剂还可含有NADPH(还原性辅酶II)或者K2HPO4、KH2PO4、EDTA和/或BSA。
10.一种测试试剂在制备用于在术前、术中、术后检测癌症治疗进程的药物中的用途，所述测试试剂包括分别独立存在的：
(a)测定样品中总巯基含量的试剂；和
(b)硫氧还蛋白还原酶特异性抑制化合物，
所述癌症是肺癌、宫颈癌、乳腺癌或鼻咽癌。
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