CN1995378A - 谷丙转氨酶测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

谷丙转氨酶测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。本发明目的是提供有效消除内源性丙酮酸干扰的谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase，ALT)测定方法及其测定试剂盒，使检测结果更准确。采用的技术方案是：使用两步法检测，第一步试剂1与样本先反应，丙酮酸氧化酶使样本中内源性丙酮酸反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧，以消耗样本中的内源性丙酮酸。第二步再与试剂2反应，利用L－丙氨酸和α－酮戊二酸启动血清ALT反应，检测生成物的线性反应吸光度变化计算血清ALT的活性。因此本发明提供的谷丙转氨酶测定方法及其测定试剂盒，检测更准确，便于推广使用。

Description

谷丙转氨酶测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒

技术领域

本发明涉及检测血清或血浆中谷丙转氨酶活性浓度的测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。

背景技术

血清谷丙转氨酶(AlanineAminotransferase，ALT)活性升高，是病毒性肝炎早期最早出现的异常性指标，被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的一种检测指标。在疾病普查及献血员筛查时，血清谷丙转氨酶活性的检测是必检项目。

目前ALT酶活性的检测从方法学上主要分为赖氏法、速率法和丙酮酸氧化酶法。中国90年代初出现丙酮酸氧化酶法，其原理为：ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸反应生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下氧化反应生成过氧化氢，过氧化氢与色原剂和4-氨基安替比林在过氧化物酶的催化下反应生成红色的化合物，根据生成的红色化合物线性反应吸光度的变化计算ALT的酶活浓度。反应式如下：

因为酶促反应的线性范围比较宽，酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高；由于生成的红色化合物可以用酶标仪检测，并可用全自动加样仪加样品、试剂，可自动读取血样本条码，很大程度减少了人为误差，检测的精确性好；操作简便，一次可以检测上百份样本；数据可保留与打印，利于标准化管理和网络化管理。因此，测定ALT活性的丙酮酸氧化酶法特别适用于血站系统的献血员筛查和城镇、社区医院和基层医疗单位病毒性肝炎相关疾病的普查。

目前市场上丙酮酸氧化酶法的谷丙转氨酶检测试剂盒，检测谷丙转氨酶活性浓度时均采用一步法检测模式，即由含有丙酮酸氧化酶、L-丙氨酸、α-酮戊二酸和过氧化物酶等物质共同组成的工作液，与样本反应后加入终止液终止反应，测定生成的红色化合物的吸光度，根据生成物线性反应吸光度的变化计算ALT的酶活浓度。这种检测方法均存在一个共同的问题：当样本未及时分离时，由于血液样本中的红、白细胞糖酵解作用产生的内源性丙酮酸也可参与反应，导致使用一步法测定ALT活性时结果假性偏高，检测结果并不能真正地反映血清ALT的活性浓度。致使检验血清ALT项目准确度低，对我国无偿献血工作的开展产生负面影响，也可能因不准确的ALT测定结果导致对临床疾病的误诊。

发明内容

为解决内源性丙酮酸对谷丙转氨酶(ALT)测定的干扰，本发明提供丙酮酸氧化酶法的谷丙转氨酶测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒。采用两步法检测模式，样本与含有丙酮酸氧化酶和过氧化氢酶的试剂1先反应后，消耗了样本中的内源性丙酮酸，再与含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸的试剂2反应，检测结果更真实地反映血清谷丙转氨酶的活性，检测准确度高，因此有效消除内源性丙酮酸干扰的谷丙转氨酶测定方法和谷丙转氨酶测定试剂盒可以得到切实的推广使用。

为实现消除内源性丙酮酸干扰的发明目的，采用如下技术方案：测定血清ALT活性时，使用两步法检测，即第一步试剂1与样本先反应后，第二步再加入试剂2反应。具体过程如下：

第一步：利用试剂1中丙酮酸氧化酶的催化作用使样本中的内源性丙酮酸反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧。第一步所包含的反应式为：

第二步：利用试剂2含有的过氧化氢酶抑制剂如叠氮钠等物质抑制过氧化氢酶的活性，利用试剂2含有的L-丙氨酸和α-酮戊二酸启动血清ALT反应。第二步所包含的反应式为：

第二步反应至一定时间后加入终止液终止反应，检测生成的红色化合物的线性反应吸光度变化，计算血清ALT的活性。因此通过两步法模式，检测结果可以更真实地反映血清ALT的活性。

检测过程中，试剂1与样本的体积比例控制在1～5范围内；试剂1与试剂2的体积比例控制在0.05～20范围内；检测过程中的每一步温度控制在15℃～40℃范围内；每一步的反应时间控制在6min～30min范围内；检测生成物在主波长为400nm～600nm的吸光度变化值计算血清ALT活性。

实现本发明的谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，包括四种配套试剂：试剂1、试剂2、终止液和校准血清。为消除内源性丙酮酸的干扰，本发明提供的谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒中的试剂1含有1KU/L～10KU/L的丙酮酸氧化酶，2KU/L～5KU/L的过氧化氢酶；试剂2含有0.5mol/L～5mol/L L-丙氨酸和5mmol/L～50mmol/Lα-酮戊二酸，含有10mmol/L～100mmol/L叠氮钠。

试剂1的主要组成成份如下：

缓冲液                 50mmol/L～200mmol/L

丙酮酸氧化酶           1KU/L～10KU/L

过氧化氢酶             2KU/L～5KU/L

过氧化物酶             1KU/L～10KU/L

稳定剂                 50mmol/L～2000mmol/L

试剂2的主要组成成份如下：

缓冲液                 50mmol/L～200mmol/L

叠氮钠                 10mmol/L～100mmol/L

L-丙氨酸               0.5mol/L～5mol/L

α-酮戊二酸            5mmol/L～50mmol/L

4-氨基安替比林         10mmol/L～100mmol/L

色原剂                 1mmol/L～10mmol/L

由于酶反应需要合适的PH范围和合适的离子强度的缓冲液，本发明提供的试剂盒由PH5.0～8.0范围的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或一种以上组成。

为保持试剂的稳定性，在试剂中加入了稳定剂，可以在牛血清白蛋白、乙二醇、三乙醇胺、甘油、糖类、钾盐、钠盐、镁盐等物质中进行选择。

色原剂为对溴苯酚、苯酚、N，N-二甲基联苯胺、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(DHBS)、二甲基苯胺(DMA)、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(EHSPT)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(HMB)等物质中的一种。

终止液是乙二胺四乙酸盐、硝酸盐、叠氮钠和重金属离子等物质中的一种。

有益效果：本发明提供的谷丙转氨酶(ALT)测定方法及谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，采用丙酮酸氧化酶法原理，在酶标仪上对样本进行两步法模式检测。即在ALT测定中，首先使样品与含有丙酮酸氧化酶和过氧化氢酶的试剂1反应，将样本中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗，再加入含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸的试剂2启动ALT的催化反应，检测生成物的线性反应吸光度变化。因此使用本发明提供的谷丙转氨酶(ALT)测定方法及谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，能够有效地消除内源性丙酮酸的干扰，使检测结果更准确地反映血清ALT活性。

具体实施方式

下面用实施例进一步说明本发明。本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规条件进行。

实施例一、谷丙转氨酶测定试剂盒的试剂1和试剂2组成如下：

试剂1的主要组成成份如下：

缓冲液               100mmol/L

丙酮酸氧化酶         2KU/L

过氧化氢酶           2KU/L

过氧化物酶           3KU/L

稳定剂               1000mmol/L

试剂2的主要组成成份如下：

缓冲液               100mmol/L

叠氮钠               30mmol/L

L-丙氨酸             1mol/L

α-酮戊二酸          30mmol/L

4-氨基安替比林       20mmol/L

TBHBA                2mmol/L

实施例二、消除内源性丙酮酸干扰的两步法测定ALT活性的方法如下：

1、酶标板上，设一孔试剂空白孔，两孔标准孔，其余为测定孔。每孔加50ul试剂1。

2、空白孔内加入蒸馏水20ul，标准孔内分别加校准血清20ul，测定孔分别加入待检血清20ul，混匀后置37℃温育10分钟。

3、每孔加50ul试剂2，混匀后置37℃温育10分钟。

4、每孔加100ul终止液，混匀后于酶标仪比色。主波长为492nm，副波长为620nm，输入试剂空白孔、标准孔及测定孔位置，输入校准血清ALT活性浓度，以试剂空白孔调零，进行检测，测定结果按以下公式计算ALT活性：

血清ALT活性(U/L)＝测定孔吸光度/标准孔吸光度×校准血清ALT活性浓度

实施例三、内源性丙酮酸对一步法检测样本的干扰：

由于血液标本采集后未及时分离血清/血浆时，标本中的红、白细胞糖酵解作用产生内源性丙酮酸，用一步法检测模式测定ALT活性浓度时，内源性丙酮酸对ALT酶活性浓度测定产生干扰。具体试验如下：

1、于酶标板上，分别加入样本为：0.125mg/ml丙酮酸钠、0.0625mg/ml丙酮酸钠、0.0313mg/ml丙酮酸钠、44.5U/LALT、0.125mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT、0.0625mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT、0.0313mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT。

2、将试剂1与试剂2按1∶1比例配成工作液。

3、每孔加入100ul工作液，与样本混匀后于37℃反应15分钟。

4、每孔加入100ul终止液，于酶标仪比色。主波长492nm，副波长620nm，测定OD值。

5、结果见表1。

表1  内源性丙酮酸对一步法检测样本的干扰

检测模式	样本	OD值
			一步法模式	0.125mg/ml丙酮酸钠	1.062
0.0625mg/ml丙酮酸钠	0.533
		0.0313mg/ml丙酮酸钠		0.260
44.5U/LALT	0.248
		0.125mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT		1.237
0.0625mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT	0.745
		0.0313mg/ml丙酮酸钠+44.5U/L ALT		0.516

表1说明：在含有44.5U/LALT的血清中加入不同浓度的丙酮酸钠，使用一步法模式检测时，丙酮酸钠对血清中ALT活性测定产生了干扰，使检测ALT的结果假性偏高，并且随着丙酮酸钠浓度的增高，干扰作用越显著。

实施例四、使用本发明提供的试剂盒进行两步法测定，分析对内源性丙酮酸的消除效果：

本试剂盒的特征是，试剂1含有丙酮酸氧化酶和过氧化氢酶，试剂2含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸底物，测定血清ALT活性时，采用两步法测定模式，第一步利用丙酮酸氧化酶的催化作用使内源性丙酮酸反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧，从而消耗内源性丙酮酸，达到消除内源性丙酮酸对血清ALT活性测定的干扰。第二步启动血清ALT的催化反应。具体试验如下：

1、于酶标板上，分别加入样本为：0.125mg/ml丙酮酸钠、0.0625mg/ml丙酮酸钠、0.0313mg/ml丙酮酸钠、44.5U/LALT、0.125mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT、0.0625mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT、0.0313mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT。

2、每孔加入50ul试剂1，混匀后置37℃温育10分钟。

3、每孔加入50ul试剂2，混匀后置37℃温育10分钟。

4、每孔加入100ul终止液，混匀后于酶标仪比色。主波长492nm，副波长620nm，测定OD值。

5、结果见表2。

表2两步法检测模式对内源性丙酮酸消除效果的测定：

检测模式	样本	OD值
			两步法模式	0.125mg/ml丙酮酸钠	0.186
0.0625mg/ml丙酮酸钠	0.099
		0.0313mg/ml丙酮酸钠		0.054
44.5U/LALT	0.181
		0.125mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT		0.346
0.0625mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT	0.28
		0.0313mg/ml丙酮酸钠+44.5U/LALT		0.225

将表1与表2进行比较，可以看出：使用本发明提供的谷丙转氨酶测定方法及谷丙转氨酶测定试剂盒，样本所含的内源性丙酮酸钠对ALT活性测定的干扰作用被有效地降低了。

因此与一步法检测模式相比，使用本发明提供的谷丙转氨酶(ALT)测定方法及谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒可以有效地消除内源性丙酮酸的干扰作用。

Claims (7)

1、有效地消除内源性丙酮酸干扰的谷丙转氨酶活性浓度的测定方法：测定血清ALT活性时，使用两步法检测，第一步试剂1与样本先反应，试剂1中的丙酮酸氧化酶可使样本中内源性丙酮酸反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧，从而消耗样本中的内源性丙酮酸。第二步再与试剂2反应，试剂2含有的过氧化氢酶抑制剂如叠氮钠等物质抑制过氧化氢酶的活性，含有的L-丙氨酸和α-酮戊二酸启动血清ALT反应，检测生成物的线性反应吸光度变化计算血清ALT的活性。

2、根据权利要求1所述的谷丙转氨酶活性浓度的测定方法，其特征在于：检测过程中，试剂1与样本的体积比例控制在1～5范围内；试剂1与试剂2的体积比例控制在0.05～20范围内；检测过程中的每一步温度控制在15℃～40℃范围内；每一步的反应时间控制在6min～30min范围内；检测生成物在主波长为400nm～600nm的吸光度变化值计算血清ALT活性。

3、本发明提供的谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，包括四种配套试剂：试剂1、试剂2、终止液和校准血清。

试剂1主要由以下成份组成：

缓冲液          50mmol/L～200mmol/L

丙酮酸氧化酶    1KU/L～10KU/L

过氧化氢酶      2KU/L～5KU/L

过氧化物酶      1KU/L～10KU/L

稳定剂          50mmol/L～2000mmol/L

试剂2主要由以下成份组成：

缓冲液          50mmol/L～200mmol/L

叠氮钠          10mmol/L～100mmol/L

L-丙氨酸        0.5mol/L～5mol/L

α-酮戊二酸     5mmol/L～50mmol/L

4-氨基安替比林  10mmol/L～100mmol/L

色原剂          1mmol/L～10mmol/L

4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所用缓冲液由PH5.0～8.0范围内的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或一种以上组成。

5、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：稳定剂可以在牛血清白蛋白、乙二醇、三乙醇胺、甘油、糖类、钾盐、钠盐、镁盐等物质中进行选择。

6、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：色原剂为对溴苯酚、苯酚、N，N-二甲基联苯胺、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(DHBS)、二甲基苯胺(DMA)、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(EHSPT)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(HMB)等物质中的一种。

7、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：终止液为乙二胺四乙酸盐、硝酸盐、叠氮钠和重金属离子等物质中的一种。