CN101281200A - 碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种碱性磷酸酶标记检测用试剂盒，包括可与靶向物质结合的碱性磷酸酶标记物，相应底物，含抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与上述靶向物质结合的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。免疫测定用试剂盒，包括经抗原抗体反应与待测物质结合的第一结合物，固定含第一结合物和待测物质的复合物的固相，与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物，含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。免疫测定的方法，包括固定步骤在固相上形成一种复合物；反应步骤让碱性磷酸酶与相应底物反应；测定步骤检测产物。

Description

碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法

技术领域：

本发明涉及一种碱性磷酸酶(ALP)标记检测用试剂盒。本发明还涉及一种免疫测定用试剂盒及用该免疫测定用试剂盒的免疫测定方法。

背景技术：

碱性磷酸酶(以下也称ALP)是一种在酶联免疫测定法中通常作为标记使用的酶。ALP在从高等动物到细菌几乎所有生物中都能看到，在高等动物中有内脏器官特异性异酶。血液等体液中已知含有来源于肝脏的ALP和来源于骨骼的ALP等内源性ALP。因此，以ALP为标记进行免疫测定时，不仅ALP标记，来源于标本的内源性ALP也与底物反应，从而难以获得正确的测定结果。

作为有助于抑制这种内源性ALP影响的物质，有针对内源性ALP的抑制剂(以下也称内源性ALP抑制剂)。以下列举使用内源性ALP抑制剂抑制内源性ALP影响的方法。

美国专利第5948630号作为减少内源性ALP影响的方法，介绍使用含人ALP抑制剂的漂洗成份。

EP公开公报第530490号上记述的方法是，把ALP标记到结合在CD4等细胞表面标记物的抗体，用此ALP标记抗体分类淋巴细胞的亚型。在此，使用了含底物的约pH9.5的缓冲剂/底物溶液和含左旋咪唑的pH7.4的细胞清洗液。

美国专利第5948630号在实施例中记述，使用含有作为底物的4-MUP和作为内源性ALP抑制剂的左旋咪唑的底物/清洗液。ALP的pH为碱性，故一般为了在合适的条件下让ALP标记与底物反应，含底物的试剂都被设定为碱性。在专利文献1中也记述了洗涤剂成份的合适pH范围约为7.0至10.0。然而，左旋咪唑等内源性ALP抑制剂在碱性条件下会变得不稳定。因此，有时专利文献1中记述的洗涤剂成份为了稳定内源性ALP抑制剂而不能使用。

根据EP公开公报第530490号上的记述，将用ALP标记抗体处理的细胞用细胞清洗液清洗二遍后，再加入缓冲剂/底物溶液测定ALP活性所引起的染色。一般来说，细胞清洗液在清洗后要从细胞除去，因此，ALP标记和底物反应的反应液中实际上不含细胞清洗液。因此，当清洗时未能充分抑制内源性ALP时，ALP标记和底物反应时就可能无法消除内源性ALP的影响。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明提供一种碱性磷酸酶标记检测用试剂盒，包括：可与靶向物质结合的碱性磷酸酶标记物，碱性磷酸酶相应的底物，含抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与所述靶向物质结合的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

所述靶向物质是含待测物质和经抗原抗体反应可与之结合的第一结合物的复合物中的待测物质。

所述的试剂盒可用于竞争法免疫测定，此时所述靶向物质指经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物。

所述碱性磷酸酶标记物含可与靶向物质结合的第二结合物和碱性磷酸酶。

所述的试剂盒含有所述辅助试剂液的碱性磷酸酶和底物的反应液为碱性。

所述底物液为碱性，所述辅助试剂液为中性或酸性。所述底物液和所述辅助试剂液含有缓冲剂，所述底物液有大于所述辅助试剂液的缓冲能。

所述抑制剂为左旋咪唑。

所述碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶为来源于细菌的碱性磷酸酶或来源于肠的碱性磷酸酶。

本发明还提供一种免疫测定用试剂盒，包括：经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物，固定含第一结合物和待测物质的复合物的固相，可与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物，含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

本发明再提供一种使用竞争法的免疫测定用试剂盒，包括：碱性磷酸酶标记物，可通过抗体抗原反应与待测物质和碱性磷酸酶标记物结合的第一结合物，固定第一结合物的固相，含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与第一结合物结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

本发明另提供一种免疫测定的方法，包括：固定步骤，在固相上形成一种复合物，所述复合物含有标本中的待测物质、可与待测物质结合的碱性磷酸酶标记物、经抗原抗体反应可与待测物质结合的、并可与固相结合的第一结合物；反应步骤，让与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶与底物液中所含碱性磷酸酶相应底物在含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及测定步骤，检测碱性磷酸酶与底物反应生成的产物。

本发明又一种使用竞争法的免疫测定方法，包括：混合步骤，将标本、碱性磷酸酶标记物、经抗原抗体反应可与碱性磷酸酶标记物和标本中的待测物质结合的第一结合物和固定第一结合物的固相混合起来；反应步骤，让与固定在固相上的第一结合物结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶与底物液中所含碱性磷酸酶相应底物在含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及测定步骤，检测碱性磷酸酶与底物反应生成的产物。所述混合步骤可以先混合标本、第一结合物和固相后，再在所得的混合物中混入碱性磷酸酶标记物。所述混合步骤可以先混合标本、第一结合物和碱性磷酸酶标记物后，再在所得的混合物中混入固相。

附图说明：

图1为本发明的免疫测定用试剂盒的一实施方式的模式图。

图2为在参考例中加入加速试验后的比较试剂1的分光光度计用比色皿的侧面照片(a)和加入加速试验后的粒子分散液的分光光度计用比色皿的侧面照片(b)。

图3为显示实施例中使用比较试剂2时各阴性标本的分布状态的分布图(直方图)。

图4为显示实施例中使用粒子分散液时各阴性标本的分布状态的分布图(直方图)。

具体实施方式：

下面将参照附图说明本发明的优选实施方案。

ALP标记检测用试剂盒

在本说明书中，所谓“ALP标记检测用试剂盒”是一种用于检测ALP标记的试剂盒，包括，可与靶向物质结合的碱性磷酸酶(ALP)标记物、ALP相应的底物及含抑制内源性ALP的抑制剂、在与上述靶向物质结合的ALP标记物中的ALP和底物反应时添加的辅助试剂液。

在本说明书中所谓的ALP标记检测用试剂盒所含“辅助试剂液”是在上述固相免疫测定法中，固相上的ALP标记与底物反应时添加的试剂。在ALP标记检测用试剂盒中辅助试剂液是作为与底物液不同的试剂设置的。辅助试剂液只要是固相上的ALP标记与底物反应时添加的试剂液即可，比如当固相为粒子是，可以作为粒子分散液使用，以使与底物的反应在有ALP标记的粒子分散于液态中的状态下进行。

本说明书中所谓的“接触”包括混合。

免疫测定用试剂盒

上述ALP标记检测用试剂盒也可以作为在用固相的免疫测定法中使用的免疫测定用试剂盒。

本实施方式的免疫测定用试剂盒是固相免疫测定法使用的检测ALP标记的试剂盒。上述固相免疫测定法包括利用夹心法的免疫测定法和利用竞争法的免疫测定法。在此对这些测定法进行简单的说明。

本说明书中的“第一结合物”在夹心法中，指经抗原抗体反应可与标本中待测物质结合、且可与固相结合的物质。在竞争法中，“第一结合物”指经抗原抗体反应可与ALP标记物和标本中待测物质结合、且可与固相结合的物质。

本说明书所谓“游离第一结合物”指标本、第一结合物和固相混合所得第一结合物中，未形成含待测物质的复合物、即没有与标本中的待测物质结合的第一结合物。

固相免疫测定法包含的步骤为：让待测物质、经抗原抗体反应与该待测物质结合的第一结合物与固相接触，在固相上形成至少含待测物质和第一结合物的复合物。一般说来，上述复合物因上述第一结合物固定在上述固相上而吸附于固相上。此固相上不仅有上述复合物，还吸附有未与待测物质形成复合物的第一结合物(以下也称游离第一结合物)。

夹心法是在上述固相上吸附的物质(复合物和游离第一结合物)中，仅标记复合物，根据该标记的检测结果测定待测物质。

而竞争法是在固相上吸附的物质(复合物和游离第一结合物)中，标记游离第一结合物，根据该标记的检测结果测定待测物质。

上述第一结合物无特别限制，只要是经抗原抗体反应能与待测物质结合的物质即可。比如，如果待测物质是抗体，第一结合物可以是与该抗体特异性结合的抗原。作为第一结合物的抗原无特别限制，只要是有作为待测物质的抗体能识别的位点(表位)的抗原即可。

而如果待测物质为抗原，则作为第一结合物可以是与该抗原特异性结合的抗体。作为第一结合物的抗体是能与作为待测物质的抗原特异性结合的抗体即可，也包括抗体的碎片及其衍生物。

作为具体例子，可列举出Fab碎片、F(ab’)碎片、F(ab)2碎片和sFv碎片等。抗体类型可以使用IgG、IgM，但不限于此。

上述复合物只要是根据固相免疫测定法在固相上形成、且至少含有待测物质和第一结合物的复合物即可，无特别限制。比如当用结合到待测物质的一次抗体和结合到该一次抗体上的标记二次抗体标记复合物时，上述复合物可以含待测物质、第一结合物和一次抗体。

ALP标记物含有与靶向物质结合的第二结合物和ALP。

在此，“靶向物质”指成为ALP标记目标的物质，在夹心法中，是由待测物质和第一结合物构成的复合物中的待测物质。在竞争法中，是游离第一结合物。

因此，夹心法测定时，ALP标记物所含第二结合物能与上述步骤获得的固相上的复合物或游离第一结合物中复合物结合，该第二结合物被ALP标记。竞争法测定时，ALP标记物所含第二结合物能与上述步骤获得的固相上的复合物或游离第一结合物中游离第一结合物结合，该第二结合物用ALP标记。

上述第二结合物无特别限定，只要是免疫测定法使用的物质即可，可根据待测物质的种类和测定法等适当选择。

比如，当在运用夹心法的免疫测定法中，待测物质为抗原时，第二结合物是直接或间接地与作为待测物质的抗原结合的物质。

作为直接与抗原结合的第二结合物可以用与抗原特异性结合的抗体。该抗体只要能与作为待测物质的抗原特异性结合即可(无特别限定)，也包括抗体的碎片及其衍生物。具体比如有：Fab碎片、F(ab’)碎片、F(ab)2碎片和sFv碎片等。抗体类型可以使用IgG、IgM，但不限于此。此时，作为第一结合物的抗体和作为第二结合物的抗体最好识别抗原的不同位点(表位)。

作为能与作为待测物质的抗原间接结合的第二结合物，可以使用能与和抗原特异性结合的一次抗体结合的二次抗体。此时，二次抗体可结合一次抗体，一次抗体可结合待测物质。作为二次抗体比如有人抗相应的IgG、IgM、IgY等抗体。在上述一次抗体附加生物素时，可以用抗生朊类取代上述二抗作为第二结合物。

上述一次抗体只要能与作为待测物质的抗原特异性结合即可，无特别限制，也包括抗体的碎片及其衍生物。此时，作为第一结合物的抗体和作为第二结合物的抗体最好识别抗原的不同位点(表位)。上述二次抗体只要是与一次抗体结合的抗体即可，无特别限定，也包括抗体的碎片及其衍生物。

当免疫测定法为夹心法，待测物质为抗体时，第二结合物为能与作为待测物质的抗体结合的物质。作为这种第二结合物可以使用能与抗体结合的抗原和抗体。作为第二结合物的抗体如有相对于人抗的IgG、IgM、IgY等抗体。

当免疫测定法为竞争法，待测物质为抗原时，第二结合物为能与作为固化在固相上的第一结合物的抗体结合的物质。具体而言，可以使用能与作为第一结合物的抗体结合的抗原。作为第二结合物的抗原只要具有作为第一结合物的抗体能识别的位点(表位)即可，无特别限定。

当免疫测定法为竞争法，待测物质为抗体时，第二结合物为能与作为固化在固相上的第一结合物的抗原结合的物质。具体而言，可以使用能与作为第一结合物的抗原结合的抗体。作为第二结合物的抗体只要是能与作为第一结合物的抗原特异性结合的抗体即可，无特别限定，也包括抗体的碎片及其衍生物。

作为用于标记的ALP，只要不能被辅助试剂液中所含内源性ALP抑制剂抑制即可，无特别限定。比如有来源于肠的ALP、来源于菌的ALP等。作为来源于肠的ALP如有来源于牛肠的ALP等。作为来源于菌的ALP如有来源于大肠菌的ALP、来源于酶的ALP等。从比活性和生产率的观点来说，最好是来源于肠的ALP。用于标记的ALP可以由天然分离而得，也可以是用基因重组法和化学合成法等一直为人所知的方法合成的ALP。

作为标记使用的ALP的最佳pH因其种类不同而各异，但来源于肠的ALP的最佳pH值为pH9～10，来源于菌的ALP pH值为8～9。

在上述第二结合物标记ALP的方法可以利用众所周知的方法。作为标记ALP的方法比如有戊二醛法、高碘酸架桥法、马来酰亚胺架桥法、碳二亚胺法和活性酯法等。

在免疫测定用试剂盒中，ALP标记物可以为溶解于缓冲液的液态，也可以是冷冻干燥成固体、用时加水等液体使用的液态。从试剂盒使用操作的简便性来说，最好ALP标记物为溶解于缓冲液的液态。

辅助试剂液为固相免疫测定中使用的试剂液，含有抑制内源性ALP的抑制剂(以下也称内源性ALP抑制剂)，在固相上的ALP与底物反应时添加，该固相上吸附有结合了ALP标记物的复合物。

辅助试剂液为竞争法固相免疫测定中使用的试剂液，含内源性ALP抑制剂，在固相上的ALP与底物反应时添加，该固相上吸附有结合有ALP标记物的第一结合物。

即辅助试剂液为含有内源性ALP抑制剂的试剂，是在固相免疫测定法中，在固相上的ALP标记与底物反应时添加的试剂。辅助试剂液只要是固相上的ALP标记与底物反应时添加的试剂液即可，比如当使用粒子作为固相时，可以作为粒子分散液使用，以使与底物的接触在含有ALP标记的粒子分散在液体的状态下进行。

作为内源性ALP抑制剂，只要是不抑制标记用ALP而仅抑制来自标本的内源性ALP的物质即可，无特别限制。具代表性的内源性ALP抑制剂如有左旋咪唑。左旋咪唑化学式为(-)2，3，5，6-四氢-6-苯基咪唑〔1，2-b〕噻唑。左旋咪唑的大部分同族体是众所周知的，这些同族体也可以作为内源性ALP抑制剂使用。作为这种同族体，比如有左旋咪唑的苯基环上有碳原子数1～6的低级烷基取代基的同族体、左旋咪唑的苯基环上有氯、溴等卤基取代基的同族体等。作为外消旋型左旋咪唑的四咪唑也可以用作内源性ALP抑制剂。作为其同族体，可例举四咪唑、L-p-溴四咪唑。此外，作为内源性ALP抑制剂还有5，6-二氢-6-(2-萘基)咪唑〔1，2-b〕噻唑等。

上述内源性ALP抑制剂已知在碱性条件下会变得不稳定。因此，从试剂中的内源性ALP抑制剂保存稳定性考虑，辅助试剂液以能使内源性ALP抑制剂保持稳定的pH值为宜。辅助试剂液pH值比如以中性或酸性为宜。具体来说，辅助试剂液pH值以pH4～8为宜，pH6～7更好。

在免疫测定用试剂盒中，底物液可以呈ALP标记的最佳pH值的碱性。但是，在免疫测定用试剂盒中，辅助试剂液与底物液是不同的试剂。因此，即使底物液为碱性，内源性ALP抑制剂也不会随之变得不稳定，从而可以使辅助试剂液在内源性ALP抑制剂稳定的条件下添加到试剂里。以此可以提供内源性ALP抑制剂保存稳定性优越的试剂盒。

另外，辅助试剂液在固相上的ALP标记与底物反应时添加。即，与洗涤液不同，不会在固相与底物混合前被除去，从而可以在ALP标记与底物反应时充分抑制内源性ALP。

使用含有这种辅助试剂液的免疫测定用试剂盒可以长期进行准确的免疫测定。

上述辅助试剂液最好为将上述内源性ALP抑制剂溶解在适当缓冲液中的液态。作为辅助试剂液中所含缓冲液以可在中性或酸性条件下使用的缓冲剂为宜。具体而言，有磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、MES(2-吗啉乙磺酸)、PIPES(1.4-哌嗪二乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)或Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TEA(三乙醇胺)等。作为缓冲剂以在碱性附近没有缓冲能的缓冲剂为好，具体而言就是MES。

辅助试剂液中的缓冲剂浓度可根据所用缓冲剂种类适当选择。辅助试剂液中的缓冲剂浓度比如可以是2mM～100mM，3mM～50mM更好，最好是5mM～20mM。

ALP标记和底物液中所含底物的反应液中也含有辅助试剂液，但因ALP的最适pH为碱性，此反应液最好为碱性。因此，免疫测定用试剂盒中可含在反应液中的辅助试剂液和后述底物液的pH、缓冲剂的种类和缓冲剂的浓度等都应设定为使反应液为碱性。

底物液含有ALP的底物。作为底物可以使用在该技术领域众所周知的ALP发光底物和显色底物等。作为ALP的化学发光底物，比如有AMPPD(3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯-1，2-二氧杂环丁烷)、CDP-star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺{1，2-二氧环己烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]}-4-yl)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧环己烷-3，2-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷}-4-yl)苯基磷酸2钠)等。作为ALP的显色底物有：对硝基苯酯、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、四唑硝基蓝(NBT)、碘硝基四唑(INT)等。

当ALP标记与上述发光底物和显色底物接触时，引起酶反应，检测此反应生成物的发光和显色，即可检测ALP标记。

上述底物液最好为将上述底物溶解在适当缓冲液中的液体。底物浓度可根据底物的种类适当选择。缓冲液可根据底物的种类适当选择，可以使用在该技术领域众所周知的缓冲液。

标记的ALP的最佳pH为碱性，故底物液最好为碱性。作为底物液的pH无特别限定，只要pH能使ALP标记和底物接触的反应液为碱性即可。作为底物液的pH以pH8～12为宜，pH9～11更好。

如上所述，辅助试剂液可以为中性或酸性。因此，受辅助试剂液pH的影响，ALP标记和底物接触的反应液中的pH有可能不是碱性。因此，为了降低辅助试剂液pH的影响，最好让底物液的缓冲能大于辅助试剂液。调节底物液和辅助试剂液的缓冲能的方法无特别限定，可以利用众所周知的方法。一般来说，缓冲剂浓度越高缓冲液的缓冲能越大。因此，底物液的缓冲剂浓度设定得高于辅助试剂液，就可以使底物的缓冲能大于辅助试剂液。这种缓冲剂的浓度可依所用缓冲剂种类适当选择。底物的缓冲剂浓度比如可设定为是辅助试剂液的缓冲剂浓度的至少2倍，5倍～20倍更好，8～15倍最好。具体而言，底物的缓冲剂浓度以4mM～1000mM为宜，10mM～500mM更好，50mM～200mM最好。

将上述辅助试剂液所含缓冲剂设定为在碱性附近无缓冲能的缓冲剂，可以使底物液的缓冲能大于辅助试剂液。

作为底物液所含缓冲剂，最好是在碱性条件下可使用的缓冲液。具体而言，甲基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、乙基乙醇胺(EAE)、二乙醇胺(DEA)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)。其中，最好是在ALP最佳pH有缓冲能的DEA和AMP。

上述免疫测定用试剂盒在用ALP作为标记的免疫测定法中也是特别使用固相的免疫测定中所用的试剂盒。作为这种免疫测定法，只要是以ALP作为标记的方法即可，无特别限定。具体而言，有EIA法、ELISA法等。

作为固相，只要是在通常免疫测定法中使用的固相即可无特别限定。作为该固相的材料，比如有胶乳、橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯树脂、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯-异丁烯酸甲酯共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏二氟乙烯树脂(PVDF)和硅等聚合物；琼脂糖；明胶；红细胞；硅胶、玻璃、非活性矾土和磁性体等无机材料等。也可以将这些材料的一种或二种以上组合使用。

作为固相的形状，只要是用于免疫测定的普通固相形状即可，无特别限定，比如可以是酶标板、试管、微珠、粒子和纳米粒子等。作为粒子，有磁性粒子、聚苯乙烯胶乳等疏水性粒子、在粒子表面有氨基、羧基等亲水基的共聚胶乳粒子、红细胞和明胶等。从测定自动化的角度说，固相以磁性粒子和胶乳等为宜，其中磁性粒子更好。

磁性粒子是以有磁性的材料为基材的粒子。这种磁性粒子在该技术领域人所共知，已知有以Fe₂O₃和/或Fe₃O₄、钴、镍、铁酸盐、镁等为基材的粒子。以蛋白质等向磁性粒子结合为目的，基材表面用聚合物包被的磁性粒子更好。

在上述免疫测定用试剂盒中，ALP标记物、底物液和辅助试剂液分别包装。图1为ALP标记物、底物液和辅助试剂液在液态下的试剂盒一例。图1中，ALP标记物盛放在第一试剂容器1中，底物液盛放在第二试剂容器2中，辅助试剂液盛放在第三试剂容器3中。免疫测定用试剂盒也可根据要求另备装在其他试剂容器中的其他试剂。免疫测定用试剂盒还可根据需要备有稀释试剂之一或若干用的一种或数种缓冲液、使用说明书、可用于反应的容器等。

上述免疫测定用试剂盒也可包含在用固相的免疫测定法中使用的其他试剂。

具体而言，免疫测定用试剂盒包括：经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物，固定含第一结合物和待测物质的复合物的固相，可与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶(ALP)标记物，含有ALP相应底物的底物液；及含有抑制内源性ALP的抑制剂、在与复合物中待测物质结合的ALP标记物的ALP和底物反应时添加的辅助试剂液。

此免疫测定用试剂盒作为用于竞争法免疫测定的免疫测定用试剂盒时，包括：碱性磷酸酶(ALP)标记物，可通过抗原抗体反应与待测物质和ALP标记物结合的第一结合物，固定第一结合物的固相，含有ALP相应底物的底物液；及含有抑制内源性ALP的抑制剂、在与第一结合物结合的ALP标记物的ALP和底物反应时添加的辅助试剂液。

上述第一结合物可使用上面例示的物质。在免疫测定用试剂盒中，第一结合物也可以是液态，也可为用时溶解在适当溶剂(比如水和缓冲液等)使用的固态。

从试剂盒的使用操作的简便性来看，最好第一结合物为溶解于溶剂的液态。缓冲液可以使用免疫测定常用的缓冲液，比如包括PIPES、TEA、Tris、MES和磷酸缓冲液等。

上述固相可以使用以上例示的固相。在免疫测定用试剂盒中，固相可以是悬浊或接触的形态，也可以是用时在适当溶剂(比如水和缓冲液等)悬浊或接触使用的固态。从试剂盒的使用操作的简便性来看，上述固相最好是在溶剂中悬浊或接触的形态。缓冲液可以使用免疫测定常用的缓冲液，比如含PIPES、TEA、Tris、MES和磷酸缓冲液等。在免疫测定用试剂盒中第一结合物可以固定在固相上，也可以不固定。

第一结合物固定在固相上时，免疫测定用试剂盒含有比如含固定有第一结合物的固相的试剂、ALP标记物、底物液和辅助试剂液。用此免疫测定用试剂盒进行免疫测定时，标本、含固定有第一结合物的固相的试剂和ALP标记物的混合顺序无特别限定。

下面举例说明使用此试剂盒进行的免疫测定。首先，混合标本和含固定有第一结合物的固相的试剂，在固相上形成含有待测物质和第一结合物的复合物。再混合吸附有复合物的固相和ALP标记物，使ALP标记物结合到吸附在固相上的复合物。向吸附有结合了ALP标记物的复合物的固相添加辅助试剂液和底物液，再在含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液存在的情况下使固相上的ALP标记和底物液所含底物反应。以此可以在ALP标记和底物接触的溶液中一方面使来自标本的内源性ALP有效地得到抑制，一方面使ALP标记和底物产生酶反应。然后，检测ALP标记和底物酶反应生成的产物的发光和显色，即可正确地测定待测物质。

第一结合物固定在固相上的方法是公认的方法。该固定比如可以通过物理吸附法、共有结合法、离子结合法以及这些方法的组合等进行。

也可以利用生物素和抗生朊类的结合将第一结合物固定在固相上。促成第一结合物在固相上固定的中间物质组合除上述生物素和抗生朊类外，还可以有半抗原和抗半抗原抗体、镍和组氨酸标签、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶等。作为半抗原和抗半抗原抗体如有DNP和抗DNP抗体。

在本说明书中，“抗生朊类”指包括抗生朊和链球菌抗生朊。

第一结合物未固定在固相上时，免疫测定用试剂盒比如包括含第一结合物的试剂、含固相的试剂、ALP标记物、底物液和辅助试剂液。用此免疫测定用试剂盒进行夹心法免疫测定时，标本、含第一结合物的试剂、含固相的试剂和ALP标记物的混合顺序无特别限定。

下面举例说明用此试剂盒进行的免疫测定。先混合标本和含第一结合物的试剂，形成含有待测物质和第一结合物的复合物。再混合复合物和含有固相的试剂，使复合物吸附到固相上。然后混合吸附有复合物的固相和ALP标记物，使ALP标记物结合到复合物。向吸附有结合了ALP标记物的复合物的固相添加辅助试剂液和底物液，再在含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液存在的情况下使固相上的ALP标记和底物液所含底物反应。以此可以在ALP标记和底物接触的溶液中一方面使来自标本的内源性ALP有效地得到抑制，一方面使ALP标记和底物产生酶反应。然后，检测ALP标记和底物酶反应生成的产物的发光和显色，即可正确地测定待测物质。

当用此免疫测定用试剂盒进行竞争法免疫测定时，可以先混合标本、含第一结合物的试剂和含固相的试剂之后，再混合ALP标记物，也可以先混合标本、含第一结合物的试剂和ALP标记物后，再混合含固相的试剂。

当第一结合物未固定在固相上时，最好固相结合位点上附加第一结合物，可与固相结合位点结合的第三结合物固定在固相上。这样可以在固相上形成含有待测物质和第一结合物的复合物。

固相结合位点和第三结合物只要是能在用试剂盒的条件下接触时特异性结合的物质组合即可，无特别限定。这些组合比如有生物素和抗生朊类、半抗原和抗半抗原抗体、镍和组氨酸标签、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶等。作为半抗原和抗半抗原抗体如有DNP和抗DNP抗体。以生物素和抗生朊类的组合为宜，最好固相结合位点含生物素，第三结合物质为抗生朊类。在本说明书中，“抗生朊类”指包括抗生朊和链球菌抗生朊。固相结合位点和第三结合物组合的各个物质哪一个固定在粒子上都可，无特别限定。

当第三结合物质是抗生朊类时，可以通过使抗生朊结合到已结合有能与抗生朊结合的物质比如生物素的固相上，将抗生朊类固定在固相上。也可以用日本专利公开第2006-226689号上记述的方法将抗生朊类固定在固相上。

使抗生朊类结合的固相也可以从比如JSR株式会社和戴诺生物技术公司(Dynal Biotech)等购买。

运用竞争法时，作为ALP标记物使用能与固相上的游离第一结合物结合的ALP标记物。

比如，当固相为粒子、辅助试剂液使用粒子分散液时，吸附结合有ALP标记物的复合物的粒子被分散到粒子分散液中，在其中添加底物液。

免疫测定方法

上述免疫测定用试剂盒可以用于免疫测定方法。这种免疫测定方法包括以下步骤：

固定步骤，在固相上形成一种复合物，该复合物含有标本中的待测物质、可与待测物质结合的碱性磷酸酶(ALP)标记物、经抗原抗体反应可与待测物质结合的、并可与固相结合的第一结合物；

反应步骤，让与复合物中待测物质结合的ALP标记物的ALP与底物液中所含ALP相应底物在含有抑制内源性ALP的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及

测定步骤，检测ALP与底物反应生成的产物。

当这种免疫测定方法是竞争法免疫测定时，包括：混合步骤，将标本、碱性磷酸酶(ALP)标记物、经抗原抗体反应可与ALP标记物和标本中的待测物质结合的第一结合物和固定第一结合物的固相混合起来；

反应步骤，让与固定在固相上的第一结合物结合的ALP标记物的ALP与底物液中所含ALP相应底物在含有抑制内源性ALP的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及

测定步骤，检测ALP与底物反应生成的产物。

在上述测定方法中，固定步骤(即在固相上形成复合物，该复合物含有标本中的待测物质、可与待测物质结合的碱性磷酸酶(ALP)标记物、经抗原抗体反应可与待测物质结合并可与固相结合的第一结合物。)可以通过将标本中的待测物质、ALP标记物、第一结合物和固相混合来实现。混合标本中待测物质、ALP标记物、第一结合物和固相的方法可以使用上述免疫测定用试剂盒记述的方法。

在上述竞争法免疫测定中，混合标本、碱性磷酸酶(ALP)标记物、经抗原抗体反应可与ALP标记物和标本中待测物质结合的第一结合物和固定第一结合物的固相的混合步骤可以使用上述用于竞争法免疫测定的免疫测定用试剂盒记述的方法。

如上述免疫测定用试剂盒记述，第一结合物可以固定在固相上，也可以不固定在固相上。

上述待测物质是一般可以通过免疫测定检测出其存在或可以定量其含量的物质即可，无特别限定。比如，蛋白质、糖类、脂蛋白、激素等。这种待测物质比如包括：人类免疫缺乏病毒(HIV)及其抗体、人类T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)及其抗体、丙型肝炎病毒(HCV)及其抗体、乙型肝炎病毒(HBV)及其抗体、癌胚抗原(CEA)、C反应蛋白(CRP)、梅毒密螺旋体(TP)抗体、α1抗胰蛋白酶、α1-巨球蛋白、β2-巨球蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、铁蛋白、胚乳、血红蛋白A1、血红蛋白A1C、肌球素、肌浆球蛋白、Dupan-2、甲胎蛋白(AFP)、组织多肽抗原(TPA)、载脂蛋白A-1、载脂蛋白E、风湿因子、抗链球菌溶血素“O”(ASO)、抗凝血酶III(AT-III)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物(PIC)、凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)、血栓调节蛋白(TM)、组织型纤溶酶原激活物抑制剂复合物(tPAI·C)、甲状腺激素(三碘甲状腺原氨酸(T3)、游离T3(FT3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、游离T4(FT4)、)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、皮质醇、胰岛素等。

含有上述待测物质的标本包括血液、血浆，血清和尿液等标本和对上述标本进行前处理所得试样。作为上述前处理，比如有通过离心分离和过滤等办法除去非溶性物质等。

与上述待测物质特异性结合的抗原或抗体可以使用免疫测定用试剂盒中记述的抗原或抗体。作为上述固相的粒子可以使用免疫测定用试剂盒中记述的粒子。

在上述免疫测定方法中，在含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液存在的条件下让与复合物中待测物质结合的ALP标记物中的ALP与底物液中所含ALP的底物发生反应，可按照上述免疫测定用试剂盒中记述的方法进行。

在上述竞争法的免疫测定方法中，在含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液存在的条件下让结合到固相上的第一结合物的ALP标记物中的ALP与底物液中所含ALP的底物发生反应，可按照上述免疫测定用试剂盒中记述的方法进行。

通过此步骤，在ALP标记与底物接触的溶液中，可以一方面有效地抑制来源于标本的内源性ALP，同时催化ALP标记与底物发生酶反应。检测ALP标记与底物发生酶反应所生成的产物的发光和显色，即可正确地测定待测物质。

检测ALP标记与底物反应的产物的步骤可以用该技术领域众所周知的方法进行。检测反应产物可以用适当的仪器测定反应生成物所发出的光和色等。作为该仪器，比如有分光光度计、照度计等。

以下根据实施例具体说明本发明。本发明不限于这些实施例。

在实施例中使用的试剂如下：

(1)HBs抗体试剂的制备

用专利公开2006-321746号公报上记述的杂交瘤HBs-1053产生的1053抗体作为HBs抗体。用Biotinylation Kit(Sulfo-0Su)((株)同仁化学研究所)生物素化HBs抗体。将所得生物素化HBs抗体溶解于0.1M MES缓冲液(pH6.5)，使浓度达到1.0μg/mL，以此为HBs抗体试剂。

杂交瘤HBs-1053由Sysmex株式会社委托国际保藏，国际保藏号为FERM BP-10582。

(2)磁性粒子试剂的制备

将市场销售的链亲和素包被磁性粒子(以下称”ST磁性粒子”)溶解于20mM MES缓冲液(pH6.5)中，使其浓度达到1％，以此为磁性粒子试剂。

(3)ALP标记HBs抗体试剂的制备

专利公开第2006-321746号公报上记述的杂交瘤HBs-149抗体产生的149抗体作为HBs抗体使用。用EMCS((株)同仁化学研究所)标记此HBs抗体。将所得ALP标记化HBs抗体溶解于0.1M MES缓冲液(pH6.5)，使浓度达到0.3μ/mL，以此为ALP标记HBs抗体试剂。

杂交瘤HBs-149由Sysmex株式会社委托国际保藏，国际保藏号为FERM BP-10583。

(4)粒子分散液的制备

制备含左旋咪唑的粒子分散液作为内源性ALP抑制剂。粒子分散液成份如下：

粒子分散液成份：

10mM MES缓冲液(pH6.5)

1mM或2mM左旋咪唑盐酸盐(东京化成工业(株))

(1)底物液

CDP-star(注册商标)(Applied Biosystems)

参考例1

本例为调查上述(4)制备的粒子分散液中所含内源性ALP抑制剂的保存稳定性。本例中使用的粒子分散液的左旋咪唑浓度为1mM。

具体而言，用上述粒子分散液进行以下加速试验。加速试验即将粒子分散液放入50mL容器(材质：聚丙烯)中，在暗处55℃下静置6天。静置后将容器恢复到室温，将粒子分散液从容器移至分光光度计用比色皿，确认有无析出。

作为比较，使用了将左旋咪唑混入专利公开平成2-207800号公报上记述的高pH胺缓冲液中制备的试剂(比较试剂1)。专利公开平成2-207800号公报上记述了使用ALP的免疫测定用试剂盒，据记述，与内源性ALP抑制剂一起加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇等指定的胺，即使在高pH条件下也可以使左旋咪唑保持稳定。

比较试剂1的成份如下。试验方法除将粒子分散液换成比较试剂1外，其他与上述相同。

比较试剂1的成份

0.1M AMP缓冲液(pH9.6)

1mM左旋咪唑盐酸盐(东京化成工业(株))

图2显示了上述试验的结果。图2为加入了加速试验后的各试剂的分光光度计用比色皿侧面照片。图2中的(a)为使用粒子分散液的结果，图2中的(b)为使用比较试剂1的结果。

如上所述，比较试剂1使用的缓冲液是专利公开平成2-207800号公报上记述的高pH胺缓冲液。据专利公开平成2-207800号公报上记述，在AMP等一定的高pH胺缓冲液中，在碱性条件下左旋咪唑也是稳定的。然而，从图2(b)的结果确认，用比较试剂1时溶液中有析出。分析该析出物得知，析出物来源于左旋咪唑(数据没有显示)。以此可以判断，用比较试剂1左旋咪唑保存的稳定性不好。

而从图2(a)的结果确认，粒子分散液中完全无析出。从以上得知，粒子分散液有优越的内源性ALP抑制剂保存稳定性。

实施例1

本例调查了上述(4)制备的粒子分散液中所含内源性ALP抑制剂降低内源性ALP影响的效果。本例中使用的粒子分散液的左旋咪唑浓度为2mM。

具体而言，先用上述(1)～(5)制备的试剂测定HBs抗原阴性标本的发光强度。测定方法如下：

首先混合25μL标本和30μL上述HBs抗体试剂，42℃培养约3分钟，使标本中的HBs抗原和HBs抗体试剂中的生物素化HBs抗体发生反应。然后，在此混合液中添加上述磁性粒子试剂30μL，培养约2分钟，将由HBs抗原和生物素化HBs抗体组成的复合物固定在ST磁性粒子上。用约150μL清洗液(0.1％Tween20、20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5))漂洗此ST磁性粒子后，在清除了清洗液的ST磁性粒子中加入上述ALP标记HBs抗体试剂100μL，42℃下培养约3分钟，使ALP标记HBs抗体结合到ST磁性粒子上的复合物中。用约150μL上述清洗液漂洗3次此ST磁性粒子。在清除了清洗液的ST磁性粒子中加入上述粒子分散液50μL，让ST磁性粒子在粒子分散液中分散后，在此添加上述底物液100μL，用LUMI-COUNTER700((株)MICROTEC CO)测定发光强度。

作为标本使用的是41种HBs抗原阴性血清(阴性血清1～41)。用含有BSA的0.1M TEA缓冲液(5％BSA、pH7.0)作为阴性质控品进行了测定。还用HBs抗原阳性血清作为阳性质控品进行了测定。结果见表1和表2。

作为比较，用不含左旋咪唑的10mM MES缓冲液(pH6.5)(比较试剂2)取代含有左旋咪唑的粒子分散液进行了测定。测定方法除用比较试剂2取代上述粒子分散液外，其他与上述相同。结果如表1和表2所示。

[表1]

[表2]

表中，“NP”为阴性质控品，“PC”为阳性质控品。“有左旋咪唑”一栏中显示了用含有左旋咪唑的粒子分散液测得的发光强度计数值(Counts)。“无左旋咪唑”一栏中显示了用不含左旋咪唑的比较试剂2测得的荧光强度计数值(Counts)。

图3和图4为显示各阴性标本对于发光强度计数值的分布状态的分布图(直方图)。这些分布图以横轴为计数值，该计数值以100为单位划分区间，以纵轴为各区间所含标本数。求HBsAg为0.03U/mL的计数值，以此为判断值。图3的判断值为3092，图4的判断值为2855。判断值以上则可判断为阳性，判断值以下则可判断为阴性。图3为使用不含左旋咪唑的比较试剂2的结果，根据表1和2的“无左旋咪唑”栏的发光强度计数值绘制。图4为使用含左旋咪唑的粒子分散液的结果，根据表1和2的“有左旋咪唑”栏的发光强度计数值绘制。

从图3和图4的结果可以看出，使用含有左旋咪唑的粒子分散液，从阴性标本获得的发光强度差异很小，用于测定的全部阴性标本的计数值约为800～1300。特别是关于在图3显示出较高计数值(约1500～2700)的阴性标本在图4其计数值较低，其分布移至低值一侧。这说明那些阴性标本是内源性ALP影响较大的标本。而且得知，使用含有左旋咪唑的粒子分散液，可以抑制这种标本中的内源性ALP，有效地消除其影响。关于图3中在判断值附近显示计数值的阴性标本，在图4其计数值变低，其分布移至低值一侧。由此得知，使用含有左旋咪唑的粒子分散液可以有效地消除内源性ALP的影响，防止假阳性的发生。

从以上可以知道，含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液其内源性ALP抑制剂的保存稳定性优越，使用含有这种辅助试剂液的试剂盒可以有效地抑制内源性ALP，获得精确的测定结果。

比如，使用含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液可以使内源性ALP抑制剂在ALP标记与底物酶反应的反应液中达到所需要的量，在这一点上也比使用含有内源性ALP抑制剂的清洗液更有利。而且，以粒子为固相、以辅助试剂液为粒子分散液的免疫测定有时清洗液的用量比一项测定中粒子分散液的用量还多。比如，在上述实施例中，在一次测定中粒子分散液为50μL，而清洗液约为900μL。这样，使用含有内源性ALP抑制剂的辅助试剂液(粒子分散液)可比使用含有内源性ALP抑制剂的清洗液降低内源性ALP抑制剂相关成本。

Claims (16)

1.一种碱性磷酸酶标记检测用试剂盒，包括：

可与靶向物质结合的碱性磷酸酶标记物，

碱性磷酸酶相应的底物，

含抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与所述靶向物质结合的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述靶向物质是含待测物质和经抗原抗体反应可与之结合的第一结合物的复合物中的待测物质。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：可用于竞争法免疫测定，此时所述靶向物质指经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记物含可与靶向物质结合的第二结合物和碱性磷酸酶。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：含有所述辅助试剂液的碱性磷酸酶和底物的反应液为碱性。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述底物液为碱性。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述辅助试剂液为中性或酸性。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述底物液和所述辅助试剂液含有缓冲剂，所述底物液有大于所述辅助试剂液的缓冲能。

9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抑制剂为左旋咪唑。

10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶为来源于细菌的碱性磷酸酶或来源于肠的碱性磷酸酶。

11.一种免疫测定用试剂盒，包括：

经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物，

固定含第一结合物和待测物质的复合物的固相，

可与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物，

含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及

含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

12.一种使用竞争法的免疫测定用试剂盒，包括：

碱性磷酸酶标记物，

可通过抗体抗原反应与待测物质和碱性磷酸酶标记物结合的第一结合物，

固定第一结合物的固相，

含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及

含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与第一结合物结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

13.一种免疫测定的方法，包括：

固定步骤，在固相上形成一种复合物，所述复合物含有标本中的待测物质、可与待测物质结合的碱性磷酸酶标记物、经抗原抗体反应可与待测物质结合的、并可与固相结合的第一结合物；

反应步骤，让与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶与底物液中所含碱性磷酸酶相应底物在含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及

测定步骤，检测碱性磷酸酶与底物反应生成的产物。

14.一种使用竞争法的免疫测定方法，包括：

混合步骤，将标本、碱性磷酸酶标记物、经抗原抗体反应可与碱性磷酸酶标记物和标本中的待测物质结合的第一结合物和固定第一结合物的固相混合起来；

反应步骤，让与固定在固相上的第一结合物结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶与底物液中所含碱性磷酸酶相应底物在含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及

测定步骤，检测碱性磷酸酶与底物反应生成的产物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述混合步骤可以先混合标本、第一结合物和固相后，再在所得的混合物中混入碱性磷酸酶标记物。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述混合步骤可以先混合标本、第一结合物和碱性磷酸酶标记物后，再在所得的混合物中混入固相。

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