WO2011102065A1 - 質量検出センサーを用いた検出方法 - Google Patents

質量検出センサーを用いた検出方法 Download PDF

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徹 家邉
博保 角矢
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Definitions

  • the present invention relates to a detection method using a mass detection sensor, and more particularly to a detection method for detecting a precipitate generated by a reaction catalyzed by an enzyme using a mass detection sensor.
  • the reaction product produced by the reaction catalyzed by the labeling enzyme is generally detected by absorption, fluorescence, or luminescence, but an electrochemical detection method or a method using a mass detection sensor is also known. (For example, see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1)
  • the enzyme alkaline phosphatase (ALP) and its substrate, bromochloroindolyl phosphate (BCIP) -nitroblue tetrazolium (NBT), are stained to detect the isolated protein of interest in Western blotting in the field of biochemistry. Used for the purpose. BCIP produces a blue precipitate upon reaction with ALP, and the reaction product oxidizes NBT to produce a purple insoluble precipitate that is stained. By staining the protein, the presence or absence can be visually confirmed.
  • an enzyme ALP is arranged above the sensor surface of the mass detection sensor according to the concentration of the detection target.
  • the present invention intends to provide a detection method using a mass detection sensor that can prevent the dynamic range from being narrowed even if the enzyme concentration is high.
  • the present invention provides a detection method using a mass detection sensor configured as follows.
  • the detection method using the mass detection sensor includes (i) a first step in which the sensor surface of the mass detection sensor is disposed upward and an enzyme is disposed in the vicinity of the sensor surface; and (ii) a reaction catalyzed by the enzyme.
  • a solution containing a substrate that generates an insoluble precipitate is supplied in contact with the sensor surface and the enzyme, and the insoluble precipitate generated from the substrate in the solution by the enzyme-catalyzed reaction is supplied to the sensor.
  • a substrate stock solution containing the substrate is mixed with a diluent having a buffering capacity that does not affect the function of the enzyme, and the concentration of the substrate is smaller than the concentration of the substrate in the substrate stock solution.
  • the concentration of the substrate is adjusted with a diluent. adjust.
  • the amount of the reaction product generated per unit time when the substrate reacts with the enzyme can be reduced by adjusting the concentration of the substrate with the diluent. This prevents reaction products from binding together to form a massive substance before depositing on the sensor surface of the mass detection sensor. A large amount of reaction product accumulates on the sensor surface, and a signal can be obtained according to the enzyme concentration, so that the dynamic range can be increased.
  • the enzyme may be in contact with the sensor surface of the mass detection sensor, but it is preferable that the enzyme does not become a mass load when the enzyme is away from the sensor surface.
  • the enzyme is alkaline phosphatase.
  • the substrate is bromochloroindolyl phosphate-nitroblue tetrazolium.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitrogen triphosphate
  • ALP Alkaline phosphatase
  • the concentration of the bromochloroindolyl phosphate (BCIP) in the solution is 0.05 mM or more and 0.2 mM or less.
  • the detection sensitivity can be increased by using a solution obtained by diluting a commercially available substrate stock solution, compared with the case of using the substrate stock solution.
  • the concentration of the nitro blue tetrazolium (NBT) in the solution is 0.04 mM or more and 0.16 mM or less.
  • the mass detection sensor is a surface acoustic wave sensor or a quartz crystal sensor.
  • the mass load due to the insoluble precipitate can be detected with high sensitivity.
  • the solution is continuously supplied onto the mass detection sensor using a supply means.
  • the supply means is a pump.
  • the dynamic range can be prevented from being narrowed even if the enzyme concentration is high.
  • Example 1 It is explanatory drawing which shows a detection principle typically.
  • Example 1 It is sectional drawing which shows a mass load state typically.
  • Example 1 It is a graph which shows the relationship between a substrate concentration and a frequency change rate.
  • Example 1 It is sectional drawing which shows a mass load state typically. (Comparative Example 1)
  • Example 1 A detection method using the mass detection sensor of Example 1 will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing the detection principle of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a mass load state.
  • an enzyme-attached antibody 20 in which an enzyme 24 is linked to an antibody 22
  • a transport antibody 30 in which another antibody 32 is immobilized on a transportable carrier 34 such as a magnetic bead, and a substrate 4.
  • a solution containing a transportable carrier 34
  • the antibody 22 of the enzyme-attached antibody 20 and the antibody 32 of the delivery antibody 30 are antibodies that specifically bind to a trace amount of protein 2 (hereinafter also referred to as “target protein”) to be detected.
  • target protein a trace amount of protein 2
  • the target protein 2 is bound so as to be sandwiched between the antibody 22 of the enzyme-attached antibody 20 and the antibody 32 of the delivery antibody 30, the antibody-attached antibody 20 and the delivery antibody 30 are interposed via the target protein 2.
  • a combined complex 40 is formed.
  • an insoluble precipitate 6 which is a solid-phase reaction product, is generated from the substrate 4 in the solution.
  • substrate 4 is bromochloroindolyl phosphate (BCIP) -nitroblue tetrazolium (NBT) and enzyme 24 is alkaline phosphatase (ALP).
  • the substrate 4 2 In the state where the complex 40 in which the enzyme-attached antibody 20 and the transporting antibody 30 are combined is present in the vicinity of the sensor surface on which the vibration of the surface acoustic wave sensor or the crystal resonator sensor that is a mass detection sensor propagates, the substrate 4 2, the insoluble precipitate 6 is deposited on the sensor surface 11 of the mass detection sensor 10 and the mass load changes as shown in FIG.
  • the mass detection sensor 10 illustrated in FIG. 2 is a surface acoustic wave sensor, and an IDT (interdigital transducer) 14 is formed on a piezoelectric substrate 12 and is covered with an insulating film 16 such as SiO 2 .
  • the mass detection sensor 10 can detect the insoluble precipitate 6 by changing the frequency characteristics when the mass load changes. Since the insoluble precipitate 6 is generated according to the amount of the complex 40 formed by the target protein 2, the presence or amount of the target protein 2 is detected by detecting the mass load due to the insoluble precipitate 6. Can do.
  • the amount of the enzyme 24 increases according to the amount of the target protein 2, and when the substrate 4 is supplied thereto, the amount of the insoluble precipitate 6 increases according to the amount of the enzyme 24, so that the mass of the target protein 2 itself is measured.
  • the mass load on the mass detection sensor can be greatly increased, and the detection sensitivity can be increased.
  • the enzyme-attached antibody 20 is supplied to the specimen and mixed, and the target protein 2 in the specimen is bound to the antibody 22 of the enzyme-attached antibody 20.
  • a solution containing the substrate 4 is supplied, and the solution is brought into contact with the sensor surface 11 and the enzyme 24 contained in the antibody with enzyme 22 forming the complex 40.
  • an insoluble precipitate 6 is generated from the substrate 4 in the solution by a reaction catalyzed by the enzyme 24 included in the antibody with enzyme 22 forming the complex 40, and the generated insoluble precipitate 6 is converted into the mass detection sensor 10.
  • the sensor surface 11 is deposited.
  • the mass load due to the insoluble precipitate 6 deposited on the sensor surface 11 is detected using the mass detection sensor 10. For example, whether or not the insoluble precipitate 6 is deposited is detected from the difference in resonance frequency before and after the deposition of the insoluble precipitate 6 on the sensor surface 11.
  • a substrate stock solution with a concentration optimized for staining affects the function of the enzyme.
  • the solution is prepared and diluted with a diluent having a buffering capacity that does not give water, such as 0.1 M Tris-0.1 M NaCl-5 mM MgCl 2 (pH 9.5), and then supplied at a constant flow rate using an external pump.
  • a diluent having a buffering capacity that does not give water, such as 0.1 M Tris-0.1 M NaCl-5 mM MgCl 2 (pH 9.5)
  • a pump it is easier to control the solution supply speed than when supplying with a supply means such as a pipette.
  • the reaction products are bound to each other particularly at a high enzyme concentration.
  • the massive substance 7 is formed before adsorbing to the sensor surface 11 of the mass detection sensor 10. This massive substance 7 is useful for dyeing applications because it is colored and has excellent visibility, but it does not float and accumulate on the sensor surface 11, so it cannot give a mass load to the sensor surface 11, The signal from the mass detection sensor 10 reaches a peak.
  • the reaction is performed while replenishing the substrate 4 by continuously supplying the solution containing the substrate 4 using a supply means such as a pump. And the insoluble precipitate 6 can be accumulated.
  • a supply means such as a pump.
  • FIG. 3 is a graph showing the frequency change rate when the substrate concentration of the solution is changed.
  • the substrate stock solution (dilution ratio is 1) and the substrate stock solution are diluted 2.5 times, 5 times, 7.5 times, 10 times, 12.5 times, and 15 times.
  • the frequency change rate is shown for 4, 0.2, 0.13, 0.1, 0.08, and 0.066.
  • the horizontal axis indicates the dilution ratio with respect to the substrate stock solution.
  • the vertical axis represents the frequency change rate.
  • FIG. 3 shows that when the substrate stock solution is diluted 2.5 to 10 times, the frequency change rate becomes larger than that of the substrate stock solution and the detection sensitivity is improved.
  • the concentration of BCIP is preferably 2.5 to 10 times 0.5 mM of the substrate stock solution, that is, 0.05 to 0.2 mM.
  • the concentration of NBT is preferably 2.5 to 10 times 0.4 mM of the substrate stock solution, that is, 0.04 to 0.16 mM.
  • the concentration of the substrate has a buffer capacity that does not affect the function of the enzyme.
  • the sample, the antibody-attached antibody 20, and the delivery antibody 30 are mixed at the same time to form a complex 40 in which the enzyme-attached antibody 20 and the delivery antibody 30 are bound via the labeled protein 2, and then the complex.
  • the solution containing the substrate 4 may be supplied in a state in which 40 is arranged in the vicinity of the sensor surface of the mass detection sensor.

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Abstract

　酵素濃度が高くてもダイナミックレンジが狭くならないようにすることができる、質量検出センサーを用いた検出方法を提供する。　（ｉ）質量検出センサーのセンサー面を上向きに配置し、センサー面の近傍に酵素２４を配置する第１の工程と、（ii）酵素２４が触媒する反応によって不溶性沈殿物６を生じさせる基質４を含む溶液を、センサー面及び酵素６に接するように供給して、酵素２４の触媒する反応によって溶液中の基質４から生じた不溶性沈殿物６をセンサー面に堆積させ、センサー面に堆積した不溶性沈殿物６による質量負荷を検出する第２の工程とを含む。溶液は、基質４を含む基質原液に、酵素２４の機能に影響を与えない緩衝能をもつ希釈液が混合されて、基質４の濃度が、基質原液中の基質４の濃度よりも小さくされている。

Description

質量検出センサーを用いた検出方法
　本発明は、質量検出センサーを用いた検出方法に関し、詳しくは、酵素により触媒される反応によって生じた沈殿物を、質量検出センサーを用いて検出する検出方法に関する。
　標的物質である抗原又は抗体を、標識酵素を連結した抗体又は抗原と反応させ、標識酵素が触媒する反応によって生じる反応生成物を検出することにより、標的物質の高感度な検出を達成することができる。
　標識酵素が触媒する反応によって生じる反応生成物は、吸光、蛍光、発光によって検出する方法が一般的であるが、電気化学的に検出する方法や、質量検出センサーを用いる方法も知られている。（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）
国際公開第２００６／０３３３４８号
Fernando Patolsky, Amir Lichtenstein, and Itamar Willner、"Detection of single-base DNA mutations by enzyme-amplified electronic transduction"、NATURE BIOTECHNOLOGY、MARCH 2001、VOLUME 19、p.253-257
　酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）とその基質であるブロモクロロインドリル燐酸（ＢＣＩＰ）－ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）は、生化学分野におけるウェスタンブロット法において、分離した目的のタンパク質を検出するために染色する目的で使用される。ＢＣＩＰはＡＬＰとの反応により青色を呈する沈殿物を生成し、その反応生成物によりＮＢＴが酸化されて紫色の不溶性沈殿を生じて染色される。タンパク質が染色されることにより、その存在有無を目視にて確認することが可能となる。
　質量検出センサーである水晶振動子や圧電表面弾性波振動子のようなピエゾ素子を用いて検出する方法においては、検出対象の濃度に応じて酵素ＡＬＰが質量検出センサーのセンサー面の上方に配置し、そこにＢＣＩＰ－ＮＢＴのような不溶性沈殿物を生じる基質を含む溶液を供給し、不溶性沈殿物による質量負荷を検出することで、本来の検出対象物質による質量負荷のシグナルを増幅することが可能である。
　しかしながら、市販されている基質を含む溶液は染色用に基質濃度が最適化されており、そのまま用いると、特に酵素濃度が高い場合に、反応生成物が有色で塊状の物質となって浮遊するため、質量負荷を与えることができずシグナルが頭打ちとなる。この現象に伴い高濃度域の測定限界が小さくなり、ダイナミックレンジを狭める結果となってしまう。
　本発明は、かかる実情に鑑み、酵素濃度が高くてもダイナミックレンジが狭くならないようにすることができる、質量検出センサーを用いた検出方法を提供しようとするものである。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した質量検出センサーを用いた検出方法を提供する。
　質量検出センサーを用いた検出方法は、（ｉ）質量検出センサーのセンサー面を上向きに配置し、該センサー面の近傍に酵素を配置する第１の工程と、（ii）前記酵素が触媒する反応によって不溶性沈殿物を生じさせる基質を含む溶液を、前記センサー面及び前記酵素に接するように供給して、前記酵素の触媒する反応によって前記溶液中の前記基質から生じた前記不溶性沈殿物を前記センサー面に堆積させ、前記センサー面に堆積した前記不溶性沈殿物による質量負荷を検出する第２の工程とを含む。前記溶液は、前記基質を含む基質原液に、前記酵素の機能に影響を与えない緩衝能をもつ希釈液が混合されて、前記基質の濃度が、前記基質原液中の前記基質の濃度よりも小さくされている。
　すなわち、酵素と該酵素と反応して不溶性沈殿物を生じさせる基質との組合せを用いて前記不溶性沈殿物による質量負荷を検出する、質量検出センサーの検出方法において、前記基質の濃度を希釈液により調整する。
　上記方法によれば、基質の濃度を希釈液により調整することにより、基質が酵素と反応して単位時間あたりに生じる反応生成物の量を減らすことができる。これにより、質量検出センサーのセンサー面に堆積する前に、反応生成物同士が結合して塊状の物質を形成することを防ぐことができるので、高濃度の酵素存在下においても、酵素濃度に応じた量の反応生成物がセンサー面に堆積し、酵素濃度に応じて信号を得ることができ、ダイナミックレンジを高めることができる。
　なお、酵素は、質量検出センサーのセンサー面に接しても構わないが、酵素がセンサー面から離れていると、酵素は質量負荷にならないため好ましい。
　好ましくは、前記酵素は、アルカリフォスファターゼである。前記基質は、ブロモクロロインドリル燐酸－ニトロブルーテトラゾリウムである。
　この場合、ブロモクロロインドリル燐酸（ＢＣＩＰ）－ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）は、タンパク質の染色用として市販されており、入手が容易である。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）は、ＢＣＩＰに対して触媒として機能する。
　好ましくは、前記溶液中の前記ブロモクロロインドリル燐酸（ＢＣＩＰ）の濃度が、０．０５ｍＭ以上、かつ、０．２ｍＭ以下である。
　この場合、市販の基質原液を希釈した溶液を用いることで、基質原液を用いた場合よりも、検出感度を高めることができる。
　より好ましくは、前記溶液中の前記ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の濃度が、０．０４ｍＭ以上、かつ、０．１６ｍＭ以下である。
　好ましくは、前記質量検出センサーは、弾性表面波センサー又は水晶振動子センサーである。
　この場合、不溶性沈殿物による質量負荷を高感度に検出することができる。
　好ましくは、前記溶液は、供給手段を用いて質量検出センサー上に連続的に供給する。
　この場合、基質を含む溶液を連続して供給することで、希釈による基質の不足を防ぎ、反応を連続させて、高濃度酵素存在下においても、酵素濃度に応じた大きな信号を得ることができる。
　より好ましくは、前記供給手段がポンプである。
　この場合、ピペットなどの供給手段を用いる場合に比べ、溶液の供給速度の制御が容易である。
　本発明の質量検出センサーによる検出方法によれば、酵素濃度が高くてもダイナミックレンジが狭くならないようにすることができる。
検出原理を模式的に示す説明図である。（実施例１） 質量負荷状態を模式的に示す断面図である。（実施例１） 基質濃度と周波数変化率との関係を示すグラフである。（実施例１） 質量負荷状態を模式的に示す断面図である。（比較例１）
　以下、本発明の実施の形態について、図１～図４を参照しながら説明する。
　＜実施例１＞　実施例１の質量検出センサーを用いた検出方法について、図１～図４を参照しながら説明する。
　図１は、実施例１の検出原理を模式的に示す説明図である。図２は、質量負荷状態を模式的に示す断面図である。図１に示すように、抗体２２に酵素２４が連結された酵素付抗体２０と、別の抗体３２が磁気ビーズなどの搬送可能な担体３４に固定化された搬送用抗体３０と、基質４を含む溶液とを用意する。
　酵素付抗体２０の抗体２２と、搬送用抗体３０の抗体３２とは、検出対象である微量のタンパク質２（以下、「標的タンパク質」とも言う。）と特異的に結合する抗体である。標的タンパク質２が、酵素付抗体２０の抗体２２と搬送用抗体３０の抗体３２との間に挟まれるように結合されると、酵素付抗体２０と搬送用抗体３０とが標的タンパク質２を介して結合された複合体４０が形成される。
　酵素付抗体２０の酵素２４が触媒する反応によって、矢印８で示すように、溶液中の基質４から、固相の反応生成物である不溶性沈殿物６が生じる。例えば、基質４はブロモクロロインドリル燐酸（ＢＣＩＰ）－ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）であり、酵素２４はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）である。
　質量検出センサーである表面弾性波センサーや水晶振動子センサーの振動が伝搬するセンサー面の近傍に、酵素付抗体２０と搬送用抗体３０とが結合された複合体４０が存在する状態で、基質４を含む溶液を供給すると、図２に示すように、質量検出センサー１０のセンサー面１１に不溶性沈殿物６が堆積して質量負荷が変化する。
　図２に例示した質量検出センサー１０は表面弾性波センサーであり、圧電基板１２上にＩＤＴ（interdigital transducer）１４が形成され、その上をＳｉＯ２等の絶縁膜１６で覆われている。
　質量検出センサー１０は、質量負荷が変化すると周波数特性が変化することにより、不溶性沈殿物６を検出することができる。不溶性沈殿物６は、標的タンパク質２によって形成される複合体４０の量に応じて生成されるので、不溶性沈殿物６による質量負荷を検出することで、標的タンパク質２の有無や量を検出することができる。
　標的タンパク質２の存在量に応じて酵素２４の量が増え、そこに基質４を供給すると酵素２４の量に応じて不溶性沈殿物６の量が増えるため、標的タンパク質２そのものの質量を測定するよりも、結果的には質量検出センサーへの質量負荷量を大幅に増やすことができ、検出感度を高めることができる。
　この測定系において、次の手順により検出を行う。
　まず、検体に酵素付抗体２０を供給して混ぜ合わせ、検体中の標的タンパク質２を酵素付抗体２０の抗体２２に結合させる。
　次いで、磁石を用いるなどして質量検出センサーのセンサー面の近傍に搬送用抗体３０が存在した状態で、検体と酵素付抗体２０との混合物を供給し、酵素付抗体２０に結合している標識タンパク質２を、搬送用抗体３０の抗体３２で捉えて、複合体４０を形成する。
　次いで、基質４を含む溶液を供給し、センサー面１１と複合体４０を形成する酵素付抗体２２に含まれる酵素２４とに溶液が接するようにする。これによって、複合体４０を形成する酵素付抗体２２に含まれる酵素２４が触媒する反応によって、溶液中の基質４から不溶性沈殿物６が生成され、生成された不溶性沈殿物６を質量検出センサー１０のセンサー面１１に堆積させる。そして、センサー面１１に堆積した不溶性沈殿物６による質量負荷を、質量検出センサー１０を用いて検出する。例えば、センサー面１１への不溶性沈殿物６の堆積前後における共振周波数の差から、不溶性沈殿物６の堆積の有無や量を検出する。
　基質４を含む溶液は、市販されている染色用に最適化された濃度（ＢＣＩＰ：０．４～０．６ｍＭ、ＮＢＴ：０．３～０．５ｍＭ）の基質原液を、酵素の機能に影響を与えない緩衝能をもつ希釈液、例えば０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　－　０．１Ｍ　ＮａＣｌ　－　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．５）で調製・希釈した上、外付けのポンプを用いて一定流速で供給する。ポンプを用いると、ピペットなどの供給手段で供給する場合よりも、溶液の供給速度の制御が容易である。
　染色用に最適化された濃度（ＢＣＩＰ：０．４～０．６ｍＭ、ＮＢＴ：０．３～０．５ｍＭ）の基質原液では、特に高い酵素濃度において反応生成物同士が結合して、図４の断面図に模式的に示すように、質量検出センサー１０のセンサー面１１に吸着する前に塊状の物質７を形成する。この塊状の物質７は、有色で視認性に優れているため染色用途には有用であるが、浮遊してセンサー面１１上に堆積しないため、センサー面１１に質量負荷を与えることができず、質量検出センサー１０からのシグナルは頭打ちとなる。
　この基質原液を希釈することで、基質４が酵素２４と反応して単位時間あたりに生じる反応生成物の量を減らし、反応生成物同士が結合して浮遊物になる前にセンサー面１１に堆積し、質量負荷を与える不溶性沈殿物６の層を形成するようにすることができる。これによって、効率よく質量負荷を起こし、酵素２４が高濃度であっても酵素濃度に応じて信号を得ることができ、ダイナミックレンジを高めることができる。
　溶液の基質濃度を下げることで、基質不足による反応の停止が懸念されるが、ポンプなどの供給手段を用いて基質４を含む溶液を連続して供給することにより、基質４を補給しながら反応を継続させて不溶性沈殿物６を累積させることができる。このように希釈による基質４の不足を防ぎ、反応を連続させることによって、酵素２４が高濃度で存在していても、酵素濃度に応じた量の反応生成物がセンサー面に堆積し、酵素濃度に応じた大きな信号を得ることができる。
　図３は、溶液の基質濃度を変えたときの周波数変化率を示すグラフである。具体的には、基質原液（希釈率は１）と、基質原液を２．５倍、５倍、７．５倍、１０倍、１２．５倍、１５倍に希釈したきの希釈率０．４、０．２、０．１３、０．１、０．０８、０．０６６とについて、周波数変化率を示している。横軸は、基質原液に対する希釈率を示す。縦軸は、周波数変化率であり、基質導入前の周波数をｆ０、基質導入後の周波数をｆ１とすると｜ｆ１－ｆ０｜／ｆ０で表され、単位はｐｐｍである。
　図３から、基質原液を２．５倍～１０倍に希釈すると、基質原液よりも周波数変化率が大きくなり、検出感度が向上していることが分かる。図３から、ＢＣＩＰの濃度は、基質原液のときの０．５ｍＭの２．５～１０倍、すなわち、０．０５～０．２ｍＭが好ましい。また、ＮＢＴの濃度は、基質原液のときの０．４ｍＭの２．５～１０倍、すなわち、０．０４～０．１６ｍＭが好ましい。
　＜まとめ＞　以上に説明したように、酵素と基質との組合せを用いて検出対象物による信号を質量検出センサーにより検出する際に、基質の濃度を酵素の機能に影響を与えない緩衝能をもつ希釈液で調整・希釈して最適化することで、酵素濃度に応じて検出信号を得ることができ、ダイナミックレンジを高めることができる。
　なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、種々変更を加えて実施することが可能である。
　例えば、検体と、酵素付抗体２０と、搬送用抗体３０とを同時に混合し、酵素付抗体２０と搬送用抗体３０とが標識タンパク質２を介して結合した複合体４０を形成した後、複合体４０を質量検出センサーのセンサー面の近傍に配置した状態で、基質４を含む溶液を供給してもよい。
　　２　標的タンパク質
　　４　基質
　　６　不溶性沈殿物
　１０　弾性表面波センサー
　１１　センサー面
　１４　ＩＤＴ
　１６　絶縁膜
　２０　酵素付抗体
　２２　抗体
　２４　酵素
　３０　搬送用酵素
　３２　抗体
　３４　担体
　４０　複合体

Claims (7)

  1. 　質量検出センサーのセンサー面を上向きに配置し、該センサー面の近傍に酵素を配置する第１の工程と、
    　前記酵素が触媒する反応によって不溶性沈殿物を生じさせる基質を含む溶液を、前記センサー面及び前記酵素に接するように供給して、前記酵素の触媒する反応によって前記溶液中の前記基質から生じた前記不溶性沈殿物を前記センサー面に堆積させ、前記センサー面に堆積した前記不溶性沈殿物による質量負荷を検出する第２の工程と、
    を含み、
    　前記溶液は、前記基質を含む基質原液に、前記酵素の機能に影響を与えない緩衝能をもつ希釈液が混合されて、前記基質の濃度が、前記基質原液中の前記基質の濃度よりも小さくされていることを特徴とする、質量検出センサーを用いた検出方法。
  2. 　前記酵素は、アルカリフォスファターゼであり、
    　前記基質は、ブロモクロロインドリル燐酸－ニトロブルーテトラゾリウムであることを特徴とする、請求項１に記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
  3. 　前記溶液中の前記ブロモクロロインドリル燐酸の濃度が、０．０５ｍＭ以上、かつ、０．２ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項２に記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
  4. 　前記溶液中の前記ニトロブルーテトラゾリウムの濃度が、０．０４ｍＭ以上、かつ、０．１６ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
  5. 　前記質量検出センサーは、弾性表面波センサー又は水晶振動子センサーであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
  6. 　前記溶液は、供給手段を用いて質量検出センサー上に連続的に供給することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一つに記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
  7. 　前記供給手段がポンプであることを特徴とする、請求項６に記載の質量検出センサーを用いた検出方法。
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