CN111172234B - 一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒 - Google Patents

一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，涉及生物检测技术领域。包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其成分及相应含量为：试剂R1：三羟甲基氨基甲烷5‑10g/L；双甘氨肽5‑10g/L；叠氮钠0.1‑0.5g/L；试剂R2：甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸10‑20g/L；乙二醇20‑80ml/L；牛血清白蛋白2‑8g/L；叠氮钠0.1‑0.5g/L。在实施过程中试剂R2中加入比例为1‑5：1‑2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺，并控制R1和R2的体积比为5‑10：1，增强了试剂的稳定性和准确性，并且提高了试剂的抗干扰能力，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒。
背景技术
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺和血清等体液中，能特异的水解肽链末端第2位为脯氨酸所形成的肽键，在细胞内的微粒体和可溶部分其比活性明显增高，其生理意义主要是水解血液中来自胶原的多肽，因此甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的生理作用可能与胶原肽降解相关。
早在1966年，Hopsu-Havu和Glenner等在鼠的肝、肾组织中发现了一种新的二肽氨基肽酶。这种酶能水解甘氨酰-脯氨酰-B-萘胺，释放二肽甘氨酰脯氨酸，而被称为甘氨酰脯氨酸-B-萘胺酸。由于甘氨酰脯氨酰-B-萘胺有致癌作用，Nagatsu等合成了新底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺，并为大家广泛接受，这种酶也一度被称为甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺酶，现已通称为甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycyl proline dipeptidylaminopeptidase，GPDA)。
经临床的大量实验和研究数据分析，发现GPDA在疾病的诊断中有着明显的变化趋势，急性肝炎、慢活肝、肝硬化、阻塞性黄疸等，血清GPDA可有不同程度升高；胃癌病人血清GPDA明显下降，一般在正常人的1/2左右；类风湿关节炎病人病程在15个月以上者，血清GPDA活性显著降低；系统性红斑狼疮病人血清GPDA显著降低；急性淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤和霍奇金病病人，血清GPDA显著降低；药物性肝损害、原发性胆汁性肝硬化引起肝内胆汁郁积者，血清GPDA活性升高。
由于甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的含量变化与多种疾病有关，因此对甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量的准确检测具有重要的意义。但是在甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的检测试剂中使用的主要原料甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸盐配制成液体后不稳定，易水解变质，从而造成整个试剂盒的稳定性降低，进而影响了整个试剂盒的测定结果，因为如何提高甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的稳定性成为主要的研究方向。
例如，中国专利申请201510233316.X公开了一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris-双甘肽缓冲液、底物稳定剂；所述试剂II含有甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸、底物稳定剂。该发明采用的试剂盒及检测方法只需十几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测，但是该申请中所使用的底物稳定剂为NaN3，其在试剂I和试剂II中的加入量为0.01-0.15g/mL，其添加量比较高，较高含量的防腐剂会在一定程度上影响检测结果的准确性和精密性，并且该申请在试剂盒中加入NaN3，仅在一定程度上提高了甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸的稳定性，对试剂的准确性以及抗干扰性能并没有提高。
又如，中国专利申请201610273288.9中公开了一种测定甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：Tris缓冲液120-310mmol/L、双甘肽3.0-14.0g/L、叠氮钠0.6-1.5g/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：甘氨酰-L-脯氨酸对硝基苯胺110-300mmol/L、乙二醇15-65mL/L、牛血清白蛋白3-12g/L、叠氮钠0.6-1.5g/L，其溶剂为纯化水。该申请同样以含量较高的叠氮钠作为稳定剂，仅在一定程度上提高了甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸的稳定性，对试剂的准确性以及抗干扰性能并没有提高。
为了从根本上解决甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶试剂盒的稳定性，以及提高甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶试剂盒的准确性以及抗干扰能力。本发明在试剂盒中添加了特殊的稳定剂不仅提高了试剂盒的稳定性，还提高了试剂盒的准确性和抗干扰能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中试剂不稳定、测定准确度低以及抗干扰能力差的缺陷，而提供一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷        5-10g/L；
双甘氨肽                5-10g/L；
叠氮钠                  0.1-0.5g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000031
优选地，所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷        6-9g/L；
双甘氨肽                6-9g/L；
叠氮钠                  0.2-0.4g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000032
再优选地，所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷        7-8.5g/L；
双甘氨肽                7-8.5g/L；
叠氮钠                  0.25-0.3g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000033
进一步优选地，所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷       8.5g/L；
双甘氨肽               8.32g/L；
叠氮钠                 0.25g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000041
本发明所述的试剂R2中还含有稳定剂，所述的稳定剂为甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺中的一种或几种；
优选地，所述的稳定剂为甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺；
再优选地，所述的稳定剂的质量比为1-5：1-2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺。
进一步优选地，所述的稳定剂的质量比为2-3：2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺。
更进一步优选地，所述的稳定剂的质量比为3：2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺。
所述的甘露醇的加入量为2-10g/L；所述的甘露聚糖的加入量为2-6g/L；所述的葡糖胺的加入量为2-3g/L。
作为一些优选的技术方案，本发明所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷       5-10g/L；
双甘氨肽               5-10g/L；
叠氮钠                 0.1-0.5g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000051
作为另一个优选的技术方案，本发明所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷       8.5g/L；
双甘氨肽               8.32g/L；
叠氮钠                 0.25g/L；
试剂R2：
Figure BDA0002354552340000052
所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，试剂R1和试剂R2在使用时的体积比例为5-10：1，优选为9：1。
另一方面，本发明还提供了上述甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的使用方法：
本试剂盒适用于杜邦AR、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞BS320、迪瑞CS600、雅培C8000/16000、东芝TBA40FR/2000FR/FX8、奥林巴斯AU2700、贝克曼AU5800/DXC800、西门子ADVIA2400、罗氏C501/701/702、罗氏P800等全自动生化分析仪。
该测定试剂盒的测定方法为速率法，反应方向为升反应
所述的方法为：向13μL待测样本中加入234μL试剂R1混合均匀，37℃孵育5min，然后再向待测样品中加入26μL试剂R2混合均匀，37℃延迟0.5分钟，在405nm或410nm波长下连续监测1分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性：
GPDA活性(U/L)＝(△A样本/min-△A空白/min)×K   (1)
主波长405nm：K＝2126
主波长410nm：K＝2457
本方法的原理为：在碱性条件下，GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在特定波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明在试剂R2中加入比例为1-5：1-2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺，增强了试剂的稳定性和准确性，并且提高了试剂的抗干扰能力；
(2)本发明公开的试剂盒在使用过程中控制试剂R1和R2的体积比为5-10：1，可以提高检测的精密性，提高检测的准确性。
(3)本发明提供的试剂盒中防腐剂的添加量明显减少，在一定程度上减少了防腐剂对试剂盒检测准确性的干扰。
(4)本发明公开的试剂盒操作简单、制备成本低，适宜于推广使用.
附图说明
图1为实施例7与对照组试剂的相关性曲线图，
图2为实施例8与对照组试剂的相关性曲线图，
图3为实施例9与对照组试剂的相关性曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
Figure BDA0002354552340000071
实施例2一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
Figure BDA0002354552340000072
实施例3一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
Figure BDA0002354552340000073
Figure BDA0002354552340000081
实施例4-6一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
Figure BDA0002354552340000082
实施例7-9一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒
Figure BDA0002354552340000083
Figure BDA0002354552340000091
对比例1
与实施例9的区别在于：稳定剂为质量比0.5：1：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺，即甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺的加入量分别为2g/L、4g/L、4g/L。
对比例2
与实施例9的区别在于：稳定剂为质量比8：2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺，即甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺的加入量分别为8g/L、4g/L、1g/L。
对比例3
与实施例9的区别在于：R1与R2的体积比为3：1。
对比例4
与实施例9的区别在于：R1与R2的体积比为12：1。
对比例5
中国专利申请201510973109.8中公开的试剂盒。
试验例1准确度验证试验
将实施例7-9的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒作为试验组，市场上购买的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒(购自安徽伊普诺康生物技术股份有限公司)作为对照组进行检测，对20个临床血清样本进行检测，检测结果如表1所示。获得了四种试剂的相关性曲线(如图1-3所示)，结果表明，对照组与实施例7试剂盒的相关系数为0.9945，说明两者相关性比较好，对照组与实施例8试剂盒的相关系数为0.9911，说明两者相关性比较好，对照组与实施例9试剂盒的相关系数为0.9968，说明两者相关性比较好，以上数据证明本发明试剂盒添加甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
表1
Figure BDA0002354552340000092
Figure BDA0002354552340000101
试验例2线性关系验证试验
选取甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量为300U/L的样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，浓度依次为300U/L、250U/L、200U/L、150U/L、80U/L、0U/L。分别利用实施例1-9以及对比例1-5试剂进行检测，每个浓度的样本分别测定三次，分别取平均值，检测结果如表2和表3所示。
表2
Figure BDA0002354552340000102
Figure BDA0002354552340000111
表3
Figure BDA0002354552340000112
如上表2和3所示，实施例1-9检测结果相关系数均大于0.999，且实施例9试剂检测结果的相关系数最高，对比例1-5这检测结果相关系数明显低于实施例，表明本发明实施例试剂具有更好的线性相关性。
试验例3稳定性试验
在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量为80U/L的样本试剂，检测实施例7-9及对比例1-5试剂的稳定性。每月1号分别用两组试剂测定同一混合血清样本，测定三次取平均值，检测数据如表4所示。
表4
Figure BDA0002354552340000113
Figure BDA0002354552340000121
上表4实验结果显示，实施例7-9试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而对比例1-5试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存12个月后开始不稳定，说明本发明试剂添加本发明公开质量比的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺后稳定性增强。
试验例4精密度试验
将实施例7-9以及对比例1-5所制得的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的测定试剂盒对含量为80U/L的同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，检测数据如表5。
表5
Figure BDA0002354552340000122
由表5可知本发明实施例7-9所制得的测定甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的试剂盒的精密度明显高于对比例，而且由表5可知，实施例9为最优的选择.
试验例5抗干扰能力检测
选择三种潜在干扰物，胆红素、血红蛋白和甘油三酯，在质控品中分别加入200mg/L、250mg/L、300mg/L的胆红素；2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L的血红蛋白；2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L的甘油三酯，对照组为不加任何干扰物的质控品，利用实施例9所述的试剂盒进行测定，每个样本测定5次，取均值，结果见表6。
表6
Figure BDA0002354552340000131
由表6的检测数据可以看出，胆红素≤250mg/L，血红蛋白≤2.5g/L，甘油三酯≤3.0g/L，对检测结果无明显干扰。
综上，本发明提供的试剂盒的可检测结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好，抗干扰能力强。其中利用实施例9所述的试剂盒进行检测，检测结果最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷5-10g/L；
双甘氨肽5-10g/L；
叠氮钠0.1-0.5g/L；
试剂R2：
Figure FDA0004108992070000011
所述的试剂R2中还含有稳定剂；所述的稳定剂的质量比为1-5：1-2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺；所述的甘露醇的加入量为2-10g/L；所述的甘露聚糖的加入量为2-6g/L；所述的葡糖胺的加入量为2-3g/L；
所述的试剂R1和试剂R2在使用时的体积比例为5-10：1。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷8.5g/L；
双甘氨肽8.32g/L；
叠氮钠0.25g/L；
试剂R2：
Figure FDA0004108992070000012
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂的质量比为3：2：1的甘露醇、甘露聚糖和葡糖胺。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷5-10g/L；
双甘氨肽5-10g/L；
叠氮钠0.1-0.5g/L；
试剂R2：
Figure FDA0004108992070000021
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其成分及相应含量为：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷8.5g/L；
双甘氨肽8.32g/L；
叠氮钠0.25g/L；
试剂R2：
Figure FDA0004108992070000022
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1和试剂R2在使用时的体积比例为9：1。
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