CN101831485B - 食品中大肠菌群的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种食品中大肠菌群的快速检测方法，包括如下步骤：1)对样品进行菌体分离富集，去除干扰物；2)将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中，在39℃～42℃下恒温培养6～7小时；3)在培养后的菌体悬液中加入发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；所述增菌增酶培养液包括以体积比100∶1混合的组分A、组分B，组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05～0.2g，亚致死细菌快速修复物3～6g，细菌快速增长剂2～5g。本发明检测结果准确、检测速度快。

Description

食品中大肠菌群的快速检测方法

技术领域

本发明涉及菌群的检测，特别涉及一种食品中大肠菌群的检测方法。

背景技术

在食品行业，大肠菌群的含量是一项重要的卫生指标。目前传统国家标准方法(GB)采用9管发酵，48-72小时才可以出结果，存在滞后现象，检测效率低。改进后的方法如：荧光方法(SN)、显色培养基方法、膜过滤方法，这几种方法需要24-48小时可以出结果，仍不能达到快速检测的目的。另外，免疫学方法，虽然8小时可以出结果，但检出限有限，同时检测成本高，一旦菌体发生变异，检测结果就不准确；分子生物学方法，虽然12小时可以出结果，明显提高了检测灵敏度，但是该方法检测成本较贵、操作繁杂、对操作员的技术要求高，不利于推广。

因此，开发适宜生产需要、操作简单的快速大肠菌群检测方法十分必要。在所有方法中利用β-半乳糖苷酶作为标记物检测大肠菌具有较好的应用潜力。可以保证建立的快速检测方法具有操作简单、低成本等优点，同时该方法也存在很大的挑战，如何达到国家标准方法的检出限，如何降低检出所消耗的时间，提高检出速率等。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种食品中大肠菌群的快速检测方法，利用β-半乳糖苷酶作为标记物检测调味品中的大肠菌群，能以较高的检出速率达到国家标准方法的检出限。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是，一种食品中大肠菌群的快速检测方法，包括如下步骤：

1)对样品进行菌体分离富集，去除干扰物；

2)将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中，在39℃～42℃下恒温培养6～7小时；

3)在培养后的菌体悬液中加入包含发光试剂底物、大肠菌群温和裂解液的发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；

所述增菌增酶培养液包括以体积比100∶1混合的组分A、组分B，组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05～0.2g，亚致死细菌快速修复物3～6g，细菌快速增长剂2～5g。本技术方案中，通过步骤1)对样品进行前处理，使样品中的菌体分离富集，去除影响检测的干扰物；通过步骤2)，对分离得到的菌体进行增菌增酶培养因此又加入一能有效诱导β-半乳糖苷酶表达的物质，使菌体快速增殖的同时，β-半乳糖苷酶也得到高效表达，从而提高检测速率。

其中，所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种。

其中，所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E中的任一种或多种。

其中，所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。

其中，组分A中还包括自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g。

其中，所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种。

其中，所述发光检测试剂包括发光试剂底物、发光增强剂、大肠菌温和裂解液。

其中，所述大肠菌温和裂解液为细胞膜破坏试剂，所述细胞膜破坏剂为EDTA、Nisin、Tween-80、硫酸粘菌素B、曲拉通、CATB中的任一种。

其中，所述发光试剂底物为AMPGD、铕试剂、荧光素-β-半乳糖苷中的任一种。

其中，所述发光增强剂为季铵盐高聚物。

其中，步骤1)中，所述菌体分离富集为：将样品利用无菌生理盐水稀释5～40倍，用真空过滤法滤过30μm聚丙烯滤膜，取滤后液过0.2-0.45μm混合醋酸纤维素滤膜，再利用20～50ml无菌生理盐水洗涤2-3次，菌体截留在混合醋酸纤维素滤膜上。

其中，组分A在121℃下灭菌15分钟后再与组分B混合。

其中，步骤3)中的发光值检测为：将50μl～100μl的增菌增酶培养后的菌体悬液与50～100μl发光检测试剂反应10～50分钟，利用发光光度计于530nm～590nm处检测发光值，将检样发光值与阴性对照样发光值比对。

本发明的食品中大肠菌群的快速检测方法具有如下优点：

本发明通过对样品进行菌体分离富集，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质；通过高效增菌增酶培养液对菌体悬液在适当的培养条件下进行培育，使快速增菌的同时增加β-半乳糖苷酶的量；通过添加大肠菌群温和裂解液使β-半乳糖苷酶(胞内酶)释放到培养液中，提高酶的得率和活力，从而提高检出速率。本发明的检测方法检测速度快，8小时内即可准确检出大肠菌群存在与否，远快于国家标准方法(48-72小时)，而且检测成本低廉，检测成本为3元/样品。

附图说明

图1是本发明食品中大肠菌群的快速检测方法的流程图。

具体实施方式

本发明的基本构思是，利用β-半乳糖苷酶作为标记物对调味品中的大肠菌群进行检测，对待侧样品先利用菌体分离富集技术收集菌体，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质；以高效增菌增酶培养液对分离后的菌体进行培养，使菌体在快速增菌的同时增加β-半乳糖苷酶的量，提高检出速率和提高灵敏度。

参见图1，图1是本发明食品中大肠菌群的快速检测方法的流程图。

本发明的食品中大肠菌群分离富集方法包括如下步骤：

S1、对样品进行菌体分离富集；

此步骤中，利用菌体分离富集技术对样品进行菌体分离富集，使菌体从样品中分离出来，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质。

S2、对分离后的菌体以增菌增酶培养液进行修复、增菌增酶培养；

在此步骤中，以增菌增酶培养液对分离富集得到的菌体进行培育，使菌体在快速增菌的同时增加β-半乳糖苷酶的量，具体步骤为：将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有增菌增酶培养液的试管中，在39-42℃的恒温培养箱中培养6-7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨0.5g，氯化钠2g，自由基清除剂1g，十二烷基磺酸钠0.03g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，在121℃下灭菌15分钟，室温保存供使用。

培养液组分B：β-半乳糖苷酶诱导物0.05g，亚致死细菌快速修复物3g，细菌快速增长剂2g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

S3、对培育后的菌体加入发光检测试剂进行发光值检测；

在此步骤中，对培育后的菌体进行发光值检测。具体步骤为：取培养完毕的菌悬液，置于发光检测仪的检测孔中，加入发光检测试剂反应一段时间，而后在振荡器上摇匀振荡，进行发光检测，测定样品的发光值。

利用已知大肠菌群阴性样的发光值，计算6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1，当比值T1少于或等于1.2(阀值A)时，判断为大肠菌群阴性，当比值T1大于1.2时，需进行培养7小时检测，计算7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2，若T2与T1的比值K少于或等于1.1(阀值B)，则判断为大肠菌群阴性，若T2与T1的比值K大于1.1，则判断为大肠菌群阳性，并与国标法进行比对。其中：阀值A、B的理论值应为1，但检测过程中发光值会有轻微的波动，故将阀值设为略高于1。其中阀值A为1.2、阀值B为1.1，是由大量检测数据经统计学分析得出。

下面，以具体实施例对本发明的食品中大肠菌群的快速检测方法进行说明。

实施例一

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g黄豆酱样品(样品代号为1)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，去除大颗粒酱渣，滤后液过0.25μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗三次，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶活性及检测反应体系的物质。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在40℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨1g，氯化钠3g，可溶性淀粉1g，十二烷基磺酸钠0.05g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，在121℃下灭菌15分钟，室温保存供使用。

培养液组分B：异丙基硫代半乳糖苷0.05g，甘油3g，三磷酸腺苷2g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液100μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入50μl发光检测试剂反应20分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为2508。其中发光检测试剂包括AMPGD、聚合度为4000的季铵盐高聚物和EDTA混合试剂，AMPGD作为发光试剂底物，聚合度为4000的季铵盐高聚物作为发光增强剂，EDTA作为大肠菌温和裂解液。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为0.91，T1少于1.2(阀值A)，因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

实施例二

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g蚝油样品(样品代号为2)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，滤后液过0.25μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗二次。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在40℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨1.5g，氯化钠2g，二苯胺3g，十二烷基磺酸钠0.04g，磷酸二氢钾8g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，在121℃下灭菌15分钟，室温保存供使用。

培养液组分B：半乳糖0.1g，丙酮酸钠4g，肌酐3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液50μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入50μl发光检测试剂反应20分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为550nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为3330。其中发光检测试剂包括铕试剂、Nisin、聚合度为8000的季铵盐高聚物，铕试剂作为发光试剂底物、Nisin作为大肠菌温和裂解液、聚合度为8000的季铵盐高聚物作为发光增强剂。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为1.21，T1大于1.2(阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为3480，计算得出7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为1.20，T2与T1的比值K为0.99，少于1.1(阀值B)，因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

实施例三

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g蚝油样品(样品代号为3)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，滤后液过0.4μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗二次。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在42℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨0.5g，氯化钠2g，活性炭3g，十二烷基磺酸钠0.045g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1.5g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用；

培养液组分B：乳糖0.15g，抗坏血酸4g，肌酐3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml组分A培养液中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液80μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入包含80μl铕试剂、聚合度为9000的季铵盐高聚物和Tween-80的发光检测试剂反应40分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为570nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为6884。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为2.51，T1大于1.2(阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为11454，计算得出7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为3.94，T2与T1的比值K为1.57，大于1.1(阀值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

实施例四

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g蚝油样品(样品代号为4)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，滤后液过0.35μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗二次。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在42℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨2g，氯化钠2g，半胱氨酸3g，十二烷基磺酸钠0.06g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠2g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用；

培养液组分B：乳糖0.15g，维生素E5g，牛血清3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml组分A培养液中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液70μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入100μl包含荧光素-β-半乳糖苷、聚合度为10000的季铵盐高聚物和硫酸粘菌素B的发光检测试剂反应50分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，发光检测的波长为580nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为4255。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为1.55，T1大于1.2(阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为5243，计算得出7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为1.80，T2与T1的比值K为1.16，大于1.1(阀值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

实施例五

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g蚝油样品(样品代号为5)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，滤后液过0.3μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗三次。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在40℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨0.8g，氯化钠4g，α-生育酚2g，十二烷基磺酸钠0.06g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用；

培养液组分B：异丙基硫代半乳糖苷0.2g，葡萄糖4g，三磷酸腺苷4g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml组分A培养液中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液80μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入100μl包含铕试剂、聚合度为12000的季铵盐高聚物和曲拉通的发光检测试剂反应45分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，发光检测的波长为590nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为2526。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为0.92，T1小于1.2(阀值A)，因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

实施例六

1、菌体分离富集

用电子天平移取10g蚝油样品(样品代号为6)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，滤后液过0.45μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗二次。

2、以增菌增酶培养液对菌体进行增菌增酶培养

将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml增菌增酶培养液的试管中，在42℃的恒温培养箱中培养6～7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下：

培养液组分A：胰蛋白胨1.8g，氯化钠2g，巯基乙醇2g，十二烷基磺酸钠0.08g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠1.5g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用；

培养液组分B：乳糖0.2g，丙酮酸钠6g，肌苷5g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml组分A培养液中。

3、检测过程

取孵育完毕的菌悬液90μl，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入100μl包含荧光素-β-半乳糖苷、聚合度为11000的季铵盐高聚物和CATB的发光检测试剂反应25分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，发光检测的波长为590nm，检测积分时间为0.5秒，测定样品的发光值，6h检样发光值为15201。

已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T1为5.54，T1大于1.2(阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为28201，计算得出7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为9.70，T2与T1的比值K为1.75，大于1.1(阀值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。

表1实施例一～实施例六的大肠菌群检测结果与国标法检测结果对照表

样品代号	6h发光值	T1	7h发光值	T2	K	结果1	结果2(MPN/100g)	比对
									1	2508	0.91	-	-	-	阴性	＜30	正确
2	3330	1.21	3480	1.20	0.99	阴性	＜30	正确
									3	6884	2.51	11454	3.94	1.57	阳性	230	正确
4	4255	1.55	5243	1.80	1.16	阳性	90	正确
									5	2526	0.92	-	-	-	阴性	＜30	正确
6	15201	5.54	28201	9.70	1.75	阳性	2400	正确
									阴性对照样	2745		2907				＜30

注：表1中，结果1代表本发明方法实施例一到实施例六的检测结果；结果2代表采用国家标准检测法对实施例一到六的样品进行检测的结果。

从以上实施例可以得出，本发明的检测方法，检测结果准确，检测速度快。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种食品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）对样品进行菌体分离富集，去除干扰物；

2）将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中，在39℃~42℃下恒温培养6~7小时；

3）在培养后的菌体悬液中加入发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；

所述增菌增酶培养液包括以体积比100：1混合的组分A、组分B，组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5~2g，氯化钠2~5g，磷酸二氢钾6~8g，氢氧化钠1~2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05~0.2g，亚致死细菌快速修复物3~6g，细菌快速增长剂2~5g；

组分A中每1000ml蒸馏水中还含有自由基清除剂1g~3g、十二烷基磺酸钠0.03g~0.06g；

所述发光检测试剂包括发光试剂底物、发光增强剂、大肠菌温和裂解液；

所述大肠菌温和裂解液为细胞膜破坏试剂，所述细胞膜破坏剂为硫酸粘菌素B；

所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种；

所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E中的任一种或多种；

所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种；

所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种；

步骤1）中，所述菌体分离富集为：将样品利用无菌生理盐水稀释5~40倍，用真空过滤法滤过30μm聚丙烯滤膜，取滤后液过0.2-0.45μm混合醋酸纤维素滤膜，再利用20~50ml无菌生理盐水洗涤2－3次，菌体截留在混合醋酸纤维素滤膜上。

2.如权利要求1的食品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述发光试剂底物为AMPGD、铕试剂、荧光素-β-半乳糖苷中的任一种。

3.如权利要求1的食品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述发光增强剂为季铵盐高聚物。

4.如权利要求1的食品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，组分A在121℃下灭菌15分钟后再与组分B混合。

5.如权利要求1的食品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤3）中的发光值检测为：将50μl~100μl的增菌增酶培养后的菌体悬液与50~100μl发光检测试剂反应10~50分钟，利用发光光度计于530nm~590nm处检测发光值，将检样发光值与阴性对照样发光值比对。

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