CN102816859A

CN102816859A - 转基因玉米t25品系的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102816859A
Application number: CN2012103294281A
Authority: CN
Inventors: 徐君怡; 曹际娟; 齐震玉; 姜丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明公开一套LAMP检测所用的引物适用于转基因玉米T25品系特异性检测，其碱基序列如SEQ ID NO：2~7；采用LAMP检测技术，结合浊度法或显色法，建立了适用于食品中转基因玉米T25品系特异性检测标准方法，本发明所述方法操作简单，在恒温的条件下、不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，结果判断简单，又可大大降低检测成本，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，也可作为传统PCR方法的有益补充。

Description

转基因玉米T25品系的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种食品中转基因玉米T25品系环介导等温扩增（LAMP）引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。

T25转基因玉米品系是拜耳作物科学股份有限公司研发的产品，具有抗草铵膦除草剂的特性。在2004年4月6日首次获得中国农业部颁发的安全证书，是目前用于加工食品和饲料最多的品系之一。

目前，转基因玉米成分检测方法主要为TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐，污染环境、灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是TaqMan实时荧光PCR检测对技术要求相对较高且成本昂贵，目前急需制定在检验检疫一线的基层实验室能够普遍适用的快速、简便、准确的标准检测方法。

随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法（LAMP，Loop-mediated IsothermalAmplification）是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，其特点是：①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性：采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增：扩增在不到1h即可完成，且产率高；④灵敏度高：扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁乳白色沉淀可用肉眼观察判断扩增与否，也可以结合实时浊度法检测设备检测；如果加入显色液，也可通过颜色变化观察判定结果（即显色法检测）。另外，它利用恒温和低反应温度（63℃），减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测等领域具有广阔的应用前景。

目前尚未发现LAMP方法应用于食品转基因成分检测的标准化研究。

发明内容

本发明通过查阅转基因玉米品系T25外源基因和植物基因组插入处接头序列信息，并对玉米基因组DNA序列和载体序列的分析、查找、比对后，最终确定T25品系特有的序列；扩增的目的片段覆盖玉米基因组和外源序列接头部分。

本发明通过考察并锁定转基因玉米T25品系靶基因（即AY629235、AX195438和AX695990中的序列SEQ ID NO：1）设计合成6套特异性LAMP引物，优化体系，最后从中筛选出一套出峰时间早，信号强的LAMP T25引物，将反应条件控制在63℃，45min进行检测，成功建立了转基因玉米T25品系鉴定的LAMP检测方法，进而确定了LAMP方法的技术参数（验证引物特异性、灵敏度、稳定性），最后室内验证。

本发明的LAMP T25引物包括两个外引物和两个内引物，特异结合靶序列上的6个特异区域。内引物FIP包含F1c(与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含B1c(与B1区域互补)和B2序列，外引物为F3和B3序列，在内外引物的基础上引入环引物FLP和BLP（图1），大大缩短了反应时间。

本发明的具体技术方案如下：

本发明涉及一种检测转基因玉米T25品系的环介导等温扩增引物，其碱基序列为SEQ IDNO：2~7，如表1：

表1 转基因玉米品系LAMP T25引物

引物	序列	SEQ ID NO
			F3	GGAACGACTCAATGACAAGA	2
B3	AGAGGCATCTTCAACGATG	3
			FIP(F1c+F2)	GGAATCCGAGGAGGTTTCCG-ATCTTCGTCAACATGGTGG	4
BIP(B1c+B2)	TTGCCCAGCTATCTGTCACTTT-GCAATGATGGCATTTGTAGG	5
			FLP	TTGGAGTAGACAAGCGTGTC	6
BLP	TAGTGGAAAAGGAAGGTGGC	7

本发明的另一方面涉及一种转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其检测试剂盒包括检测引物：SEQ ID NO：2~7。

优选的情况下：对于上述转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其包括：

每25μL的LAMP反应体系，其包括：SEQ ID NO：2~3各0.2μM、SEQ ID NO：4~5各1.6μM、SEQ ID NO：6~7各0.8μM、1×ThermoPol缓冲液、0.8mM甜菜碱、1.4 mM dNTP、8U BstDNA大片段聚合酶；

其中上述1×ThermoPol缓冲液为：10 mM KCl，20 mM pH 8.8的Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2 mM MgSO₄和0.1%TritonX-100；

上述试剂盒在使用过程中，除了按照上述25μL反应体系加入上述试剂之外，还需要加入模板DNA和蒸馏水（补足25μL反应体系），再进行LAMP扩增反应。

本发明的另一方面在于，公开一种利用上述转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，来检测转基因玉米T25品系的方法，其方法步骤包括：

①分别提取T25转基因玉米品系标准样品和待测样品的基因组DNA；

②分别以步骤①精提的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测：

每25μL的LAMP反应体系中：DNA模板200ng、SEQ ID NO：2~3各0.2μM、SEQ IDNO：4~5各1.6μM、SEQ ID NO：6~7各0.8μM、1×ThermoPol缓冲液、0.8mM甜菜碱、1.4mM dNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸馏水：余量；

其中上述1×ThermoPol缓冲液为：10 mM KCl，20 mM pH8.8的Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2 mM MgSO₄和0.1%TritonX-100；

③环介导等温扩增法的检测结果以肉眼、浊度法或显色法进行判断。

具体情况下：对于上述的检测转基因玉米T25品系的方法，其所述步骤③中的浊度法利用LAMP实时浊度仪完成。

具体情况下：对于上述的检测转基因玉米T25品系的方法，其所述步骤③中的显色法使用的显色剂为荧光染料SYBR Green I。

其中，环介导等温扩增（LAMP）快速检测技术结合实时浊度法或显色法的检测原理：

本发明根据转基因玉米T25品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对特异结合靶序列上的6个特异区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在玉米T25品系特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；LAMP扩增效率很高，在反应过程中，核酸大量合成,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物白色焦磷酸镁沉淀，因此可直接通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测；也可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色,在紫外灯或日光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBRGreenI的橙色不变，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪，可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。

本发明的创新特征是：

(1)LAMP T25引物特异性较好，实施例中对非转基因水稻，玉米，小麦，花生，大杏仁，绿豆，核桃，胡萝卜，鹰嘴豆，羽扇豆，四季豆，桔子，白云豆，大豆，燕麦，番茄，转基因玉米MON810、MON863、MON89034、BT176、GA21、BT11、NK603，转基因油菜RT73，转基因大豆MON88017、MON89788、DP305423、DP356043、GTS40-3-2，转基因土豆EH92-527-1等均无非特异扩增；

(2)引物T25的灵敏度实验果显示该引物检测限可达0.5%；

(3)本项目研制的玉米T25品系特异性LAMP检测引物和方法，检测的特异性达到100%，性能参数等同于传统PCR方法或荧光定量PCR方法，

(4)引物T25的稳定性实验结果显示引物1%，0.5%及阴性精密度的稳定性均良好；

(5)LAMP法不需要PCR仪等昂贵、操作复杂的仪器，水浴锅或恒温装置即可完成反应，反应结束后，通过观察是否产生了白色沉淀或加入SYBR显色剂观察颜色变化就可判定反应是否发生，操作简便，适于基层推广，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：LAMP T25引物的检测原理；

图2：LAMP T25引物筛选的LAMP实时浊度法检测结果；

图3：LAMP引物T25的灵敏度；

图4：LAMP T25引物特异性检测结果；

图5：LAMP引物T25检测模板浓度为1%时的精密度；

图6：LAMP引物T25检测模板浓度为0.5%时的精密度；

图7：LAMP引物T25检测模板为ddH₂O时的精密度。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明所述的非转基因玉米样品是为AOCS0406-A；购自Sigma公司。

本发明所述的T25转基因玉米品系标准样品为AOCS0306-H3；购自Sigma公司。

(1)LAMP反应试剂：

Bst DNA大片段聚合酶（Bst DNA polymerase large fragment），New England Biolabs公司；

甜菜碱(Betaine)、MgCl₂，Sigma公司；

dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司；

10×ThermoPol缓冲液（贮存液）：配制方法如下，100 mM KCl，200 mM Tris-HCl（pH8.8，25℃），100 mM(NH₄)₂SO₄，20 mM MgSO₄和1%TritonX-100。使用时，需做10倍稀释。

(2)SYBR Green I荧光染料，厦门致善生物科技有限公司；

(3)LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物FLP、反向环引物BLP)，由生工生物工程（上海）有限公司合成；

(4)LAMP实时浊度仪，LA-320C，日本荣研化学株式会社；

(5)本发明所述的对照样品以及LAMP反应体系中所使用的各种溶剂均由常规途径制备或者商业途径获得。

实施例1

（一）LAMP反应体系的建立与引物筛选

用浓度为100%的T25转基因玉米品系标准样品，进行精提DNA，精提DNA的实验方法参考《分子克隆实验指南第三版》（萨姆布鲁克D.W拉塞尔著.科学出版社2002[美]J.黄培堂等译）。

精提DNA的浓度及纯度的测定：

取5μL DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得：

C=A×N×50/1000式中：

C——DNA浓度(μg/μL)

A——260nm处的吸光值

N——核酸稀释倍数

1OD_260nm＝50μg/mL双链DNA，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于LAMP检测。

T25转基因玉米品系标准样品（即：浓度为100%），提取后基因组DNA浓度为100ng/μl，[为方便表述，以下简写为T25DNA（100%，100ng/μl）]，作为阳性模板进行引物的初步筛选；所述的引物具体信息如下：

应用LAMP T25引物，采用下述反应体系，分别以上述精提的DNA作为模板，进行LAMP引物筛选与反应体系的建立：

每25μL的LAMP反应体系中：DNA模板200ng、SEQ ID NO：2~3各0.2μM、SEQ IDNO：4~5各1.6μM、SEQ ID NO：6~7各0.8μM、1×ThermoPol缓冲液、0.8mM甜菜碱、1.4mM dNTP、8UBst DNA大片段聚合酶、蒸馏水：余量；

LAMP（实时浊度法）具体操作步骤：

参照LAMP实时浊度仪使用说明书，将混合物置于反应孔中，反应条件为：于63℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应，根据出峰时间初步筛选反应条件。

LAMP T25引物的LAMP反应结果如图2，其中：

CH1~2两组：是指扩增模板为阴性对照的ddH₂O，这两条扩增曲线在图2中重合成一条直线（虚线），证明没有扩增，从而说明本实验中没有假阴性结果；

CH3~4两组：是指扩增DNA模板为T25DNA（100%，100ng/μl）；这两条扩增曲线在图2中重合成一条扩增曲线（实线）；证明本实验中所设计的LAMP T25引物，出峰时间为25min左右。

进一步将反应时间控制在45min进行特异性和灵敏度等实验。

实施例2 LAMP引物T25的灵敏度

为检测LAMP引物T25的灵敏度，同时根据最低灵敏度出峰时间及假阳性最早出峰时间，确定反应时间。重复实施例1的实验方法，但将LAMP T25的模板和反应条件进行下述调整：

①模板如下：将转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）用非转基因玉米AOCS0406-A DNA分别稀释到10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%几个梯度，每个稀释度分别取2μl进行LAMP实验；同时，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照；再以转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）作为阳性对照，分别进行LAMP扩增；通过实时浊度法检测结果；

②实施例1反应条件中的恒温反应时间由“60min”改为“45min”。

上述LAMP引物T25的灵敏度试验结果如图3所示，结果分析如下：

CH1组，其反应的模板为阳性对照——T25基因组DNA（100%，100ng/μl）；

CH2~5组的DNA模板为将转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）用非转基因玉米AOCS0406-A DNA分别稀释到10%，5%，1%，0.5%几个梯度在图3中都有对应的扩增曲线（CH1~5组的扩增曲线在图3中是实线）;

CH6~7组的DNA模板为将转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）用非转基因玉米AOCS0406-A DNA分别稀释到0.1%，0.05%。图3中CH6~7组没有扩增曲线，证明最低检出限是0.5%；

CH8组的DNA模板为阴性对照（ddH₂O），在图3中是平直的虚线；证明假阳性未出现；

从图3中可以看出，采用转基因玉米品系T25 DNA用非转基因玉米AOCS0406-A DNA稀释至不同浓度梯度，T25作为LAMP引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化，检测灵敏度可达0.5%。最低检出限0.5%约24min出峰，假阳性未出现，最终将反应时间确定为45min。

实施例3 LAMP引物T25的特异性（实时浊度法）

为验证LAMP反应的特异性，重复实施例2，将实施例2中LAMP反应的模板DNA换成下述样品的精提DNA，并分组:

CH2组的DNA模板为阴性对照（ddH₂O）；

CH3~32依次为下述样品的DNA：水稻，玉米，小麦，花生，大杏仁，绿豆，核桃，胡萝卜，鹰嘴豆，羽扇豆，四季豆，桔子，白云豆，大豆，燕麦，番茄，转基因玉米MON810、MON863、MON89034、BT176、GA21、BT11、NK603，转基因油菜RT73，转基因大豆MON88017、MON89788、DP305423、DP356043、GTS40-3-2，转基因土豆EH92-527-1。

反应体系和反应条件如实施例2，LAMP T25引物特异性检测结果如图4，

CH1组的DNA模板为阳性对照；在图4中有对应的扩增曲线（是实线）;

CH2组的DNA模板为阴性对照（ddH₂O），在图4中是平直的虚线；证明假阳性未出现；CH3~32组的DNA模板在图4中没有扩增曲线，呈现为平直的虚线；证明本引物没有非特异性的扩增，具有良好的特异性。

实施例4 稳定性实验

（一）1%精密度实验

为验证LAMP反应的稳定性，重复实施例2，将实施例2中LAMP反应的模板DNA换成下述样品的精提DNA，并分组:

将转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）用非转基因玉米AOCS0406-A DNA稀释到1%[即T25精提DNA（1%，1ng/μl）]20个平行样品作为模板，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）作为阳性对照，进行LAMP扩增，观察1%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图5，对结果分析如下：

CH1：阴性对照（超纯水）；CH2：阳性对照（100%转基因玉米品系T25 DNA）组，CH3~22：1%转基因玉米品系T25 DNA。

检测结果分析：CH2组以及CH3~22组均为实线，均集中在21~27min之间出峰，部分峰形有重叠现象；阴性对照组CH1组：没有扩增出相应的峰，是一条平直的虚线；显示出1%精密度的稳定性良好。

（二）0.5%精密度实验

为验证LAMP反应的稳定性，重复实施例3，将实施例3中LAMP反应的模板DNA换成下述样品的精提DNA，并分组:

将转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）用非转基因玉米AOCS0406-A DNA稀释到0.5%[即T25精提DNA（0.5%，0.5ng/μl）]20个平行样品作为模板，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）作为阳性对照，进行LAMP扩增，观察0.5%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图6，对其结果分析如下：

CH1：阴性对照（超纯水）；CH2：阳性对照（100%转基因玉米品系T25DNA）组，CH3~22：0.5%转基因玉米品系T25 DNA；

检测结果分析：CH2组以及CH3~22组均为实线，均集中在21~27min之间出峰，因此部分峰形重叠在一起；阴性对照组CH1组：没有扩增出相应的峰，是一条平直的虚线；显示出0.5%精密度的稳定性良好。

（三）阴性精密度实验

以21份ddH₂O分别作为待检样品的模板和阴性对照的模板，以转基因玉米品系T25精提DNA（100%，100ng/μl）作为阳性对照，以T25作为LAMP引物进行LAMP扩增，20个平行样品观察阴性精密度LAMP反应的稳定性。图7为阴性精密度实验LAMP反应结果，对其结果分析如下；

CH1：阳性对照（100%转基因玉米品系T25DNA）组，CH2~22：阴性对照（超纯水）；

CH2~22组为重叠的平直的虚线，均没有扩增；这说明，

①模板为ddH₂O的组没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；

②CH1组有扩增的曲线（实线），说明阳性结果正常。

结果显示，CH1组有实线的峰形出现，而20份阴性平行样品均没有扩增峰出现，在图7中对应的是一条重叠的直线（虚线），显示出阴性样品的精密度稳定性良好。

综上，（一）~（三）的实验结果证明：LAMP T25引物的特异性好、检测限可达0.5%，即T25的基因组DNA的浓度为0.5ng/μl，灵敏度和稳定性都较好。

实施例5 室内验证

本发明设计一种转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，试剂盒包括的溶液：每25μl的反应体系中，包括SEQ ID NO：2~3各0.2μM、SEQ ID NO：4~5各1.6μM、SEQ ID NO：6~7各0.8μM、20 mM pH8.8的Tris-HCl、10 mM KCl、8 mM MgSO₄、10 mM(NH₄)₂SO₄、0.1%Tween20、1mM甜菜碱、6 mM MgSO₄、1.6 mM dNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶；蒸馏水，余量；

其使用方法步骤包括：

①分别提取待测样品的基因组DNA；

②分别以步骤①精提的DNA作为模板，利用上述25μl的反应体系所包含的试剂，进行环介导等温扩增法检测：63℃恒温反应45min，80℃下保温5min；

为评估LAMP方法的特异性，采用以下试验方法进行对比试验：实时荧光PCR方法按照GB/T19495.5－2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》执行。文献中用于荧光定量PCR进行品系特异性检测的序列分别为：

正向引物：ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC

反向引物：GACATGATACTCCTTCCACCG

探针序列为：FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA

分别对模拟样品进行检测，模拟样品DNA的配制：

取非转基因玉米样品（AOCS0406-A，即空白样品）的DNA溶液（浓度为100ng/μl）2份，用100%的转基因玉米T25标准品的DNA对2份空白样品的DNA进行添加，制备2个不同质量浓度的T25模拟样品DNA：即，将转基因玉米品系T25精提DNA分别稀释到1%（1ng/μl）、0.5%（0.5ng/μl），并简称为1%和0.5%的模拟样品DNA。

分别对上述样品以LAMP实时浊度法检测，检测结果如表2：

表2 LAMP方法检测结果（实时浊度法）

结果分析：

LAMP实时浊度法检测结果显示转基因玉米T25品系1%模拟样品、0.5%模拟样品和空白样品（0%）的检测结果均合格，准确率达到100%。比较LAMP实时浊度法和实时荧光PCR方法的实验结果，可以看出LAMP实时浊度法和实时荧光PCR方法的结果一致，说明用LAMP方法检测转基因玉米T25品系转基因成分，本方法的特异性良好。

（二）LAMP方法的稳定性

为评估LAMP方法的稳定性，用实施例2所述的LAMP方法分别对3个不同浓度1%模拟样品、0.5%模拟样品和空白样品（0%）的样品进行检测，每个样品重复20次，同时与实时荧光PCR方法进行比对。实验结果见表3

表3 灵敏度实验结果

样品	LAMP显色法	LAMP实时浊度法	实时荧光PCR法
				空白样品（0%）	阴性	阴性	阴性
模拟样品（0.5%）	阳性	阳性	阳性
				模拟样品（1%）	阳性	阳性	阳性

LAMP显色法结果显示转基因玉米T25的1%模拟样品、0.5%模拟样品，空白样品（0%）的阴阳性结果均正确，准确率达到100%。比较LAMP方法和实时荧光PCR方法的实验结果可以看出LAMP方法和实时荧光PCR方法的检测结果一致，说明用LAMP方法检测转基因玉米T25品系转基因成分，本方法的稳定性良好。

（三）LAMP方法的特异性

为评估LAMP方法的特异性，分别对19份阴性样品、1份阳性样品、2份阳性标准品和2份阳性模拟样品进行检测，比较LAMP实时浊度法和实时荧光PCR方法的实验结果。本实验所用的试验方法如实施例2，检测样品和检验结果见表4。

表4 特异性实验样品清单及检测结果

从LAMP（显色法）结果可看出转基因含量越高，颜色变化越明显。

LAMP（实时浊度法）的检测结果图也显示转基因含量越高，开始出现大量扩增的时间越短。

从实时荧光PCR法检测结果也可看出转基因含量越高，Ct值越小。

各检测方法的结果统计见表4，显示阴性样品的LAMP反应结果全部正确，准确率达到100%。转基因玉米T25标准品、1%和0.5%模拟样品的LAMP检测结果为阳性，准确率达到100%。阳性样品中，含T25转基因成分的玉米样品FR2100的LAMP检测结果为阳性。

实时荧光PCR反应的结果显示24个阴、阳性样品的检测结果均与事实相符。其中阴性样品均无PCR扩增信号产生。

比较LAMP方法和实时荧光PCR法的实验结果：可以看出LAMP方法和实时荧光PCR方法的检测结果一致，LAMP显色法可以检测出转基因含量低至0.5%的转基因玉米T25品系，灵敏度较高。

以上实验数据显示，本项目研制的玉米T25品系特异性LAMP检测方法，适用于转基因玉米T25品系的检测，定性检测低限为0.5%，检测的稳定性达到100%，灵敏度达到0.5%，特异性达到100%，均符合评估要求。

采用LAMP检测技术建立适用于食品中转基因玉米T25品系特异性检测标准方法，操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，性能参数等同于传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。

Claims

1.一种检测转基因玉米T25品系的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO：2~7。

2.一种转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物：SEQ ID NO：2~7。

3.根据权利要求2所述的转基因玉米T25品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中：

每25μL的LAMP反应体系，其包括：SEQ ID NO：2~3各0.2μM、SEQ ID NO：4~5各1.6μM、SEQ ID NO：6~7各0.8μM、1×ThermoPol缓冲液、0.8mM甜菜碱、1.4mM dNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶；

其中上述1×ThermoPol缓冲液为：10 mM KCl，20 mM pH8.8的Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2 mM MgSO₄和0.1%TritonX-100。

4.利用权利要求2所述试剂盒检测转基因玉米T25品系的方法，其特征在于，检测步骤包括：

反应条件为：63℃恒温反应45min，80℃下保温5min；

5.根据权利要求4所述的检测转基因玉米T25品系的方法，其特征在于，所述步骤③中的浊度法利用LAMP实时浊度仪完成。

6.根据权利要求4所述的检测转基因玉米T25品系的方法，其特征在于，所述步骤③中的显色法使用荧光染料SYBR Green I。