CN106222238A - 一种杂菌检测方法以及包括检测方法的食用菌的接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌培养环境杂菌的检测方法以及包括检测方法的使用的接种方法。食用菌培养环境杂菌的检测方法包括：采样，将检测平皿放在检测式样，使培养基暴露在空气，以收集食用菌培养环境杂菌的杂菌；杂菌培养，将检测平皿放在恒温培养箱进行培养；菌落计数，观测检测平皿上的菌落总数；以及检测评定，根据检测结果评定检测式样的平均菌落数；其中，平均菌落数＝菌落总数/检测平皿个数。本发明杂菌检测方法操作简单，检测精度高，解决了环境杂菌难以检测的问题，提高了接种室的洁净级别。

Description

一种杂菌检测方法以及包括检测方法的食用菌的接种方法

技术领域

本申请涉及杂菌领域，具体涉及一种用于食用菌培养环境的杂菌检测方法以及包括检测方法的食用菌的接种方法。

背景技术

食用菌的制种和栽培上，因各种原因引起的杂菌污染屡见不鲜。各种杂菌(如霉菌和细菌)几乎无一例外地都是竞争性的，它们和食用菌生活在同一培养基上，争夺食用菌的培养和生活空间，影响食用菌的生长；许多杂菌还通过产生一些有毒物质来抑制食用菌菌丝的生长。从某种意义上来说，使用制种和栽培的中心工作就是如何防止和控制各种杂菌的污染，以获得菌丝体或栽培体的纯培养。

传统杂菌检测方法会对杂菌环境的式样进行分类，设定不同的采样点进行采样、利用杂菌培养装置对收集的杂菌进行培养、在一定的环境条件下将观测道德菌落计数以及根据观察的菌落情况进行除菌效果的结果评定。对于大多数的杂菌检测方法来说，对式样检测结果的评定方法至关重要。因为它和环境式样的温度、压力以及种类相关。

在实际生产中，制作菌种时，操作不慎，造成杂菌污染。菌种培养期间，如不及时检查，食用菌菌丝体生长掩盖了杂菌，培养了带有杂菌的菌种。因此杂菌检测方法进行有效的评估。

发明内容

本申请所要解决的技术问题在于提供一种食用菌环境杂菌的检测方法以及包括检测方法的食用菌的接种方法，解决了食用菌培养环境中杂菌难以检测的问题，提高接种室的洁净级别。

为了解决上述问题，本申请公开了一种食用菌培养环境杂菌的检测方法，其特征在于，包括：采样，将检测平皿放在检测式样，使培养基暴露在空气，以收集食用菌培养环境杂菌的杂菌；杂菌培养，将检测平皿放在恒温培养箱进行培养；菌落计数，观测检测平皿上的菌落总数；以及检测评定，根据检测结果评定检测式样的平均菌落数；其中，平均菌落数＝菌落总数/检测平皿个数。

进一步地，培养基为大豆蛋白琼脂培养基或沙氏培养基。

进一步地，检测区的工作区至少两采样点分别采样至少一次。

进一步地，培养皿在检测之前保持封闭，并且所述培养皿在空气中暴露0.2小时到0.7小时之间。

进一步地，检测皿在恒温保温箱中于32摄氏度到34摄氏度之间培养2天到3天。

进一步地，使用显微镜和/或用肉眼观察对所述检测平皿的进行所述菌落总数计数。

进一步地，检测式样可为培养环境或灭菌物品。

进一步地，检测评定方法为如果平均菌落数≤10,则食用菌培养环境除菌合格，否则，食用菌培养环境除菌不合格。

本发明还提供了一种食用菌的接种方法，包括：灭菌，将食用菌菌种灭菌处理；检测，根据上述检测方法进行检测；以及接种，将杂菌检测合格的食用菌接种。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

一、本发明的杂菌检测方法对操作区的采样布置合理，对重点的工作区进行了着重采用，具有代表性，使得采样更为准确；

二、本发明的杂菌检测方法的检测评定方法操作简单，精确率更高，提高了较好食用菌环境杂菌的洁净等级；

三、本发明的食用菌培养环境灭菌效果的检测方法操作简单，可在对物品灭菌后进行即时检测，缩短了食用菌培养的时间。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本发明食用菌培养环境杂菌的检测方法的流程图；

图2是本发明食用菌接种方法的流程图。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其它变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其它要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者系统中还存在另外的相同要素。

实施例描述

本申请的杂菌检测方法以及包括检测方法的食用菌的接种方法，适用于对食用菌菌种接种时对杂菌进行检测，解决了食用菌接种环境中杂菌难以检测，提高接种室的洁净级别。

具体实施例

参见附图1，是本发明食用菌培养环境杂菌的检测方法的流程图，如图所示，本发明的食用菌培养环境杂菌的检测方法包括一下步骤：

S1：采样，将检测平皿放在检测式样，使培养基暴露在空气，以收集食用菌培养环境杂菌的杂菌；本发明的食用菌每个工作区域至少选取两个采样点采样。原则上平均分布采样水平位置，对重点操作区域或疑似污染风险高的区域可增加检测平皿的数量，以保证检测的精确度。每个采样点一般采样一次，也可根据实际情况进行改变。工作区采样点的高度位置略高于工作面，这样可将工作面的采样点和工作区的采样点区分开来，以确定每个工作位置的不同洁净程度。非工作区域的采样点高度位置离地1.0米到1.3米之间，地面的杂菌和非工作区的杂菌是不同的，但是非工作区的采样点仍旧属于检测式样的范围，因为非工作区和工作区在食用菌的接种和栽培上在空间上具有连续性，这就要求非工作区也进行杂菌检测，但要求其和地面进行隔离，以和工作区的杂菌检测上保持一致性。确定采样点以后，进行采样。在本发明的一个实施例中，打开平皿盖使培养基暴露在检测式样的空气中0.2小时到0.7小时，例如0.5小时。注意检测前不得打开检测平皿，因为检测之前打开检测平皿可能带进不属于工作区的杂菌。同时，检测时的温度保持在室温，即食用菌接种和栽培的工作温度，因为杂菌根据其生长环境不同而不同，本发明要检测的是工作温度下的杂菌，所以检测温度保持在工作时的温度。

S2：杂菌培养，将检测平皿放在恒温培养箱进行培养；采样完毕后盖好盖子，把平皿倒置平放在恒温培养箱于32摄氏度到34摄氏度之间培养2天到3天。食用菌的杂菌在检测的初期是难以观察到的，因为杂菌是要通过一段时间培养，具有其自身菌落的颜色和大小才能辨认出来。根据食用菌的一般培养温度，即32摄氏度到34摄氏度之间来培养杂菌，从而可以筛选出食用菌具有大致相同生长温度的杂菌。同时，这些杂菌要培养到2天到3天，这是一般杂菌形成的菌落的大致时间，在这个过程中，杂菌菌落会逐渐长出，因为具有其合适的生长温度和时间，杂菌具有稳定的颜色和大小可以观察出来。食用菌生产中产检的杂菌有：木霉、青霉、毛霉、酵母菌、竞争性杂菌(包括褐轮韧革菌、红栓菌等)藻类病害和粘菌病害等。以木霉为一个示例，木霉的种类较多，主要由绿色木霉，康氏木霉，木素木霉等。木霉是普遍发生且危害最严重的杂菌，广泛分布于各种植物残体、土壤和空气中，在4摄氏度到42摄氏度都能生长，孢子萌发喜高温高湿环境，具有适应性强，传播蔓延速度快等特点。在培养料上初期为纤细，密集的白色菌丝体，成棉絮状，几天后分分生孢子大量形成，菌落为绿色粉状，边缘仍是密集的白色菌丝。如在子实体后期感染，则在菌盖或耳片上产生褐色病斑，以后出现深绿色分生孢子，引起实体腐烂。各种杂菌的生长状况不同，可根据实际情况进行对照。为了保证检测的精确度，在每一批检测平皿保留一个未曾打开盖子的检测平皿作为空白对照，同样放入培养箱一起培养。作为空白对照的检测平皿应该没有被任何杂菌污染，这样形成的洁净空白便于检测人员进行对照。

S3：菌落计数，观测检测平皿上的菌落总数；培养完成后，观察所得到的杂菌的颜色和菌落形状等，观察的方法有利用显微镜和/或用肉眼等对平皿上所有菌落直接计数。菌落计数的标准为根据颜色确定的菌落的大小而确定。

S4：检测评定，根据检测结果评定检测式样的平均菌落数；其中，平均菌落数＝菌落总数/检测平皿个数。确定了菌落数量以后，计算检测结果的平均菌落数，即每个采样点的的平均菌落数。计算公式为：区域内检测菌落总数/采样点个数＝平均菌落数。对菌落进行计数后，就要对检测结果进行评定，如果所述检测式样域的平均菌落数≤10cfu，则判定所述食用菌培养环境杂菌的检测合格，否则所述食用菌培养环境杂菌的检测不合格。本发明检测结果的评定结果示例见下图：

需要指出的是，本发明确定食用菌培养环境杂菌的评定方法中，平均菌落数以10cfu为标准仅为一个示例。根据食用菌培养环境的不同条件，诸如温度、压力、通风情况和光照，这个数值会有变化，但是都落入本发明保护范围内。

需要指出的是，本发明的培养基为大豆蛋白琼脂培养基或沙氏培养基，作为本发明的一个实施例，大豆蛋白琼脂的培养基配方为：酪蛋白胰酶消化物13克到20克，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3克到10克，氯化钠4克到7克，琼脂12克到20克，纯化水900毫升到1300毫升。作为本发明的一个实施例，酪蛋白胰酶消化物15克，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5克，氯化钠5克，琼脂15克，纯化水1000毫升，它的制备方法为：取上述成分除琼脂外，混合，加入1000毫升纯化水，微热搅拌溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，然后加入琼脂，加热融化，过程中搅拌均匀，分装灭菌。灭菌后冷却至约60摄氏度，在灭菌操作要求下倾注约20毫升至经灭菌处理过的培养皿中，加盖后在室温放至凝固。

作为本发明的另一个实施例，沙氏培养基的配方为：葡萄糖35克到50克，酪蛋白酶胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混合18克到13克，琼脂12克到18克，纯化水800毫升到1500毫升，葡萄糖35克到50克，酪蛋白酶胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混合8克到13克，琼脂14克到17克，纯化水900毫升到1400毫升。作为本发明的一个实施例，它的制备方法为：取上述成分除琼脂外，混合，加入1000毫升纯化水，微热搅拌溶解，调节pH值使其灭菌后为5.6±0.2，然后加入琼脂，加热融化，过程中搅拌均匀，分装灭菌。灭菌后冷却至约60摄氏度，在灭菌操作要求下倾注约20毫升至经灭菌处理过的培养皿中，加盖后在室温放至凝固。

以上制备好培养基平皿在2摄氏度到8摄氏度封闭保存，制备好后7天内使用。本发明举出了两个实施例，但是本发明的培养基没有限定如此，任何食用菌培养适用的培养基都在本发明的范围之内。

作为本发明的一个变型，杂菌检测方法的对象也可是灭菌物品。以菌袋作为一个实施例，在食用菌的接种和栽培过程中，要使用灭菌物品例如菌袋对食用菌进行包裹和封存，这就要求灭菌物品绝对没有杂菌，否则会对食用菌接种和栽培产生毁灭性影响。为了检测灭菌物品的灭菌效果，就要使用本发明公开的杂菌检测方法对霉菌物品是否存在杂菌，即灭菌效果进行检测。

具体地，随机抽取经高温高压灭好菌的菌袋，用消过毒的密封容器将菌袋密封装好，这样是为了防止外部环境造成的污染从而影响检测结果，将经高温高压灭菌的培养料放入菌袋，留样待检，等到菌袋料温冷却至25摄氏度以下时进行检测。在无菌环境下，将样品置于超净工作台内检测，所有器具及检测人员需按无菌操作要求进行操作。作为本发明的一个是实施例，每个菌袋选取圆柱体中心轴部位的上、中、下三个点作为采样点，也可根据实际情况进行改变。接下来根据前述食用菌培养环境杂菌检测方法的检测平皿进行培养。打开菌袋，垂直将其剖开，用无菌镊子挑取少量培养料放入检测平皿内，并盖好盖子，在恒温保温箱中于32摄氏度到34摄氏度培养2到3天，并且每一批所述检测平皿保留一个未曾使用的检测平皿作为空白对照。接下来的步骤和本发明前述的食用菌培养环境杂菌检测方法的步骤是一致的，最后没有计算检测平皿内的平均菌落数，而是仅仅观察是否有杂菌存在。如果检测平皿上没有菌落检出，则判定灭菌物品灭菌合格，否则判定灭菌物品灭菌不合格。

本发明还公开了一种食用菌接种方法，包括:

R1：灭菌，将食用菌菌种灭菌处理；食用菌的灭菌方法采用本领域常规灭菌方法，在这里不做过多限定；

R2：采样，将检测平皿放在检测式样，使培养基暴露在空气，以收集食用菌培养环境杂菌的杂菌；这个步骤和之前的S1中的采样步骤一致，在这里不做过多限定；

R3：杂菌培养，将检测平皿放或倒放在恒温培养箱进行培养；这个步骤和之前的S2中的杂菌培养步骤一致，在这里不做过多限定；

R4：菌落计数，观测检测平皿上的菌落总数；这个步骤和之前的S3中的菌落计数步骤一致，在这里不做过多限定；

R5：检测评定，根据检测结果评定检测式样的平均菌落数；其中，平均菌落数＝菌落总数/检测平皿个数；这个步骤和之前的S4中的检测评定步骤一致，但是，对检测的评定方法在这个接种方法做了相应的变化，如果所述检测式样域的平均菌落数为0，则判定所述食用菌培养环境杂菌的检测合格，否则所述食用菌培养环境杂菌的检测不合格。

R6:接种，将杂菌检测合格的食用菌接种；食用菌的接种方法采用本领域常规灭菌方法，在这里不做过多限定。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种食用菌培养环境杂菌的检测方法，其特征在于，包括：

采样，将检测平皿放在检测式样，使培养基暴露在空气，以收集食用菌培养环境杂菌的杂菌；

杂菌培养，将所述检测平皿放在恒温培养箱进行培养；

菌落计数，观测所述检测平皿上的菌落总数；以及

检测评定，根据检测结果评定所述检测式样的平均菌落数；

其中，平均菌落数＝菌落总数/检测平皿个数。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养基为大豆蛋白琼脂培养基或沙氏培养基。

3.根据权利要求1所述食用菌培养环境杂菌的检测方法，其特征在于，所述检测区的工作区至少两采样点分别采样至少一次。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养皿在检测之前保持封闭，并且所述培养皿在空气中暴露0.2小时到0.7小时之间。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测平皿在恒温保温箱中于32摄氏度到34摄氏度之间培养2到3天。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使用显微镜和/或用肉眼观察对所述检测平皿的进行所述菌落总数计数。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测式样可为培养环境或灭菌物品。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测评定方法为如果平均菌落数≤10,则食用菌培养环境除菌合格，否则，食用菌培养环境除菌不合格。

9.一种食用菌的接种方法，其特征在于，包括：

灭菌，将食用菌菌种灭菌处理；

检测，根据权利要求1至权利要求8的其中之一的检测方法进行检测；以及

接种，将杂菌检测合格的食用菌接种。