KR20060079995A

KR20060079995A - 대장균에서 발현가능한 ｇｕａＡ 유전자를 포함하는 벡터,이를 포함하는 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물을이용하여 ５＇－구아닐산 합성효소를 배지 중에축적시키는 방법

Info

Publication number: KR20060079995A
Application number: KR1020050000429A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 김형석; 이진남; 오기훈; 김정환; 오윤석; 심재익; 최경오
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-01-04
Filing date: 2005-01-04
Publication date: 2006-07-07
Also published as: KR100629773B1

Abstract

본 발명은 대장균에서 발현가능한 guaA 유전자를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 5'-구아닐산 합성효소를 배지 중에 축적시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 5'-구아닐산 생산 공정에서 안정적이고 대량으로 5'-구아닐산 합성효소를 공급할 수 있다.

PL 프로모터, 샤인달가노 염기서열, 5'-구아닐산 합성효소, guaA 유전자, 에스케리키아

Description

대장균에서 발현가능한 ｇｕａＡ 유전자를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 ５＇－구아닐산 합성효소를 배지 중에 축적시키는 방법{Vectors containing guaA gene expressible in Escherichia coli, Escherichia cells harboring the same, and processes for accumulating 5'-guanylic acid synthetase in a medium using them}

도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pUPSG의 구축 과정을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pUC-guaA::loxPKm의 구축 과정과 이로부터 DNA 절편 guaA::loxPKm의 구축 과정을 나타낸다.

본 발명은 대장균에서 발현가능한 guaA 유전자를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 5'-구아닐산 합성효소를 배지 중에 축적시키는 방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산(5'-guanylic acid, GMP)은 효모의 RNA를 미생물 효소를 이용한 분해 또는 화학적으로 분해하는 방법, 당과 질소원과 인산원을 함유하는 배지에서 미생물의 변이주를 배양하고 뉴클레오티드를 직접 생산하는 방법, 발효법으로 뉴클 레오티드 합성의 중간체를 생산한 후 화학적 또는 효소적으로 뉴클레오티드로 변환하는 방법이 있으며, 현재 경제적으로 유리한 제조법으로서는 발효와 화학합성 또는 발효와 효소전환에 의한 복합 제조방법이 공업적으로 널리 사용되고 있다.

한편, 효소전환에 의한 복합 제조방법은 직접 발효에 의하여 5'-크산틸산(XMP)을 생산하게 되는 발효공정과 그 발효 산물들을 효소적으로 5'-구아닐산(GMP)으로 전환하는 반응공정으로 이루어지며 2종의 미생물이 사용된다. 즉 제1공정(발효공정)에서는 XMP의 생산균으로 육종된 변이주가 사용되며, 제2공정(반응공정)에서는 5'-구아닐산 합성효소(GMP synthetase)를 암호화하는 유전자를 과발현시킨 미생물이 사용된다.

제2공정은 해당 효소를 코딩하는 guaA 유전자를 강력한 프로모터인 박테리오파지 람다의 PL 프로모터와 결합하여 만든 고생산 플라스미드를 에스케리키아 속 균주에서 발현하여 사용하는데, 전사과정은 강력한 프로모터에 의해 효율이 높지만 해독과정은 에스케리키아 속 균주의 리보좀 부착서열이 결손되어 그 효율이 최적화되었다고 볼 수 없다(EP0263716A2). 또한 이 공정에서 과발현 미생물에서의 플라스미드 안정성은 배양공정 후기에 급격하게 감소하는데, 이는 5'-구아닐산 합성효소는 과량 생산시 모균주에게 독성을 나타내는 것으로 알려져 있으며 상기 효소의 연속적 과발현이 배양 공정 후반부의 미생물 생육을 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 현재 사용하는 고생산 플라스미드의 효율을 더욱 높여 생산성을 끌어 올리는 것이 필요하며, 이와 더불어 미생물에서의 플라스미드 안정성을 높여 배양공정 전체에서 고른 효소 생산을 하도록 하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 대장균에서 고발현될 수 있는 guaA 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 5'-구아닐산 합성효소를 배지 중에 고농도로 축적하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

박테리오파지 람다 유래 PL 프로모터, 에스케리키아 속에서 기능성인 리보좀 결합 서열, 및 5′-구아닐산 합성효소 (5′-guanylic acid synthetase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되어 있는 벡터를 제공한다.

5'-구아닐산 합성효소를 코딩하는 guaA 구조유전자에 박테리오파지 람다의 PL 프로모터와 에스케리키아 콜라이의 리보좀 부착서열을 최적화한 염기서열을 결합시켜 pUC18 벡터에 삽입한 고생산 플라스미드가 제공된다. 본 발명의 PL 프로모터는 에스케리키아 속 미생물에 감염하는 바이러스인 박테리오파지 람다에서 유래한 것으로 매우 강력한 프로모터로 알려져 있으며, 특히 전사조절인자인 cI 억제인자와 함께 학술적, 산업적 목적으로 많이 이용되고 있다. PL 프로모터는 cI 억제인자가 부착되는 부위가 RNA 중합효소가 부착하는 부위와 겹쳐져 있어 전사과정을 억제할 수 있으며, 특히 cI 억제인자 중 열 안정성이 감소한 온도 감수성 변이인자는 온도에 따른 전사조절을 가능하게 함으로써 널리 사용된다. 또한 PL 프로모터는 에스케리키아 속 미생물의 포괄적 전사조절인자인 IHF(integration host factor)에 의해 전사가 촉진됨이 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 IHF 부착서열을 모두 포함하는 PL 프로모터 부위를 guaA 유전자에 결합하는 것을 목적으로 하였고, 이 경우 해독 과정에 필수적인 샤인달가노 염기서열이 결손되어 있는 점을 감안하여 이를 최적화하여 삽입하는 기술을 제공한다.

본 발명의 에스케리키아 콜라이의 리보좀 부착서열은, 샤인달가노 염기서열(shine-dalgarno sequence, SD sequence)로 알려져 있으며, 해독과정 개시 코돈인 AUG로부터 10개의 염기쌍 이내에 5'-AGGAGG-3'로 알려진 컨센서스 염기서열이 위치하고 있다. 이는 에스케리키아 속 균주의 해독과정을 담당하는 리보좀의 한 구성체인 16S rRNA의 3'-UCCUCC-5' 부위와 상보적인 결합을 하는 부분으로서, 비록 해당 컨센서스 염기서열이 결손되어 있어도 해독과정이 일어나지만 그 효율이 감소함이 널리 알려져 있다. 또 다른 연구에서는 5'-TAAGGAG-3' 염기서열이 강력하게 보존되어 있으며 이들의 위치가 구조유전자의 첫번째 AUG 개시코돈으로부터 13번째 염기쌍에 위치할 때 최적임을 보여주고 있다. 따라서 본 발명에서는 강력한 PL 프로모터로부터 전사된 guaA 구조유전자의 mRNA가 높은 효율로 해독될 수 있도록 인위적으로 조합한 샤인달가노 염기서열을 guaA 유전자와 결합하였다.

PL 프로모터는 박테리오파지 람다를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 얻었으며 guaA 구조유전자는 에스케리키아 종 K12의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR을 통해 얻었고 이때 pfu 효소를 사용하였다. 에스케리키아 속 균주의 리보좀 부착서열은 약 20개 이내의 염기쌍으로 구성할 수 있는데, 이는 PL 프로모터와 guaA 구조유전자의 사이에 위치하게 된다. 따라서 PL 프로모터를 얻기 위해 사용하는 프라이머 중 3'-말단 1종과 guaA 구조유전자를 얻기 위해 사용하는 프라이머 중 5'-말단 1종을 인공적으로 조합한 리보좀 부착서열이 공유되도록 제작하여 각각의 PCR 산물이 리보좀 부착서열을 중심으로 말단간의 상보적 결합이 가능하게 하고, 이를 주형으로 하여 나머지 프라이머들을 사용한 2차 PCR에서 PL 프로모터와 리보좀 부착서열과 guaA 구조유전자가 결합된 최종 PCR 산물을 얻었다. 또한 PL 프로모터와 guaA 구조유전자를 얻기 위해 사용한 프라이머들 중 2차 PCR에 사용한 것들은 제한효소 절단서열을 삽입하여 제작하였으므로, 최종 PCR 산물을 제한효소를 처리한 후 동일한 제한효소로 절단한 pUC18 벡터에 상보적 결합을 통해 손쉽게 도입하였다. 그리고 5'-구아닐산 합성효소 과발현에 따른 모균주의 높은 치사율 때문에 발생하는 낮은 클로닝 효율을 극복하기 위하여 플라스미드 제작시에는 박테리오파지 람다의 cI 억제인자를 게놈 상에 포함하고 있는 에스케리키아 종 POP2136 균주를 사용하였다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 에스케리키아 종 K12의 변이주로서, 본 발명의 벡터가 형질전환되어 있고, 내재적 guaA 유전자가 불활성화된 에스케리키아 속 미생물을 제공한다. 본 발명의 에스케리키아 속 미생물은 내재적 guaA 유전자가 불활성화되어 있어, 본 발명의 벡터의 상기 미생물 내 안정성을 향상시킨 균주이다. 또한 과발현 벡터의 향상된 안정성과 함께 5'-구아닐산 합성효소의 생산량도 증가된 균주이다.

상기 guaA 유전자의 불활성화는 다양한 불활성화 돌연변이 기술(Knockout Mutation)을 이용함으로써 달성될 수 있다. 불활성화 돌연변이는 시험관내에서 반드시 필요한 것은 아니지만 편리하게는 우성 선별 마커를 제공하는 외래 DNA 조각이 천연 염색체 DNA의 특정 단백질 암호화 영역내에 삽입되어 그 서열이 불활성화 되는 것을 포함한다. 단백질 암호화 영역내에서의 불활성화 돌연변이는 야생형 단백질의 발현을 억제하거나 그 단백질에 의해 제공되는 기능을 상실시킨다.

불활성화 과정은 불활성화 유전자 카세트를 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 천연적으로 균주는 DNA 유입에 대해 컴피턴트하여 형절전환할 수 있으나 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다. 상기 불활성화 유전자 카세트는 선별 마커를 제공할 수 있는 외래 DNA 조각이 삽입된 천연 염색체 DNA의 절편을 가리키며, 게놈 DNA의 절편내에 외래 DNA 조각을 도입하고 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 카세트로 치환시킴으로써 형성된다. 본 발명의 한 태양으로서 불활성화 프로토콜은 표적부위 DNA를 포함한 "테일(tail)"이 불활성화 카세트의 5' 및 3' 말단에 남아 있도록 표적 DNA 내로 외래 DNA 조각을 클로닝하는 것을 포함한다. 테일은 적어도 50개 이상의 염기쌍이 바람직하고, 효율적인 재조합 및/또는 유전자 전환을 위해 200 내지 500개 염기쌍이 더욱 바람직하다. 편리상 표적 DNA 내로 클로닝한 외래 DNA는 선별 마커, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 제공한다. 표적 DNA가 항생제 내성 유전자에 의해 불활성화되는 경우 형질전환체의 선별은 적절한 항생물질이 함유된 한천 평판배지 상에서 실시한다. 형질전환 후 불활성화 카세트가 유입된 세포 분획은 그 카세트의 게놈 DNA 테일을 따라 동종 재조합 또는 유전자 전환을 겪게 되고 결국 야생형 게놈 서열은 불활성화 카세트로 치환된다. 불활성화 재조합이 이루어졌는지의 여부는 예를 들면 써던 블로팅 하이브리드(Southern blotting hybrid) 실험에 의해 쉽게 확인할 수 있으며, 더욱 편리하게는 PCR에 의해 검증할 수 있다. 당업자는 본 발명의 불활성화 카세트 및 DNA 절편을 일반적인 클로닝 방법에 의해 제조할 수 있음을 인지할 것이다. PCR은 게놈 DNA, 적합한 효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는 Peltier Thermal Cycler(MJ research 사)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정할 수 있다.

게놈 DNA에 외래 유전자의 정보를 제거하여 안정성을 증대하기 위해서 표적 DNA 내로 클로닝된 외래 DNA, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 제거해야 한다. 표적 유전자가 불활성화된 형질전환체의 게놈 DNA에서 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서, 불활성화 카세트 내에 존재하는 염기서열 일부를 인식하여 항생제 내성 유전자를 제거시키는 효소를 암호화하는 유전자를 발현하는 플라스미드를 형질전환 시킨다. 해당 형질전환체의 선별은 암피실린이 함유된 한천 평판배지 상에서 실시한다. 표적 DNA 상의 항생제 유전자의 제거 여부는 적절한 항생제를 함유한 한천 평판배지 상에서 투스픽을 통한 콜로니의 형성 여부를 통해 확인한다.

따라서, 본 발명의 미생물은 항생제 마커 유전자 단편이 guaA 유전자에 삽입된 재조합 벡터로 에스케리키아 종 K12를 형질전환시킨 후 guaA 유전자가 불활성화된 균주를 선별하고, 이 균주로부터 항생제 내성 유전자를 제거하여 얻어진 미생물 이 바람직하다.

구체적으로는, 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 미생물은 다음의 과정을 포함한 제조방법으로 제조된 에스케리키아 속 미생물이 바람직하다. 즉, 에스케리키아 종 K12로부터 게놈 DNA를 분리하고 이를 주형으로 한 PCR 반응에 의해 guaA 유전자를 증폭한다. 얻어진 유전자 산물을 플라스미드 또는 기타 벡터(예를 들어, 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등) 내로 클로닝하여 형성된 재조합 벡터(예를 들어, 재조합 플라스미드 pUC-guaA)를 형질전환에 의해 대장균과 같은 숙주 세포내로 도입한다. 형질전환체를 배양 증식한 후 이들로부터 guaA 유전자를 갖는 재조합 벡터를 추출하고, 추출된 재조합 벡터내의 guaA 유전자에 loxP 염기서열을 포함하는 항생제 내성 유전자 절편을 삽입하여 guaA 유전자가 불활성화된 재조합 벡터(예를 들어, pUC-guaA::loxPKm)를 제작한 다음, 이 재조합 벡터를 위와 같이 형질전환에 의해 숙주 세포 내로 도입하고 배양한다. 얻어진 형질전환체로부터 증식된 재조합 벡터를 분리하고 적절한 제한효소 처리 또는 PCR 반응에 의해 guaA 유전자의 불활성화 카세트 절편(예를 들어, guaA::loxPKm)을 얻는다. 이들 절편을 에스케리키아 종 K12에 전기충격법과 같은 기술에 의해 유입시킨 후 항생제 마커를 포함하는 guaA 유전자의 절편이 염색체 상의 야생 guaA 유전자와 재조합하여 생장을 거듭해도 계속 guaA 유전자의 불활성화 특성을 갖는 항생제 내성을 가진 균주를 분리한다. 선별된 균주의 염색체 상의 항생제 마커를 제거하기 위해 항생제 내성 유전자 내의 loxP 염기서열을 인식해서 항생제 내성 유전자를 제거시키는 효소를 암호화하는 유전자를 발 현하는 재조합 벡터를 형질전환 시킨다. 이 벡터를 에스케리키아 종 K12에 형질전환에 의해 숙주 세포내로 도입하고, 형질전환체의 선별은 벡터의 항생제 내성을 이용하여 암피실린이 함유된 한천 평판배지상에서 실시한다. 표적 DNA상의 항생제 유전자의 제거 여부는 적절한 항생제를 함유한 한천 평판배지상에서 투스픽을 통해 콜로니가 형성되는지의 여부를 통해 확인하며, 항생제 마커 일부를 포함하는 guaA 유전자의 절편이 염색체 상의 야생 guaA 유전자와 재조합하여 생장을 거듭해도 계속 guaA 유전자의 불활성화 특성을 갖는 균주(예를 들어, 에스케리키아 종 K12△guaA)를 분리한다.

따라서, 본 발명의 미생물은 재조합 벡터 pUC-guaA::loxPKm으로 에스케리키아 종 K12를 형질전환시키고 guaA 유전자가 불활성화된 균주를 선별하여 얻어진 미생물이 바람직하며, 에스케리키아 종 K12△guaA가 더욱 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 미생물을 배양하고, 배지 중에 5'-구아닐산 합성효소(GMP synthetase)를 고농도로 축적하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지내에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원으로는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효소 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해 생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물 로는 인산 1 수소칼륨, 인산 2 수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적인 조건하에서는, 예를 들면 진탕배양 또는 통기 교반배양에 의해 바람직하게는 30~40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 1~2일 동안 수행할 수 있으며 배지 중에 5'-구아닐산 합성효소의 활성이 포함된 미생물이 축적된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 5'-구아닐산 합성효소를 과량 생산하는 과발현 벡터 pUPSG의 구축

박테리오파지 람다 1316(bacteriophage λ1316)을 주형으로 한 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 PL 프로모터 245bp 부위를 증폭하였다. 사용된 프라이머들은 5'-말단쪽으로 5'-GCTGAATTCTTGCCTCACGATCGCCCCCAAAAC-3'(서열번호 1)와 3'-말단쪽으로 5'-ATGATCCTCCTTATCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3'(서열번호 2)이며, 서열번호 1의 밑줄은 제한효소 EcoRI의 인식서열을 나타내고, 서열번호 2의 이중밑줄은 인공적으로 조합된 샤인달가노 염기서열(SD sequence)을 포함한 부분을 나타낸다. 반응조건은 최초 변성(denaturation) 단계를 95℃에서 3분간을 실시한 후 다시 변성 단계 95℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계 50℃에서 30초, 연장(extension) 단계 72℃에서 30초를 실시하였고 30주기를 반복한 후 최종 연장 단계를 72℃에서 5분간 수행하였다.

에스케리키아 종 K12의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 반응에서 1.6kb 크기의 guaA 유전자를 얻기 위해 사용한 프라이머들은 5'-말단쪽으로 5'-ACCATGATAAGGAGGATCATATGACGGAAAACATTCATAAG-3'(서열번호 3)와 3'-말단쪽으로 5'-GCCAAGCTTTCATTCCCACTCAATGGTAG-3'(서열번호 4)이며, 서열번호 3의 이중밑줄은 인공적으로 조합된 샤인달가노 염기서열을 포함한 부분으로 서열번호 2의 것과 상보적으로 동일하여 향후 두개의 PCR 산물이 결합할 수 있는 부위로 작동하고, 서열번호 4의 밑줄은 제한효소 HindIII의 인식서열을 나타낸다. 반응조건은 연장 단계의 시간을 1분 30초로, 최종 연장 단계의 시간을 10분으로 늘려 수행한 것을 제외하고는 상기와 동일하다.

각각의 PCR 결과물들을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 각각의 특이적인 밴드를 용출하고 그 상대적인 양을 전기영동으로 확인하였으며, 이들을 동일한 몰(mole) 비율로 혼합한 후 주형으로 삼아 2차 PCR 반응을 진행하였다. 이 반응에는 상기 프라이머들 중 서열번호 1의 것과 서열번호 4의 것을 사용하였고 반응 조건은 연장 단계의 시간을 2분으로 늘려 수행한 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 2차 PCR 산물도 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1.9kb의 밴드를 용출하여 순수분리했으며, 이를 제한효소 EcoRI과 HindIII를 넣고 적절한 버퍼를 첨가한 후 37℃에서 밤새 인큐베이션하였고 pUC18 벡터도 마찬가지로 처리하였다. 이후 각각의 반응물에서 DNA만을 회수한 후 적절한 비율로 혼합하고 DNA 결합효소인 리가아제를 첨가 하여 16℃에서 4시간 동안 반응하였고 이중 일부를 에스케리키아 종 POP2136 균주에 형질전환하여 암피실린이 첨가된 한천 평판배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 첨가된 액체배지 3ml에 접종하여 37℃에서 밤새 배양한 후 미니프렙키트(Intron)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리하여 PL-SD-guaA 의 1.9kb 크기의 절편이 생성되는 것으로 클로닝 여부를 확인하였다. 완성된 플라스미드는 서열결정 분석을 통해 PCR 반응 중 오류가 발생하지 않았음을 확인하였고(박테리오파지 람다 유래 PL 프로모터(서열번호 5) 및 guaA 유전자 서열(NCBI 등록번호 M10101)), 이를 pUPSG로 명명하였다 (도 1).

실시예 2: 에스케리키아 종 K12 균주의 guaA 유전자가 불활성화된 신규의 미생물 제조

게노믹-팁 시스템(QIAGEN)을 이용하여 에스케리키아 종 K12로부터 게놈 DNA를 추출하였고, 이를 주형으로 한 PCR반응으로 guaA 구조유전자를 증폭하였다. 사용된 프라이머들은 5'-말단으로 5'-ATGACGGAAAACATTCATAAGC-3'(서열번호 7)와 3'-말단으로 5'-TCATTCCCACTCAATGGTAGC-3'(서열번호 8)이며 반응조건은 최초 변성(denaturation) 단계를 95℃에서 3분간을 실시한 후 다시 변성 단계 95℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계 50℃에서 30초, 연장(extension) 단계 72℃에서 1분 30초를 실시하였고 25주기를 반복한 후 최종 연장 단계를 72℃에서 10분간 수행하 였다.

이 PCR 결과물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1.6kb 크기의 밴드를 용출하여 pUC18 클로닝 벡터의 HincII 위치에 밤새 연결시켰다. 이에 따라 형성된 재조합 플라스미드 pUC-guaA를 대장균 POP2136에 형질전환시키고 암피실린이 든 한천 평판배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 첨가된 액체배지 3ml에 접종하여 37℃에서 밤새 배양한 후 미니프렙키트(Intron)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리하여 1.6kb 크기의 절편이 생성되는 것으로 guaA 구조유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pUC-guaA를 제한효소 HincII로 처리한 후, 1.0% 아가로즈 겔에서 약 4.3kb 크기의 밴드를 용출하였다. 여기에 플라스미드 pUG6를 제한효소 EcoRV와 HincII로 처리하여 얻은 loxP 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편(약 1.7kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pUC-guaA::loxPKm를 얻었다(도 2).

이 재조합 플라스미드 pUC-guaA::loxPKm를 POP2136에 형질전환시키고, 암피실린과 카나마이신이 포함된 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신이 첨가된 액체배지 3ml에 접종하여 밤새 배양한 후 미니프렙키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형으로 한 PCR 반응으로 guaA 구조유전자와 loxPKm 부위를 포함하는 DNA 절편(guaA::loxPKm), 약 2.3kb 크기의 절편을 증폭하였다. 사용된 프라이머들은 서열번호 7와 서열번호 8이며, 반응조건은 최초 변성(denaturation) 단계를 95 ℃에서 3분간을 실시한 후 다시 변성 단계 95℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계 50℃에서 30초, 연장(extension) 단계 72℃에서 2분 30초를 실시하였고 30주기를 반복한 후 최종 연장 단계를 72℃에서 10분간 수행하였다. 이 DNA 절편 guaA::loxPKm을 에스케리키아 종 K12 균주에 전기충격요법으로 유입시켜 카나마이신이 포함된 한천 평판배지에 도말한 후 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니의 항생제 마커를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 선별된 콜로니에 형질전환 시키고, 암피실린이 포함된 한천 평판배지에 도말하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신이 없는 한천 평판배지에 투스픽을 한 후 43℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 후 항생제 없는 배지에서만 형성된 콜로니를 획득 하였으며 이들을 카나마이신이 첨가된 한천 평판배지에서 성장하지 못함을 재확인한 후 K12△guaA로 명명하였다.

실시예 3: 선별균주 에스케리키아 종 K12△guaA 균주에서 pUPSG 플라스미드의 안정성과 5'-구아닐산 합성효소의 생산량 측정

에스케리키아 종 K12 균주와 K12△guaA 균주를 pUPSG로 형질전환하고, 5'-구아닐산 역가배지(표 1)를 사용하여 삼각 플라스크에서 플라스미드 안정성과 5'-구아닐산 합성효소의 생산량을 조사하였다. 항생제 암피실린이 첨가된 한천 평판배지에 도말하여 37℃에서 10시간 배양한 형질전환 균주를 암피실린이 첨가된 3ml 역가배지에 접종하여 37℃에서 250rpm, 16시간 배양하였고, 각각의 균체를 암피실린이 첨가된 50ml 역가배지에 1% 접종하여 30℃와 37℃에서 200rpm, 10시간 배양하였다. 배양이 끝난 균주를 이용하여 5'-구아닐산 합성효소의 생산량을 측정하였으며, 또한 일부 균주는 항생제가 포함되지 않은 한천 평판배지와 항생제가 포함된 한천 평판배지에 각각 적절한 희석농도로 도말하고 30℃에서 16시간 배양하여 생성된 콜로니 갯수를 세어 pUPSG 플라스미드의 안정도를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타난 바와 같이, 플라스미드 안정성이 K12 균주보다 K12△guaA 균주에서 온도에 따라 적게는 2배에서 많게는 100배까지 향상되었고, 5'-구아닐산 합성효소의 생산량도 3배 이상 증가함을 알 수 있다.

5'-구아닐산 역가배지

조성물	농도(g/L)
박토 펩톤	16
NaCl	5
효모 추출물	10
pH 7.0

형질전환 균주들의 5'-구아닐산 합성효소 생산성과 pUPSG 플라스미드 안정성 비교 결과

		K12[pUPSG]			K12△guaA[pUPSG]
		효소역가	콜로니의 갯수	안정성	효소역가	콜로니의 갯수	안정성
30℃	항생제 없는 배지	-	5×10⁸	40%	-	4×10⁸	75%
30℃	항생제 있는 배지	2U/ml	2×10⁸	40%	4U/ml	3×10⁸	75%
37℃	항생제 없는 배지	-	7×10⁹	0.09%	-	8×10⁹	8.8%
37℃	항생제 있는 배지	6U/ml	6×10⁶	0.09%	21U/ml	7×10⁸	8.8%

안정성은 항생제 있는 배지에서 자란 콜로니 갯수를 항생제 없는 배지에서 자란 콜로니 갯수로 나누어준 백분율이다.

pUPSG로 형질전환된 K12△guaA 균주를 수탁하였고, 수탁번호는 KCCM-10629(수탁일: 2004년 11월 30일)이다.

본 발명에 따른 PL 프로모터와 샤인달가노 염기서열을 최적화하여 guaA 유전자를 상시 과발현하는 신규의 벡터 pUPSG와 플라스미드 안정성을 높인 에스케리키아 종 K12△guaA 균주는, 기존에 PL 프로모터만을 사용한 guaA 발현벡터와 K12 야생주를 사용한 경우보다 5'-구아닐산 합성효소의 생산량이 크게 증가함을 알 수 있었다. 따라서 5'-구아닐산 생산 공정에서 안정적이고 대량으로 5'-구아닐산 합성효소를 공급할 수 있는 방법을 제시하고 있다.

<110> CJ Corporation <120> Vectors containing guaA gene expressible in Escherichia coli, Escherichia cells harboring the same, and processes for accumulating 5'-guanylic acid synthetase in a medium using them <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gctgaattct tgcctcacga tcgcccccaa aac 33 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 atgatcctcc ttatcatggt ggtcagtgcg tcctgctgat 40 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 accatgataa ggaggatcat atgacggaaa acattcataa g 41 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gccaagcttt cattcccact caatggtag 29 <210> 5 <211> 245 <212> DNA <213> bacteriophage lambda 1316 <400> 5 tcatggtggt cagtgcgtcc tgctgatgtg ctcagtatca ccgccagtgg tatttatgtc 60 aacaccgcca gagataattt atcaccgcag atggttatct gtatgttttt tatatgaatt 120 tattttttgc aggggggcat tgtttggtag gtgagagatc tgaattgcta tgtttagtga 180 gttgtatcta tttatttttc aataaataca attggttatg tgttttgggg gcgatcgtga 240 ggcaa 245 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SD sequence <220> <221> RBS <222> (1)..(20) <400> 6 accatgataa ggaggatcat 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 atgacggaaa acattcataa gc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 tcattcccac tcaatggtag c 21

Claims

박테리오파지 람다 유래 PL 프로모터, 에스케리키아 속에서 기능성인 리보좀 결합 서열, 및 5′-구아닐산 합성효소 (5′-guanylic acid synthetase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되어 있는 벡터.
제1항에 있어서, 박테리오파지 람다 유래 PL 프로모터는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 리보좀 결합 서열은 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 5′-구아닐산 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 NCBI 등록 번호(accession number)가 M10101 인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터가 pUPSG 인 것을 특징으로 하는 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 에스케리키아 속 미생물.
제6항에 있어서, 대장균 K12 또는 내재적 guaA 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 K12 변이주인 미생물.
제 7 항에 있어서, pUPSG 벡터로 형질전환된 내재적 guaA 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 K12 변이주 (수탁번호 KCCM-10629).
제7항에 있어서, 상기 대장균 K12 변이주는 guaA 유전자가 상동성 재조합에 의한 핵산의 치환에 의하여 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
제6항에 따른 미생물을 배양하여 5′-구아닐산 합성효소를 배지 중에 고농도로 축적하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 미생물은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 대장균 K12 또는 내재적 guaA 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 K12 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 대장균 K12 변이주는 guaA 유전자가 상동성 재조합에 의한 핵산의 치환에 의하여 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.