CN101389752A - 能够产生有机酸的细菌以及产生有机酸的方法 - Google Patents

Abstract

提供的是一种细菌，其能够产生有机酸并且被修饰以具有与未修饰的菌株的相比的增强的2－氧代戊二酸脱氢酶活性。有机酸，例如丁二酸可以通过培养所述细菌来制备。

Description

能够产生有机酸的细菌以及产生有机酸的方法

技术领域

本发明涉及产生有机酸的细菌，例如棒状杆菌型细菌，并且涉及使用所述有机酸产生细菌来产生有机酸，例如琥珀酸。

背景技术

对于通过发酵产生包括琥珀酸等有机酸，通常使用厌氧细菌，例如属于厌氧螺菌属和放线杆菌属的那些(专利文献1和2，非专利文献1)。厌氧细菌的使用获得了高的产物产量，然而需要许多的营养物用于厌氧细菌的增殖。因而，必须在培养基中添加大量的有机氮源，例如玉米浆(steep liquor)(CSL)。有机氮源的大量的添加不仅引起培养基成本方面的增加，还引起用于分离产物的纯化成本方面的增加，从而最终是不经济的。

此外，还已知一种方法，其中需氧菌例如棒状杆菌型细菌首先在需氧条件下培养来增殖细菌，然后，细菌被保持在厌氧条件下作为静息细菌来产生有机酸(专利文献3和4)。在这种情况下，对于增殖细菌细胞，仅添加少量的有机氮，所以这种方法是经济的，因为细菌细胞可以在简单的培养基中充分地生长，但是对于目的有机酸的产生量、其浓度、每个细菌细胞(bacterialcell)的其生产率、以及生产方法的简化等等而言仍需要被改进。此外，已经报道了利用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性增强的细菌发酵生产有机酸(例如，专利文献5)，但是需要进一步的开发有机酸的发酵生产。

已经报道了，在棒状杆菌型细菌中检测到2-氧代戊二酸脱氢酶(也称为α-酮戊二酸脱氢酶)活性(非专利文献2)，克隆了2-氧代戊二酸脱氢酶的基因(非专利文献3)。此外，公开了利用2-氧代戊二酸脱氢酶活性降低了的微生物生产氨基酸的方法(专利文献6)。

然而，迄今为止还没有报道利用其中2-氧代戊二酸脱氢酶活性增强了的细菌生产有机酸。

专利文献1：美国专利NO.5,143,834

专利文献2：美国专利NO.5,504,004

专利文献3：JP-A-11-113588

专利文献4：JP-A-11-196888

专利文献5：JP-A-11-196887

专利文献6：WO95/34672

非专利文献1：International Journal of Systematic Bacteriology(1999)，49，207-216

非专利文献2：Shiio I，Ujigawa-Takeda K.1980.Presence and regulation ofα-ketoglutarate dehydrogenase complex in a glutamate-producing bacterium，Brevibacterium flavum.Agric.Biol.Chem.44：1897-1904.

非专利文献3：UsudaY，Tujimoto N，Abe C，AsakuraY，Kimura E，Kawahara Y，O，Matsui H.1996.Molecular cloning of the Corynebacteriumglutamicum(′Brevibacterium lactofermentum′AJ12036)odhA gene encoding anovel type of 2-oxoglutaratedehydrogenase.Microbiology.142：3347-54.

发明内容

本发明的目的是提供以更高的生产效率产生有机酸例如琥珀酸的方法。

本发明的发明人进行了锐意研究来解决上述目的。结果，发明人发现，通过被修饰从而2-氧代戊二酸脱氢酶活性增强的细菌或其处理的细胞作用于反应溶液中的有机原材料，所述反应溶液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体，使所述有机原材料的消耗速率、有机酸例如琥珀酸的产生速率、或有机酸的产率提高，从而实现了本发明。

也就是说，本发明提供了以下的。

(1)具有有机酸产生能力的细菌，其中所述细菌被修饰，从而与2-氧代戊二酸脱氢酶未修饰的菌株相比，增强了2-氧代戊二酸脱氢酶活性。

(2)具有有机酸产生能力的细菌，其中所述细菌被修饰，从而减少乙酸产生，并且与2-氧代戊二酸脱氢酶未修饰的菌株相比，增强了2-氧代戊二酸脱氢酶活性。

(3)根据(2)的细菌，其中通过降低乙酸激酶活性和磷酸转乙酰酶活性中的一种或两种来减少所述乙酸的产生。

(4)根据(2)的细菌，其中通过降低乙酰CoA水解酶活性来减少乙酸产生。

(5)根据(2)的细菌，其中通过降低丙酮酸氧化酶活性来减少乙酸产生。

(6)根据(1)到(5)的任一项的细菌，其中所述细菌被进一步修饰从而使乳酸脱氢酶活性降低。

(7)根据(1)到(6)的任一项的细菌，其中所述细菌被进一步修饰从而使丙酮酸羧化酶活性增强。

(8)根据(1)到(7)的任一项的细菌，其中所述细菌选自棒状杆菌型细菌、芽孢杆菌属细菌、根瘤菌属细菌、埃希氏菌属细菌、乳杆菌属细菌和琥珀酸杆菌属细菌。

(9)根据(1)到(8)的任一项的细菌，其中所述有机酸是琥珀酸。

(10)一种制备有机酸的方法，包括：

使根据(1)到(9)的任一项的细菌或其处理的细胞作用于反应溶液中的有机原材料从而产生有机酸，所述反应溶液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体；和

收集所述有机酸。

(11)根据(10)的方法，其中使所述细菌或其处理的细胞在厌氧气氛中作用于有机原材料。

(12)根据(10)或(11)的方法，其中所述有机原材料是葡萄糖或蔗糖。

(13)根据(10)到(12)的任一项的方法，其中所述有机酸是琥珀酸。

(14)一种制备含有有机酸的聚合物的方法，包括：

通过根据(10)到(13)的任一项的方法制备有机酸；和

使所获得的有机酸作为原材料进行聚合反应。

附图的简要说明

附图1是说明构建质粒pC3.14的操作的图表。

附图2是说明构建质粒pODH3.2的操作的图表。

实施发明的最佳方式

以下，将详细描述本发明的实施方式。

本发明的细菌是具有有机酸产生能力的细菌，其被修饰，从而与未修饰的菌株相比，2-氧代戊二酸脱氢酶(在下文中，也称为ODH)活性被增强。

在本发明中，术语“有机酸产生能力”是指当本发明的细菌被培养在培养基中时在培养基中蓄积有机酸的能力。“有机酸”的实例包括充当TCA循环中的代谢中间物的有机酸，其具体实例包括琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、异柠檬酸和顺乌头酸。在这些中，琥珀酸、苹果酸和延胡索酸是优选的，琥珀酸是更优选的。

所述细菌可以是通过修饰本身具有有机酸产生能力的细菌或经育种赋予了有机酸产生能力的细菌来增加ODH活性而得的细菌，或者可以是通过修饰来增强ODH活性变得具有有机酸产生能力的细菌。作为通过育种赋予有机酸产生能力的方法，可以例举突变处理或基因重组处理。其具体实例包括如下所述的降低乳酸脱氢酶活性的修饰，和增强丙酮酸羧化酶活性的修饰。

在本发明中使用的细菌可以是具有产生两种或更多类型的有机酸的能力的细菌。

可以在本发明的方法中使用的细菌不受限制，只要它具有有机酸产生能力。棒状杆菌型的细菌(coryneform bacterium)、属于芽孢杆菌属(genus Bacillus)的细菌、属于埃希氏菌属(genus Escherichia)的细菌、属于乳杆菌属(genusLactobacillus)的细菌、属于琥珀酸杆菌属(genus Saccinobacillus)的细菌和属于根瘤菌属(genus Rhizobium)的细菌是优选的。在这些中，棒状杆菌型细菌是更优选的。

作为属于埃希氏菌属的细菌，可以例举大肠杆菌(Escherichia coli)。作为属于乳杆菌属的细菌，可以例举瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(J ApplMicrobiol，2001，91，p846-852)。属于杆菌属的细菌的实例包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)。作为属于根瘤菌属的细菌，可以例举埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)。

棒状杆菌型细菌没有特别的限制，只要它被分类到棒状杆菌型细菌中。其实例包括棒杆菌属细菌、属于短杆菌属细菌、和属于节杆菌属的细菌。在这些中，属于棒杆菌属的细菌或属于短杆菌属的细菌是优选的。更优选的实例包括被分类到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中的细菌。

在本发明中使用的细菌的亲株(parent strain)的特别优选的实例包括黄色短杆菌MJ-233(FERM BP-1497)、黄色短杆菌MJ-233 AB-41(FERMBP-1498)、产氨棒杆菌ATCC6872、谷氨酸棒杆菌ATCC31831和乳发酵短杆菌ATCC 13869。由于黄色短杆菌有时被分类到谷氨酸棒杆菌中(Lielbl，W.，Ehrmann，M.，Ludwig，W.and Schleifer，K.H.，Intemational Journal ofSystematic Bacteriology，1991，vol.41，p255-260)，在本发明中，黄色短杆菌MJ-233菌株和它的突变体MJ-233 AB-41菌株分别相同于谷氨酸棒杆菌MJ-233菌株和谷氨酸棒杆菌MJ-233 AB-41菌株。

黄色短杆菌MJ-233已经于1975年4月28日以登记号FERM P-3068保藏在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(现独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566Japan)，之后根据布达佩斯条约的规定在1981年5月1日转为国际保藏物，登记号为FERM BP-1497。

用作亲株的上述细菌可以是任何菌株，不仅包括野生型菌株，还包括通过普通的突变处理，例如UV照射和NTG处理获得的突变体，以及通过遗传方法例如细胞融合和遗传重组方法获得的重组菌株。

本发明的细菌可以通过修饰具有有机酸产生能力的上述细菌从而增强ODH活性来获得。赋予有机酸产生能力的修饰也可以在进行增强ODH活性的修饰之后进行。

在此，术语“ODH活性”是指催化下述反应的活性，在所述反应中2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸)被氧化脱羧基来产生琥珀酰-CoA。术语“ODH活性被增强”是指与ODH未修饰的菌株相比，ODH活性被增强。与ODH未修饰菌株比较，每单位细菌细胞重量ODH活性优选增强不低于1.5倍，更优选的不低于2倍。ODH活性可以根据Shiio等人(Isamu Shiio and KyokoUjigawa-Takeda，Agric.Biol.Chem.，44(8)，1897-1904，1980)的方法来测定。

使用ODH基因来增强ODH活性的修饰可以通过，例如，使用质粒等等来转化、通过同源重组将ODH基因整合到染色体中等等、或ODH基因的表达控制序列的修饰等来进行。

可以用于通过使用质粒等等的转化、同源重组等等将ODH基因导入宿主细菌中的ODH基因没有限制，只要它是当被导入所述宿主细菌中时提高ODH活性的基因，也就是说，编码具有ODH活性的蛋白质的基因。可以例举来自棒状杆菌型细菌并具有SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列的ODH基因(odhA)。所述ODH基因可以是同源基因，例如，在严格条件下与具有上述核苷酸序列的DNA杂交的DNA，或具有与上述核苷酸序列不低于90％的同源性、优选的不低于95％的同源性、更优选的不低于99％的同源性的DNA，只要它编码具有ODH活性的蛋白质。

在此，严格条件包括通常的southern杂交的洗涤条件，优选的包括在60℃下、在相当于1×SSC的盐浓度和0.1％ SDS，优选0.1×SSC和0.1％ SDS下进行的杂交的条件。

此外，还可以使用来自棒状杆菌型细菌以外的细菌、其他微生物、动物或植物的ODH基因。对于来自微生物、动物或植物的ODH基因，可以使用以下的基因：其核苷酸序列已经被确定的基因；在根据同源性等从微生物、动物或植物的染色体分离编码具有ODH活性的蛋白质的基因之后，其核苷酸序列被确定的基因。进一步的，在确定基因的核苷酸序列之后，还可以使用根据所述核苷酸序列合成的基因。这些基因可以通过杂交方法或PCR方法扩增包含启动子和ORF的区域来获得。

通过将包含上述ODH基因的DNA片段插入适合的质粒例如下述质粒载体中，所述质粒载体至少含有控制质粒在棒状杆菌型细菌中的复制功能的基因，可以获得能够在棒状杆菌型细菌中高表达ODH的重组质粒。在上述重组质粒中，用于表达ODH基因的启动子可以是来自ODH基因自身的启动子，但是所述启动子可以被替换为可以在宿主细菌中起作用的其它强启动子。可以例举来自大肠杆菌(E.coli)的启动子，例如tac启动子或trc启动子。

当ODH基因被导入棒状杆菌型细菌中时，可以使用的质粒载体没有限制，只要它至少含有控制所述棒状杆菌型细菌中的复制功能的基因。质粒载体的具体实例包括：在JP-A-3-210184中描述的质粒pCRY30；在JP-A-2-72876和美国专利NO.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；在JP-A-1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；在JP-A-58-67679中描述的pAM330；在JP-A-58-77895中描述的pHM1519；在JP-A-58-192900中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；在JP-A-57-134500中描述的pCG1；在JP-A-58-35197中描述的pCG2；在JP-A-57-183799中描述的pCG4和pCG1l；以及在WO95/34672中描述的pPK4。在这些中，对于在棒状杆菌型细菌的宿主-载体系统中使用的质粒载体，具有控制质粒在棒状杆菌型细菌中的复制功能的基因、以及控制质粒在棒状杆菌型细菌中的稳定功能的基因的质粒载体是优选的。例如，可以优选地使用质粒pCRY30、pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX。

通过用重组载体转化棒状杆菌型细菌，例如黄色短杆菌MJ-233菌株(FERM BP-1497)，获得了其中ODH基因的表达被增强的棒状杆菌型细菌，所述重组载体通过将ODH基因插入到质粒载体的合适位点中获得。转化可以通过已知的方法，例如电脉冲方法(Res.Microbiol.，Vol.144，p.181-185，1993)来进行。

可以通过已知的同源重组方法将多拷贝的ODH基因掺入(incorporating)染色体中而高表达ODH基因来增强ODH活性。

以上已经描述了利用棒状杆菌型的实例，但是在使用其他细菌时ODH活性也可以通过类似的途径来增强。

此外，ODH活性也可以通过置换宿主的染色体上的启动子来增强。启动子区域的序列信息可以从，例如，GenBank数据库登记号NO.AP005276获得。要替换的启动子的种类没有特别的限制，只要它能够在宿主细菌中起作用。在厌氧状态下转录活性不被抑制的启动子是优选的。其实例包括在大肠杆菌中使用的tac启动子和trc启动子。

对于启动子置换的方法，可以例举以下描述的实施例中显示的使用sacB基因的方法(Schafer，A.et al.Gene145(1994)69-73)。

在本发明中，增强ODH活性的修饰可以在有机酸产生细菌中进行，所述细菌已经被修饰从而乙酸产生减少。在被修饰从而乙酸产生减少的有机酸产生细菌中，2-氧代戊二酸有时作为副产物形成。由于ODH催化2-氧代戊二酸氧化性脱羧基产生琥珀酰-CoA的反应，ODH活性的增强引起了作为副产物的2-氧代戊二酸量的降低，以及目标有机酸产生量的增加。

修饰使得乙酸产生减少的实例包括降低乙酸激酶(在下文中也称为ACK)、磷酸转乙酰酶(在下文中也称为PTA)、乙酰CoA水解酶(在下文中也称为ACH)和丙酮酸氧化酶(在下文中也称为POXB)的活性的修饰。

由于乙酸作为草酰乙酸和草酰乙酸衍生物的生物合成途径中的中间产物从乙酰-CoA产生，优选降低上述任一种酶的的活性或所有酶活性，从而通过阻断乙酸生物合成途径来减少作为副产物的乙酸的量。

术语“PTA活性”是指催化下述反应的活性，所述反应通过将磷酸转移到乙酰-CoA来产生乙酰磷酸。用语“被修饰使得PTA活性降低”是指PTA活性低于未修饰的菌株例如野生型菌株的比活性(specific activity)。与未修饰的菌株相比，每个细菌细胞PTA活性优选降低到30％或更低，更优选10％或更低。PTA活性可以被完全地消除。PTA活性的降低可以通过Klotzsch等人(Klotzsch，H.R.，Meth Enzymol.12，381-386(1969)的方法(Klotzsch，H.R.，Meth Enzymol.12，381-386(1969)的方法测定PTA活性来确认。

术语“ACK”活性是指催化乙酰磷酸和ADP产生乙酸的反应的活性。用语“被修饰使得ACK活性降低”是指ACK活性低于未修饰的菌株例如野生型菌株的比活性。与未修饰的菌株相比，每个细菌细胞ACK活性优选降低到30％或更低，更优选的10％或更低。ACK活性可以被完全地消除。ACK活性的降低可以通过Ramponi等人(Ramponi G.，Meth.Enzymol.42，409-426(1975))的方法测定ACK活性来确认。

在谷氨酸棒杆菌(包括分类为黄色短杆菌的细菌)中，这两种酶都由pta-ack操纵子编码，如Microbiology.1999 Feb；145(Pt2)：503-13中所描述的，因而两种酶PTA和ACK的活性可以通过破坏pta基因来降低。

pta基因的破坏可以根据本领域已知的方法来进行，例如利用同源重组的方法，或利用sacB基因的方法(Schafer，A.等人Gene145(1994)69-73)。对于pta基因，可以例举包含SEQ ID NO：7中所示核苷酸编号1～1383的核苷酸序列的DNA。进一步的，由于被用于破坏pta基因的基因可能具有这样的程度的同源性，其足以引起与作为破坏靶标的棒状杆菌型细菌染色体DNA上的pta基因的同源重组，还可以使用与所述序列同源的基因。在此，足够引起同源重组的这种程度的同源性是指优选不低于70％、更优选不低于80％、更优选不低于90％，以及特别优选不低于95％的同源性。此外，可以在严格条件下与上述基因杂交的DNA互相间引起同源重组。

当仅降低ACK活性时，可以使用ack基因进行修饰。ack基因的实例包括具有SEQ ID NO：7所示核苷酸编号1386到2579的核苷酸序列的基因。此外，还可以使用与所述序列具有这样程度的同源性的基因，所述同源性足以引起与染色体上的ack基因的同源重组。在此，足够引起同源重组的这种程度的同源性是指优选不低于70％、更优选不低于80％、更优选不低于90％，以及特别优选不低于95％的同源性。此外，可以在严格条件下能与上述基因杂交的DNA互相间引起同源重组。

本发明中使用的细菌可以是通过除了增强ODH活性的修饰之外的上述修饰的两种或多种的组合来获得的细菌。当进行多种修饰时，每种修饰的顺序没有特别的限制。

术语“ACH活性”是指催化乙酰CoA和水产生乙酸的反应的活性。用语“被修饰使得ACH活性降低”是指ACH活性低于未修饰的菌株例如野生型菌株的比活性。与未修饰的菌株相比，每个细菌细胞ACH活性降低到50％或更低，优选30％或更低，更优选10％或更低。术语“降低”还包括活性的完全消除。ACH活性的降低可以通过Gergely，J.，等人(Gergely，J.，Hele，P.&Ramkrishnan，C.V.(1952)J.Biol.Chem.198 p 323-334)的方法测定ACH活性来确认。编码棒状杆菌型细菌的ACH的基因的实例包括登录在GenBank中的谷氨酸棒杆菌的序列(GenBank Accession NO.NC_003450中的NCgl2480(与NC_003450中编号2729376到2730884的核苷酸互补的链))(WO 2005/113744)。谷氨酸棒杆菌的ach基因的序列还在SEQ ID NO：14的1037到2545中显示。此外，还可以使用与所述序列具有这样程度的同源性的基因，所述同源性足以引起与染色体中ach基因的同源重组。在此，足够引起同源重组的这种程度的同源性是指优选不低于70％、更优选不低于80％、更优选不低于90％，以及特别优选不低于95％的同源性。此外，可以在严格条件下能与上述基因杂交的DNA互相间引起同源重组。

术语“POXB活性”是指催化从丙酮酸和水产生乙酸的反应的活性。用语“修饰使得POXB活性降低”是指POXB活性低于未修饰的菌株例如野生型菌株的比活性。与未修饰的菌株相比，POXB活性降低到每个细菌细胞优选50％或更低，更优选30％或更低，特别优选10％或更低。术语“降低”还包括活性的完全消除。POXB活性的降低可以通过Chang等人(Chang Y.and Cronan J.E.JR，J.Bacteriol.151，1279-1289(1982))的方法测定POXB活性来确定。编码棒状杆菌型细菌的poxB基因的实例包括保藏在Genbank中的序列(与GenBank Accession NO.NC_003450中的核苷酸编号2776766到2778505互补的链)(WO 2005/113745)。谷氨酸棒杆菌的poxB基因的序列还在SEQ ID NO：16的996到2735中显示。此外，还可以使用与所述序列具有这样程度的同源性的基因，所述同源性足以引起与染色体上poxB基因的同源重组。在此，足够引起同源重组的这种程度的同源性是指优选不低于70％、更优选不低于80％、更优选不低于90％，以及特别优选不低于95％的同源性。此外，可以在严格条件下能与上述基因杂交的DNA互相间引起同源重组。

ach基因和poxB基因的破坏可以，按照与如上所述pta基因的破坏相似的途径，通过已知的方法进行。

本发明的细菌可以是被修饰的细菌，使得除了ODH活性的增强之外乳酸脱氢酶(在下文中也称为LDH)活性降低。当所述有机酸是琥珀酸时这种细菌是特别有效的。例如，制备LDH基因破坏的细菌，然后用ODH基因修饰该细菌，可以获得这种细菌。要注意的是，降低LDH活性的修饰和增强ODH活性的修饰的任一个都可以首先进行。

用语“LDH活性降低”是指与LDH基因未修饰菌株相比，LDH活性是更低的。与未修饰的菌株的相比，每细菌细胞LDH活性优选降低到10％或更低。进一步的，LDH活性可以被完全地消除。LDH活性的降低可以通过已知的方法(L.Kanarek and R.L Hill，J.Biol.Chem.239，4202(1964))测定LDH活性来确认。对于获得LDH活性降低的棒状杆菌型细菌的菌株的具体方法，可以例举JP-A-11-206385中描述的染色体上同源重组的方法，使用sacB基因的方法(Schafer，A.等人Gene145(1994)69-73)，等等。

此外，本发明中使用的细菌可以是被修饰的细菌，使得除了ODH活性增强之外丙酮酸羧化酶(在下文中也称为PC)活性增强。用语“PC活性增强”是指与未修饰的菌株例如野生型菌株和亲本菌株的相比，PC活性提高优选的100％或更多，更优选300％或更多。例如，通过测定NADH的降低的方法(WO 2005/021770)，可以测量PC活性。例如，通过将PC基因导入ODH基因的表达增强的棒状杆菌型细菌中，可以获得这种细菌。要注意的是，PC基因的导入和增强ODH活性的修饰的任一个可以首先进行。

PC基因的导入可以通过以JP-A-11-196888中所描述的相类似的方式在棒状杆菌型细菌中将丙酮酸羧化酶(PC)基因高表达来进行。对于PC基因，例如，可以使用来自谷氨酸棒杆菌(Peters-Wendisch，P.G.等人Microbiology，vol.144(1998)p915-927(SEQ ID NO：5))的PC基因。在SEQ ID NO：5的核苷酸序列中，一部分核苷酸可以用其他核苷酸替换，或可以缺失，新的核苷酸可以被插入，或者核苷酸的部分可以被转位，只要基本上不损害PC活性。这些衍生物的任一种可以在本发明中使用。进一步的，还可以适当地使用以下的DNA：在严格条件下与包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA杂交的DNA；具有与SEQ ID NO：5的核苷酸序列不低于90％、优选的不低于95％、更优选的不低于99％的同源性并编码具有PC活性的蛋白质的DNA。

此外，还可以使用来自谷氨酸棒杆菌以外的细菌、其他细菌、动物或植物的PC基因。特别地，来自以下细菌、动物和植物的PC基因的序列是已知的(参考文献在下文显示)，或者PC基因可以通过以如上所述类似的方式杂交、或通过PCR方法扩增ORF来获得。

人(Human)[Biochem.Biophys.Res.Comm.，202，1009-1014，(1994)]

小鼠(Mouse)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，90，1766-1779，(1993)]

大鼠(Rat)[GENE，165，331-332，(1995)]

酵母(Yeast；)

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[Mol.Gen.Genet.，229，307-315，(1991)]

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[DDBJ Accession No.；D78170]

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)[GENE，191，47-50，(1997)]

Rhizobium etli[J.Bacteriol.，178，5960-5970，(1996)]

PC活性的增强可以按照与如上所述ODH活性的增强类似的方式来进行。

2.有机酸的制备方法

制备本发明的有机酸的方法包括使上述的细菌或其处理的细胞作用于反应溶液中的有机原材料来产生有机酸，并收集所述有机酸，所述反应溶液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体。要生产的有机酸包括上述的有机酸。在这些中，琥珀酸、延胡索酸、苹果酸或丙酮酸是优选的，琥珀酸是更优选的。

当上述细菌被用于有机酸的生产时，在固体培养基例如琼脂培养基上进行斜面培养的那些可以直接地用于反应，但是可以优选使用预先在液体培养基中培养上述细菌而制备的细菌细胞(即，种子培养物(seed culture))。用于种子培养的培养基可以是任何通常用于细菌培养的那些。例如，可以使用普通的培养基，其是通过将天然的营养物来源例如肉提取物、酵母提取物和蛋白胨添加到无机盐例如硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁形成的组合物中来制备的。在通过离心、膜分离等等收获之后，种子培养后的细菌细胞优选地被用于生产有机酸的反应。通过使种子培养获得的细菌在含有机原材料的培养基中扩增，同时，与含有机原材料的培养基中的有机原材料反应可以产生有机酸。或者，通过使预先扩增获得的细菌细胞与含有机原材料的反应溶液中的有机原材料反应，可以生产有机酸。

在本发明中，还可以使用处理的细菌细胞。处理的细菌细胞的实例包括用丙烯酰胺、角叉菜胶等等固定的细菌细胞，破碎的细菌细胞的碎片，其离心的上清液，或通过用硫酸铵处理等等部分纯化所述上清液获得的级分。

用于本发明的生产方法的有机原材料没有特别的限制，只要它是可以被在此描述的细菌同化来产生有机酸例如琥珀酸的碳源。一般地，使用可发酵的碳水化合物，包括：碳水化合物，例如半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖(sucrose)、蔗糖(saccharose)、淀粉或纤维素；或多元醇，例如甘油、甘露醇、木糖醇或核糖醇。在这些中，葡萄糖或蔗糖是优选的，葡萄糖是特别优选的。

此外，还可以使用含有任何一种上述的可发酵碳水化合物的淀粉糖化液体、糖蜜等等。这些可发酵碳水化合物的任何一种可以单独地使用，或可以组合地使用。上述有机原材料使用的浓度没有特别的限制，但是有益的是在不抑制有机酸例如琥珀酸是产生的范围内尽可能地提高浓度。反应一般在5到30％(W/V)，优选10到20％(W/V)的范围中进行。当在反应的过程中有机原材料降低时，可以再添加上述有机原材料。

含有有机原材料的反应溶液没有特别的限制。要使用的反应溶液可以是用于培养细菌的培养基或缓冲液例如磷酸盐缓冲液。反应溶液优选的是含有氮源、无机盐等等的水溶液。在此，氮源没有特别的限制，只要它可以被在此描述的细菌同化来产生有机酸例如琥珀酸。其具体实例包括各种有机的和无机的氮化合物，例如铵盐、硝酸盐、尿素、大豆水解产物、酪蛋白分解产物、蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物和玉米浆。无机盐的实例包括各种类型的磷酸盐、硫酸盐和镁、钾、锰、铁、锌等等的金属盐。此外，如果必要，可以添加促进生长的任何因子，包括：维生素，例如生物素、泛酸、肌醇和烟酸；核苷酸；和氨基酸。进一步的，希望添加适合量的商业上可获得的消泡沫剂到培养溶液中来抑制反应时的起泡。

除了上述的有机原材料、氮源、无机盐等等之外，反应溶液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体。碳酸根离子或碳酸氢根离子可以从还可以用作中和试剂的碳酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾提供。然而，如果需要，碳酸根离子或碳酸氢根离子也可以从碳酸或重碳酸、或其盐、或二氧化碳气体提供。碳酸或重碳酸的盐的具体实例包括碳酸镁、碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢铵、碳酸氢钠和碳酸氢钾。以1到500mM、优选2到300mM、更优选3到200mM的浓度添加碳酸根离子或碳酸氢根离子。当含有二氧化碳气体时，要含有的二氧化碳气体的量是每升溶液50mg到25g，优选100mg到15g，更优选150mg到10g。

反应溶液的pH值可以通过添加碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等等来调节。反应的pH值通常是5到10，优选6到9.5，因而如果需要，甚至在反应期间使用碱性材料、碳酸盐、尿素等等将反应溶液的pH值调节到上述范围内。

本反应中使用的细菌的生长最佳温度一般在25℃到35℃的范围内。反应时的温度一般在25℃到40℃的范围内，优选的在30℃到37℃的范围内。在反应中使用的细菌细胞的数量没有特别的限制，但是该数量被调整到1到700g/L、优选10到500g/L、更优选20到400g/L的范围内。反应的时间优选的是1到168小时，更优选的3到72小时。

当进行细菌的种子培养时，需要通过通气和搅拌来供应氧气。另一方面，产生有机酸例如琥珀酸的反应可以伴随通气和搅拌来进行，或者可以在既不通气也不提供氧气的厌氧条件下进行。在此，术语“厌氧条件”是指当溶液中的溶解的氧浓度保持很低时进行反应。在这种情况下，希望的是在0到2

ppm、优选的0到1ppm、更优选的0到0.5ppm的溶解氧浓度下进行反应。为此，可以使用的方法包括：使用密封的器皿不通气地进行反应；在提供惰性气体例如氮气时进行反应；和使用含有二氧化碳气体的惰性气体进行通气。

上述的细菌反应引起有机酸例如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸或丙酮酸在反应溶液中的产生和蓄积。在反应溶液(培养溶液)中蓄积的有机酸可以根据常规方法从反应溶液中收集。特别地，通过经离心、过滤等等除去固体物质例如细菌细胞，用离子交换树脂等等对剩余物脱盐，随后通过柱层析从溶液中结晶或纯化，可以收集有机酸。

进一步的，在本发明中，在通过如上所述的本发明的方法产生有机酸之后，可以使用获得的有机酸作为原材料进行聚合反应来产生含有有机酸的聚合物。

近年来，虽然环境友好的工业产品的数量正在提高，使用植物来源的原材料制备的聚合物已经引起了注意。在本发明中要生产的琥珀酸可以被加工成聚合物，例如聚酯和聚酰胺，然后使用。含琥珀酸的聚合物的具体实例包括，通过在二醇例如丁二醇或乙二醇与琥珀酸之间的聚合化获得的琥珀酸聚酯，以及通过在二胺例如己二胺与琥珀酸之间的聚合化获得的琥珀酸聚酰胺。

此外，通过本发明的生产方法获得的琥珀酸或含有琥珀酸的组合物可以用于食品添加剂、药物、化妆品，等等。

实施例1

<ODH质粒扩增的菌株的制备>

(A)从MJ233菌株提取基因组DNA

在10mL的A培养基[2g尿素、7g(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、6mg的FeSO₄·7H₂O、6mg的MnSO₄·4-5H₂O、200μg生物素、100μg硫胺素、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸、和20g葡萄糖溶于1L蒸馏水中]中，培养黄色短杆菌MJ-233菌株直到对数期的晚期，通过离心收集细菌细胞(10,000g，5分钟)。获得的细菌细胞悬浮在0.15mL含有10mg/mL的溶菌酶、10mM NaCl、20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和1mM EDTA·2Na的溶液中。然后，向其中添加蛋白酶K，从而到100μg/ml的终浓度，生成物在37℃保持1小时。进一步添加十二烷基硫酸钠以达到0.5％的终浓度，生成物在50℃保持6小时以裂解细菌。向裂解物中添加等量的苯酚和氯仿的溶液，在室温下慢慢地摇动混合物10分钟。随后，全部的进行离心(在10到12℃，5000×g20分钟)，收集上清液级分。向其中添加醋酸钠以达到0.3M，添加2倍量的乙醇并混合。混合物进行离心(15000×g，2分钟)来收集沉淀物。收集的沉淀物用70％乙醇洗涤，然后风干。向获得的DNA，添加5mL含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)，在4℃静止过夜。获得的DNA用作模板DNA用于以后进行的PCR。

(B)克隆ODH基因和构建用于增强的质粒

包含启动子区域的来自黄色短杆菌MJ-233菌株的2-氧代戊二酸脱氢酶复合物E1组件的基因(odhA)，通过使用以上(A)制备的DNA作为模板，以及合成的DNA(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)进行PCR来获得，所述合成的DNA根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的该基因的序列(与Gen Bank数据库登记号NO.BA000036的1172498到1176271互补的链)来设计，谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的全基因组序列已经被报道了。反应溶液由1μl的模板DNA、0.5μl的PfxDNA聚合酶(Invitrogen Corporation制造)、1倍浓度的附带缓冲液(attached buffer)、0.4μM的各引物、1mM MgSO₄和0.2μMdNTP组成，总体积调节到50μl。反应温度和反应条件如下：使用DNA热循环仪PTC-200(MJ Research Inc.制造)；94℃ 10秒、68℃ 5分钟的循环重复35次，条件是反应溶液在第一个循环中在94℃保温2分钟，并在最后的循环中在68℃保温10分钟。在PCR反应完成之后，添加0.1μl的Takara ExTaq(TAKARABIO INC)，混合物进一步在72℃保温30分钟。扩增的产物如下确认：通过进行0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖；由FMC Bioproducts Inc生产)凝胶电泳分离扩增的产物；然后通过进行溴化乙锭染料染色来显现；从而检测到约4.4kb的片段。通过使用QIAQuick Gel提取试剂盒(QIAGENGmbH制造)从凝胶收集目标DNA片段。收集的DNA片段与PCR产物克隆载体pT7BlueT-载体(由Novagen Inc.生产)混合，二者通过使用Ligation Kitver.2(TAKARA BIO INC.)相互连接。获得的质粒DNA被用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。这样获得的重组大肠杆菌涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。在培养基上形成白色菌落的克隆通过常规方法在液体培养基中培养，随后纯化质粒DNA。获得的质粒DNA使用限制性内切酶SseI和BamHI切割，从而检测到约4.4kb的插入的片段。获得的质粒DNA命名为pODH1.0。

(C)具有与pTZ4的兼容性的棒状杆菌型细菌的表达载体的构建

(i)导入链霉素/奇霉素抗性基因

通过用链霉素/奇霉素抗性基因替换具有与pTZ4相容的复制区域的质粒载体pC3(Plasmid 36 62(1996))的卡那霉素抗性基因，来构建能够与pTZ4共存的棒状杆菌型细菌的载体。要注意的是，pTZ4是用于导入如下所述MJ233/PC/ΔLDH菌株中的PC扩增用的质粒的原始质粒。

链霉素/奇霉素抗性基因(大肠杆菌Tn7)通过PCR获得，其中携带该基因的用于植物转化的二元载体pLAN421(Plant Cell Reports 10，286(1991))用作模板。

反应溶液由10ng的模板DNA、0.2μL的PfxDNA聚合酶(invitrogenCorporation制造)、1倍浓度的附带缓冲液、0.3μM的各引物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11显示的合成的DNA)、1mM MgSO₄和0.25μM dNTP组成，总体积调节到20μL。

反应温度和反应条件如下:使用DNA热循环仪PTC-200(MJ Research Inc.制造)；94℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 60秒的循环重复20次，条件是反应溶液在第一个循环中在94℃保温1分钟20秒，在最后的循环中在72℃保温2分钟。

扩增的产物如下确认：通过进行0.8％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖；由FMC Bioproducts Inc生产)凝胶电泳分离扩增的产物；然后通过进行溴化乙锭染料染色来显现产物；检测到937bp的片段。通过使用QIAQuick Gel提取试剂盒(QIAGEN GmbH制造)从凝胶收集目标DNA片段。收集的DNA片段用T4多核苷酸激酶(TAKARA BIO INC.)在5′末端进行磷酸化。

在用限制性内切酶HindIII和NruI切割pC3之后，其两个末端用克列诺片段(Klenow Fragment)(TAKARA BIO INC.)平滑化。所述DNA片段与如上所述制备的链霉素/奇霉素抗性基因混合，通过使用连接试剂盒ver.2(Ligation Kit ver.2)(TAKARA BIO INC.)将所述片段和基因相互连接。获得的质粒DNA被用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)，50μg/mL奇霉素涂布到LB琼脂培养基上。获得的菌落在液体培养基中培养，通过常规方法制备质粒DNA。将SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的合成的DNA用作引物的上述PCR的分析结果，确认了链霉素/奇霉素抗性基因的插入。获得的质粒DNA命名为pC3。

然后，通过用限制性内切酶BamHI和PvuII切割pC3制备DNA片段，DNA片段的两个末端用克列诺片段平滑化。DNA片段与pBglII接头(TAKARA BIO INC.：CAGATCTG)混合，通过连接试剂盒ver.2(TAKARABIO INC.)进行连接。获得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)，转化的大肠杆菌涂布到含有50μg/mL奇霉素的LB琼脂培养基上。获得的菌落在液体培养基中培养，通过常规方法制备质粒DNA。选择能用限制性内切酶BglII切割的质粒DNA，命名为pC3.1。

(ii)多克隆位点的引入

包含LacZ多克隆位点的α-肽基因通过使用大肠杆菌质粒pT7Blue(Novagen Inc.)作为模板和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中所示的合成的DNA作为引物来制备。

反应溶液由10ng的模板DNA、0.2μL的PfxDNA聚合酶(InvitrogenCorporation制造)、1倍浓度的附带缓冲液、0.3μM的各引物、1mM MgSO₄和0.25μM dNTP组成，总体积调节到20μL。

反应温度和反应条件如下：使用DNA热循环仪PTC-200(MJ Research Inc.制造)；94℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 30秒的循环重复20次，条件是反应溶液在第一个循环中在94℃保温1分钟20秒，在最后的循环中在72℃保温2分钟。

扩增的产物如下确认：通过进行1.0％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖：FMCBioproducts Inc.制造)凝胶电泳来分离扩增的产物；产物通过进行溴化乙锭染料染色来显现；检测到5，777bp的片段。通过使用QIAQuick Gel提取试剂盒(QIAGEN GmbH制造)从凝胶收集目标DNA片段。收集的DNA片段用T4多核苷酸激酶(TAKARA BIO INC.)在5′末端进行磷酸化。

在用限制性内切酶PstI和HpaI切割pC3.1之后，DNA片段的两个末端使用克列诺片段(TAKARA BIO INC.)来平滑化。DNA片段与如上所述制备的α-肽基因片段混合，随后通过使用连接试剂盒ver.2(Ligation Kitver.2)(TAKARABIO INC.)来连接。获得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)，转化的大肠杆菌涂布到含有50μg/mL X-Gal和50μg/mL奇霉素的LB琼脂培养基上。从获得的菌落中选择蓝色菌落。获得的菌落在液体培养基中培养，然后通过常规方法制备质粒DNA。确认该质粒DNA具有由EcoRV切割的切割位点，所述位点来源于插入的LacZ多克隆位点。获得的质粒DNA命名为pC3.14(附图1中所示的构建步骤)。

然后，将通过用限制性内切酶SseI和BamHI切割上述pODH1.0而获得的约4.4kb的DNA片段通过0.75％琼脂糖凝胶电泳来分离，并收集。获得的片段与通过用限制性内切酶PstI和BamHI切割质粒pC3.14获得的DNA片段混合，随后使用连接试剂盒ver.2(Ligation Kit ver.2)(TAKARA BIO INC.)连接。获得的质粒DNA被用于转化大肠杆菌DH5α菌株。转化的大肠杆菌涂布到含有50μg/mL奇霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。在培养基上生长的白色菌落通过常规方法在液体培养基中培养，随后纯化质粒DNA。获得的质粒DNA用限制性内切酶SseI和BamHI切割，从而选择含有约4.4kb的插入片段的质粒，命名为pODH3.2(附图2)。

(D)ODH质粒扩增的菌株的制备

用于ODH增强的质粒DNA(pODH3.2)通过电脉冲方法(Res.Microbiol.，Vol.144，p.181-185，1993)导入黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株中(一种其中PC基因被扩增、LDH基因被破坏的菌株：JP-A-2005-95169：WO2005/21770)。获得的转化体涂布到含有10μg/mL链霉素和25μg/mL卡那霉素的LBG琼脂培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl、20g葡萄糖、和15g琼脂溶于1L蒸馏水中]上。在培养基上生长的每种菌株通过常规方法在液体培养基中培养。然后，提取质粒DNA，通过用限制性内切酶切割来分析。结果，确认了菌株携带pODH3.2，并命名为黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株。

(E)ODH酶活性的测定

在含有2％葡萄糖的100ml的A培养基中培养上述黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株过夜。将50ml获得的培养物在4℃在4,000rpm进行离心10分钟来收集细菌细胞。然后，所述细菌细胞用30ml的100mMTES-NaOH缓冲液(pH 7.5)洗涤两次。洗涤后的细菌细胞悬浮在10ml缓冲液A(100mM TES-NaOH缓冲液(pH 7.5)，30％甘油)中，将1ml细菌细胞悬浮液转移到用于裂解的15ml Falcon中，向其中添加1mg的玻璃珠。细菌细胞悬浮液在4℃冷却的条件下用Bioruptor(Cosmo Bio Co.，Ltd.制造)进行超声波裂解(高水平的超声处理1分钟随后2分钟中断的循环重复7次)。该细菌细胞裂解溶液在4℃在18,000×g进行离心5分钟来除去珠子，进一步进行18,000×g的离心25分钟。获得的上清液用作粗酶级分来测定ODH酶活性。利用BSA浓度作为标准使用Protein Assay(Bio-Rad Laboratories，Inc.，#_500-0006)测定蛋白质浓度。

ODH活性参考Agric.Boil.Chem.，44(8)，1897-1904，1980，I Shiio and KUjigawa-Takeda中描述的方法如下测定。首先，制备反应溶液，使得包含以下的终浓度：100mM TES(DOJINDO LABORATORIES，#_344-02653)-NaOH缓冲液(pH 7.7)、0.2mM辅酶A(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，#_306-50481)、0.3mM焦磷酸硫胺素(Sigma-Aldrich Corporation，#_C-8754)，5mM的2-氧代戊二酸(2-oxogulutarate)(Sigma-Aldrich Corporation，#_305-72-6)、3mM L-半胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，#_033-05272)、5mM MgCl₂、1mM 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(Wako PureChemical Industries，Ltd.，#_44047000)。在反应溶液转移到用于测定的比色杯之后，添加粗酶溶液来启动反应。在365nm测定吸光度(A₃₆₅)的升高。1U被定义为每分钟A₃₆₅提高1时的酶量。通过上述方法测定的黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株的ODH比活性是0.028U/mg蛋白质。另一方面，按照类似的方式通过培养作为亲株的黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株获得的细菌细胞显示了0.009U/mg蛋白质的ODH比活性。结果，确认了在ODH基因质粒扩增的菌株中ODH活性提高至约三倍。

实施例2

<ODH质粒扩增的菌株的评估>

(A)用碳酸铵中和的厌氧发酵

将100mL的培养基添加到500mL锥形烧瓶中，所述培养基通过在1,000mL蒸馏水中溶解4g尿素、14g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁七水化物、20mg硫酸亚铁七水化物、20mg硫酸锰水合物、200μg D-生物素、200μg盐酸硫胺素、5g酵母提取物和5g酪蛋白氨基酸获得。然后其在120℃加热20分钟来灭菌，然后冷却到室温。向其中添加预先灭菌的4mL 50％葡萄糖水溶液、无菌过滤的50μL 5％卡那霉素水溶液、和无菌过滤的50μL 2％链霉素水溶液。然后，将在实施例1的(D)中制备的黄色短杆菌MJ233/ODH/PC/ΔLDH菌株接种到其中，在30℃种培养24小时。

将培养基添加到5L发酵器中，所述培养基通过在2,500mL蒸馏水中溶解42g硫酸铵、1.5g磷酸二氢钾、1.5g磷酸氢二钾、1.5g硫酸镁七水化物、60mg硫酸亚铁七水化物、60mg硫酸锰水合物、600μg D-生物素、600μg盐酸硫胺素、15g酵母提取物、15g酪蛋白氨基酸、和1mL消泡剂(AdekanolLG294：Asahi Denka Co.，Ltd.制造)获得，然后在120℃加热20分钟来灭菌，然后冷却到室温。向其中添加预先灭菌的500mL 12％葡萄糖水溶液、无菌过滤的1.5mL 5％卡那霉素水溶液、和无菌过滤的1.5mL 2％链霉素水溶液。添加100mL上述的种子培养物，在30℃保温，随后是使用2M碳酸铵维持pH 7.5，主培养(main culture)16小时，每分钟500mL的通气，500rpm的搅拌。

向500-mL锥形烧瓶中，添加在通过200mL蒸馏水中溶解0.2g硫酸镁七水化物、8mg硫酸亚铁七水化物、8mg硫酸锰水合物、80μg D-生物素、80μg盐酸硫胺素和1mL消泡剂(Adekanol LG294：Asahi Denka Co.，Ltd.制造的)获得的培养基，然后在120℃加热20分钟进行灭菌，然后冷却到室温。将培养基添加到通过在8,000rpm离心上述主培养物5分钟获得的细菌细胞中，将所述细菌细胞重悬浮，使得O.D.(660nm)变为60。200mL所述悬浮液和预先灭菌的200mL 20％葡萄糖溶液加载到1-L发酵釜中，相互混合，生成物在35℃保温。在不通气和400rpm搅拌的条件下，用2M碳酸铵维持pH为7.6，混合物进行反应。在反应开始后约47小时终止反应。

结果，与MJ233/PC/ΔLDH菌株相比，在黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株中，琥珀酸的收率提高3.4％，相对于琥珀酸产量，氨基酸产量降低47％。也就是说，发现的是，ODH的增强引起了明显的琥珀酸收率的提高和氨基酸收率降低的效果。

(B)用碳酸钠中和的厌氧发酵

将100mL的培养基添加到500-mL锥形烧瓶中，所述培养基通过在1,000mL蒸馏水中溶解4g尿素、14g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁七水化物、20mg硫酸亚铁七水化物、20mg硫酸锰水合物、200μg的D-生物素、200μg盐酸硫胺素、5g酵母提取物和5g酪蛋白氨基酸获得，然后在120℃加热20分钟来灭菌，然后冷却到室温。向其中添加预先灭菌的4mL 50％葡萄糖水溶液、无菌过滤的50μL 5％卡那霉素水溶液和无菌过滤的50μL 2％链霉素水溶液。然后，将实施例1的(D)中制备的黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株接种于其中，并在30℃种子培养24小时。

将培养基添加到5L发酵器中，所述培养基通过在2,500mL蒸馏水中溶解42g硫酸铵、1.5g磷酸二氢钾、1.5g磷酸氢二钾、1.5g硫酸镁七水化物、60mg硫酸亚铁七水化物、60mg硫酸锰水合物、600μg的D-生物素、600μg盐酸硫胺素、15g酵母提取物、15g酪蛋白氨基酸和1mL消泡剂(AdekanolLG294：Asahi Denka Co.，Ltd.制造的)获得，然后在120℃加热20分钟来灭菌，然后冷却到室温。向其中添加预先灭菌的500mL 12％葡萄糖水溶液、无菌过滤的1.5mL 5％卡那霉素水溶液和无菌过滤的1.5mL 2％链霉素水溶液。然后，向其中添加100mL的上述种子培养培养基，生成物在30℃保温，随后在2M碳酸铵维持pH为7.5，每分钟500mL的通气，500rpm下搅拌的条件下主培养16小时。

将培养基添加到500-mL锥形烧瓶中，所述培养基通过在200mL蒸馏水中溶解0.2g硫酸镁七水化物、8mg硫酸亚铁七水化物、8mg硫酸锰水合物、80μg的D-生物素、80μg盐酸硫胺素、1mL消泡剂(Adekanol LG294：AsahiDenka Co.，Ltd.制造的)获得，然后其在120℃加热20分钟来灭菌，然后冷却到室温。将所述培养基添加到在8,000rpm离心上述主培养获得的培养物5分钟而收集的细菌细胞(cell)中，将所述细菌细胞重悬，使得O.D.(660nm)变为60。200mL所述悬浮液和预先灭菌的200mL 20％葡萄糖溶液加载到1-L发酵釜中，混合，生成物在35℃保温。在不通气、在400rpm下搅拌的条件下，使用2M碳酸钠维持pH值为7.6来进行反应。在开始反应后约47小时终止反应。

结果，与MJ233/PC/ΔLDH菌株相比，在黄色短杆菌MJ233/pODH/PC/ΔLDH菌株中，琥珀酸的收率提高3.8％，相对于琥珀酸的产量，乙酸产量降低27％。也就是说，发现了ODH的增强引起了明显的琥珀酸收率的提高和乙酸收率的降低的效果。

实施例3

<在乙酸产生减少的菌株中ODH增强的效果>

(A)ODH扩增的菌株的制备

评估了在乙酸产生减少的菌株中2-氧代戊二酸脱氢酶的增强效果。对于其中乙酸产生减少的菌株，使用2256Δ(ldh，pta，ack，ach，poxB)菌株，所述菌株是通过降低乳发酵短杆菌2256(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)(WO2005/113744和WO2005/113745)中的乳酸脱氢酶(ldh)、乙酰CoA水解酶(ach)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)和丙酮酸氧化酶(poxB)的每一种的活性获得的菌株。

对用于ODH扩增的质粒，使用含有ODH基因的pPKS-X(WO95/34672)，以及，用其相应的载体pPK4(WO 95/34672)作对照。乳发酵短杆菌2256Δ(ldh，pta，ack，ach，poxB)菌株通过电脉冲方法来转化。转化的菌株涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基上(在5g/L葡萄糖、10g/L聚胨(polypeptone)、10g/L酵母提取物、1g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/L MnSO₄·7H₂O、3g/L尿素以及1.2g/L大豆水解产物中含有1.5％琼脂，并具有7.5的pH值(KOH))，并在31.5℃培养约24小时。然后，纯化获得的菌落，通过常规方法提取质粒。结果，确认了目标质粒的导入。通过向乙酸产生减少的菌株中导入ODH扩增的质粒获得的菌株命名为2256Δ(ldh，pta，ack ach，poxB)/pPKS-X。通过导入载体获得的菌株命名为2256Δ(ldh，pta，ack，ach，poxB)/pPK4。

(B)ODH扩增的菌株的琥珀酸的产生

其中导入了以上描述的ODH扩增质粒的菌株(2256Δ(ldh，pta，ack，ach，poxB)/pPKS-X)和其中导入了以上描述的载体的菌株(2256Δ(ldh，pta，ack，ach，poxB)/pPK4)在CM-Dex琼脂培养基中培养。获得的细菌细胞接种在3ml的种子培养基中(20g/L葡萄糖、14g/L(NH₄)₂SO₄、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/LK2HPO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、4g/L尿素、0.02g/L FeSO₄·7H₂O、0.02g/LMnSO₄·7H₂O、200μg/L生物素、200μg/L VB1·HCl、1g/L酵母提取物、和1g/L酪蛋白氨基酸)。将细菌细胞在有氧条件下在31.5℃在试管中振摇培养约8小时。

然后，3mL的各个主培养基(将200g/L葡萄糖进行过滤、干热灭菌的碳酸镁与过滤的葡萄糖混合，获得143g/L的终浓度)添加到各试管中。试管用硅软木塞密封来防止通气，在31.5℃振摇48小时进行琥珀酸产生的培养。通过液相色谱分析产生的琥珀酸的量。对于柱，使用两根相互随机连接的Rezex ROA-Organic Acid H+(Phenomenex Inc.)，样品在50℃用5mM对甲苯磺酸洗脱。洗脱物用含有5mM对甲苯磺酸和100μM EDTA的20mMBis-Tris水溶液中和。通过CDD-10AD(Shimadzu Corporation)测定混合物的电导率来测定琥珀酸。每个细菌菌株的多个样品进行评估，平均结果在表1中示出。产率(％)显示了相对于葡萄糖的琥珀酸的产率，α-KG/SA(％)显示了培养基中α-氧代戊二酸(α-KG)与琥珀酸(SA)的浓度比。

表1.ODH增强的菌株的琥珀酸产生

 

细菌菌株的名称	产率(％)	α-KG/SA(％)
			2256Δ(ldh，pta，ack，poxB，ach)/(pPK4)	48.7	3.0
2256Δ(ldh，pta，ack，poxB，ach)/(pPKS-X)	51.4	1.6

与作为对照的2256Δ(ldh，pta，ack，poxB，ach)/(pPK4)相比，在作为ODH扩增的菌株的2256Δ(ldh，pta，ack，poxB，ach)/(pPKS-X)菌株中，产率平均提高约3％，作为副产物的α-KG的量降低到约一半。根据这些结果，发现在被修饰从而乙酸产生减少的琥珀酸生产细菌中，ODH活性的增强导致了作为副产物的α-KG产生的降低和琥珀酸产生的提高。

工业实用性

根据本发明的生产方法，有机酸例如琥珀酸可以以高效率快速地产生。获得的有机酸例如琥珀酸可以用作食品添加剂，或用于药物、化妆品等等中。此外，还可以通过聚合反应利用获得的有机酸作为原材料来制备含有有机酸的聚合物。

序列表

<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)

<120>能够产生有机酸的细菌以及产生有机酸的方法

<130>A7005-C7028

<150>JP2006-048060

<151>2006-02-24

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>3774

<212>DNA

<213>黄色短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3771)

<400>3

<210>4

<211>1257

<212>PRT

<213>黄色短杆菌

<400>4

<210>5

<211>3423

<212>DNA

<213>黄色短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3420)

<400>5

<210>6

<211>1140

<212>PRT

<213>黄色短杆菌

<400>6

<210>7

<211>2579

<212>DNA

<213>黄色短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1383)

<220>

<221>CDS

<222>(1386)..(2579)

<400>7

<210>8

<211>461

<212>PRT

<213>黄色短杆菌

<400>8

<210>9

<211>397

<212>PRT

<213>黄色短杆菌

<400>9

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

<210>14

<211>3600

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1037)..(2545)

<400>14

<210>15

<211>502

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>15

<210>16

<211>3780

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(996)..(2735)

<400>16

<210>17

<211>579

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>17

Claims (14)

1.具有有机酸产生能力的细菌，其中所述细菌被修饰，从而与2-氧代戊二酸脱氢酶的未修饰菌株相比，增强了2-氧代戊二酸脱氢酶活性。

2.具有有机酸产生能力的细菌，其中所述细菌被修饰，从而减少乙酸产生，并且与2-氧代戊二酸脱氢酶未修饰的菌株相比，增强了2-氧代戊二酸脱氢酶活性。

3.根据权利要求2的细菌，其中通过降低乙酸激酶活性和磷酸转乙酰酶活性中的一种或两种来减少所述乙酸产生。

4.根据权利要求2的细菌，其中通过降低乙酰CoA水解酶活性来减少乙酸产生。

5.根据权利要求2的细菌，其中通过降低丙酮酸氧化酶活性来减少乙酸产生。

6.根据权利要求1到5的任一项的细菌，其中所述细菌进一步被修饰从而使乳酸脱氢酶活性降低。

7.根据权利要求1到6的任一项的细菌，其中所述细菌进一步被修饰从而使丙酮酸羧化酶活性增强。

8.根据权利要求1到7的任一项的细菌，其中所述细菌选自棒状杆菌型细菌(coryneform bacterium)、芽孢杆菌属细菌(Bacillus bacterium)、根瘤菌属细菌(Rhizobium bacterium)、埃希氏菌属细菌(Escherichia bacterium)、乳杆菌属细菌(Lactobacillus bacterium)和琥珀酸杆菌属细菌(Saccinobacillusbacterium)。

9.根据权利要求1到8的任一项的细菌，其中所述有机酸是琥珀酸。

10.一种制备有机酸的方法，包括：

使根据权利要求1到9的任一项的细菌或其经处理的细胞作用于反应溶液中的有机原材料从而产生有机酸，所述反应溶液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体；和

收集所述有机酸。

11.根据权利要求10的方法，其中使所述细菌或其处理的细胞在厌氧气氛中作用于有机原材料。

12.根据权利要求10或11的方法，其中所述有机原材料是葡萄糖或蔗糖。

13.根据权利要求10到12的任一项的方法，其中所述有机酸是琥珀酸。

14.一种制备含有有机酸的聚合物的方法，包括：

通过根据权利要求10到13的任一项的方法制备有机酸；和

将所获得的有机酸作为原材料进行聚合反应。

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