CN108384815A - 一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法。其主要步骤如下：对木质纤维素原料进行预处理；经酶解糖化获得可发酵糖；利用低浓度的木质纤维素水解液培养土曲霉作为种液，接种于高浓度水解液中进行衣康酸发酵。本发明的突出优点是利用木质纤维素为原料代替葡萄糖等碳源发酵生产衣康酸，降低了衣康酸的生产成本，对环境友好，提高了衣康酸生产过程的经济性。

Description

一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法
技术领域
本发明涉及一种以木质纤维素为原料，利用微生物发酵生产衣康酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是世界上第五大有机酸。由于分子内存在一个不饱合双键和两个活泼的羧基,使得衣康酸能够进行加成、聚合反应,形成聚合高分子,其中尤其重要的是衣康酸的酯化反应。标准的酯化反应能够产生衣康酸二酯,且产率很高。衣康酸酯类是合成树脂、塑料、增塑剂的重要原料；另外,衣康酸与胺类反应生成的N-烃基吡咯烷酮是一类重要的化合物。衣康酸及其酯类是生产腈纶等化纤、合成树脂、塑料、橡胶、药物、表面活性剂、无毒食品包装材料、除草剂、除垢剂、粘着剂等工业原料,广泛用于化工行业。
衣康酸的生产方法有化学合成法、柠檬酸分解法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于原料来源广泛、成本低、生产条件温和，是目前国内外生产衣康酸的主要方法。衣康酸发酵的使用的原料是糖类原料，如例如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、乳糖等，以及淀粉类原料，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、西米淀粉的水解液。而淀粉主要是由24～30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键或α-1,6-糖苷键连接而成，因此水解液的主要成分是葡萄糖。就主要发酵微生物土曲霉(A.terreus)来说，单糖的衣康酸产率要高于多糖，葡萄糖的衣康酸产率最高，但是就工业生产来说太过昂贵，为了降低成本并从原料来源和环境保护的角度出发，开发来源广、价格低的可再生原料正成为衣康酸微生物发酵领域的研究重点。到目前为止以木质纤维素资源发酵生产衣康酸的研究少有报道，这主要是因为木质纤维素的水解液主要是葡萄糖和木糖的混合糖液，而土曲霉对木糖的利用率较葡萄糖低，在总糖浓度相同的情况下，有木糖存在时，产酸能力较单一葡萄糖碳源低。并且木质纤维素水解液中常含有甲酸、糠醛、羟甲基糠醛、锰离子等不利于发酵的抑制因素，同时预处理过程中会引入过多的磷或氮元素，而土曲霉对某些抑制物相当敏感并且对营养物质的需求较高，因此木质纤维素水解液一般不适合用于衣康酸的发酵。
发明内容
本发明旨在提供一种利用木质纤维素为原料发酵生产衣康酸的方法。
本发明的技术方案为：一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，木质纤维素原料预处理后，经酶解糖化获得木质纤维素可发酵糖液，利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液；利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉发酵制备衣康酸。
所用木质纤维素原料为竹子或橡子壳。
原料的预处理，所述预处理方法是指稀酸、稀碱、蒸汽爆破的一种或几种联合预处理。
酶解糖化时以超纯水替代缓冲溶液。
酶解时选用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的混合酶，在温度48～50℃，pH为4.8～5.0的条件下，震荡水解48～72h。
所述的土曲霉是土曲霉AtYSZ-38，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11039。
所述的利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液，其中所使用的种液培养基组成为：以葡萄糖计木质纤维素可发酵糖浓度为10～20g/L、(NH4)2SO4 3～5g/L、MgSO4 ·7H2O 0.5～1.0g/L、KH2PO4 0.5～1.0g/L、玉米浆0.5～1.0g/L、调pH为3.0～3.5。
所述的利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液，具体方法是菌株经斜面培养3～5d后，用接种针刮下接种于种液培养基，28～30℃，150～200r/min培养12～24h。
所述的利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉制备衣康酸，其中，所用的培养基组成为：以葡萄糖计木质纤维素可发酵糖液浓度为30～60g/L，、(NH4)2SO43～5g/L、MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L、KH2PO4 0.5～1.0g/L、玉米浆2.5～3.0g/L、、调pH为3.0～3.5。
所述的利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉制备衣康酸，其中，发酵时的培养条件为接种量5～15％，温度35～37℃，转速200～250r/min，培养3～5d。
有益效果：
1.利用资源丰富、廉价的木质纤维素原料替代葡萄糖或淀粉等碳源发酵制备衣康酸，不与人争粮，以低糖浓度水解糖制备种液，高糖浓度水解液发酵产酸，降低了工艺过程的成本，将竹子下脚料等木质纤维素资源变废为宝，保护生态环境，有利于实现可持续发展。
2.通过调整培养基的配方使得土曲霉菌株可以适应木质纤维素的水解液，可以克服水解液中存在的毒素和木糖对土曲霉生产衣康酸的影响，不需要进行去毒步骤。
3.利用水解液可发酵糖制备种液或发酵产衣康酸时，培养基中必须添加适量浓度的玉米浆。
附图说明
图1不同水解液浓度(以葡萄糖计)对衣康酸产量的影响。
图2竹子水解液的液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供的以木质纤维素原料制备衣康酸的方法，木质素原料预处理后，经酶解糖化获得可发酵糖，然后利用低浓度的可发酵糖培养土曲霉(Aspergillus terreus)作为种液；利用高浓度的可发酵糖接种土曲霉(A.terreus)发酵制备衣康酸。
木质素原料预处理后，经酶解糖化获得可发酵糖的具体方法可以参考申请号为2014108315160，名称为一种竹子生物质废弃物酶水解产可发酵糖的两步预处理方法中实施例1所记载的内容，由于缓冲溶液对土曲霉的发酵产酸有影响(参见表1)，因此，在酶水解过程以超纯水替代柠檬酸缓冲溶液进行水解
表1缓冲液对AtDES3-235生长产酸的影响
本发明所使用的土曲霉(Aspergillus terreus)AtYSZ-38的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11039，保藏日期为2015年7月2日。
制备种液
土曲霉菌株经斜面培养3～5后，用接种针刮下接种于种液培养基，28～30℃，150～200r/min培养12～24h，种液培养基配方为木质纤维素酶解糖浓度10～20g/L，(NH4)2SO43～5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，KH2PO4 0.5～1.0g/L，玉米浆0.5～1.0g/L，用0.5～1.0M硫酸调pH为3.0～3.5；
发酵产衣康酸
接种量5～15％，温度35～37℃，转速200～250r/min，培养3～5d，发酵培养基配方为木质纤维素酶解糖浓度30～60g/L，(NH4)2SO4 3～5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，KH2PO4 0.5～1.0g/L，玉米浆2.5～3.0g/L，用0.5～1.0M硫酸调pH为3.0～3.5。
实施例1
利用竹材水解液制备种液及产酸
种液培养基成分：20g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，玉米浆1.0g/L，用0.5M硫酸调pH为3.0，将土曲霉AtYSZ-38斜面培养3d后，用接种针刮下接种于种液培养基，28℃，150r/min培养24h。
发酵培养基成分：40g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，玉米浆2.5g/L，用0.5硫酸调pH为3.0，接种量为10％，培养温度35℃，转速250r/min，培养5d，测定衣康酸含量为23.75g/L，糖酸转化率达到了48.32％。
表2玉米浆对水解液发酵产酸的影响(40g/L的竹材水解液)
实施例2
利用橡子壳水解液制备种液及产酸
种液培养基成分：20g/L的橡子壳水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，玉米浆1.0g/L，用0.5M硫酸调pH为3.0，将土曲霉AtYSZ-38斜面培养3d后，用接种针刮下接种于种液培养基，28℃，150r/min培养24h。
发酵培养基成分：40g/L的橡子壳水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，玉米浆2.5g/L，用0.5硫酸调pH为3.0，接种量为10％，培养温度35℃，转速250r/min，培养5d，测定衣康酸含量为20.36g/L，糖酸转化率达到了44.25％。
实施例3
利用竹材水解液制备种液及产酸
种液培养基成分：15g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 4g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，KH2PO4 0.7g/L，玉米浆0.7g/L，用0.5M硫酸调pH为4.0，将土曲霉AtYSZ-38斜面培养3d后，用接种针刮下接种于种液培养基，29℃，180r/min培养24h。
发酵培养基成分：60g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，玉米浆3g/L，用0.5硫酸调pH为3.0，接种量为15％，培养温度36℃，转速250r/min，培养4d。
实施例4
利用竹材水解液制备种液及产酸
种液培养基成分：10g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，玉米浆0.5g/L，用0.5M硫酸调pH为3.0，将土曲霉AtYSZ-38斜面培养5d后，用接种针刮下接种于种液培养基，28℃，150r/min培养24h。
发酵培养基成分：30g/L的竹材水解液(以葡萄糖计)，(NH4)2SO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KH2PO4 08g/L，玉米浆2.8g/L，用0.5硫酸调pH为3.0，接种量为6％，培养温度35℃，转速250r/min，培养5d。

Claims (10)

1.一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，木质纤维素原料预处理后，经酶解糖化获得木质纤维素可发酵糖液，其特征在于，利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液；利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉发酵制备衣康酸。
2.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所用木质纤维素原料为竹子或橡子壳。
3.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：原料的预处理，所述预处理方法是指稀酸、稀碱、蒸汽爆破的一种或几种联合预处理。
4.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：酶解糖化时以超纯水替代缓冲溶液。
5.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：酶解时选用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的混合酶，在温度48～50℃，pH为4.8～5.0的条件下，震荡水解48～72h。
6.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所述的土曲霉是土曲霉AtYSZ-38，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 11039。
7.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所述的利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液，其中所使用的种液培养基组成为：以葡萄糖计木质纤维素可发酵糖浓度为10～20 g/L、(NH4)2SO4 3～5 g/L、MgSO4∙7H2O0.5～1.0 g/L、KH2PO4 0.5～1.0 g/L、玉米浆0.5～1.0 g/L、调pH 为3.0～3.5。
8.按照权利要求1或7所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所述的利用低浓度的木质纤维素可发酵糖液培养土曲霉作为种液，具体方法是菌株经斜面培养3～5d后，用接种针刮下接种于种液培养基，28～30 ℃，150～200 r/min培养12～24 h。
9.按照权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所述的利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉制备衣康酸，其中，所用的培养基组成为：以葡萄糖计木质纤维素可发酵糖液浓度为30～60 g/L，、(NH4)2SO4 3～5 g/L、MgSO4∙7H2O 0.5～1.0 g/L、KH2PO4 0.5～1.0 g/L、玉米浆2.5～3.0 g/L、调pH 为3.0～3.5。
10.按照权利要求1或9所述的利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法，其特征在于：所述的利用高浓度的木质纤维素可发酵糖液为碳源接种土曲霉制备衣康酸，其中，发酵时的培养条件为接种量5～15%，温度35～37 ℃，转速200～250 r/min，培养3～5 d。
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