CN86102604A

CN86102604A - 重组dna表达载体和编码异青霉素n合成酶的dna复合物

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Publication number: CN86102604A
Application number: CN198686102604A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·多米尼克·英戈利亚; 斯蒂芬·怀亚特·奎因纳; 休伦·玛丽·萨姆森; 保罗·卢瑟·斯卡特鲁德
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1986-11-26
Also published as: AU619596B2; KR860008287A; EP0200425A2; ES8800344A1; BG45219A3; JPS61254192A; IL78531A0; ES557658A0; CA1309673C; AU592791B2; ES554218A0; ES8900142A1; FI95810C; EP0200425A3; HU202279B; DE3683080D1; FI861653A; JPH0787788B2; IE861029L; HUT40705A

Abstract

本发明包括新的编码异青霉素合成酶的DNA化合物及有关方法、转化体和多肽。这种新的DNA，连同它的相关活化序列一起从顶头孢霉中分离出来并克隆到大肠杆菌的克隆载体上。分离出的DNA已被用于构建在顶头孢霉内能驱动异青霉素N合成酶的表达的载体。顶头孢霉活化序列还进一步被融合到一条潮霉素磷酸转移酶编码DNA片段上并置于顶头孢霉表达载体上。

Description

本发明涉及编码异青霉素合成酶活性的DNA序列。异青霉素合成酶催化由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸生成异青霉素N的反应。该反应是生物合成一些重要抗生素的一个关键步骤，如来自Penicillium chrysogenum、Cephalos-porium acremonium和Streptomyces clavuligerus的青霉素;未自C.aremonium的先锋霉素;以及来自S.clavu-ligerus的7α-甲氧基先锋霉素。

编码异青霉素N合成酶活性的新的DNA序列是由顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）中分离的，已用来构建驱动该活性表达的重组DNA表达载体。这些表达载体中，有两种类型特别有用。第一种类型的载体驱动大肠杆菌中异青霉素N合成酶活性的高水平表达，而第二种类型的载体则驱动顶头孢霉中该酶活性的表达。

大肠杆菌产生的异青霉素N合成酶活性，已在由δ-〔L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸转变为异青霉素的体外试验中显示出来。用本发明的大肠杆菌载体转化的大肠杆菌的细胞粗提液，无需预先活化处理即具有异青霉素N合成酶活性。因此，本发明的大肠杆菌载体为得到大量活性异青霉素N合成酶提供了一种有效的工具。异青霉素N合成酶不仅对于生产异青霉素N是有用的，而且对于缩合δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸以外的其它三肽，以形成新的抗生素也是有用的。

本发明的头孢霉载体可用于菌种改良目的。头孢霉是一种在生产青霉素和头孢霉素中有重要经济价值的微生物。用本发明的某些重组DNA表达载体转化Cephalosporium，导致在转化菌体内以高水平产生异青霉素N合成酶，因此表现出增加了这些转化菌的发酵过程的效率和产率。

编码异青霉素N合成酶的DNA复合物，很容易改建成其他表达载体，用以增加其它微生物，如Penicillium chrysog-enum和Streptomyces clavuligerus的发酵过程的效率和产率。虽然本发明中编码异青霉素N合成酶的DNA是由C.acremonium中分离的，但该DNA复合物亦可用于构建那些在多种宿主细胞内驱动异青霉素N合成酶活性表达的载体，例如本发明的大肠杆菌载体。所有产生青霉素和头孢霉素的生物体均利用共同的前体δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和异青霉素N。因此，本发明的编码异青霉素N合成酶的DNA化合物，可用于制取一些有用的载体，它们可改善产生青霉素和头孢霉素的所有菌属的微生物发酵效率和产率。

本发明的DNA复合物是由顶头孢霉的基因组DNA中得到的，其核苷酸序列十分同源于S.chavuligerus、P.chrysog-enum以及其它产生异青霉素N合成酶的生物体中编码异青霉素N合成酶活性的DNA复合物。由于这种同源性，故本发明的编码异青霉素N合成酶的DNA复合物可被标记，并用于筛选产生异青霉素N或相似化合物的生物体的基因组文库中异青霉素N合成酶类型的酶。许多微生物都包含这样一些DNA：即它们编码相当于由本发明的DNA组合物所编码之活性的异青霉素N合成酶活性，而本发明即包括了这些相当的DNA组合物。

本发明的编码异青霉素N合成酶的DNA组合物得自于顶头孢霉基因组DNA，并以与转录和翻译活化序列结合的方式被分离，此活化序列控制编码顶头孢霉异青霉素N合成酶之基因组DNA的表达。本发明也包括该新的转录和翻译活化序列，如本文所公开的，此序列已被用于驱动顶头孢霉中异源基因的表达。

本发明还包括异青霉素N合成酶（IPS）基因的调节信号，这些信号位于IPS基因编码区的编码链之3′端。这些3′调节序列编码IPS基因的转录终止、mRNA多聚腺苷酸化和加工信号。这些信号存在于表达载体中适当的位置，即在被表达的基因编码区之编码链的3′端，可提高顶头孢霉中该载体编码的预期产物的表达。

以下部分提供对本发明的更详细的描述。为了使本文说明书中和权利要求中所用的一些名词更清楚并帮助读者了解本发明，故对以下条目定义如后。

抗生素-一种由微生物产生的物质，为天然的或进行了有限的化学修变的，可抑制其它微生物或真核细胞的生长，或者杀死这些细胞。

抗生素生物合成基因-编码一种酶活性的DNA片段，该酶活性在由原始代谢物转化成抗生素的过程中某一酶促反应所必须的。

生产抗生素的微生物-产生抗生素或含有表达时产生抗生素的基因的任何微生物，包括但不仅限于Streptomyces，Bacillus、Monospora，Cephalosporium，Podospora、Penicillium及Nocardia等。

抗生素抗性基因-编码一种赋予微生物以抗某抗生素抗性的DNA片段。

ApR-氨苄青霉素抗性基因。

双功能克隆穿棱载体-一种重组DNA克隆载体，其可复制和/或整合到两不同分类的生物体内。

Ceph DNA-顶头孢霉DNA。

Ceph·Ori-顶头孢霉线粒体DNA，其提供一重组DNA载体的染色体外保留。

克隆-将一DNA片段掺入一重组DNA克隆载体中的过程。

CoS-噬菌体入的粘性末端序列。

柯斯质粒（Cosmid）-能在宿主细胞中以与质粒相似的方式复制、但也能包装到噬菌体头内的重组DNA克隆载体。

功能性多肽-可回收的有完整生物活性的异源或同源多肽或前体、含有一异源多肽及部分或全部同源多肽的可回收的生物活性多肽、或者含有一异源多肽及未经生物活化的同源多肽（其可在特异位点被切断）的可回收的未经生物活化的融合多肽。

基因组文库-DNA片段已被克隆于其中的一组重组DNA克隆载体，其实质上代表了特定生物体的全部基因组。

HmR-潮霉素抗性基因。

杂交-两个同源单链DNA分子形成双链DNA分子的退火过程，其碱基可能完全或不完全配对。

IPS-异青霉素N合成酶编码DNA。

IPSP-顶头孢霉异青霉素N合成酶（IPS）基因的转录和翻译活化序列。

IPSt-IPS基因的转录终止和mRNA多聚腺苷酸化及加工信号。

异青霉素N合成酶-亦称环化酶，其为一种催化δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸形成异青霉素N的酶。

KmR-卡那霉素抗性基因。

mel-酪氨酸酶基因。

mRNA-信息核糖核酸。

PGK-酵母Saccharomyces cerevisiae磷酸甘油酸激酶基因的转录和翻译活化序列。

重组DNA克隆载体-任何自主复制或整合因子，包括但并不仅限于质粒，包含有一能够或已经向其加上一个或多个其它DNA分子的DNA分子。

重组DNA表达载体-任何自主复制或整合因子，包括但并不仅限于质粒，其包含一转录和翻译活化序列，位于编码研究中或有商业价值的多肽或RNA的DNA片段的并驱动其表达。

重组DNA载体-任何重组的DNA克隆或表达载体。

限制性片段-任何经一种或多种酶的作用而产生的线性DNA分子。

rRNA-核糖体核糖核酸。

敏感宿主细胞-当有一种给定的抗生素存在时，只有赋于细胞以抗该抗生素以抗性的DNA片段才能生长的宿主细胞。

TcR-四环素抗性基因。

转录活化序列-启动DNA转录的DNA序列。

转化体-受到转化的受体宿主细胞。

转化-将DNA引入一受体宿主细胞，改变基因型而导致受体细胞的改变。

转译活化序列-当转录mRNA中时，启动mRNA转译成蛋白质的DNA序列。

trp-大肠杆菌色氨酸操纵子的转录和转译活化序列（即色氨酸操纵子）。

图1～7中给出的限制性位点图谱和功能图谱大体上代表了本文所讨论的重组DNA载体。图谱上限制性位点的间隔，与载体上限制性位点的真实间隔是成比例的，但所观察到的限制性位点距离可能与计算的图谱距离稍有不同。限制性位点的形成是不彻底的，因此在载体上某一已知类型的限制性位点可能比实际显示在图上的要多。

图1：质粒pIT335的限制性位点和功能图。

图2：质粒pCZ106的限制性位点和功能图。

图3：质粒pIT337的限制性位点和功能图。

图4：质粒pIT221的限制性位点和功能图。

图5：质粒pPS20的限制性位点和功能图。

图6：质粒pPS19的限制性位点和功能图。

图7：质粒pPS21的限制性位点和功能图。

图8：质粒pPS21A的限制性位点和功能图。

图9：质粒pPS25的限制性位点和功能图。

图10：质粒pPS28的限制性位点和功能图。

图11：质粒pPS29的限制性位点和功能图。

图12：质粒pPS26的限制性位点和功能图。

图13：质粒pPS34的限制性位点和功能图。

图14：质粒pIT336的限制性位点和功能图。

图15：质粒pPS35的限制性位点和功能图。

图16：质粒pPS27的限制性位点和功能图。

图17：质粒pPS37的限制性位点和功能图。

本发明包括编码异青霉素N合成酶活性的DNA复合物和重组DNA克隆及表达载体。一条编码异青霉素N合成酶活性的特定DNA序列如下所示。其中只给出双股DNA分子的“有意义”或编码链，并且该DNA是以5′→3′方向从左到右记录的。对核苷酸序列编以号码，序号写在DNA序列的上面。异青霉素N合成酶的氨基酸残基列在每行DNA序列的上面，以氨基末端至羧基末端方向从左到右写出。每个氨基酸残基均出现在编码它的DNA的下面。氨基酸残基也编有号码，序号数字在氨基酸残基序列的下面。

编码异青霉素N合成酶活性的DNA序列及相对应的氨基酸序列

其中A是脱氧腺苷，G是脱氧鸟苷，C是脱氧胞苷，T是胸苷，ALA是丙氨酸，ARG是精氨酸，ASN是天冬酰胺，ASP是天冬氨酸，CYS是半胱氨酸，GLN是谷氨酰胺，GLU是谷氨酸，GLY是甘氨酸，HIS是组氨酸，ILE是异亮氨酸，LEU是亮氨酸，LYS是赖氨酸，MET是蛋氨酸，PHE是苯丙氨酸，PRO是脯氨酸，SER是丝氨酸，THR是苏氨酸，TRP是色氨酸，TYR是酪氨酸，VAL是缬氨酸。

如上所示的DNA序列G和C含量占～63%，它编码-多肽即异青霉素N合成酶，计算的分子量为38，476道尔顿，测得的分子量约为40，000道尔顿。

本领域内的技术人员会了解到上列DNA序列是本发明的重要部分。上述序列可按着改良的磷酸三酯法，使用充分保护的脱氧核糖核苷酸单体方便地合成。此合成方法是本领域内的已知技术，基本上可参照Itakura等人（Science，198：1056，1977）和Crea等人（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75：5765，1978）的方法完成。此外，特别推荐使用Hsiung等人（Nucleic Acid Reserch，11：3227，1983）和Narang等人（Methods in Enzymology，68：90，1980）所公开的方法。除上述可参考的手工操作方法外，该DNA尚可用自动的DNA合成仪合成，如Systec 1450A或AB 380A DNA合成仪。

由于遗传密码的简并性质-其起因于大多数氨基酸残基和终止信号有一个以上密码子，所以上述异青霉素N合成酶的氨基酸残基序列可由许多不同的DNA序列编码。因为这些可替代的DNA序列能编码本发明的同一氨基酸序列，故本发明还进而包括这些可替代的DNA序列。

再者，本发明的异青霉素N合成酶编码DNA可有遗传变异体。这些遗传变异体可能与本发明之复合物共有相当数目的同源DNA和氨基酸序列，即使它们不完全相同亦会有相似的活性，但在某些方面与本发明的复合物会有不同。这些遗传变异体也相当于本发明的复合物。

本发明的编码异青霉素N合成酶活性的DNA复合物是由俗称为Brotzu菌株的一个顶头孢霉的菌株分离的，从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，Rockville，Maryland）可得到该菌株，寄存登记号是ATCC 11550。构建了顶头孢霉菌株的总基因组DNA的基因组文库，并检验了基因组文库中与一组64个不同脱氧核糖寡核苷酸同源的序列的存在。根据所得到的顶头孢霉异青霉素N合成酶的氨基末端氨基酸序列的资料，以及关于遗传密码的知识，构建了这一组64个不同的脱氧核糖寡核苷酸。鉴定出基因组文库的许多载体与64个不同脱氧核糖寡核苷酸中的一个或多个是同源的。DNA序列分析找到了哪些载体是为顶头孢霉异青霉素合成酶编码的。

鉴定了编码异青霉素N合成酶的载体后，修变一个特殊的异青霉素N合成酶编码载体，以便删除存在于该载体上的并不编码异青霉素N合成酶的大多数顶头孢霉DNA。所得载体定名为质粒pIT335，已被转化到大肠杆菌K12 JA221宿主细胞中，该大肠杆菌K12 JA221/PIT335转化体已寄存于Northern Regional研究实验室（Peoria，Illinois）的储存培养物保藏中心，寄存登记号为NRRL B-15960。质粒pIT335的限制性酶切位点和基因图谱如图1中所示。

可按照实施例1中所述的方法由大肠杆菌K12JA221中分离质粒pIT335。以质粒pIT335为原料，构建了质粒pIT337，它驱动大肠杆菌中异青霉素N合成酶的高效表达。通过连接质粒PIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段于质粒PCZ106的～8.7Kb NcoⅠ-NcoⅠ和～1.6Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段，构成了质粒pIT337。

质粒pCZ106包含一个失控复制子、trp转录和翻译活化序列和操纵子、以及一个编码牛生长激素衍生物的DNA序列。质粒pCZ106上这种类型的失控复制子的应用，已在美国专利4487835号、4499189号及4495287号中描述和公开过。基本上说，在大约25℃的低温时，大肠杆菌中包含一个失控复制子的质粒，每个宿主细胞约有～10-15个拷贝。但当温度升到约37℃时，每个大肠杆菌宿主细胞中的拷贝数则增加到大约1000。可供分离质粒pCZ106的大肠杆菌K12 RV308/pCZ106宿主细胞，已寄存在Northern Regional研究实验室（Peoria，Illinois）的储存培养物保藏中心，寄存登记号为NRRLB-15959。质粒pCZ106的限制性酶切位点和基因图谱如图2中所示。

质粒pIT337包含质粒pCZ106的失控复制子和trp转录和翻译活化序列，以及来自质粒pIT335的异青霉素N合成酶基因的蛋白质编码序列。质粒pIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段包含完整的异青霉素N合成酶蛋白编码序列，以及NcoⅠ限制酶识别序列为5'-CCATGG-3'

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3'-GGTACC-5'，

包含编码异青霉素N合成酶氨基末端蛋氨酰残基的5-ATG-3'

|||

3-TAC-5'。

所构建的质粒pIT337中，已使trp转录和翻译活化序列定位于能驱动异青霉素N合成酶编码DNA表达的位置。质粒pIT337的限制性酶切点和功能基因图谱如附图3中所示。实施例2则更详细地描述质粒pIT337的构建。

在大约37℃时，包含有质粒pIT337的大肠杆菌K12 RV308（NRRL B-15624）细胞以高效率表达异青霉素N合成酶，接近总细胞蛋白的～9%。这些大肠杆菌K12 RV308/pIT337转化体的细胞粗提物能够催化δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸向异青霉素N的转化。而未转化之大肠杆菌K12 RV308细胞的细胞粗提物则不能催化这一转化。实施例3中给出了转化的分析方法和分析结果。

质粒pIT337为在大肠杆菌中大量生产异青霉素N合成酶提供了有效的工具。因为质粒pIT337的大肠杆菌转化体以接近总细胞蛋白9%的水平表达异青霉素N合成酶，又因为培养大肠杆菌没有培养天然产生异青霉素N合成酶的微生物那么复杂，所以大肠杆菌/pIT337转化体可用于产生重组的异青霉素N合成酶，而且比使用非转化体或“天然”异青霉素N合成酶生产菌更为有效和经济。

异青霉素N合成酶可用于在如实施例3中所述的无细胞体系内由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸生成异青霉素N。异青霉素N不仅是一种有用的抗生素，而且也是生产某些重要的抗生素，如青霉素N、氨基苯乙酰去乙酸头孢菌素及其它头孢菌素的原料（见美国专利4307192号）。或许异青霉素N合成酶的最重要的应用是用此酶将除δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸外的三肽缩合成新的β-内酰胺衍生物。

产生青霉素之微生物的无细胞提取物可用于合成非天然的（即自然界不存在的）β-内酰胺。本发明的大肠杆菌表达载体提供了获得异青霉素N合成酶的便宜而有效的方法，其可于体外缩合非天然产生的三肽，形成新的抗生素或抗生素核心结构。

寻找将用作异青霉素N合成酶之底物的非天然三肽，可代之寻找将接受非天然三肽作底物的突变型异青霉素N合成酶。本发明提供了寻找突变型异青霉素N合成酶的原料。大肠杆菌是进行突变克隆实验的最好宿主，而本发明的大肠杆菌表达载体可用本领域内已知的方法很容易地引起突变，如用X线或紫外线照射或用化学诱变剂（如甲磺酰乙酯、亚硝基胍或甲磺酰甲酯）或位点特异性致突变作用，以得到识别非天然三肽为底物的突变酶，并催化这些非天然三肽缩合成非天然β-内酰胺的反应。

本发明不仅限于所举例说明的特定载体。反之，本发明包括了那些编码异青霉素N合成酶的DNA复合物。本发明的DNA复合物可被用以构建在任何宿主细胞内表达异青霉素N合成酶的表达载体，表达载体在宿主细胞内复制或整合，并且在其中用转录和翻译活化序列来表达异青霉素N合成酶活性功能。

因此，尽管本文所举例的大肠杆菌表达载体可利用在大肠杆菌中起作用的失控复制子，但本发明包括了能驱动大肠杆菌中异青霉素N合成酶表达的任何大肠杆菌表达质粒或载体。因此，本发明包括了在大肠杆菌内驱动异青霉素N合成酶表达的载体，此载体并可利用在大肠杆菌中起作用的复制子，如质粒pBR322、pACY184、F、ColV-K94、RI、R6-5、或R100的复制子。本发明并不是只限于质粒载体，因为本发明亦包括表达异青霉素N合成酶活性的表达载体，此载体可利用整合或病毒复制以为在宿主细胞内复制和保留提供条件。

本发明不限于一个特定的转录和翻译活化序列，以驱动异青霉素N合成酶活性编码DNA的表达。本发明包括使用任何在大肠杆菌内有功能的转录和翻译的活化序列，并用以在大肠杆菌内表达异青霉素N合成酶。已知有许多在大肠杆菌内有功能的转录和翻译的活化序列，并均适于驱动大肠杆菌内异青霉素N合成酶的表达。这样的转录和翻译的活化序列包括（但不只限于）：lpp、lac、trp、tac、λPL及λPR转录和翻译的活化序列。

除上述各种大肠杆菌转录和翻译的活化序列外，其它生物体的转录和翻译的活化序列也可被连接到本发明异青霉素N合成酶编码DNA复合物上而形成表达载体从而驱动异青霉素N合成酶在宿主细胞（活化序列在其中是具有功能活性的）内的表达。虽然大肠杆菌是最适于异青霉素N合成酶产生和嗣后的体外提纯的宿主，但驱动除大肠杆菌外的其他宿主细胞内表达异青霉素N合成酶的载体也是有用的，特别是用于提高一特定微生物内β-内酰胺类抗生素产生能力和效率。

有多种微生物可产生β-内酰胺类抗生素。下表中列出了一部分产生β-内酰胺类抗生素的微生物。

表1

产生β-内酰胺类抗生素的微生物

微生物抗生素

土壤杆菌属（Agrobacterium）各种β-内酰胺

顶头孢霉菌（Cephalosporium 青霉素和头孢菌素

acremonium）

色杆菌属（Chromobacterium）各种β-内酰胺

葡糖杆菌属（Gluco）各种β-内酰胺

诺卡菌属（Nocardia）

lactamadurans 头孢菌素C

uniformis 诺卡霉素（nocardi-

cin）

青霉属（Penicillium）

Chrysogenum 各种青霉素和其它β-内

酰胺

沙雷氏菌属（Serratia）各种β-内酰胺

链霉属（Streptomyces）

antibioticus

argenteolus clavulanic acid

asparenomycin

A.MM4550.

和MM13902

cattleya thienamycin

chartreusis SF1623和Cephamy-

cin A及B

cinnarnonensis Cephamycin A和B

clavuligerus PA-32413-I，Cephamycin

C、A16886A，青霉素、

头孢菌素、clavulanic

acid及其它氧氮双环庚酮

（clavam）

fimbriatus Cephamycin A和B

flavovirens MM4550和MM13902

flavus MM4550和MM13902

fulvoviridis MM4550和MM13902

griseus Cephamycin A和B及

Carpetimycin A和B

halstedi Cephamycin A和B

hetermorphus C2081X和Cephamycin

A及B

hygroscopicus 醋酸基头孢菌素C

lipmanii Cephamycin、青霉素N、

η-甲氧基头孢菌素C、

A16884、MM4550、MM13902

Olivaceus epithienamycinF，

MM4550和MM13902

Pana-yensis C2081X、Cephamycin

A和B

Pluracidomyceticus Pluracidomycin A

rochei Cephamycin A和B

Sioyaensis MM4550和MM13902

SP·OA-6129 OA-6129A

SP·KC-6643 carpetimycin A

tokuromensis asparenomycin A

viridochromogenes cephamycin A和B

Wadayamensis WS-3442-D

在医药工业中，上述的许多产生β-内酰胺抗生素的微生物均被用于产生抗生素的目的。通过增加发酵期间抗生素合成酶的细胞内浓度而增加这些微生物的抗生素生成能力并使之更为有效。本发明的编码异青霉素N合成酶活性的DNA复合物可用于构建表达载体：即当其被转化到适当的宿主细胞内时，可增加被转化之宿主细胞内的异青霉素N合成酶浓度，从而增加该细胞产生抗生素的能力和效率，条件是该宿主细胞通过一个有异青霉素N合成酶活性参与的中间体反应而产生β-内酰胺抗生素。

一个将增加给定的细胞（被载体转化的细胞）内异青霉素N合成酶浓度的载体，需要有以下组成部分：1）本发明的一个编码异青霉素N合成酶活性的DNA复合物;2）一条不仅在被转化的宿主细胞内有功能、而且是以正确方向定位的且其定位适于驱动异青霉素N合成酶DNA表达的转录和翻译活化序列;以及3）为使载体保留于宿主细胞内的复制和整合功能。当然，上述载体还应包含有抗生素抗性基因或提供筛选含有载体之宿主细胞的方法的其它组成，但是当载体整合到宿主细胞的染色体DNA中时，则这种供筛选用的组成部分可以是不必要的也是不要求的。

质粒pPS20是本发明举例说明典型的表达载体即设计此类型载体以增加产生β-内酰胺抗生素的宿主细胞内异青霉素N合成酶活性浓度。将质粒pIT221的～2.7Kb HindⅢ限制片段插入质粒pIT335的唯一的HindⅢ限制性内切酶识别位点，构建成质粒pPS20。质粒pIT221的～2.7Kb HindⅢ限制片段包含以正常位置和方向连接的酵母Saccharomyces cerevisiae（啤酒酵母）磷酸甘油酸激酶（PGK）基因的转录和翻译活化序列，以驱动潮霉素（hygromycin）抗性基因的表达。因为质粒pIT335的～2.7Kb HindⅢ限制片段可以以两个方向插入HindⅢ的质粒pIT335中，所以连接生成质粒pPS20时也生成了一个功能相当的“异构体”，定名为质粒pPS20.1。质粒pPS20的限制位点和功能图如图5中所示;实施例4中描及了质粒pPS20和pPS20.1的构建。

欧洲专利公告177243中公开并权利要求了用于构建质粒pPS20和pPS20.1的质粒pIT221原材料。有关质粒pIT221的构建流程（1-VI）和实施例（1-6）已在欧洲专利公开177243的29～57页上述及，该专利作为本文的参考文献。附图4中给出了质粒pIT221的限制性酶切点和功能图。

质粒pIT221的～2.7Kb HindⅢ限制片段包含一个潮霉素的抗性基因，它以正确位置和方向连接到酵母PGK转录和翻译活化序列上，用于表达潮霉素抗性活性（HmR）。如美国专利申请654919号中所公开的，PGK-HmR基因可用以将顶头孢霉和相关宿主细胞转化为潮霉素抗性表现型。

质粒pPS20包含PGK-HmR基因，且可基于被转化体表达的潮霉素抗性活性选择顶孢霉/pPS20转化体。质粒pPS20也包含本发明的异青霉素N合成酶编码DNA，连同一端接有顶头孢霉基因组中为异青霉素N合成酶编码的DNA的基因组DNA。

因为质粒pPS20包含位于顶头孢基因组内异青霉素N合成酶编码DNA之上游的差不多3Kb的基因组DNA，所以质粒pPS20一定包含异青霉素N合成酶编码DNA的转录和翻译活化序列。大多数转录和翻译活化序列编码在欲被活化的DNA的上游，不过有些为核糖体RNA编码的DNA序列并不是被位于编码区之上游的转录活化序列活化的。“上游”是分子生物学领域里使用的一个词，在本文中是指处于由异青霉素N合成酶编码DNA的编码链之5′端开始的5′方向上的DNA。在质粒pPS20上编码的顶头孢霉转录和翻译活化序列被正确定位，以驱动异青霉素N合成酶活性编码DNA的表达，这是因为在质粒pPS20的构建中，没有将影响转录和翻译活化序列的缺失或插入片段被引入异青霉素N合成酶DNA编码链的5′端侧翼DNA中。因此质粒pPS20可用于增加顶头孢霉及相关宿主细胞（顶头孢霉转录和翻译活化序列在这些细胞中具有功能活性）的抗生素产生能力及效率。这种抗生素产生能力和效率的增加，是由于增加了转化体中异青霉素N活化酶活性的水平，同时由于附加的、被表达的异青霉素N合成酶DNA的拷贝的存在。质粒pPS20也包含一个潮霉素抗性基因，该基因在顶头孢霉中具有功能活性并可用于选择顶头孢霉/pPS20转化体。

然而，顶头孢霉/pPS20转化体一旦被选择，就不需要在转化体的生长培养基中保留选择压力-潮霉素B。因为顶头孢霉/pPS20转化体是很稳定的，故不需要选择压力。相信这种稳定性是由于质粒pPS20通过染色体整合而转化顶头孢霉。但本发明并不只限于驱动顶头孢霉中异青霉素N合成酶活性表达并通过染色体整合去转化宿主的质粒。依据美国专利4492758号中所公开的方法很容易构建顶头孢霉的染色体外复制的表达载体。美国专利4492758号中描述了能插入如质粒pPS20这样的载体内的线粒体DNA片段，用以提供在顶头孢霉中进行染色体外复制载体所需的功能。

如上所述，质粒pPS20和由质粒pPS20制得的质粒之一（即质粒pIT335）含有一条顶头孢转录和翻译活化序列。因为位于质粒pIT335和pPS20上的顶头孢霉转录和翻译活化序列能被用以驱动各种的DNA序列的表达，所以活化序列构成了本发明的一个重要部分。虽然有关顶头孢霉转录和翻译活化序列的序列资料是很有限的，但已经知道该活化序列被编在直接位于质粒pIT335和pPS20上异青霉素N合成酶活性编码DNA上游（并相邻于该DNA）的～500bp（碱基对）SalⅠ-NcoⅠ限制片段上。含有上述～500bpSalⅠ-NcoⅠ限制片段的任何限制片段必然包含顶头孢霉转录和翻译活化序列。

现有关于编码质粒pIT335上的顶头孢霉转录和翻译活化序列的资料。下示序列是存在于质粒pIT335上的异青霉素N活化酶DNA上游的DNA序列。正如下列图示序列中的。“XXXXXXXXXX”区域所示，只有～500bp SalⅠ-NcoI限制片段的一部分包含有活化序列的序列是已知的。为了进一步弄清活化序列如何定向于质粒pIT335上，用单股DNA与限制性酶SalⅠ和NcoⅠ的切点交错的特征来图示说明此限制片段。

编码于质粒pIT335上的顶头孢霉转录和翻译活化序列的部分DNA序列

←～380 bp→

5'-TCGAC XXXXXXXXXX CGAATACTTG AATATTCCTT GGTCGCTCTT

| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||

3'-G XXXXXXXXXX GCTTATGAAC TTATAAGGAA CCAGCGAGAA

CTGATTTTCG AGGCTTCTCC TTCCGCCATC GTCGCCTCAC

|||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||

GACTAAAAGC TCCGAAGAGG AAGGCGGTAG CAGCGGAGTG

GCATATCTCG TCTTTCACAT CTTACACCAG CAGGACAAAC

|||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||

CGTATAGAGC AGAAAGTGTA GAATGTGGTC GTCCTGTTTG

CGTCAC-3'

||||||

GCAGTGGTAC-5'

↑→异青霉素N合成酶编码区起始于此。

“TAC”互补于编码异青霉素N合成酶之氨基末端蛋氨酰残基的5′-ATG-3′。

顶孢霉转录和翻译活化序列可被用以驱动任何DNA序列的表达。质粒pPS21就是例证。质粒pPS21是质粒pIT221的衍生物，它是用本发明的顶头孢霉转录和翻译活化序列取代用于驱动潮霉素抗性基因表达的PGK转录和翻译活化序列而得到的。首先除去质粒pIT221的～300bp XmaⅠ片段以形成质粒pPS19而完成此取代。完成这一XmaⅠ删除以除去BamHⅠ限制酶识别位点，此位点干扰pPS21的构建。之后用BamHⅠ消化质粒pPS19并用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段处理。BamHⅠ消化切掉一条包含PGK转录和翻译活化序列的～230bp BamHⅠ限制片段;Klenow处理将单股BamHⅠ的交错切口合成双股DNA。之后质粒pPS19的大的～7.7Kb BamHⅠ片段被连接到～0.8Kb、Klenow处理过的、质粒pIT335的NcoⅠ限制片段上，其包含了顶头孢霉转录和翻译活化序列。

当然，Klenow处理的NcoⅠ限制性片段可以从两个方向之一插入，但只有一个可能的方向，即顶头孢霉转录和翻译活化序列的正确方向，才能获得要求的结果，即驱动潮霉素抗性基因的表达。图7示质粒pPS21的限制性位点和功能图，图6示质粒pPS19的限制性位点及功能图。有关构建质粒pPS21的更详细的描述在实施例5中给出。

质粒pPS21A是本发明的另一个载体，利用3 IPS基因的转录和翻译活化序列，以驱动顶头孢霉中潮霉素抗性基因的表达。一个定名为质粒pPS23的中间体质粒，被用来构建质粒pPS21A。质粒pPS23的构建如下：从含有IPS基因之活化序列的质粒pIT335中分离出～850bp NcoⅠ限制片段，将BamHⅠ和NcoⅠ兼容的，带有单股交错端的连接子附接于～850bp NcoⅠ片段上，将所得到的从质粒pIT335衍生来的～860bp BamHⅠ限制片段连接于BamHⅠ消化的质粒PVC8上。这一连接过程产生了定名为pPS23和pPS23.1的两个质粒，它们只是在插入BamHⅠ限制片段的方向上有所不同。质粒PVC8可从Pharmacia P-L Biochemicals公司（800 Centennial Ave.，Piscataway，N.J.08854）得到。

用限制酶BamHⅠ消化质粒pPS23，分离含有IPS转录和翻译活化序列的～860bp BamHⅠ限制片段并与BamHⅠ消化的质粒pPS19连接。通过一连接产生了许多有用的质粒，包括质粒pPS21A。质粒pPS21A是通过连接质粒pPS23的～0.86Kb BamHⅠ限制片段与质粒pPS19的～7.7Kb BamHⅠ限制片段而得到的，它含有以定位于合适方向的转录和翻译活化序列，以驱动潮霉素抗性基因的表达。在质粒pPS23的构建中使用的连接子，确保了正确的读码方式会保留在表达潮霉素抗性基因的质粒pPS21A中。实施例7中描述了质粒pPS21A的构建;图8示质粒pPS21A的限制性位点和功能图。

以产生质粒pPS21A的同样连接方法，也产生了其它几个有用的质粒。质粒pPS22包含如质粒pPS21A的同样序列，但包含IPS基因之活化序列的BamHⅠ限制片段是以在质粒pPS21A中的方向相反的方向插入的。因此，质粒pPS22并不以高频率赋予顶头孢霉以潮霉素抗性，于是，质粒pPS22在顶头孢霉转化中作为一有用的负对照。

这样连接而产生的另一个质粒，既可在顶头孢霉转化中用作负对照，亦可作为能用于鉴定具有转录和翻译活化活性的顶头孢霉序列的一个质粒。如上所述，质粒pPS19包含有正确定向以驱动潮霉素抗性基因表达的啤酒酵母PGK转录和翻译活化序列。用限制酶BamHⅠ消化质粒pPS19，产生了两个片段：一个片段大小约230bp并含有PGK活化序列，另一个片段大小约～7.6Kb并含有大部分潮霉素抗性基因的编码序列。

质粒pPS19的～7.6Kb BamHⅠ限制片段成环，产生质粒pPS24，该质粒没有定位以驱动载体上潮霉素抗性基因表达的转录和翻译活化序列。因此，质粒pPS24能通过以一个使内源性顶头孢霉转录和翻译活化序列驱动潮霉素抗性基因表达的位置整合到顶头孢霉DNA中，而将顶头孢霉转化成有抗潮霉素抗性的。从而鉴定质粒pPS24 DNA在一抗潮霉素的、顶头孢霉/pPS24转化体中整合的部位，也即鉴定了顶头孢霉转录和翻译活化序列。另外，将顶头孢霉DNA克隆到质粒pPS24上单一BamHⅠ位点中。并用所得到的质粒转化顶头孢霉。以高频率将顶头孢霉转化为抗潮霉素转化体的那些质粒必定包含一条在顶头孢霉中有功能活性的转录和翻译活化序列。

以产生质粒pPS21A的同样连接方法还产生了其它有用的质粒。这些质粒定名为质粒pPS25和pPS25.1，是将质粒pPS29的两个BamHⅠ限制片段连接到质粒pPS23的～860bp BamHⅠ限制片段上产生的。质粒pPS25中，PGK和IPS活化序列是以适于驱动潮霉素抗性基因表达的方向定位的。质粒pPS25包含直接定位于潮霉素抗性基因编码序列之上游的IPS活化序列，以及直接定位于IPS活化序列之上游的PGK活化序列。质粒pPS25赋予顶头孢霉以潮霉素抗性。附图9中给出了质粒pPS25的限制性位点和功能图。实施例7中描述了质粒pPS22、pPS23和pPS24的构建。

质粒pPS25.1只是在含有PGK活化序列的～0.23Kb BamHⅠ限制片段的定向上不同于质粒pPS25。在质粒pPS25.1中，PGK活化序列并不是定位于使它能驱动潮霉素抗性基因表达的方向上的。然而，质粒pPS25和pPS25.1都以同样的高频率将顶头孢霉转化成潮霉素抗体表现型，这表明PGK活化序列对于表达潮霉素抗性表现型不是必要的。

赋予顶头孢霉以潮霉素抗性的本发明之其它有用的质粒可通过用限制酶PstⅠ部分消化质粒pPS21，之后再重新连接而构建的。质粒pPS28是从质粒pPS21A上删除包含有顶头孢霉复制原点的～1.85Kb PstⅠ限制片段得到的。质粒pPS29是从质粒pPS21A上删除获得质粒pPS28时同样的PstⅠ片段连同另一～0.49Kb PstⅠ限制片段而得到的;～0.49Kb PstⅠ限制片段是位于头孢霉复制原点和质粒pPS21A上IPS基因的活化序列之间的。质粒pPS28和pPS29的限制性位点和功能图分别在图10和11中给出有关质粒pPS28和pPS29的构建则在实施例8中述及。

使用质粒pPS21A作为起始材料还构建了其它有用的衍生质粒。将质粒pPS21A的～3.45Kb HindⅢ限制片段插入质粒PIT335的单一HindⅢ位点，产生出质粒pPS26和pPS26.1，两者只是在插入质粒pPS21A的HindⅢ限制片段的方向上互不相同。质粒pPS26和pPS26.1包含有来自顶头孢霉的完整的IPS基因以及由IPS基因的活化序列驱动的潮霉素抗性基因。有关质粒pPS26和pPS26.1的构建在实施例9中述及，质粒pPS26的限制性酶切点和功能图则在附图12中给出。

欧洲专利公告177243中描述了一个相似于质粒pIT221的载体的构建，在同一申请中也描述并公开了如上所称的一个质粒，但该相似载体还包含有编码顶头孢霉核糖体RNA的DNA。该定名为pPS6的质粒，由于rRNA编码DNA的存在而提高了整合到顶头孢霉染色体DNA中的能力。在上述欧洲专利公告177243的72-75页上，实施例13中公开了质粒pPS6的构建，可供参考的实施例13被列入本文的参考文献。因为质粒pPS6包含有如质粒pIT221所包含的同样的PGK-HmR基因，所以用本发明的顶头孢霉活化序列置换PGK转录和翻译活化序列所得到的pPS6衍生物显然是在本发明的范围之内的。

质粒pPS6含有一个～3.7Kb XmaⅠ限制片段，而该片段包含了顶头孢霉的rRNA基因。当质粒转化到顶头孢霉中时，质粒上存在这个XmaⅠ片段，增加了因同源重组而将质粒整合到顶头孢霉基因组中去的可能性。因此，可通过将含有一部顶头孢霉rRNA基因的质粒pPS6的～3.7Kb XmaⅠ限制片段插入到质粒pPS21A的单一XmaⅠ位点中，构建成质粒pPS30和pPS30.1;质粒pP30和pP30.1只是在XmaⅠ限制片段的插入方向上有所不同。质粒pPS31和pPS31.1是通过将质粒pPS6的～3.7Kb XmaⅠ限制片段插入质粒pPS29的单一XmaⅠ位点而构建的。实施例10中描述了质粒pPS30、pPS30.1、pPS31和pPS31.1的构建。

利用顶头孢霉IPS基因的转录和翻译活化序列驱动潮霉素抗性基因表达的本发明之质粒载体，远远优越于利用啤酒酵母PGK活化序列驱动顶头孢霉中潮霉素抗性基因表达的质粒。本载体的优点是通过以下两项研究证明的：（1）转化频率，在使用IPS活化序列驱动载体上潮霉素抗性基因表达时，每微克载体DNA转化的潮霉素抗性顶头孢霉转化体的数目是相对于用PGK活化序列时的50至300倍;（2）再生时间，当以IPS活化序列驱动上述表达时，转化后出现肉眼可见菌落的时间，比相对于使用PGK活化序列时约少50%。

顶头孢霉转录和翻译活化序列可用于表达顶头孢霉中的任何DNA序列，正如由上面描述表达载体时所指出的。因此，本发明包括使用编码在质粒pIT335的～0.5Kb Sal1-NcoⅠ限制片段之内的顶头孢霉转录和翻译活化序列，以驱动编码某种有用物质的任何DNA序列。

本发明为克隆一条完整的、有功能的顶头孢霉DNA序列，该序列不仅编码异青霉素N合成酶的氨基酸序列，而且还编码为驱动顶头孢霉中异青霉素N合成酶的表达所必须的转录和翻译活化序列。同样地，本发明的IPS基因包括位于编码区之下游的序列，这些序列用于终止转录并提供mRNA多聚腺苷酸化及加工信号。一般来说，用于转录终止多聚腺苷酸化以及mRNA加工信号的序列是编码于编码区之终止密码子下游～500bp区域之内的。因此，包含了IPS羧基末端编码DNA和其下游序列的～0.5Kb BamHⅠ-PstⅠ限制片段也含有IPS基因的转录终止和mRNA聚腺苷酸化以及加工信号。

构建了一个定名为质粒pPS27的载体，该载体含有IPS转录和翻译活化序列，继后是潮霉素抗性基因、再后是IPS基因的转录终止和mRNA多聚腺苷酸化及加工信号。为了构建质粒pPS27而将质粒pIT335的～1.4Kb BamHⅠ-XhoⅠ限制片段插入SalⅠ-BamHⅠ消化的质粒pUC8内（SalⅠ和XhoⅠ交错部分是兼容的），以产生质粒PIT336（图14）。

由限制酶PstⅠ消化质粒PIT336并使之成环，而在质粒上除保留～0.5Kb BamHⅠ-PstⅠ限制片段（该片段含有IPS的转录终止和mRNA聚腺苷酸化及加工信号）以外去掉所有头孢霉DNA序列，得到质粒pPS35（图15）。

之后用限制酶HindⅢ消化质粒pPS35，将质粒pPS29的～2.3Kb HindⅢ限制片段（该片段含有接在潮霉素抗性基因之前的IPS基因的转录和翻译活化序列）以适当的方向插入HindⅢ消化的质粒pPS35中，以产生质粒pPS27。实施例11中描述了质粒pPS27的构建，附图16中给出了质粒pPS27的限制性酶切点和功能图。

质粒pPS27的一个有用的衍生物可按下述程序构建：分离质粒pPS27的～2.3Kb HindⅢ和～0.5Kb HindⅢ-BamHⅠ限制片段，将这些片段以合适的方向插入质粒pIT335的～5.9Kb BglⅡ-HindⅢ限制片段中，以产生质粒pPS34。质粒pPS34含有潮霉素抗性基因以及由IPS基因的调控部分控制的异青霉素N合成酶编码基因。附图13中给出了质粒pPS34的限制性酶切点及功能图。

可用质粒pIT336为起始材料构建一个将在异青霉素N合成酶基因位点上整合到顶头孢霉基因组中的质粒。这个质粒定名为pPS37，对于插入失活研究有实用性，因为当质粒pPS37整合到IPS基因的编码区内时，用质粒pPS37转化一个顶头孢霉菌株，即将产生那个菌株的缺乏IPS的突变体。质粒pPS37是通过将含有处于IPS活化序列控制下的潮霉素抗性基因的质粒pPS21A之～3.45Kb HidⅢ限制片段，插入到NruⅠ消化的质粒pIT336中构建成的。质粒pIT336在该质粒上IPS编码区部位内具有唯一的一个NruⅠ位点。将～3.45Kb HindⅢ限制片段（已用Klenow酶处理成平头）插入NruⅠ消化的质粒pIT336中实际上产生两个质粒，即pPS37和pPS37.1，但两者只是插入片段的方向不同。质粒pPS37和质粒pPS37.1可用于转化顶头孢霉，以得到有潮霉素抗性的、IPS缺乏的转化体。

本发明是一项开创性发明，它首次提供了编码酶活性（常称为环化酶活性）的DNA序列的克隆和遗传工程，该酶对于催化某三肽底物成取代的β-内酰胺是不可少的。除顶头孢霉外的许多其它微生物也表达相当类似的（如果不是完全相同的）环化酶活化）不同属的抗生素生成微生物中环化酶的相似性，源于不同环化酶之氨基酸序列、以及编码环化酶活性DNA序列的相应相似性。

本发明提供了一种环化酶（特别是顶头孢霉的异青霉素N合成酶）的氨基酸和DNA序列，因此可用以自产生β-内酰胺的微生物体中分离编码环化酶的DNA。例如，本发明提供的DNA序列可用于制备标记的探针，该探针则用于找出前述产生β-内酰胺之微生物体中编码环化酶的DNA序列。本发明的编码异青霉素N合成酶的DNA，具有高G和C含量（～63%），使本发明的DNA复合物对于分离Streptomyces clavuligerus异青霉素N合成酶编码DNA特别有用。已知链霉菌DNA具有高G和C含量，通常约为70%，所以本发明高G和C含量之DNA，使得本发明的DNA复合物特别适用于分离同源S.clavu-ligerus或其它链霉菌DNA序列。本发明包括编码环化酶活性的DNA复合物，并且包括了驱动各种宿主细胞内那种环化酶活性之表达的表达载体。

提供下列实施例旨在进一步阐明并举例说明本发明，而绝没有限定本发明之范围的意思。

实施例1

大肠杆菌K12 JA221/PIT335的

培养和质粒PIT335的分离

A、大肠杆菌K12JA221/PIT335的培养

一大肠杆菌K12JA221/PIT335的冻干品得自Northern Regional Research实验室（Peoria，Illinois），登记号为NRRLB-15960。在下述的操作中直接将该冻干品用作“培养物”。

将大肠杆菌K12JA221/pIT335的培养物接种于一升含有5.0微克/毫升氨苄青霉素的L-培养基（10克胰蛋白胨、10克NaCl及5克酵母提取物/升）上并于37℃在空气中震荡保温，直到在590毫微米的光密度（O.D.590）为～1吸收单位，此时向培养物中加入150毫克氯霉素。继续保温16小时;加氯霉素可抑制蛋白质合成，进而抑制细胞分裂，但质粒复制则可继续进行。

B、质粒pIT335的分离

将实施例1A中制得的培养物于Sorvall GSA转头（Dupo-nt公司，Instrument Products，Biomedical Divi-sion，Newtown，CN 06470），6000rpm4℃离心5分钟。弃去所得上清液，用40毫升TES缓冲液（10毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.5;10毫摩尔NaCl和1毫摩尔EDTA）洗涤细胞团块之后再离心。弃去上清液后，在干冰-乙醇浴中冷冻细胞团块，然后再融化。将融化的细胞团块再悬浮于10毫升25%蔗糖溶液及50毫摩尔EDTA中。加入1毫升浓度为5毫克/毫升溶菌酶溶液;3毫升0.25摩尔EDTA，pH＝8.0;以及100微升浓度为10毫克/毫升的RNaseA并混合之，然后将该溶液在冰中保温15分钟。向溶菌酶处理的细胞内加入3毫升溶解细胞溶液（将3毫升10%Triton-X100、75毫升0.25摩尔EDTA，pH＝8.0、15毫升1摩尔Tris-HCl，pH＝8.0及7毫升水混合而制成），混匀并将所得溶液于冰中继续保温15分钟。将溶解的细胞在干冰-乙醇浴中冷冻之后再融化。

于SW27转子（Beckman，7360N.Lincoln Ave.，Lincoln-Wood，IL60646）中以25，000rpm将溶液离心40分钟，除去细胞沉渣后，用缓冲液饱和的酚提取。加入30.44克CsCl和～1毫升浓度为5毫克/毫升的溴乙啶（Ethidium bromide）溶液后，将溶液体积调至40毫升并倒入VTi50超速离心管（Beckman）内。封闭离心管后，将溶液置于VTi50转头中以42，000rpm离心～16小时。分离所得到的、紫外光下可见的质粒带，之后置于Ti75管中并用Ti75转头（Beckman），以50，000rpm离心16小时。用含有0.761克/毫升CsCl的TES缓冲液作任何必要的体积调整。再次分离质粒带，用饱和异丙醇提取以除去溴乙啶，并用TES缓冲液作1∶3稀释。之后向溶液内加二倍体积的乙醇，之后于-20℃保温过夜。在SS34转头（Sorvall）中以10，000rpm离心15分钟，分离质粒DNA沉淀物。

将如此得到的～1毫升质粒PIT335DNA悬浮于1毫升TE缓冲液（10毫摩尔Tris-HCl，pH＝8和1毫摩尔EDTA）中并于-20℃保存。附图1中给出了质粒pIT335的限制性酶切点和功能图。

实施例2

质粒pIT337的构建

A、大肠杆菌K12RV308/PCZ106的培养和质粒pCZ106的分离

大肠杆菌K12RV308/pCZ106培养物的冻干品得自Northern Regional Research实验室（Peoria，Illi-nois），寄存登记号为NRRLB-15959。该冻干品用于接种1升含有50微克/毫升卡那霉素的L-培养液，将已接种的培养液于通气震荡器中25℃保温，直到O.D.590为0.5～1.0吸收单位之间。当培养物的光密度达到0.5-1.0吸收单位时，将温度升至37℃并继续保温2-6小时。本文前面所提到的失控复制子是对温度敏感的，并于37℃失去对拷贝数的控制。于37℃保温2-6小时为失控复制提供了充裕的时间。

37℃保温2-6小时后，收集细胞并基本上按着实施例1B的方法分离质粒pCZ106DNA。得到约5毫克的质粒pCZ106DNA并悬浮于5毫升TE缓冲液中。附图2中给出了质粒pCZ106的限制性酶切点和功能图。

B、质粒pCZ106的NcoⅠ和BamHⅠ消化以及质粒pCZ106的～8.7Kb NcoⅠ-NcoⅠ和～1.6Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段的分离。

将实施例2A中制备的大约25微克（相当于25微升）质粒pCZ106DNA加到10微升10X BamHⅠ反应缓冲液（1.5摩尔NaCl;60毫摩尔Tris-HCl、Hp7.9;60毫摩尔MgCl₂和1毫克/毫升小牛血清白蛋白（BSA））、5微升（～50单位）限制性内切酶^＊BamHⅠ、5微升（～50单位）限制性内切酶NcoⅠ和50微升H₂O中，并混匀之。将所得反应混合物于37℃保温4小时，经此时间反应便基本完成。

之后将NcoⅠ-BamHⅠ反应混合物加在1%琼脂糖凝胶上作电泳分离，直至将所要～1.6K NcoⅠ-BamHⅠ和～8.7Kb NcoⅠ-NcoⅠ片段同另一消化产物即～0.3Kb限制片段明显分开。将电泳分离的凝胶放在溴乙啶的稀溶液（0.5微克/毫升）中染色并将染色的凝胶暴露于长波紫外光下，即可使电泳分离的DNA带显现出来。标定所要片段的位置后在凝胶中每个所要的片段前面纵切成小段，并在每个凝胶块上放一小片Schleicher和Schuell（Keene，NH03431）NA-45DEAE膜。经进一步电泳后，DNA非共价结合于DEAE膜上。待所要的片段结合于DEAE膜上后，取出膜并用低盐缓冲液（100毫摩尔KCl;0.1毫摩尔EDTA及20毫摩尔Tris-HCl，pH＝8）冲洗。接着，将各片膜放入小试管内并浸于高盐缓冲液（1摩尔NaCl;0.1毫摩尔EDTA及20毫摩尔Tris-HCl，pH＝8）中，并于65℃保温1小时以从DEAE薄膜上脱下DNA。65℃保温后，收集保温缓冲液并用高盐缓冲液冲洗薄膜。合并冲洗液及保温缓冲液。之后收集所要的DNA片段。

调整高盐-DNA溶液的体积，以使NaCl浓度为0.25摩尔，之后加入3倍体积的冷无水乙醇。混合所得溶液并于-70℃放置10-20分钟。冷却后，将溶液以15，000rpm离心15分钟。再次用沉淀法除去残留的盐后，用乙醇冲洗DNA沉淀，干燥后再悬浮去20微升TE缓冲液中，制得所要的质粒pCZ106的～1.6Kb NcoⅠ-BamHⅠ和～8.7Kb NcoⅠ-NcoⅠ限制片段各～5.0微克。将所得的纯化片段分别溶解于25微升TE缓冲液中并于-20℃保存。

^＊除非另外指出，所用限制性酶和连接酶均得自New England Biolabs（32 Tozer Road，Beverly，MA01915）。

本文所用单位定义均相应于其制造商的单位定义。

C、质粒pIT335的NcoⅠ和BamHⅠ消化，编码异青霉素N合成酶的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段的分离

基本上按照实施例2B的方法，用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ消化实施例1B中制得的约25微克（相当于25微升）质粒pIT335。将得到的NcoⅠ-BamHⅠ消化的DNA上样于1%琼脂糖凝胶上，并基本上按实施例2B的方法分离所要的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段。将得到的约5微克所要的片段悬浮于25微升TE缓冲液中并于-20℃保存。

D、质粒pIT337的最后构建

使实施例2B中纯化的5微升质粒pCZ106的～1.6Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段和2.5微升～0.7Kb NcoⅠ-NcoⅠ限制片段同实施例2C中纯化的5微升质粒pIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段相连接，以产生质粒pIT337。该反应体积为30微升并含有上述各种DNA片段、1.1微升（～100单位）T₄DNA连接酶、3微升10X连接缓冲液（0.5摩尔Tris-HCl，pH＝7.8;100毫摩尔MgCl₂;200毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）;10毫摩尔ATP和1毫克/毫升BSA）以及13.4微升水。反应混合物于15℃保温2小时，其后反应即基本完成。连接好的DNA组成了要求的质粒pIT337DNA。附图3中给出了质粒pIT337的限制性酶切点及功能图。

实施例3

大肠杆菌K12RV308/pIT337的构建以及对产生异青霉素N合成酶之大肠杆菌的测定

A、大肠杆菌K12RV308/pIT337的构建

大肠杆菌K12RV308（NRRLB-15624）培养于25毫升L-培养液中，直到其O.D.590达～0.5吸收单位。培养物在冰上冷却十分钟，离心收集细胞。将沉淀的细胞重新悬浮于25毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中并于冰上保温25分钟。再次离心沉淀出细胞，沉淀的细胞再悬浮于2.5毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中并于冰上保温过夜。

200微升这种细胞悬液与实施例2D中制备的连接好的DNA混合，并于冰上保温20分钟，之后离心收集细胞。将沉淀的细胞重新悬浮于1毫升L-培养液中，于25℃保温1小时。将等分的细胞混合物铺在含有50微克/毫升卡那霉素的L-琼脂（含12克/升琼脂的L-培养液）板上，于25℃保温。通过卡那霉素抗性的选择以及对转化体质粒DNA的限制酶分析，检出大肠杆菌K12RV308/pIT337转化株。基本上按着实施例2A的方法从大肠杆菌K12RV308/pIT337转化株制得质粒DNA，但此处为小量制备，而且去掉了CsCl梯度离心的各个步骤。

B、表达异青霉素N合成酶活性之大肠杆菌K12RV308/pIT337的培养

将实施例3A中制备的大肠杆菌K12RV308/pIT337转化株的几份分离物各自接种在5毫升等分的含50微克/毫升卡那霉素的L-培养液中，将培养物置于通气震荡器中25℃保温，直到O.D.590为～0.2吸收单位。之后将培养物转入37℃空气震荡器并于37℃保温～6小时。

37℃保温6小时后，各收集1毫升培养物，离心沉淀出细胞。分别用1毫升10毫摩尔NaCl洗涤沉淀细胞，之后再悬浮于1毫升IPS提取缓冲液（0.05摩尔Tris-HCl，pH＝8.0;0.01摩尔KCl和0.01摩尔MgSO₄）中。用超声细胞破碎器（ModelW185，Heat Systems-Ultrasonics有限公司，Plain-view，Long lsland，NY）的微型插塞尖端释放6次每次5秒超声脉冲破碎细胞。每次超声脉冲之间的间隔为60秒，操作期间混合物放在冰-乙醇浴中。超声处理后，离心细胞混合物除去细胞碎片，然后上清液直接用于分析。

C、异青霉素N合成酶活性的分析

下述测定方法参照了Shen等人的方法（1984，J.of Antibiotics 37（9）：1044-1048）。

该异青霉素N合成酶分析的反应总体积为500微升。反应开始前，先以1.0毫升1.4毫摩尔的δ（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸的溶液和3.75毫摩尔DTT在室温下反应30-60分钟，以将二聚体三肽还原为单体形式。将各为50微升的下列储备液等分到各分析管（为一次性使用的无菌玻璃管，大小为10×100毫米）：500毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.4;100毫摩尔KCl;100毫摩尔MgSO₄;2.0mM FeSO₄;以及6.7毫摩尔抗坏血酸。之后，取不同量的提取物，用水稀释至150微升。向各管内加入约100微升三肽溶液;加入三肽即开始反应。加底物后振荡各试管。之后将反应混合物置于250rpm的回旋震荡器中，其中保温温度为25℃，反应时间为45分钟。

反应进行45分钟后，取出各100微升的两份样品分别加入生物分析板的孔中，并将100单位青霉素酶A加于剩余的样品中。青霉素酶A得自RiKer′s Laboratories，Inc.，该酶以每瓶100，000单位出售，用水重新水合至5.0毫升。于各反应混合物中加入5微升（100单位）重新水合的青霉素酶A，于室温反应5分钟，之后将各取100微升青霉素酶A处理的提取物分别加到生物分析板的孔内。进行青霉素酶A处理是要验证生物分析板上的色带是由于青霉素的存在，而不是由于有头孢霉素或其它污染物。

向生物分析板的各孔分别加入0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0微克青霉素N，画出青霉素N标准曲线。另外，向约200微升浓度为0.2微克/毫升的青霉素N中加入5微升青霉素酶A制剂，以检验其活性。

制备含有K131营养琼脂的生物分析板，是将30.5克BBL抗生素培养基^＃11（Beckman Dickinson & Company，Cockeysville，MD）溶解于1升去离子水中，将溶液加热至沸，冷却至70℃，之后于121℃和15磅/平方英寸的压力高压灭菌。用4毫升Micrococus luteus（ATCC9341）的新鲜过夜培养物接种于700毫升琼脂糖平板。M.luteus生长在K544培养液中，该培养液含有：5克Difco蛋白胨、1.5克Difco酵母提取物、3.5克氯化钠、3.7克磷酸氢二钾（无水的）、1.3克磷酸二氢钾;1.5克Difco牛肉提取物，溶于1升去离子水;将溶液加热至沸、冷却到25℃，用1当量HCl或1当量NaOH调至pH＝7.0，之后以121℃和15磅/平方英寸压力高压灭菌20分钟备用。将接种的琼脂分加到100×15毫米平板内，每板15毫升。用一次性使用的5毫升吸管在板上吸出小孔;每个孔直径为10毫米。

制板后，将样品分加到孔内，将板置于37℃保温箱内保温18小时。测量每个样品孔周围无菌区的直径以判定分析结果，这些无菌区的出现是由于当存在青霉素时M.luteus不能够生长。

分析结果如表Ⅱ所示。

虽然当无菌区带大小增加到21毫米以上时，分析的线性关系渐不明显，但分析结果明确表明大肠杆菌Kl2RV308/pIT337转化体可表达异青霉素N合成酶活性，而大肠杆菌K12RV308/pCZ106转化体则不能。

大肠杆菌产生的物质实际上比得自顶头孢霉的异青霉素N合成酶更为稳定。这种更好的稳定性首先是在冻融实验中观察到的。顶头孢霉异青霉素N合成酶活性经反复冷冻和反复融解而很快失活，但本发明中大肠杆菌产生的异青霉素N合成酶活性则对冷冻和融溶有很好的抗力。

这种更好的稳定性可能是由于顶头孢霉在酶的加工上与大肠杆菌有所不同。例如，由顶头孢霉中分离的异青霉素N合成酶并不含有氨基末端前两个氨基酸残基（即蛋氨酸和甘氨酸，但其编码在顶头孢霉异青霉素N合成酶活性的编码DNA中，并且也存在于本发明的大肠

杆菌产生的酶中。如Tsunasawa等人（1985，J.of Biol.Chem.260（9）：5382-91）所公开的，大肠杆菌产生一种肽酶，当蛋白质肽链上氨基末端蛋氨酸后面的氨基酸残基有一小的侧链时，则肽酶切断该残基。在IPS蛋白中，氨基末端蛋氨酸后面为一个甘氨酸残基，所以氨基末端蛋氨酸被切断。

纵观大肠杆菌产生的异青霉素N合成酶有更好的稳定性以及有不同的氨基酸残基序列，本发明也包括一种新颖的蛋白质：即大肠杆菌产生的异青霉素N合成酶。

实施例4

质粒pPS20的构建

A、HindⅢ消化的质粒pIT335的制备

将实施例1B中制备的5微升（相当于5微克）质粒pIT335DNA加到5微升10X HindⅢ反应缓冲液（500毫摩尔NaCl，500毫摩尔Tris-HCl，pH＝8.0;100毫摩尔MgCl₂和1毫克/毫升BSA）、5微升（～50单位）限制性酶HindⅢ和35微升H₂O中，并混合之。所得反应混合物于37℃保温4小时。经HindⅢ消化的质粒pIT335DNA用酚提取一次，再用CHCl₃提取一次。提取后，将HindⅢ消化的质粒pIT335DNA用NaCl调到0.25摩尔，用两倍体积的无水乙醇稀释，在干冰-乙醇浴中冷却，之后离心收集沉淀的DNA。将如此得到的～5微克HindⅢ消化的质粒pIT335DNA溶解于10微升TE缓冲液中并于-20℃保存。

B、质粒pIT221的HindⅢ消化，以及包含有潮霉素抗性基因的质粒pIT221之～2.7Kb HindⅢ限制片段的分离

欧洲专利公告177243中公开了转化顶头孢霉的载体及条件。欧洲专利公告177243的构建流程1-6和实施例1-6列为本文的参考文献，其中公开了质粒pIT221的构建。附图4中提供了质粒pIT221的限制性酶切点及功能图。

基本上按照本申请实施例1的方法由大肠杆菌K12JA221/pIT221中分离质粒pIT221。基本上依据实施例4A的方法，用100微升1×HindⅢ反应缓冲液含100单位限制性酶HindⅢ消化约50微克质粒pIT221。依照实施例4A的方法提取、沉淀并重新溶解HindⅢ消化的质粒pIT221DNA后，将该DNA上样于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。所要的质粒pIT221的～2.7Kb HindⅢ限制片段包含酵母Saccharo-myces cerevisiae磷酸甘油酸激酶转录和翻译活化序列并编码潮霉素抗性磷酸转移酶，按照实施例2B的相似的方法在凝胶上将该片段与其它消化产物分开并纯化之。

用上述方法分离出约5微克要求的～2.7Kb HindⅢ限制片段。将所得的纯化片段溶解于10微升TE缓冲液中并于-20℃保存。

C、质粒pPS20的最后构建

基本上按照实施例2C的方法，用100单位T₄DNA连接酶，使大约1微升实施例4A中制备的HindⅢ消化的质粒pIT335DNA与4微升实施例4B中制备的质粒pIT221的～2.5KbHindⅢ限制片段，在30微升连接缓冲液中连接。经连接的DNA即构成预期的质粒pPS20。附图5中给出了质粒pPS20的限制性酶切点和功能图。

～2.7Kb HindⅢ限制片段可以两个方向插入质粒pIT335中，所以该连接的DNA也构成另一个质粒，即质粒pPS20.1。质粒pPS20.1功能上相等于质粒pPS20，质粒pPS20.1只是在～2.7Kb HindⅢ限制片段的方向上与质粒pPS20不同。

D、大肠杆菌K12JA221/pPS20的构建以及质粒ppPS20DNA的分离

50微升大肠杆菌K12JA221（NRRLB-15211）的培养物在L-培养液中生长至O.D.590约为0.2。培养物在冰中冷却10分钟，离心收集细胞。将沉淀的细胞重新悬浮于25毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中并在冰上保温25分钟。离心再次得到细胞沉淀，将细胞沉淀再悬浮于2.5毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中，并在冰中保温过夜。

使200微升这种细胞悬液与实施例4C中制备的连接好的DNA混合，并在冰中保温20分钟。之后将混合物于40℃保温2分钟，再于室温保温10分钟。向细胞混合物内加入3毫升L-培养液，之后在通气震荡器中37℃保温2小时。

将细胞混合物的等分样品铺在含100微克/毫升氨苄青霉素的L-琼脂（L-培养液加有15克/升琼脂）板上，之后将平板于37℃保温。通过对氨苄青霉素抗性转化体之质粒DNA的限制酶分析，检出大肠杆菌K12JA221/pPS20转化株。大致按照实施例1的方法由大肠杆菌K12JA221/pPS20和大肠杆菌K12JA221/pPS20.1转化体得到质粒DNA，但不同只是提取量较小，且去掉了CsCl梯度步骤。

实施例5

质粒pPS21的构建

A、质粒pIT335DNA的NcoⅠ消化和Klenow处理，所得编码顶头孢霉转录和翻译活化序列的～0.85Kb片段的分离

将实施例1中制备的约50微升（相当于50微克）质粒pIT335DNA加到10微升10×BamHⅠ缓冲液、5微升（～50单位）限制性酶NcoⅠ、以及35微升水中并混匀之。所得反应混合物于37℃保温4小时。之后将反应混合物调到NaCl成0.25摩尔，用两倍体积无水乙醇稀释，在干冰-乙醇浴中冷却10分钟，离心沉淀的DNA。

将NcoⅠ消化的质粒pIT335DNA沉淀溶解于50微升1×Klenow缓冲液（40毫摩尔磷酸钾缓冲液，pH＝7.5;6.6毫摩尔MgCl₂;1.0毫摩尔2-巯基乙醇;33微摩尔dATP;33微摩尔dCTP;33微摩尔dGTP和33微摩尔TTP）中。向该DNA内加入2微升（～10单位，New England Bio-labs）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（即Klenow）并混合之，所得反应混合物于16℃保温1小时。经缓冲的酚提取终止反应。

之后将NcoⅠ消化的、Klenow处理过的质粒pIT335 DNA上样于1%琼脂糖凝胶进行电泳分离。由凝胶中分离含IPS基因之顶头孢霉转录和翻译活化序列的～0.85Kb限制片段并纯化之，操作基本上同实施例2B。得到约4微克预期得到的片段，并将其悬浮于10微升TE缓冲液中。

B、中间体质粒pPS19的构建

将1微克质粒pIT221DNA溶解在5微升10×XmaⅠ缓冲液（250毫摩尔NaCl;60毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.5;60毫摩尔2-巯基乙醇和1毫克/毫升BSA）、43微升H₂O和2微升（～10单位）限制性酶XmaⅠ内。将所得反应混合物于37℃保温4小时。经酚提取终止反应。用CHCl₃进一步提取Xma-Ⅰ反应混合物后，将调整反应混合物的NaCl至0.5摩尔，用2倍体积无水乙醇稀释，在干冰-乙醇浴中冷却10分钟沉淀之，离心得到XmaⅠ处理的质粒pIT221DNA沉淀物。

将XmaⅠ消化的质粒pIT221DNA重新溶解在100微升含500单位T₄DNA连接酶的1×连接缓冲液中。连接反应混合物于12℃保温～16小时，之后大致按实施例4D的方法用于转化大肠杆菌K12JA221。通过对转化体质粒DNA的限制酶分析鉴定抗氨苄青霉素的质粒pPS19转化体。基本上按照实施例1的方法制备质粒pPS19DNA。附图6中给出了质粒pPS19的限制性酶切点和功能图。

C、质粒pPS19DNA的BamHⅠ消化和Klenow处理，～7.7Kb片段的分离

按照实施例4A的方法用限制性酶BamHⅠ消化并用Klenow处理50微克质粒pPS19DNA，不同的是用BamHⅠ限制性酶，而不是用NcoⅠ限制性酶消化质粒pPS19DNA。将经过Bam-HⅠ消化的、Klenow处理过的质粒pPS19DNA上样于1%琼脂糖凝胶上，大体上按照实施例2B的方法分离并纯化～7.7Kb片段。结果得到约5微克预期的片段，将其溶解于10微升TE缓冲液并于-20℃保存。

D、质粒pPS21的最后构建

2微升实施例5A中制备的～0.85Kb片段与2微升实施例5C中制备的～7.7Kb片段，在30微升含500单位T₄DNA连接酶的1×连接缓冲液中连接。连接反应于12℃保温16小时，连接的DNA即构成预期的质粒pPS21DNA。

E、大肠杆菌JA221/pPS21的构建

大体上按照实施例4D的方法，用实施例5D中制备的连接好的DNA转化大肠杆菌K12JA221。通过对转化体质粒DNA的限制酶分析，筛选存在有质粒pPS21的抗氨苄青霉素转化体。因为～0.8Kb片段能以两个方向之一插入质粒pPS19的～7.7Kb片段中，又因为只有一个方向才能正确定位表达潮霉素抗性基因的顶头孢霉转录和翻译活化序列，所以只有大约一半的转化体是预期的大肠杆菌K12JA221/pPS21。基本上按照实施例1的方法，用一个这样的大肠杆菌K12JA221/pPS21转化体制备质粒pPS21DNA。

实施例6

用质粒pPS20和pPS21遗传转化顶头孢霉

1984年9月27日提交的美国专利申请654，919号中公开并权利要求了下述转化方法。

A、顶头孢霉菌株

用于转化的优选头孢霉菌株得自美国典型培养物保藏中心（Ro-ckville，Maryland），登记号为ATCC11550。为改善头孢菌素C的生产通过突变、选择或遗传繁殖由ATCC 11550得到其它头孢霉菌株或任何商品菌株，均适用于制备具有本发明之载体和质粒的转化体。

B、细胞培养的接种物的制备

为了有效地遗传转化顶头孢霉细胞，必须除去细胞壁以得到稳定的原生质体。制备这种原生质体时，以一种均一的接种物开始是十分有利的。否则，培养物中的细胞制备便不能繁殖，并且由于细胞的量不足或不适用而浪废了制备头孢霉原生质体的时间。

C、用于细胞培养的均一接种物的制备

将或是冻干的或是在液氮中储存并于室温下融解的一安瓶孢子（在1.5毫升防腐溶媒（5%乳糖、10%甘油和0.1%吐温80）中约10⁹个分生孢子），稀释在5毫升无菌盐水中。以0.1毫升这种悬液接种含有20毫升Trypticase

-Soy琼脂（BBL^TM，Division of Becton，Dickinson & Company，Coc-keysville，Maryland 21030）培养基的近50个斜面。接种前先使培养基干燥直到表面不再有可见的湿气。接种的斜面于25℃保温约4天。向覆盖于各斜面培养基表面的菌丝体生长物内加入约10毫升防腐溶媒。旋转各斜面以悬浮分生孢子，由各斜面收集分生孢子悬液并以10毫升分装冻存于-80℃。冷冻的分生孢子悬液慢慢失去存活力，并且在-80℃储存约三个月后便不能使用。

D、制备原生质体用的细胞的生长

用实施例6C中制备的10毫升冷冻的分生孢子悬液中的细胞接种500毫升震荡培养瓶中的约106毫升水培养基。离心（10分钟×2600rpm）得到细胞，之后直接悬浮于水培养基中。制成悬液前必须倾去上清，因为乳糖和甘油可反而影响细胞的生长。将含有悬浮之细胞的培养瓶置于迥旋水浴震荡器上，并以285rpm（1英寸旋距）于29～30℃保温24小时。对于制备可转化的原生质体来说，在培养阶段优先推荐使用29-30℃的温度，但也可用约25℃这一较低的温度。本领域内的技术人员会理解到，29-30℃不同于为生产抗生素目的培养顶头孢霉所优选的温度（25℃）。

^＊水培养基制备方法如下：将100毫升A溶液分装于500毫升震荡培养瓶内;用商品封闭物盖好培养瓶，并以121℃高压灭菌20分钟。之后向A溶液内加入2毫升B溶液和4毫升C溶液，以制成水培养基。

A溶液：蔗糖，36克/升;L-冬酰胺，7.5克/升;KH₂PO₄，15克/升;K₂HPO₄，21克/升;Na₂SO₄，75克/升;MgSO₄·7H₂O，0.18克/升;CaCl₂，0.06克/升;盐溶液，1毫升/升;中性pH。盐溶液：Fe（NH₄）（SO₄）₂·6H₂O，15克/升;MnSO₄·4H₂O，3克/升;ZnSO₄·7H₂O，3克/升;CuSO₄·5H₂O，0.8克/升）。

B溶液：葡萄糖，108克/升（121℃高压灭菌20分钟）。

C溶液：蔗糖，25克/升;玉米浸泡液的浓缩液（4%W/V氮），12.5毫升;醋酸铵，5.5克/升;CaCO₃，5克/升;用KOH将pH调至6.5;并以121℃高压灭菌20分钟。

E、头孢霉原生质体的制备

吸滤（Whatman^＃1滤纸，Buchner漏斗）收获经24小时培养的细胞，并悬浮于已加入了浓度为0.01摩尔的二硫苏糖醇的Mcllvaine氏缓冲液（pH＝7.1）（0.1摩尔柠檬酸和0.2摩尔磷酸氢二钠）中。加入足够的缓冲液使细胞终浓度为每20毫升缓冲液含1克细胞（吸滤后称重）。将加在50毫升震荡培养瓶内的细胞悬液放在迥旋水浴震荡器上，于29-30℃以140rpm（1英寸旋距）保温90分钟。用水洗涤二硫苏糖醇处理过的细胞，之后悬于酶溶液（25毫克/毫升β-葡糖苷酸酶（Sigma化学公司）于Mellvaine氏缓冲液（pH6.35）中，并另加有0.8摩尔NaCl和0.02摩尔MgSO₄）中。细胞终浓度为每10毫升酶溶液含1克处理过的细胞。将细胞悬液置于迥旋水浴震荡器上，于29-30℃以120rpm（1英寸旋距）保温3小时。用4倍体积洗涤溶液（0.8摩尔NaCl和0.02摩尔MgSO₄）稀释原生质体的悬浮液，之后通过两层纸巾重力过滤。于室温2600rpm将含原生质体的滤液离心5分钟。倾去上清液，将沉淀的原生质体悬浮于10毫升洗涤溶液中。洗涤过程重复两次后，再将原生质体悬浮于足够的0.8摩尔NaCl，经血细胞计数器计数，使其浓度达到每毫升含2-3×10⁸原生质体。

F、转化方法

为使每个质粒转化，将悬浮于0.8摩尔NaCl的1毫升头孢霉原生质体（2-3×10⁸/毫升）悬液加到0.005毫升新蒸馏的过DMSO中，之后使CaCl₂达80毫摩尔。将大约20微升转化质粒（根据所作转化不同，可以是pPS20或pPS21）和聚乙二醇（Baker，溶于水中，大于20%，浓度，W/V）加到原生质体的悬液中，使混合物体积达到10毫升。混合物于室温保温10分钟之后以700rpm离心5分钟，再以2500rpm离心10分钟。将沉淀的原生质体悬浮于1毫升0.8摩尔NaCl中。将等分（0.1毫升）悬浮液加到Trypticase-Soy琼脂培养基（BBL）的表面（该培养基富含10.8%蔗糖，以稳定原生质体保持渗透平衡）。Petri氏培养皿于15℃保温24小时后，向各培养皿内加入4毫升含0.8摩尔氯化钠和足够潮霉素的液化琼脂（0.41%W/V，42℃）。使潮霉素终浓度达到100微克/毫升。待全面固化后，将培养皿置于湿气箱中25℃保温。使转化菌落大小长到足够进行传代培养须12天，但对于生长较慢的转化体，则要用长达60天的时间才能使菌落大小适于传代。很容易将不稳定转化体同稳定转化体区分开，因为不稳定转化体传代培养时不能在含有100微克/毫升潮霉素的新鲜培养基上生长。

G、对顶头孢霉/pPS20和顶头孢霉/pPS21转化体的分析

顶头孢霉/pPS20转化体可比控制质粒（如质粒pIT221）的顶头孢霉转化体表达明显较高水平的异青霉素N合成酶活性。这是由于无论在发酵中还是在顶头孢霉/pPS20转化体的细胞提取物中。均增加了转化体产生异青霉素N的能力。

顶头孢霉/pPS21转化体具有潮霉素抗性，这表明本发明的顶头孢霉转录和翻译活化系列是有功能活性的。

实施例7

质粒pPS21A、pPS22、pPS23、pPS23.1、pPS24、pPS25和pPS25.1的构建

A、中间体质粒pPS23和pPS23.1的构建

（ⅰ）BamHⅠ消化的质粒pUC8的制备

约5微克质粒pUC8（得自Pharmacia P-L Bioche-micals公司）溶解于5微升10×BamHⅠ反应缓冲液和40微升H₂O中。向DNA的溶液内加入约5微升（50单位）限制酶BamHⅠ，所得反应混合物于37℃保温2小时。用缓冲液饱和的酚提取而终止反应，之后再用氯仿提取。将NaCl浓度调到0.25摩尔，加2倍体积乙醇并于-70℃冷却10分钟，使BamHⅠ处理的质粒pUC8DNA沉淀。离心收集BamHⅠ消化的质粒pUC8DNA并重新悬浮于5微升水中。

（ⅱ）质粒pIT335之～0.85Kb NcoⅠ限制片段的分离

将大约10微升质粒pIT335溶解于5微升10×BamHⅠ缓冲液和40微升H₂O中。向DNA的溶液内加入约5微升（50单位）限制酶NcoⅠ，所得反应混合物于37℃保温2小时。之后将反应混合物上样于1%琼脂糖凝胶上，基本上按照实施例2B的方法分离含有IPS基因之转录和翻译活化序列的预期的～0.85Kb NcoⅠ限制片段。得到约1微克所要的片段并悬浮于5微升水中。

（ⅲ）用于构建质粒pPS23的连接子的制备

下列连接子的单链是用自动DNA合成仪合成的：

5'-CATGAAGAAG-3'

||||||

3'-TTCTTCCTAG-5'

约75微微摩尔的每条单链分别溶解在23.5微升水和2.5微升连接酶缓冲液中。向各单链DNA的溶液内加入约1微升（10单位）T₄DNA激酶（Bethesda Research实验室），反应于37℃保温10分钟。接着激酶反应后，将反应混合物于70℃保温15分钟。之后使单链DNA复性成连接子，收集合併两反应混合物，于65℃保温10分钟，室温保温2小时，之后于4℃保温过夜。

（ⅳ）质粒pPS23和pPS23.1的最后构建

将1微升BamHⅠ消化的质粒pUC8DNA加到4微升质粒pIT335的～0.85Kb NcoⅠ限制片段和10微升复性之连接子的混合物中。向该DNA混合物内加入约4微升10×连接酶缓冲液、2微升（500单位）T₄DNA连接酶和29微升H₂O，所得反应混合物于4℃保温过夜。连接了的DNA即构成了预期的质粒pPS23和pPS23.1。

50毫升大肠杆菌K12JM109的培养物（得自Pharma-cia P-L Biochemicals）于L-培养液中生长至O.D.590约接0.5吸收单位。培养物在冰中冷却10分钟，离心收集细胞。沉淀的细胞再悬浮于25毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中并于冰中保温25分钟。再次离心得到沉淀细胞，将沉淀细胞重新悬浮于2.5毫升冷的100毫摩尔CaCl₂中并于冰中保温过夜。

以200微升细胞悬液与如上制备的连接的DNA混合并于冰中保温20分钟。20分钟后，将细胞置于42℃水浴中2分钟，之后转到冰中再保温10分钟。离心收集细胞并重新悬浮于1毫升L-培养液内，37℃保温2小时。

将等分的细胞混合物铺板于含有100微克氨苄青霉素/毫升、40微克X-凝胶/毫升和40微克IPTG/毫升的L-琼脂（每升L-培养液含15克琼脂）板上。平板于37℃保温过夜。这些板上，含有不带插入片段之质粒的菌落，如大肠杆菌K12JM109/pUC8显现蓝色;而含有携带插入片段之质粒的菌落，如大肠杆菌K12JM109/pPS23则显白色。收集几个白色菌落，通过对其质粒DNA的限制性酶分析，以鉴定质粒中含IPS活化序列的～0.85Kb BamHⅠ限制片段的存在。大体上按照实施例2A的方法由大肠杆菌K12JM109/pPS23和大肠杆菌K12JM109/pPS23.1细胞制得质粒DNA。

B、质粒pPS23之～0.85Kb BamHⅠ限制片段的分离

约50微克质粒pPS23DNA溶解于15微升10X BamHⅠ反应缓冲液和125微升H₂O中。向DNA的溶液内加入大约10微升（100单位）限制酶BamHⅠ，所得反应混合物于37℃保温2小时。将BamHⅠ消化的质粒pPS23DNA上样于1%琼脂糖凝胶上，基本上参照实施例2B的方法分离含IPS基因之活化序列的～0.85Kb BamHⅠ限制片段。得到约5微克预期的片段并将其悬浮于10微升水中。

C、BamHⅠ消化的质粒pPS19DNA的制备

约5微克质粒pPS19DNA溶解在10微升10X BamHⅠ反应缓冲液和35微升H₂O中。向质粒pPS19DNA的溶液内加入约5微升（50单位）限制酶BamHⅠ，所得反应混合物于37℃保温2小时。用缓冲液饱和的酚提取BamHⅠ消化的质粒pPS19DNA的反应混合物一次，然后再用酚提取两次。沉淀DNA，离心收集并重新悬浮于10微升H₂O中。

D、质粒pPS21A、pPS22、pPS24、pPS25和pPS25.1的最后构建

将大约1微升～0.86Kb BamHⅠ限制片段加到1微升BamHⅠ消化的质粒pPS19DNA、3微升10X连接酶缓冲液、2微升T₄DNA连接酶和23微升H₂O中。将所得连接反应混合物于15℃保温过夜。连接了的DNA即构成预期得到的质粒pPS21A、pPS22、pPS24、pPS25和pPS25.1。

大体上按照实施例7A（ⅳ）中所述的方法，用连接的DNA转化大肠杆菌K12C600（得自美国典型培养物保藏中心，Roc-kville，MD20852，登记号ATCC33525）。将转化了的细胞在含有100微克/毫升氨苄青霉素的L-琼脂板上铺板，之后于37℃保温过夜。

由转化平板上择取若干单个菌落，培养并用以制备质粒DNA。通过限制性酶分析法对质粒DNA进行分析。下表说明适当的限制性酶消化可用于区分各质粒。

质粒酶片段的大小（Kb）

pPS19 BamHⅠ 7.62和0.23

PstⅠ 5.15、1.85和0.85

pPS21A BamHⅠ 7.62和0.85

PstⅠ 5.15、1.85、0.99和0.49

pPS22 BamHⅠ 7.62和0.85

PstⅠ 5.15、1.85、0.94和0.54

pPS24 BamHⅠ 7.62

pst1 7.62

pPS25和 BamHⅠ 5.15、1.85、0.99和0.72

pPS25.1 Pst1 7.62、0.85和0.23

附图8和9中分别给出了质粒pPS21A和pPS25的限制性酶切点及功能图。

基本上按照实施例6的方法用质粒pPS21A、pPS25.1和pPS25转化顶头孢霉。顶头孢霉/pPS21A、顶头孢霉/pPS25.1和顶头孢霉/pPS25是抗潮霉素的。也可用质粒pPS22和pPS24转化顶头孢霉，但是这些质粒转化的顶头孢霉表现有潮霉素抗性的转化频率比用质粒pPS21A、pPS25.1和pPS25转化时低得多，这大概是因为质粒pPS22和pPS24必须于适当的位置整合到顶头孢霉基因组中去，以使基因组的顶头孢霉活化序列能驱动潮霉素抗性基因的表达。

实施例8

质粒pPS28和pPS29的构建

将大约20微升质粒pPS21A DNA溶解于10微升10X PstⅠ反应缓冲液（1.0摩尔NaCl;100毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.5;100毫摩尔MgCl₂和1毫克/毫升BSA）和88微升H₂O中。向DNA的溶液内加入大约2微升（150单位）限制酶PstⅠ，反应混合物于37℃保温4分钟，之后于70℃保温10分钟以终止反应。将部分PstⅠ消化的质粒pPS21A DNA上样于琼脂糖凝胶上，电泳后将凝胶染色，然后观察到片段有：8.5Kb（线状质粒）;8.0Kb;7.5Kb;7.0Kb;6.6Kb;6.1Kb;5.2Kb;3.3Kb;2.3Kb;1.9Kb;1.5Kb;1.0Kb和0.5Kb。大体上按照实施例2B的方法各自分离～6.6Kb和～6.1Kb PstⅠ限制片段;各片段回收到约0.5微克。

将～6.6Kb PstⅠ限制片段溶解在3微升10X连接酶缓冲液及25微升H₂O中。向DNA的溶液内加入约2微升T₄DNA连接酶，将所得反应混合物于15℃保温过夜。连接了的DNA即构成所要的质粒pPS28 DNA，大体上按实施例7的方法以其转化大肠杆菌K12C600。以相似方式通过连接使～6.1Kb PstⅠ限制片段成环，产生质粒pPS29，其也被用于转化大肠杆菌K12C600。附图10和11中分别给出了质粒pPS28和pPS29的限制性酶切点及功能图。

用质粒pPS28和pPS29按实施例6的方法转化顶头孢霉。顶头孢霉/pPS28和顶头孢霉/pPS29转化体表现了抗潮霉素表型，而且质粒pPS28和质粒pPS29DNA以高频率转化顶头孢霉产生潮霉素抗性。

实施例9

质粒pPS26和pPS26.1的构建

约20微克质粒pPS21A溶解于10微升10X HindⅢ反应缓冲液及85微升H₂O中。向DNA的溶液内加入大约5微升（50单位）的限制酶HindⅢ，将所得反应混合物于37℃保温2小时。将HindⅢ消化的质粒pPS21A DNA上样于1%琼脂糖凝胶上并进行电泳分离，直到在凝胶上清楚地分离出～3.45Kb、～3.16Kb、～1.2Kb和～0.69Kb HindⅢ限制片段。按照实施例2B的方法分离～3.45Kb限制片段。结果得到约5微克预期的～3.45Kb HindⅢ限制片段，将其悬浮于10微升H₂O中。

将大约2微升质粒pPS21A的～3.45Kb HindⅢ限制片段加到1微升实施例4A中制备的HindⅢ消化的质粒pIT335、3微升10X连接酶缓冲液、22微升H₂O及2微升T₄DNA连接酶的混合物中。所得连接反应混合物于15℃保温过夜。连接的DNA即构成预期得到的质粒pPS26和pPS26.1。按实施例7的方法将连接的DNA用于转化大肠杆菌K12C600。借助其抗氨苄青霉素表型和对其质粒DNA的限制性酶分析鉴定大肠杆菌K12C600/pPS26和大肠杆菌K12C600/pPS26.1。附图12中给出了质粒pPS26的限制性酶切点及功能图。

按实施6的方法用质粒pPS26和pPS26.1转化顶头孢霉。质粒pPS26和pPS26.1以高频率转化顶头孢霉成为抗潮霉素转化体，且顶头孢霉/pPS26和顶头孢霉/pPS26.1转化体比未经它们转化的菌株能产生显著多的异青霉素N（如通过Micrococcus Iuteus的生长抑制带测定的）。

实施例10

质粒pPS30、pPS30.1、pPS31和pPS31.1的构建

A、质粒pPS6之～3.7Kb XmaⅠ限制片段的分离

美国专利申请654919（代理人案号X-6570，85年9月27日申请）72-75页实施例13中公开并权利要求了质粒pPS6，该申请列入本文参考文献。将大约10微升质粒pPS6溶解于20微升10X XmaⅠ反应缓冲液（250毫摩尔NaCl;100毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.5;100毫摩尔MgCl₂;100毫摩尔2-巯基乙醇和1毫克/毫升BSA）和165微升H₂O中。向质粒pPS6DNA的溶液内加入约15微升（30单位）的限制性酶XmaⅠ，并将所得反应混合物于37℃保温4小时。

将XmaⅠ消化的质粒pPS6 DNA上样于1%琼脂糖凝胶上并作电泳分离，直到将～3.7Kb XmaⅠ限制片段同其它消化产物明显分开。之后按实施例2B的方法分离～3.7Kb XmaⅠ限制片段。结果得到约5微克预期的～3.7Kb XmaⅠ限制片段并将其悬浮于10微升H₂O中。

B、质粒pPS30和pPS30.1的最后构建

将大约1微升质粒pPS21A DNA溶解在2微升10X XmaⅠ反应缓冲液和6微升H₂O中。向质粒pPS21A DNA的溶液内加入大约2微升（6单位）限制酶XmaⅠ，所得反应混合物于37℃保温4小时。用缓冲液饱和的酚提取而终止反应，再用氯仿提取2次。之后沉淀、离心收集反应混合物，并重新悬浮于23微升H₂O中。

向XmaⅠ消化的质粒pPS21A DNA的溶液内加入约2微升质粒pPS6的～3.7Kb XmaⅠ限制片段、3微升10X连接酶缓冲液和2微升T₄DNA连接酶，将所得连接反应混合物于15℃保温过夜。经连接的DNA即构成预期得到的质粒pPS30和pPS30.1，两者区别只是～3.7Kb XmaⅠ限制片段插入的方向不同。

将连接好的DNA用于转化大肠杆菌K12 600，转化方法基本上同实施例7。根据转化体的氨苄青霉素抗性表型和对其质粒DNA的限制性酶分析鉴定大肠杆菌K12 600/pPS30和大肠杆菌K12C600/pPS30.1转化体。

也可用质粒pPS30和pPS30.1转化顶头孢霉。顶头孢霉/pPS30和顶头孢霉/pPS30.1转化体是抗潮霉素的。

C、质粒pPS31和质粒pPS31.1的最后构建

大体上按照实施例10B的方法将构建完成的质粒pPS31和pPS31.1转化到大肠杆菌K12C600和顶头孢霉中去，不同的只是构建中使用质粒pPS29而不是质粒pPS21A作为起始材料。

实施例11

质粒pPS27的构建

A、质粒PIT336的构建

将约1微克质粒PUC8溶解在2微升10X BamHⅠ反应缓冲液和16微升H₂O中。向质粒pUC8 DNA的溶液内加入约2微升（20单位）限制性酶BamHⅠ，将所得反应混合物于37℃保温2小时。沉淀、离心收集BamHⅠ消化的质粒pUC8 DNA，并将其重新悬浮于2微升10X SalⅠ反应缓冲液（1.5摩尔NaCl;60毫摩尔Tris-HCl，pH＝7.9;60毫摩尔MgCl₂;60毫摩尔2-巯基乙醇和1毫克/毫升BSA）和16微升H₂O中。向BamHⅠ消化的质粒PUC8 DNA的溶液内加大约2微升（20单位）的限制酶SalⅠ，将所得反应混合物于37℃保温2小时。用酚提取而终止反应，随后再用氯仿提取两次。沉淀SalⅠ-BamHⅠ消化的质粒pUC8 DNA，离心收集并重新悬浮于5微升H₂O中。

将大约10微克质粒pIT335溶解于10微升10X BamHⅠ反应缓冲液和80微升H₂O中。向质粒pIT335 DNA的溶液内加限制酶XhoⅠ和BamHⅠ各5微升（50单位），将所得反应混合物于37℃保温2小时。之后将反应混合物上样于1%琼脂糖凝胶上电泳，直到将～1.4Kb BamHⅠ-XhoⅠ限制片段同其它反应产物（即5.6Kb、1.3Kb和0.01Kb片段）分开。大体上按照实施例2B的方法分离出含有IPS基因之转录终止和mRNA多聚腺苷酸化及加工信号的～1.4Kb BamHⅠ-XhoⅠ限制片段。结果得到大约2微克预期的片段并将其悬浮于5微升H₂O中。

将5微升SalⅠ-BamⅠ消化的质粒PUC8加到2微升质粒PIT335的～1.4Kb BamⅠ-XhoⅠ限制片段、3微升10X连接酶缓冲液、18微升H₂O和2微升T₄DNA连接酶中。将所得反应混合物于15℃保温过夜。SalⅠ和XhoⅠ交错部分在连接时是兼容的，但一经连接，SalⅠ和XhoⅠ都不能在连接处切断DNA。经连接的DNA即构成预期的质粒pIT336，并可大体上按照实施例7A（ⅳ）的方法用以转化大肠杆菌K12RR1△M15（得自NRRL，寄存登记号为NRRLB-15440）。将经过转化的细胞在含有100微克/毫升氨苄青霉素、40微克/毫升X-gal及40微克/毫升IPTG的L-琼脂板上铺板。将培养的转化板上没有显示蓝颜色的菌落用于制备质粒DNA，通过限制性酶分析法分析该质粒DNA，以鉴定大肠杆菌K12RR1△M15/pIT336转化体。附图14中给出了质粒pIT336的限制性酶切点及功能图。

B、质粒pPS35的构建

将大约2微升质粒pIT336溶解在2微升10X PstⅠ反应缓冲液和17微升H₂O中。向PIT336 DNA的溶液内加大约1微升（10单位）限制性酶PstⅠ，所得反应混合物于37℃保温2小时。通过用酚提取而终止反应，随后再用氯仿提取两次。沉淀Pst1消化的质粒pIT336 DNA，离心收集并将其重新悬浮于86微升H₂O中。

将大约10微升10X连接酶缓冲液和4微升T₄DNA连接酶加到质粒pIT336DNA的溶液内，所得反应混合物于15℃保温过夜。如此连接的DNA即构成了预期的质粒pPS 35，并将其用于转化大肠杆菌K12JA221（得自NRRL，寄存登记号为NRRL B-15211），转化方法基本上同实施例7A（ⅳ）的方法。将转化的细胞在含有100微克/毫升氨苄青霉素的L-琼脂板上铺板。分离出几个抗氨苄青霉素的菌落，并用来制备质粒DNA。通过对其质粒DNA的限制性酶分析鉴定所要的大肠杆菌K12JA221/pPS35转化体。附图15中给出了质粒pPS35的限制性酶切点及功能图。

C、质粒pPS27的最后构建

将大约2微克质粒pPS35溶解于2微升10X HindⅢ反应缓冲液和17微升H₂O中。向质粒pPS35 DNA的溶液内加约1微升（10单位）限制酶HindⅢ，所得反应混合物于37℃保温2小时。用酚提取而终止反应，之后再用氯仿提取两次。沉淀并离心收集HindⅢ消化的质粒pPS35 DNA，将其重新悬浮于3微升10X连接缓冲液和23微升H₂O中。

将基本上按照实施例9的方法，用质粒pPS29代替质粒pPS21A作起始材料制备并分离得到的大约2微升质粒pPS29的～2.3Kb HindⅢ限制片段（其含有由IPS基因之活化序列驱动的潮霉素抗性基因）和2微升T₄DNA连接酶加入到HindⅢ消化的质粒pPS35 DNA的溶液内。所得反应混合物于15℃保温过夜。连接的DNA构成了预期的质粒pPS27，并用其按实施例11B的方法转化大肠杆菌K12JA221。

培养抗氨苄青霉素的转化体并用以制备质粒DNA，这些转化体业经限制性酶分析法分析，鉴定为预期的大肠杆菌K12JA221/pPS27转化体。只有以一个方向插入的～3.45Kb HindⅢ限制片段才产生了预期的质粒pPS27。附图12中给出了质粒pPS27的限制性酶切点和功能图。

质粒pPS27可以高频率转化顶头孢霉成为抗潮霉素的表型。顶头孢霉/pPS27转化体基本上是按照实施例6的方法制备的。

Claims

1、一个当其在某种微生物体内复制时编码异青霉素N合成酶的重组DNA载体。

2、根据权利要求1的载体，其为质粒PIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段。

3、根据权利要求1或2的载体，其中权利要求的是：

（1）.编码异青霉素N合成酶的一种DNA复合物。

（2）.根据权利要求1的DNA复合物，其为质粒PIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段。

（3）.根据权利要求1的DNA复合物，其中编码链的序列是

5′-ATG GGT TCC GTT CCA GTT CCA GTG GCC AAC GTC CCC CGA

ATC GAT GTC TCG CCC CTA TTC GGC GAT GAC AAG AAG

CTC GAG GTA GCT CGC GCC ATC GAC GCC GCA TCG ACA

GGC TTC TTT TAC GCG GTG AAC CAC GGT GTC GAC TGG

CTC TCG CGC GAG ACG AAC AAA TTC CAC ATG AGC GAC

GAG GAG AAG TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC GAG

CAC GAG TCC CAG ATC CGG GCG GGC TAC TAC CTG CCG

GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG TCC

TTC AGC CCA GAC CAC CCG CGA ATC AAG GAG CCC ATG

CAC GAG GTC AAC GTC TGG CCG GAC GAG GCG AAG GGG

TTC CGG GCC TTC GCC GAG AAG TAC TAC TGG GAC GGC

CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC GGC TAC GCT CTC GGT

CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC TCC CGC ACG

ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC ATC CGT TAC CCG GAC

CCG TAC CCG GAG CCG GCC ATC AAG ACG GCC GAC ACC

AAG CTC AGC TTC GAG TGG CAC GAG GAC GTG TCCACG

GTG TTG TAC CAG TCC GAC GTG CAG AAT CTG CAG ACC

CCG CAG GGC TGG CAG GAC ATC CAG GCT GAC GAC TTC

CTC ATC AAC TGC GGC AGC TAC ATG GCC CAT ATC GAC

TAC TAC CCG GCC CCG ATC CAC CGC GTC AAA TGG GAG

GAG CGC CAG TCA CTG CCC TTC TTC GTC AAC CTG GAG

GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC GGG

GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC GGA

GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAT

GGT CAG ACC TAA-3′

其中A是脱氧腺苷、G是脱氧鸟苷、C是脱氧胞苷、T是胸苷。

4、根据权利要求1、2或3的载体，其为一种质粒。

5、根据权利要求4的载体，其为质粒pIT335或pIT337。

6、根据权利要求5的载体，其为质粒pIT335。

7、根据权利要求5的载体，其为质粒pIT337。

8、包含异青霉素合成酶基因之顶头孢霉转录和翻译活化序列的重组DNA载体，其可在某种微生物体内复制。

9、根据权利要求8的载体，其中活化序列包含在质粒pIT335的～0.5Kb SalⅠ-NcoⅠ限制片段中。

10、根据权利要求8或9的载体，其中活化系列包含序列

5'-CGAATACTTG AATATTCCTT GGTCGCTCTT CTGATTTTCG

|||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||

3'-GCTTATGAAC TTATAAGGAA CCAGCGAGAA GACTAAAAGC

AGGCTTCTCC TTCCGCCATC GTCGCCTCAC GCATATCTCG

|||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||

TCCGAAGAGG AAGGCGGTAG CAGCGGAGTG CGTATAGAGC

TCTTTCACAT CTTACACCAG CAGGACAAAC CGTCACC-3'

|||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||

AGAAAGTGTA GAATGTGGTC GTCCTGTTTG GCAGTGG-5'

其中A是脱氧腺苷、G是脱氧鸟苷、C是脱氧胞苷、T是胸苷。

11、根据权利要求8、9或10的载体，其为一种质粒。

12、根据权利要求11的载体，其为质粒pPS23或pPS23.1。

13、根据权利要求11的载体，其中顶头孢霉转录和翻译活化序列被定位在适于编码一功能性多肽之DNA序列表达的位置。

14、根据权利要求13的载体，其中的功能性多肽是一种抗生素生物合成酶。

15、根据权利要求13的载体，其中的功能性多肽是一种获得性抗生素抗性的酶。

16、根据权利要求15的载体，其中获得性抗生素抗性的酶赋予对潮霉素的抗性。

17、根据权利要求14、15或16的载体，其为质粒pPS21、pPS21A、pPS25、pPS25.1、pPS26、pPS26.1、pPS27、pPS28、pPS29、pPS30、pPS30.1、pPS31、pPS31.1、pPS37或pPS37.1。

18、当在某种微生物体内复制时，可编码顶头孢霉IPS基因的转录终止和mRNA聚腺苷酸化及加工信号的重组DNA载体。

19、根据权利要求18的载体，其中加工信号包含在质粒pIT335的～0.5Kb PstⅠ-BamHⅠ限制片段内。

20、根据权利要求18或19的载体，其为一种质粒。

21、根据权利要求20的载体，其为质粒pIT336、pPS34或pPS35。

22、在宿主细胞内产生异青霉素N合成酶活性的方法，其包括：

（1）用包含权利要求1、2和3之DNA复合物的重组DNA表达载体转化所说的宿主细胞，此DNA复合物是为表达而从所说的宿主细胞内有功能的转录和翻译活化序列定位的;

（2）在允许表达所说的DNA的条件下培养在步骤（1）中转化了的宿主细胞。

23、根据权利要求22的方法，其中DNA复合物是质粒pIT335的～1.5Kb NcoⅠ-BamHⅠ限制片段。

24、根据权利要求22或23的方法，其中DNA复合物编码之氨基酸序列是：

PHE PHE TYR ALA VAL ASN HIS GLY VAL ASP LEU PRO TRP LEU

SER ARG GLU THR ASN LYS PHE HIS MET SER ILE THR ASP GLU

GLU LYS TRP GLN LEU ALA ILE ARG ALA TYR ASN LYS GLU HIS

GLU SER GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU PRO ILE PRO GLY

LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO SER PHR

SER PRO ASP HIS PRO ARG ILE LYS GLU PRO THR PRO MET HIS

GLU VAL ASN VAL TRP PRO ASP GLU ALA LYS HIS PRO GLY PHE

ARG ALA PHE ALA GLU LYS TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU

SER SER ALA VAL LEU ARG GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY ARG

ASP GLU ASP PHE PHE THR ARG HIS SER ARG ARGASP THR THR

LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO TYR LEU ASP PRO

TYR PRO GLU PRO ALA ILE LYS THR ALA ASP ASP GLY THR LYS

LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VAL

LEU TYR GLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS THR PRO

GLN GLY TRP GLN ASP ILE GLN ALA ASP ASP THR GLY PHE LEU

ILE ASN CYS GLY SER TYR MET ALA HIS ILE THR ASP ASP TYR

TYR PRO ALA PRO ILE HIS ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU

ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL ASN LEU GLY TRP GLU ASP

THR ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA LYS ASP GLY ALA

LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR GLY GLU

TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY

GLN THR

其中ALA是丙氨酸、ARG是精氨酸、ASN是天冬酸胺、ASP是天冬氨酸、CYS是半胱氨酸、GLN是谷氨酰胺、GLU是谷氨酸、GLY是甘氨酸、HIS是组氨酸、ILE是异亮氨酸、LEU是亮氨酸、LYS是赖氨酸、MET是蛋氨酸、PHE是苯丙氨酸、PRO是脯氨酸、SER是丝氨酸、THR是苏氨酸、TRP是色氨酸、TYR是酪氨酸、VAL是缬氨酸。

25、根据权利要求22、23或24的方法，其中宿主细胞包括括Agrobacterium、Cephalosporium、Chromobacte-rium、E.coli、Gluconobacter、Nocardia、Penicil-lium、Serratia或Streptomyces。

26、根据权利要求25的方法，其中宿主细胞是Cephalos-porium acremonium、Penicillin chrysogenum或E.coli。

27、根据权利要求22-26中任一项的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌（E.coli）/pIT337。

28、根据权利要求22-26中任一项的方法，其中培养的宿主细胞是顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）/pPS20。

29、用权利要求1-19中任一个重组DNA载体转化的一种宿主细胞。

30、根据权利要求29的宿主细胞，其为大肠杆菌。

31、根据权利要求29的宿主细胞，其为顶头孢霉。

32、根据权利要求30的宿主细胞，其为大肠杆菌K12/pIT335。

33、根据权利要求31的宿主细胞，其为顶头孢霉/pPS21。