CN101040041A

CN101040041A - 质粒dna的稳定液体制剂

Info

Publication number: CN101040041A
Application number: CNA2005800351740A
Authority: CN
Inventors: F·布兰彻; M·考德; N·梅斯特拉利; T·吉耶曼; D·盖莱
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-19
Publication date: 2007-09-19
Also published as: EA200700656A1; IL181753A0; EP1791945A1; WO2006029908A1; TNSN07087A1; CA2579340A1; AU2005284244A1; NZ553914A; NO20071946L; KR20070058621A; BRPI0515553A; EA011554B1; JP2008512997A; MX2007003214A

Abstract

本发明涉及质粒DNA液体制剂，其在+4℃至室温长期稳定并保持不降解，因此可用于储存用于研究、基于质粒的疗法(例如DNA疫苗和基因疗法)的质粒DNA。本发明还涉及在+4℃至室温以随时间稳定的形式保存质粒DNA的方法。本发明还涉及通过基于质粒的疗法(例如DNA疫苗接种或基因疗法)用于人或动物体治疗方法的稳定质粒DNA液体组合物。

Description

质粒DNA的稳定液体制剂

发明领域

本发明涉及稳定的质粒DNA液体制剂，在所述制剂中，质粒于4℃至室温长期保持不降解。因此，所述制剂对研究或基于质粒的疗法(例如DNA疫苗和基因疗法)中使用的质粒DNA的储存有用。

发明背景

分子生物学的发展清楚提示，基于质粒的疗法，具体地说是DNA疫苗和基因疗法领域，可支持疾病治疗的有效途径。将正常基因安全有效地传递入人类细胞中的一种有前景方法是通过质粒DNA。质粒DNA是目的DNA序列可插入其中的共价闭环(ccc)或超螺旋形细菌DNA。可导入哺乳动物细胞的目的DNA序列的实例包括外源基因、功能基因或突变基因、反义序列、RNAi或dsRNAi序列、核酶以及用于例如抗病毒感染的DNA疫苗或用于心血管疾病、血管生成相关疾病或癌症治疗的DNA序列。质粒DNA一旦传递入人类细胞，就开始复制和生产插入DNA序列的拷贝。因此，使用质粒DNA作为活性药物成分(API)对治疗各种病状相当有前途，但储存已成为该技术的明显障碍。实际上，如果质粒DNA保持在非最佳条件中，则其结构降解，分子的超螺旋(ccc)拓扑可经氧化损伤转变为失活形式(开环和线性)。通过Fenton型反应产生的氧化剂，例如过氧化氢、超氧化物和羟基自由基负责DNA氧化降解。具体地说，自由基氧化途径和脱嘌吟作用以及β-消除代表了含水制剂中高度纯化的质粒DNA的主要DNA降解源，引起DNA单链断裂或产生切口，随后共价闭环(ccc)双链超螺旋DNA转变为松弛环形或开环和线性形式。

质粒DNA通常配制在磷酸盐或Tris缓冲水溶液中，其中所述磷酸盐或Tris缓冲液以约10mM的浓度存在。但是，这种组合物一般经历降解过程，这些降解过程在于含水溶液中储存期间发生。这些质粒DNA溶液在约+4℃和+25℃的稳定性非常差。具体地说，其脱嘌呤速率在+4℃至室温(RT)很高。通常通过检测超螺旋、开环和线性DNA含量，以及通过脱嘌呤速率(即无嘌呤位点的累积)和通过氧化速率(即8-羟基鸟嘌呤随时间的形成)，监测降解过程。

因此，长期储存质粒DNA药物导致许多影响DNA稳定性的降解反应。为克服这些难题，通常冻干质粒DNA，用于在扩展至室温的温度储存，但随后需要额外的再制操作步骤，增加了污染和/或降解的风险。

因为发生在质粒DNA中的任何链断裂都影响质量和性能，所以关键是解决在质粒DNA的储存和操作过程中随时间出现的损伤，提供确保质粒DNA的长期储存稳定性和在+4℃至室温的扩展温度安全操作的储存组合物。

申请人因此开发了用于质粒DNA的新型液体组合物，其长期稳定并抗广泛范围的温度，例如达室温的温度，因此有利于DNA型药物、DNA疫苗或基因疗法在安全给予对象前的储存、运输、操作和分配。具体地说，这种液体制剂对可用于研究和基于质粒的疗法(例如基因疗法和DNA疫苗)的高度纯化的质粒DNA有用。

发明概述

本发明的第一个目标是在达+25℃的温度于液体制剂中长期保存质粒DNA的组合物。

本发明因此涉及一种稳定质粒DNA液体储存组合物，其包含质粒DNA以及浓度高达5mM、高达4mM或高达3mM或再高达2mM的缓冲液，所述缓冲液足以将质粒DNA组合物的pH保持在6-9之间，由此允许保存超螺旋含量为至少80％、经历脱嘌呤和产生切口的质粒含量低于20％的质粒DNA。

本发明还涉及一种稳定质粒DNA液体储存组合物，其包含质粒DNA以及浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所述制剂或组合物的pH保持在6.2-8.5之间和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3，由此保存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于5％，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每月低于5％。

本发明还涉及稳定一种稳定质粒DNA液体储存组合物，其包含质粒DNA以及浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所述制剂或组合物的pH保持在6.7-8.0之间和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3，由此保存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于2％，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每月低于2％。

本发明还涉及稳定一种稳定质粒DNA液体储存组合物，其包含质粒DNA以及浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所述制剂或组合物的pH保持在7.0-7.5之间(约+/-0.3)，由此允许保存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于1％，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每月低于1％。

本发明的另一个目标是一种将质粒DNA以稳定形式保存在储存液体组合物中的方法，其包括(i)制备质粒DNA的纯化样品；(ii)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间；和(iii)储存质粒DNA。本发明的方法允许人们保存具有至少80％的超螺旋质粒DNA的高质量质粒DNA。

本发明涉及一种于约+4℃至+25℃的温度将质粒DNA以稳定形式保存在储存液体组合物中的方法，其中脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于5％至每年低于5％，所述方法包括(i)制备质粒DNA的纯化样品；(ii)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6.2-8.5之间和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和(iii)于选定温度储存质粒DNA。

本发明涉及一种于约+4℃至+25℃的温度将质粒DNA以稳定形式保存在储存液体组合物中的方法，其中脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于2％至每年低于2％，所述方法包括(i)制备质粒DNA的纯化样品；(ii)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6.7-8之间和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和(iii)于选定温度储存质粒DNA。

本发明涉及一种于约+4℃至+25℃的温度将质粒DNA以稳定形式保存在液体组合物中的方法，其中脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于1％至每年低于1％，所述方法包括(i)制备质粒DNA的纯化样品；(ii)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在7.0-7.5之间和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和(iii)于选定温度储存质粒DNA。

按照本发明，质粒DNA的组合物包含浓度低于5mM或低于4mM或低于3mM的缓冲溶液。优选地，稳定质粒DNA储存组合物包含痕量水平或达2mM、更优选在1mM-2mM之间的非常稀浓度的缓冲溶液。最优选所述缓冲溶液以低于1mM、250μM-1mM或400μM-1mM的浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6-9之间，或在6.2-8.5之间，优选在6.7-8之间，最优选在7-7.5之间，和/或距任一个或多个这些值的约+/-0.3。

本发明的稳定组合物尤其可用于储存高度纯化的质粒DNA，其具有非常低水平的污染染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素。这种高度纯化的质粒DNA具有低于约0.01％的宿主细胞RNA杂质，和/或低于约0.01％的宿主细胞蛋白杂质，和/或低于约0.01％的宿主细胞基因组DNA杂质。优选的高度纯化的质粒DNA具有低于约0.001％的宿主细胞RNA杂质，和/或低于约0.001％的宿主细胞蛋白杂质，和/或低于约0.001％的宿主细胞基因组DNA杂质。最优选的高度纯化质粒DNA具有低于约0.0001％的宿主细胞RNA杂质，和/或低于约0.0001％的宿主细胞蛋白杂质，和/或低于约0.0001％的宿主细胞基因组DNA杂质。

本发明的再另一个目标是制备用于在达约25℃的温度储存的稳定质粒DNA液体组合物的方法，其包括(1)裂解细胞的步骤，其包括(a)使细胞通过湍流流动，以快速混合细胞悬液与裂解细胞的溶液；和(b)使细胞通过层流流动，以允许在基本没有搅拌的情况下温育在(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物由湍流流入层流，任选还包括(c)加入中和所述裂解溶液的第二溶液，在(b)中温育的混合物层流入第二溶液中，以便由细胞释放质粒DNA；(2)一步层析，用于纯化如此释放的质粒DNA；(3)混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间，和(4)在达约25℃的温度储存质粒DNA组合物。

本发明还涉及一种制备用于在达约25℃的温度储存的稳定质粒DNA液体制剂的方法，其包括(1)裂解细胞的步骤，其包括使细胞通过(a)湍流设备流动，以快速混合细胞悬液与裂解细胞的溶液；和使细胞通过(b)层流流动，以允许在基本没有搅动的情况下温育在(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物由湍流流入层流，任选还包括(c)用于加入中和所述裂解溶液的第二溶液的设备，在(b)中温育的混合物由层流设备流入添加第二溶液的设备中，以便由细胞释放质粒DNA；(2)进行一步层析，用于纯化如此释放的质粒DNA；(3)进行一步渗滤和/或缓冲液交换；(4)混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间，和(5)将质粒DNA液体组合物分装入小瓶，并在达约25℃的温度储存质粒DNA组合物。

按照本发明方法，以低于5mM或低于4mM或低于3mM的浓度将缓冲溶液加入质粒DNA混合物中。优选地，所述方法包括加入痕量水平的缓冲溶液或加入达2mM、更优选在1mM-2mM之间的非常稀浓度的缓冲溶液。最优选所述缓冲溶液以低于1mM、250μM-1mM之间或400μM-1mM之间的浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6-9之间，或在6.2-8.5之间，优选在6.7-8之间，最优选在7-7.5之间，和/或距任一个或多个这些值的约+/-0.3。

本发明的再一个目标是含稳定质粒DNA液体制剂的小瓶，该制剂作为在研究或基于质粒的疗法(例如基因疗法或DNA疫苗)中使用的活性药物成分。

本发明的再另一个目标是含纯化的质粒DNA的小瓶，所述纯化的质粒DNA是称为NV1FGF的质粒，其是携带FGF-1基因编码表达盒的pCOR质粒，可用于治疗外周肢体缺血，包括外周动脉病(PAOD或PAD)和严重肢体缺血(CLI)。

本发明的其它目标和优势部分在以下描述中阐明，部分由所述描述清晰可见，或者可通过实施本发明了解。通过所附权利要求书中具体指出的元素和组合，可认识并实现本发明的目标和优势。

要理解的是，前文的一般性描述和下文的详述都仅为示例性和说明性的，不限制要求保护的本发明。并入本说明书并构成本说明书一部分的附图图解了本发明的几个实施方案，这些附图与说明书一起用于阐明本发明的原理。

附图简述

图1是可用于本发明的连续模式细胞裂解的设备示意图。

图2是连续细胞裂解设备中的混合器M1的示意图。

图3是一张表格，对比了使用单步阴离子交换层析(AEC)或两步法(阴离子交换层析步骤与三股螺旋亲和层析(THAC)组合)和三步法(包括组合的阴离子交换层析步骤、三股螺旋亲和层析步骤和疏水作用层析(HIC)步骤)得到的gDNA、RNA、蛋白、内毒素杂质的纯化得率，ND表示未检出：低灵敏度分析方法。

图4是一张表格，比较了分离和纯化质粒DNA的各种方法，例如单独的或组合的阴离子交换层析(AEC)、羟磷灰石层析(HAC)、疏水作用层析(HIC)、反相层析(RPC)、大小排阻层析(SEC)、三股螺旋亲和层析(THAC)，以及依照本发明的方法。在此提供了关于纯化的质粒DNA质量的结果。ND，未检出(低灵敏度分析方法)。

图5A和5B图示了于+25℃和+5℃储存达90天的质粒DNA的脱嘌呤和产生切口的速率(形成开环质粒形式)。

图6A和6B图示了于+25℃和+5℃储存达150天的质粒DNA的脱嘌呤和产生切口的速率(形成开环质粒形式)。

定义

质粒DNA制剂或组合物指含有效量的质粒DNA的组合物或质粒DNA以有效量存在的制剂，用于研究或基于质粒的疗法，例如基因疗法或DNA疫苗。

稳定储存质粒DNA制剂指可用于长期储存稳定形式的质粒DNA的制剂，之后其原样用于研究或基于质粒的疗法。储存时间在+5℃至+25℃(RT：室温)的温度范围可长达几个月、1年、5年、10年、15年或直至20年。

一般来说，稳定质粒DNA制剂或组合物指具有至少80％比率的超螺旋双链的质粒DNA制剂，剩余的为开环或/和线性质粒形式。

后文的稳定质粒DNA制剂指含质粒DNA的组合物，所述质粒DNA储存于+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率(形成开环质粒形式)每月低于5％，储存于+5℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于5％。优选地，后文的稳定质粒DNA制剂指含质粒DNA的组合物，所述质粒DNA储存于+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率(形成开环质粒形式)每月低于2％，储存于+5℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于2％。更优选地，后文的稳定质粒DNA制剂指含质粒DNA的组合物，所述质粒DNA储存于+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率(形成开环质粒形式)每月低于1％，储存于+5℃时的脱嘌呤和产生切口的速率每年低于1％。

酸性指涉及或含有酸；具有小于7的pH值。

碱性指涉及或含有强碱(alkali)或碱(base)；具有大于7的pH值。

连续指不中断，没有中断。

基因组DNA(缩写为gDNA)指来源于染色体或存在于染色体中的DNA。

层流指溶液水流的流动类型，其中各个质点都按照与每个质点平行的方向移动。

裂解物指细胞裂解过程产生的物质。术语裂解指通过使用含裂解剂的溶液进行化学处理破裂缓冲溶液(即细胞悬液)中细胞的细胞壁和/或细胞膜的行为。裂解剂包括例如强碱、变性剂、有机溶剂和酶。在一个优选实施方案中，进行细胞裂解，以从宿主细胞释放完整质粒。

中和以实现(溶液)中性或引起(酸或碱/强碱)经历中和作用。我们借此术语指中和溶液使溶液pH达到5-7、优选约7或更优选比之前更接近7的pH的事件。

牛顿流体是其中剪切应力与速度梯度成比例并垂直于剪切面的液体。比例常数称为粘度。牛顿流体的实例包括液体和气体。

非牛顿流体是其中剪切应力不单独与速度梯度成比例正比并垂直于剪切面的液体。非牛顿流体可能不具有明确的粘度。非牛顿流体包括塑性固体、幂律流体、粘弹性流体(兼备粘性和弹性特性)和时间依赖性粘滞流体。

质粒DNA指由不是染色体的DNA环组成的小细胞内含物，其可具有将非内源DNA片段插入其中的能力。本文使用的质粒DNA还可为任何形式的质粒DNA，例如切割、加工或其它操作过的形式的非染色体DNA，包括例如以下任一种或任意组合：有切口的环形质粒DNA、松弛环形质粒DNA、超螺旋质粒DNA、切割质粒DNA、线性化的或线性的质粒DNA和单链质粒DNA。构建质粒的方法包括描述于Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)的方法。质粒DNA的小量制备方法在本领域众所周知(Birnboim和Doly，Nucleic AcidsResearch 7：1513(1979))，可用于初始分离质粒DNA，后续通过本发明的某些方面加工，并可与由本发明方法生产的高度纯化样品对比。优选地，质粒DNA形式在通过本发明的纯化方法制备后为或至少为：基本闭环形式的质粒DNA或约80％、85％、90％、95％或约99％以上的闭环形式质粒DNA。或者，在某些治疗方法中可优选超螺旋共价闭合形式的质粒DNA(ccc)，其在这些治疗方法中可能比开环、线性或多聚形式更有效。因此，药物级质粒DNA可与一种或多种形式的质粒分离(isolated)或隔离(separated)，基本包含一种或多种目标形式。

对本发明来说，术语流动指通常通过泵的作用使液体以特定流速(例如升/分钟)通过混合器。应当指出的是，一般认为通过混合器的流速影响裂解、沉淀和混合的效率。

术语“有切口的”或“松弛的”DNA指不是超螺旋的DNA。“超螺旋”DNA是本领域描述特定分离形式的质粒DNA的公知术语。其它形式的质粒DNA也是本领域知晓的。

“污染杂质”是希望与DNA隔离或分离的任何物质。污染杂质包括但不限于宿主细胞蛋白、内毒素、宿主细胞DNA(例如染色体DNA或基因组DNA)和/或宿主细胞RNA。应理解，什么东西是或可被认为是污染杂质可取决于实施本发明方法的背景。“污染杂质”可以是或可以不是宿主细胞源的，即，它可以是或可以不是宿主细胞杂质。

“分离”或“纯化”第一成分(诸如DNA)是指从其他成分中富集所述第一成分，该第一成分最初与所述其他成分一同存在。本文提供了期望的和/或可获得的纯化程度。

术语“基本没有和高度纯化的”定义为约95％和优选大于98.99％纯或没有杂质，或具有低于5％和优选低于1-2％的杂质。

药物级DNA在本文被定义为含有不超过约5％、优选不超过约1-2％的细胞成分(诸如细胞膜)的DNA制品。

还描述了生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法，所述高度纯化的质粒DNA基本没有杂质，因此为药物级DNA。通过本发明方法生产和分离的质粒DNA包含非常低水平(即百万分率(ppm))的污染染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素，并主要包含闭环形式质粒DNA。按照本发明生产的质粒DNA的纯度足以用于研究和基于质粒的疗法，并任选足以用于人类临床实验材料以及人类基因疗法实验和临床实验。

本发明的“药物级质粒DNA组合物”是通过本发明方法生产的组合物和/或具有至少一种下文定义为“药物级质粒DNA”的纯度水平的组合物。优选地，本发明的“药物级质粒DNA组合物”的纯度水平由下文鉴别为“药物级质粒DNA”的至少两个条件所确定，例如低于约0.01％染色体或基因组DNA和低于约0.01％蛋白杂质，或例如低于约0.01％染色体或基因组DNA和低于约0.1EU/mg内毒素。药物级质粒DNA优选含低于约0.001％染色体或基因组DNA和低于约0.001％蛋白杂质，或例如低于约0.001％染色体或基因组DNA和低于约0.1EU/mg内毒素。更优选其含低于约0.0001％染色体或基因组DNA和低于约0.0001％蛋白杂质，或例如低于约0.0001％染色体或基因组DNA和低于约0.1EU/mg内毒素。最优选药物级质粒DNA含低于约0.00008％染色体或基因组DNA和低于约0.00005％蛋白杂质，或例如低于约0.00008％染色体或基因组DNA和低于约0.1EU/mg内毒素。其它的纯度水平组合包括在所述定义内。当然，药物级质粒DNA组合物还可包含任何具体用途(包括在联合治疗、组合物和疗法中的用途)期望的附加组分。染色体或基因组DNA、RNA、内毒素或蛋白水平指基于细胞生产质粒的杂质或纯化过程的其它杂质。

更优选地，“药物级质粒DNA”在本文定义为含有百万分之一或1ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg/100mg质粒DNA)水平或以下的基因组DNA、RNA和/或蛋白杂质的DNA制备物。

此外或更确切地，本文的“药物级质粒DNA”可指含低于约0.01％或低于0.001％、优选低于0.0001％或优选低于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg/100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA的DNA制备物。

“药物级质粒DNA”还可指含低于约0.01％或低于0.001％、优选低于0.0001％或优选低于0.00002％(＜0.00002％，即＜0.00002mg/100mg质粒DNA)的RNA杂质的DNA制备物。

“药物级质粒DNA”还可指含低于约0.0001％、最优选低于0.00005％(＜0.00005％，即＜0.00005mg/100mg质粒DNA)的蛋白杂质的DNA制备物。

“药物级质粒DNA”还可指含低于0.1EU/mg内毒素的DNA制备物。

药物级质粒DNA在本文指优选地主要为环形的DNA制备物，更确切地指包含80％、85％、90％、95％以上或99％以上的闭环形式质粒DNA的DNA。

T型管指T型构型的管道，其中T型由按该构型制造的单根管形成，或由组合建立该构型的一根以上的管形成。T型管具有三个臂和臂于此连接的中心区域。T型管可用于混合成分，因为两种流体可各自流入到T的一个臂中，在中心区域汇合，并从第三臂流出。混合随着流体汇合而发生。

湍流指流体质点以横断主流方向的方向进行不规则随机运动，其中给定点速度在量值和方向上不规律变化。

粘弹性指流体兼具粘性和弹性特性。

发明详述

本发明涉及稳定的质粒DNA液体制剂，其中的质粒DNA在室温长期保持不降解。这种质粒DNA制剂或组合物因此可用于储存研究、基于质粒的疗法(例如基因疗法或DNA疫苗)中的质粒DNA。

按照本发明，稳定质粒DNA液体储存组合物包含质粒DNA和缓冲溶液，所述缓冲溶液的浓度达5mM或达4mM或达3mM或达2mM，足以将所述组合物的pH保持在6-9之间，所述组合物含主要为超螺旋形式的质粒DNA，在约4℃至25℃的温度储存达几个月、1年、2年、3年、4年、5年和达10年。

具有主要为超螺旋形式的质粒的质粒DNA组合物包含至少80％的超螺旋或闭环质粒DNA，或约85％和优选约90％或约95％。最优选稳定质粒DNA组合物包含约99％的超螺旋或闭环形式质粒DNA。或者，用于质粒DNA储存的稳定组合物产生的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/月。

本发明的稳定质粒DNA液体储存制剂因此包含质粒DNA和非常稀的缓冲溶液，缓冲溶液浓度达2mM，足以将组合物的pH保持在约至少6和至多9，或在6.2-8.5之间，优选在6.7-8之间，更优选在7-7.5之间，和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

稳定质粒DNA液体组合物包含浓度达2mM的缓冲溶液，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.2-8.5之间，和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3，由此允许储存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/年，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/月。

优选地，稳定质粒DNA液体组合物包含浓度达2mM的缓冲溶液，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.7-8之间，和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3，由此允许储存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于2％/年，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于2％/月。

更优选地，稳定质粒DNA液体组合物包含浓度达2mM的缓冲溶液，以便将所述制剂或组合物的pH保持在7-7.5之间，和/或距一个或两个这些值的约+/-0.3，由此允许储存质粒DNA，其储存于约+4℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于1％/年，其储存于约+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于1％/月。

测定缓冲溶液的摩尔比率，以便在一定限度内和体积中发挥缓冲作用，其中pH值稳定在6-9之间，或6.2-8.5之间，优选6.7-8之间，最优选7-7.5之间，和/或距这些值中任一个的约+/-0.3。所述缓冲溶液因此可以低于5mM的浓度加入。优选地，稳定质粒DNA储存组合物包含痕量缓冲溶液或达2mM、更优选在1mM-2mM之间的非常稀浓度的缓冲溶液。最优选所述缓冲溶液以低于1mM、250μM-1mM或400μM-1mM的浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6-9之间，或在6.2-8.5之间，优选在6.7-8之间，最优选在7-7.5之间，和/或距任一个或多个这些值的约+/-0.3。

缓冲溶液以达2mM或在1mM-2mM之间的浓度存在。优选缓冲溶液以低于1mM的浓度存在。最优选缓冲溶液以低至250μM直到1mM浓度的痕量水平存在。缓冲溶液的痕量水平可为约400μM，刚够将pH保持在上文指出的范围。

可用于本发明组合物的缓冲溶液由含Tris[三(羟甲基)-氨基甲烷]或赖氨酸和选自强酸(例如盐酸)或弱酸(例如马来酸、苹果酸或乙酸)的酸的酸/碱系统组成，或由含Hepes[2-(4-(2-羟乙基哌嗪)-1-基)乙磺酸]和强碱(例如氢氧化钠)的酸/碱系统组成，或由磷酸缓冲液例如磷酸钠或磷酸钾组成。缓冲溶液还可包含Tris/HCl、赖氨酸/HCl、Tris/马来酸、Tris/苹果酸、Tris/乙酸或Hepes/氢氧化钠。优选地，在本发明的稳定质粒DNA储存组合物中使用Tris缓冲液。

如下文的实施例所述，本发明的质粒DNA制剂在4℃和室温(RT)(例如20或25℃)均具有极佳的稳定性。

本发明的组合物还可包含盐水赋形剂。可用于本发明组合物的盐水赋形剂可包括选自以下的阴离子和阳离子：乙酸根、磷酸根、碳酸根、SO₄ ^2-、Cl^-、Br^-、NO₃ ^-、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺和NH₄ ⁺和任意其它盐或先前可获得或使用的药物化合物形式。优选的盐水赋形剂是浓度为100-200mM、优选浓度为约150mM的NaCl。

本发明的稳定组合物对储存高度纯化的质粒DNA或药物级质粒DNA特别有用，其具有非常低水平的污染染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素。这种高度纯化的质粒DNA具有低于约0.01％或0.001％或0.0001％的宿主细胞RNA杂质，或/和低于约0.01％或0.001％或0.0001％的宿主细胞蛋白杂质，和/或低于约0.01％或0.001％或0.0001％的宿主细胞基因组DNA杂质。

本发明的组合物还可包含佐剂，例如选自聚乙二醇、Pluronic或聚山梨醇酯糖或醇等的聚合物。

按照另一方面，本发明涉及一种在组合物中保存质粒DNA的方法，其包括a)制备质粒DNA的纯化样品；和b)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6.2-9之间。优选地，所述pH保持在6.5-8.5之间，优选在6.7-8之间，最优选在7-7.5之间，更具体地说为约7.2。

本发明还涉及一种在组合物中保存质粒DNA的方法，其包括a)制备质粒DNA的纯化样品；b)将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间；和c)储存质粒DNA。本发明的方法允许储存具有至少80％超螺旋质粒DNA的质粒DNA。

所产生组合物的pH可保持在6.2-8.5和一个或两个这些值的约+/-0.3之间，由此允许质粒DNA在+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/月至低于5％/年。

优选地，所产生组合物的pH可保持在6.7-8之间(约+/-0.3)，由此允许质粒DNA在+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率低于2％/月至低于2％/年。

最优选地，所产生组合物的pH可保持在7-7.5和一个或多个这些值的约+/-0.3之间，由此允许质粒DNA在+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率低于1％/月至低于1％/年。

按照本发明的方法，将缓冲溶液以达2mM或在1mM-2mM之间的浓度加入到质粒DNA组合物中。优选以达到1mM以下的浓度加入缓冲溶液。最优选缓冲溶液以低至250μM直到1mM浓度的痕量水平存在。缓冲溶液的痕量水平可为约400μM，刚够将pH保持在上文指出的范围。

按照本发明的方法，还可将盐水赋形剂加入到质粒DNA和缓冲溶液中。盐水赋形剂描述于上文。优选的盐水赋形剂为NaCl，浓度为100-200mM，优选约150mM。

按照本发明配制在组合物中的质粒DNA可为分离形式。它们可经本文描述的细菌细胞裂解和纯化分离，或经自动化核酸合成设备合成。

它们可包含编码多肽的多核苷酸，其中多核苷酸可为转基因，例如治疗基因，如哺乳动物起源的，例如啮齿动物或人基因，与启动子序列有效连接。插入到质粒DNA中的多核苷酸可为基因组来源的，因而含有如其基因组结构中所示的外显子和内含子，或者可来源于互补DNA。多核苷酸可编码各种多肽中的任一种，例如但不限于免疫原肽或蛋白、血管生成因子、促红细胞生成素、腺苷脱氨酶、VIII因子、IX因子、抗肌萎缩蛋白、β-球蛋白、LDL受体、CFTR、胰岛素、抗血管生成因子、生长激素、α1-抗胰蛋白酶、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、白介素和干扰素。优选地，质粒DNA包含编码血管生成因子的多核苷酸，所述血管生成因子例如为FGF基因(FGF-1至FGF-22)、VEGF、HGF或HIF-1。作为使用编码多肽的多核苷酸的替代，所述多核苷酸可编码siRNA，其可用于抑制靶基因表达，例如在不期望基因表达(例如病原体基因)的情况下或在不期望细胞中的基因表达水平高的情况下。适用于各种脊椎动物系统的启动子众所周知，包括例如RSV LTR、MPSV LTR、SV40、金属硫蛋白启动子，有利地可使用CMV IEP。

质粒DNA可包括原核和真核载体和表达载体，例如pBR322和pUC载体及其衍生物。它们可掺入不同的复制起点，例如原核复制起点，例如pMB1和ColE1，或真核复制起点，例如有利于在酵母、真菌、昆虫和哺乳动物细胞中复制的真核复制起点(例如SV40 ori)。

插入片段可包括任何有机体的DNA，但优选是哺乳动物源的，除编码治疗蛋白的基因之外其还可包含调节序列，例如启动子、增强子、基因座控制区、选择基因、用于转基因插入的多接头、前导肽序列、内含子、聚腺苷酸化信号或其组合。载体、起点和遗传元件的选择将根据需要而有所变化，完全属于本领域技术人员的知识范围。选择标记可为例如抗生素抗性基因，例如SupPhe tRNA、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和胸苷激酶抗性。质粒骨架有利地允许插入哺乳动物、其它真核、原核或病毒DNA的片段，产生的质粒可被纯化并用于体内或活体外的基于质粒的疗法。

优选地，使用具有条件复制起点的质粒DNA，例如美国公开申请2003/1618445中描述的pCOR质粒。产生的高拷贝数大大提高了质粒DNA对染色体DNA、RNA、细胞蛋白和辅因子的比率，提升了质粒得率，使下游纯化更容易。因此，根据本发明可以使用任何质粒DNA。代表性载体包括但不限于NV1FGF质粒。NV1FGF是编码酸性成纤维细胞生长因子或1型成纤维细胞生长因子(FGF-1)的质粒，用于治疗患有末期外周动脉阻塞性疾病(PAOD)或外周动脉疾病(PAD)的患者。Camerota等(J Vasc.Surg.，2002，35，5：930-936)描述，对患有不可重现末期PAD的、具有静息疼痛或组织坏死的51名患者，将提高的单剂量或重复剂量的NV1FGF肌内注射入缺血性大腿和小腿中。随后评定各种参数，例如经皮氧分压、踝肱指数和趾肱指数、疼痛评估和溃疡愈合。在给予NV1FGF后观察到肱指数显著升高、疼痛减轻、溃疡面积消退和灌注改善。

按照另一方面，本发明提供如上文定义的组合物，用于通过疗法治疗人体或动物机体的方法。优选地，本发明的组合物含编码FGF或VEGF家族的血管生成基因的pCOR质粒，用于治疗心血管疾病，例如外周缺血、外周动脉病(例如PAOD或PAD)、严重肢体缺血(CLI)和间歇性跛行(IC)。

作为另一个优选用途，质粒DNA包含编码免疫肽的多核苷酸，并可用作DNA疫苗。本发明因此提供接种人或动物的组合物，由此产生抗感染因子(包括胞内病毒)以及还抗肿瘤细胞的有效免疫性。实际上，质粒DNA稳定组合物可用作DNA疫苗，以极大地增强一般激发较差免疫应答的某些病毒蛋白和癌症特异性抗原的免疫原性。它们可用于诱导针对疱疹病毒、非甲非乙肝炎和HIV的较差免疫原性病毒蛋白的细胞毒性T细胞免疫。

质粒DNA可编码赋予免疫性的多肽，其可用作内源免疫原，以激发体液或细胞应答或这二者，或者仍然用于抗体。就此而言，术语“抗体”包括任意类型的完整免疫球蛋白、具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及片段，例如F(ab)₂、Fab′、Fab等，包括杂合片段。这种片段的缀合物和如例如美国专利第4,704,692号(其内容在此通过引用结合到本文中)所述的所谓抗原结合蛋白(单链抗体)也包含在“抗体”的定义中。因此，含编码抗体可变区的多核苷酸的质粒DNA可用于原位生产抗体。关于涉及获得抗体编码多核苷酸的示例性方法，参见Ward等，Nature，341：544-546(1989)；Gillies等，Biotechnol.7：799-804(1989)；和Nakatani等，loc.cit.，805-810(1989)。抗体又能发挥治疗作用，例如通过结合与病原体有关的表面抗原。或者，编码抗体可为如在例如美国专利第4,699,880中描述的抗独特型抗体(结合其它抗体的抗体)。这种抗独特型抗体可结合受治疗个体中的内源或外源抗体，由此改善或防止与免疫应答相关的病理状况，例如在自身免疫病范围内的病理状况。

本发明的组合物因此可给予入人或动物体内，使质粒DNA被传递入动物机体的各种细胞中，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾细胞，或传递入血细胞。优选将多核苷酸体内直接传递入肌肉或皮肤细胞中。例如，可使用注射器或疫苗枪注射入肌肉或皮肤，以提供对对象的有效免疫。实际上，导入对象细胞中的抗原基因(被转染的细胞现在表达抗原)将通过正常细胞途径被加工和提呈至免疫系统。或许可以共注射佐剂或淋巴因子，以进一步增强免疫。

例如，本发明的质粒DNA稳定组合物可用于抗病毒的接种，或者用作治疗慢病毒感染的DNA疫苗，所述慢病毒例如为乙肝病毒、HIV和疱疹病毒组成员，其中病毒以失活或部分活性的形式胞内保持。本发明的质粒DNA组合物还可用于治疗恶性疾病，以增强针对恶性病症特异性蛋白、癌基因、胚胎抗原或活化标记的细胞免疫应答。

通常在细菌细胞中生产用于按照本发明配制进行长期储存的质粒DNA(pDNA)，然后对所述细菌细胞进行裂解，以便释放由其分离pDNA的细胞内容物。

该过程一般涉及3步，包括细胞重悬浮、细胞裂解、宿主杂质的中和与沉淀。细胞重悬浮一般使用人工搅拌或磁力搅拌以及匀浆器或叶轮混合机，以将细胞重悬浮在重悬浮缓冲液中。

细胞裂解可通过人工搅拌或磁力搅拌进行，以便混合重悬浮细胞和裂解溶液，所述裂解溶液由溶菌酶或稀强碱(碱)组成，例如强碱或乙酸钾(KOAc)和变性剂；然后将混合物在室温(20-25℃)或冰上保持一段时间，例如5分钟，以完成裂解。一般还加入RNA酶，以降解细菌悬液中的RNA。第三阶段是中和和沉淀宿主杂质。一般通过温和搅拌或磁力搅拌将第二阶段的裂解物和冷中和溶液混合，以酸化裂解物，然后在冰中放置10-30分钟，以促使高分子量染色体DNA、宿主蛋白和其它宿主分子变性和沉淀。

当细胞裂解使用溶菌酶处理进行时，细菌与溶菌酶接触，然后于约100℃在合适缓冲液中煮沸20-40秒，形成基因组DNA、蛋白和碎片的不溶结块，留下溶液中的质粒和作为主要杂质的RNA。接着，为溶解细胞质膜，加入NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)的混合溶液。NaOH部分变性DNA，部分降解RNA，SDS用于溶解膜和变性蛋白。接着，SDS-蛋白复合物和细胞碎片通过加入5N乙酸钾(pH 4.8)沉淀。此时，pH对中和所述操作中使用的NaOH和复性质粒这二者很重要。此后，应用离心去除沉淀，由此获得在上清液中的目标质粒DNA。

或者，进行碱裂解，其由混合细菌细胞悬浮液和碱性裂解溶液组成。碱性裂解溶液由变性剂和强碱组成，所述变性剂例如为十二烷基硫酸钠(SDS)，以裂解细菌细胞和释放胞内物质，所述强碱例如为氢氧化钠，以变性细胞中的蛋白和核酸(具体地说是gDNA和RNA)。由于细胞裂解和DNA变性，溶液粘度急剧升高。在变性后，加入酸性溶液，例如乙酸钾(溶液3)，以中和氢氧化钠，诱导核酸复性。gDNA的长片段随机再结合，形成网状物，其作为絮凝物沉淀，捕获蛋白、脂质和其它核酸。十二烷基硫酸钾盐也沉淀，带走与其结合的蛋白。彼此缠绕的pDNA(质粒DNA)的两条链通常再结合，以重新形成初始质粒，该质粒保留在溶液中。

这些化学步骤可能适于以小规模或低于5升的小体积细菌发酵裂解细胞，但粘度增加可能使大规模处理更困难。

裂解技术可以分批方式进行，即其中通过向容器或罐序贯加入溶液混合不同溶液。在含细胞悬液的溶液已与裂解溶液混合后，粘弹性碱性裂解物与中和溶液混合。

使用串联静止混合器连续混合各种细胞裂解溶液可用作分批方法的替代，尤其是在设想大规模质粒生产时。按照这些方法，同时向静止混合器中加入细胞悬浮溶液和细胞裂解溶液。然后将离开第一静止混合器的裂解细胞溶液和沉淀溶液同时加入到第二静止混合器。离开此第二混合器的溶液包含沉淀的裂解物和质粒。裂解细胞的其它连续模式包括使用其中悬浮细胞被加热至70-100℃的流通式热交换器。在于热交换器中裂解细胞后，对排出流进行连续流或分批离心，在离心过程中细胞碎片和基因组DNA沉淀，留下质粒DNA在上清液中。

用于连续碱裂解细菌细胞悬液(尤其在大规模的情况下)的优选方法描述于国际专利公开WO 05/026331，其通过引用结合到本文中。此优选方法解决了流体的粘弹特性和混合过程中涉及的剪切力引起的问题，提供了限制剪切力的巨大优势。因此，使用本文进一步描述的可放大宿主细胞连续碱裂解法可制备高收率的质粒DNA。

第一个步骤，接种宿主细胞，即在细胞的指数生长期用质粒DNA转化宿主细胞，并在含包含抗生素(例如四环素)的LB培养基的平板上划线。然后将来自平板的单个菌落各自接种到独立的无菌塑料锥形瓶中补加有合适抗生素四环素的20ml LB培养基中，在振荡培养箱中于37℃生长12-16小时。然后这些培养物之一用于接种添加到2L锥形瓶中的200ml无菌LB培养基。使其在振荡培养箱中以37℃和200rpm生长，用于接种两个5L锥形瓶，在振荡培养箱中以30℃和200rpm生长，在5小时后且OD600nm达2个单位的指数生长期中期时用于接种发酵罐。

宿主细胞培养和接种是本领域公知的。一般来说，使宿主细胞生长，直到它们达到高生物量和细胞处于指数生长期，以具备大量质粒DNA。可以使用两种不同的方法，即分批和补料—分批发酵。

分批发酵容许通过操控生长温度和所使用碳源使生长速率受控。本文使用的术语“分批发酵”是一种细胞培养过程，依据该过程，细胞生长和包含在培养细胞中的质粒生产所需的所有营养物在接种时都极大过量地(例如达10倍过量的营养物浓度)存在于容器中，从而避免了灭菌后向无菌容器中添加的需求，以及对复杂补料模式和策略的需求。具体地说，分批培养基中酵母提取物的量由5g/l(同LB培养基中一样)添加至20g/l，由此提供巨量的生长因子和核酸前体。培养基还补加硫酸铵(5g/l)，其用作有机氮源。

另一种发酵类型是补料—分批发酵，其中通过在细胞生长期间向培养物中添加营养物来控制细胞生长速率。本文使用的“补料—分批发酵”指一种细胞培养过程，其中通过在发酵期间小心监测培养物中代谢物的增加来控制生长速率。本发明的补料—分批发酵允许细胞培养物达到高于分批发酵的生物量。以下针对50L制备物描述发酵过程的实例和示例性补料添加速率。然而，其它体积，例如10L、50L或大于500L，根据设备规模，也可以使用下述示例性补料速率来处理。高度富集的分批培养基和补料—分批培养基发酵适合于高细胞密度培养物生产，以最大化单位质粒得率，并容许在仍处于指数生长的同时以高生物量收获。补料—分批发酵使用葡萄糖或甘油作为碳源。所述发酵以分批模式进行，直到初始碳底物(葡萄糖)耗尽。此时刻由DO突然升高指示，并通过对该事件后立即取出的样品进行葡萄糖分析来确认。然后启动事先灌注的补料培养基泵。泵速由源自Curless等(Bioeng.38：1082-1090，1991)的模型来确定，该文献的全部内容在此通过引用结合到本文中。该模型设计得便于控制补料—分批过程的补料阶段。在初始分批过程中，非抑制性浓度的底物被以其最大比生长速率生长的细胞消耗，使接种后的生物量水平急速升高。由于有毒代谢物的积累，培养物不能以此速率无限生长(Fieschio等，“Fermentation Technology Using RecombinantMicroorganisms.”载于Biotechnology，H.J.Rhem和G.Reed.编辑，Weinheim：VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b：117-140，1989)。为了容许持续的对数生长，该模型计算生长限制性碳底物的基于时间的补料速率，而不需要反馈控制，以产生操作员设定的补料—分批生长期。以一定水平选择补料速率，所述水平不引起抑制性代谢物的积聚，并且足以产生高生物量。在补料—分批发酵中的补料过程当中，前体(硫酸铵形式的有机氮)添加设计用于防止对质粒质量的有害影响。

本领域众所周知的裂解方法包括例如可使用含质粒的微生物细胞的流通式热裂解。该方法特别描述于国际专利公开WO 96/02658。具体的热交换器由10英尺×0.25英寸外径的不锈钢管组成，制成盘管型。盘管完全浸没入恒定高温水浴中。盘管的滞留体积约50mL。热电偶和温度计分别用于检测进口和出口温度以及水浴温度。使用Masterflex蠕动泵和硅胶管将产品流泵入加热盘管中。细胞裂解物流出盘管，然后在Beckman J-21分批式离心机中离心以澄清。在离心后，可使用本发明的纯化方法纯化质粒DNA。

替代的细胞裂解可以利用串联静态混合器。如WO 097/23601(在此通过引用结合到本文中)所述，用于通过第一静态混合器裂解细胞和通过第二静态混合器沉淀细胞裂解物的第一静态混合器可用作在本发明质粒DNA纯化方法之前裂解细胞的可选方法。使用静态混合器，大量细胞可温和和连续地在管线中裂解，其它静态混合器在线排列，以完成其他功能，例如稀释和沉淀。适用于本发明方法的静态混合器包括本领域称为静态或静止混合器的任何流通式装置，其长度足以允许本发明方法实施。例如，为裂解细胞，静态混合器应必须具有一定长度，该长度能为裂解溶液和细胞之间提供足够接触时间，以使目标细胞在通过混合器期间裂解。适合的静态混合器含有内部螺旋结构，其使两种液体以相反旋流相互接触，导致液体掺混在一起，成为湍流。

用于细胞裂解的最优选方法或装置包括：(a)湍流设备，以快速地混合细胞悬液(图1中的溶液1)与裂解细胞的溶液(图1中的溶液2)；和(b)层流设备，以允许基本上没有搅动地温育(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物从湍流设备流入层流设备。另外，该装置可包括添加中和所述裂解溶液的第三溶液(图1中的溶液3)的设备，其中在(b)中温育的混合物从层流设备流入添加第二溶液的设备。因此，例如，该方法可用于从细胞分离质粒DNA，包括：(a)在湍流设备中混合所述细胞与强碱裂解溶液；和(b)通过添加酸性溶液中和强碱裂解溶液。

该方法使用T型管，在粘弹性流体出现之前均一且非常快速地混合细胞悬液(溶液1)和碱性溶液(溶液2)，由此提供了限制剪切力的巨大优势。T型管一般具有小直径管道，通常直径小于1cm，优选约2到8mm，更优选约6mm，以便提高混合流体的接触时间，但该方法不利用由穿过管道而引发的混合。下文的表1分别显示了湍流、层流和湍流设备的参数B1a、B1b、B2的变化，其对应流速S1、S2和S3，如图1所示。

表1

B1a(60L/h)		B1b(60L/h)		B2(90L/h)		流速
B1a(60L/h)		B1b(60L/h)		B2(90L/h)		流速		直径	长度	直径	长度	直径	长度	S1、S2和S3	范围
5-7mm	2-6m	12.5-19mm	13-23m	5-8mm	2-4m	60/60/90L/h	±20％	直径	长度	直径	长度	直径	长度	S1、S2和S3	范围

所述方法可使用具有非T管道的混合器或注射器，其允许细胞分散到裂解溶液中。因此，与例如在罐中通过桨搅拌液体时相比，对通过管道的液体的机械应力大大降低。混合的初始效力在随后的几秒钟产生甚至更高的效力，因为该流体还没有粘弹特性，通过小直径管道实现的混合非常有效。相比之下，当使用T形管混合时，初始混合仅是适中的，而流体快速变成粘弹性的，在流入管道时引起相当大的问题。这种部分混合导致仅部分细胞裂解，因此在中和前仅能释放一部分质粒。在裂解期间，裂解可分为两个阶段：阶段I和阶段II。这两个阶段相当于I)细胞裂解和II)核酸变性，使产生粘弹性流体的流变性能发生重大变化。调整管道直径使得有可能满足这两个阶段的要求。在小直径管道(B1a)内，混合增加。这是用于阶段I的构型。在大直径管道(B1b)内，混合(以及由此产生的剪切应力)下降。这是用于阶段II的构型。

使用的优选混合器称为M1，如图2所示，但也可使用任何T型装置来提供符合本发明的细胞悬液分散。用此混合器进行裂解的一种方法是将溶液1通过一个或多个小直径管口逆流注射到碱性裂解溶液中，以获得有效分散。在所示构型中这些管口的直径可为约0.5mm到2mm，优选约1mm。随后，混合物离开混合器M1，短时间(约2.5秒)内通过小直径管道(图1)。直径和流动时间的组合可容易地计算，以维持湍流。这些参数变化的实例在表1中提供。对管道直径的所有标注提供的都是管道内径，而不是外径，外径包括管道壁自身的厚度。在管道中的这种短暂停留时间允许溶液1和2非常快速地匀化。假定溶液1和溶液2在阶段I中仍是牛顿流体，则在匀化阶段中流动模式是湍流。在离开此管道时，溶液1和2是匀化的，细胞在悬浮液中开始裂解。

然后匀化的混合物通过直径大得多的第二管道(B1b)(图1)，在其中发生细胞裂解和粘弹性流体形成。在该阶段中，可以使混合最小化，可尽可能地使溶液“静息”来限制湍流，以最小化任何剪切应力，否则其会片段化gDNA。约1-3分钟、约2分钟、优选1分20秒的接触时间足可完成细胞裂解和使核酸变性。在变性阶段中，流体的流动模式可为层流，促使SDS和氢氧化钠向细胞组分缓慢扩散。

由此获得裂解物，然后可将中和溶液3与称为M2的Y混合器混合。在本发明的一个实施方案中，Y混合器的内径约4-15mm，或约6-10mm，可为约6mm或约10mm。小直径管道(例如约6mm管道)位于Y混合器的出口，以使裂解物和溶液3快速(＜1秒)有效混合。然后在收获罐中收集中和溶液。在中和期间，pH的快速降低诱发絮凝物形成(即形成团或块)。另一方面，部分变性的质粒非常快速地复性，并保留在溶液中。絮凝物在收获罐中逐渐沉降，带走大量杂质。图1中的示意图显示了连续裂解(CL)系统的一个实施方案。连续裂解可独自使用，或与其它方法一起使用。

用此方法可裂解任何类型的细胞(即原核细胞或真核细胞)，用于任何与裂解有关的用途，例如，从靶细胞中释放随后要纯化的目标质粒DNA。

此连续碱性裂解步骤的方法可以对从发酵收获的细胞实施，所述发酵已培养到的细胞生物量还未达稳定期，因此处于指数生长中(2-10g干重/升)。所述连续碱性裂解步骤还可对从发酵收获的细胞实施，所述发酵已培养至高细胞生物量，不再处于指数生长中，而是已达稳定期，具有约10-200g干重/升的细胞浓度，优选为12-60g干重/升。

可使用各种方法纯化质粒DNA，之后按照本发明配制成稳定储存组合物。实际上，通常由细菌制备物生产的质粒DNA制备物包含松弛和超螺旋质粒DNA的混合物。质粒DNA纯化方法在本领域众所周知。

一般来说，由细菌发酵分离和纯化质粒DNA的方法包括如上所述破碎含质粒的细菌宿主细胞，用乙酸中和来中和裂解物，以使宿主细胞基因组DNA和蛋白沉淀，然后通过例如离心去除。液相包含质粒DNA，其用醇沉淀，然后在溴化乙锭存在下使用CsCl进行等密度离心，以分离不同形式的质粒DNA，即超螺旋的、有切口环形的和线性化的。需要用丁醇再提取，以去除残余的溴化乙锭，接着使用醇进行DNA沉淀。其它纯化步骤在去除宿主细胞蛋白之后。这些方法一般适合于小规模或实验室规模的质粒制备。

可选方法包括例如大小排阻层析、羟磷灰石层析以及各种基于反相或阴离子交换的层析。这些可选方法可胜任实验室规模的少量研究物质的生产，但对生产大量质粒DNA可能不容易放大。例如，可采用的质粒DNA分离方法使用离子交换层析(Duarte等，Journal ofChromatography A，606(1998)，31-45)或大小排阻层析(Prazeres，D.M.，Biotechnology Techniques第1卷，第6册，1997年6月，417-420页)，外加使用添加剂，例如聚乙二醇(PEG)、变性剂和其它组分，例如六胺钴、亚精胺和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。用于分离超螺旋和松弛形式的质粒DNA的可选已知方法在处理过程中使用树脂和溶剂，例如乙腈、乙醇和其它组分，例如三乙胺和四丁基磷酸铵。

对于在治疗背景下将核酸或质粒DNA导入人或动物的情况而言，要求高度纯化的药物级质粒DNA，因为纯化的核酸必须满足药物安全性、效力和有效性的质量标准。当质粒DNA由具有高水平内毒素的革兰氏阴性细菌源纯化时尤其需要去除污染内毒素。这些内毒素一般为脂多糖或其片段，其为革兰氏阴性细菌外膜组分，存在于宿主细胞和宿主细胞膜或大分子的DNA制备物中。它们可引起炎性反应，例如在接受质粒DNA的宿主中的发热或脓毒病。因此，去除内毒素在治疗或预防用途的质粒DNA的纯化中可能是关键和必需的步骤。从质粒DNA溶液中去除内毒素主要利用内毒素的带负电结构。然而，质粒DNA也是带负电的，因此分离通常用结合这两种分子并在一定条件下在结合内毒素的同时优先洗脱质粒DNA的阴离子交换树脂来实现。除了制备无污染内毒素(其如果给予患者可能激发毒性反应)的核酸以外，可能还期望生产高度纯的核酸，其不含毒性化学物质、突变原、有机溶剂或其它会危及所产生核酸的安全性或有效性的试剂。

在将质粒DNA按照本发明配制在稳定水溶液中以长期储存之前，优选通过组合层析步骤纯化质粒DNA，以获得含低水平(即百万分率(ppm))的污染染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素的质粒DNA制备物，其主要包含闭环形式的质粒DNA。更优选地，使用描述于国际专利公开WO 95/026331和国际专利申请号PCT/EP2005/005213的纯化方法制备应用于研究和基于质粒的疗法(例如基因疗法和DNA疫苗)的质粒DNA。

纯化方法包括使用三股螺旋亲和层析，其在至少一种另外的层析技术之前或之后，可选地或通常作为最终纯化步骤，或至少在质粒纯化流程结束时或接近结束时。三股螺旋亲和层析与一种或多种层析步骤组合使用，例如离子交换层析、疏水作用层析、凝胶渗透或大小排阻层析、羟磷灰石(I型和II型)层析、反相和亲和层析。涉及核酸分离的任何可用亲和层析方法都适合使用。阴离子交换层析或任一种或多种使用的其它层析步骤或技术可使用固定相、置换层析方法、模拟移动床技术和/或连续床柱或系统。另外，任一种或多种所述步骤或技术可使用高效液相层析技术或系统。

因此，所述方法优选包括含三股螺旋亲和层析的纯化步骤和离子交换层析的另外步骤，还可包含疏水作用层析或凝胶渗透层析。离子交换层析步骤既可处于流化床离子交换层析中，也可为轴向和/或径向高分辨率阴离子交换层析。最优选的方法包括离子交换层析、三股螺旋亲和层析和疏水作用层析步骤依该次序的组合。裂解物过滤或其它絮凝物去除可先于第一层析步骤。

因此，连续裂解可与以上列出的纯化步骤组合，产生含pDNA的高纯度产物。例如，其可与絮凝物去除(例如裂解物过滤、沉降或离心)、离子交换层析(例如阳离子或阴离子交换)、三股螺旋亲和层析和疏水作用层析中的至少一种组合。在一个实施方案中，连续裂解之后依次是阴离子交换层析、三股螺旋亲和层析和疏水作用层析。在另一个实施方案中，连续裂解之后依次是裂解物过滤、阴离子交换层析、三股螺旋亲和层析和疏水作用层析。这些步骤使得可确实放大质粒生产过程，其可产生具有前所未有纯度的大量pDNA。宿主DNA和RNA以及蛋白质处于亚ppm范围。

所述方法还可使用大小排阻层析(SEC)、反相层析、羟磷灰石层析的和/或其它可用层析技术、方法或系统的其它步骤，与本文描述的符合本申请的步骤组合。

可使用絮凝物去除为所产生的pDNA产物提供更高纯度。该步骤可用于去除大量沉淀物质(絮凝物)。进行絮凝物去除的一种机制是通过裂解物过滤步骤，例如通过1-5mm、优选3.5mm的网格滤器，之后是作为精纯过滤步骤的深层过滤。进行絮凝物去除的其它方法是通过离心或沉降。

可使用离子交换层析为所产生的pDNA产物提供更高纯度。可根据杂质特性和溶液pH选择阴离子交换。

可使用阴离子交换层析为所产生的pDNA产品提供更高纯度。阴离子交换层析起将带负电(或酸性)分子结合至带正电支持体的作用。然后，使用离子交换层析使分子可依据其电荷而被分离。通过此技术可容易地分离分子(酸性、碱性和中性的)家族。可以使用分步洗脱方案，许多杂质洗脱在早期级分中，pDNA洗脱在晚期级分中。阴离子交换对从pDNA制品中去除蛋白质和内毒素非常有效。

对于离子交换层析，填料和制备此材料的方法以及制备、聚合和官能化阴离子交换层析与通过其洗脱和分离质粒DNA的过程在本领域众所周知。

为合成用于阴离子交换层析填料的基体材料而使用的化合物可为任何化合物，条件是具有疏水性的各种官能团或各种离子交换基团可在合成基础材料之后通过后反应导入。单官能单体的实例包括苯乙烯、邻卤甲基苯乙烯、间卤甲基苯乙烯、对卤甲基苯乙烯、邻卤烷基苯乙烯、间卤烷基苯乙烯、对卤烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-邻卤甲基苯乙烯、α-甲基间卤甲基苯乙烯、α-甲基对卤甲基苯乙烯、α-甲基-邻卤烷基苯乙烯、α-甲基间卤烷基苯乙烯、α-甲基对卤烷基苯乙烯、邻羟甲基苯乙烯、间羟甲基苯乙烯、对羟甲基苯乙烯、邻羟烷基苯乙烯、间羟烷基苯乙烯、对羟烷基苯乙烯、α-甲基邻羟甲基苯乙烯、α-甲基间羟甲基苯乙烯、α-甲基对羟甲基苯乙烯、α-甲基邻羟烷基苯乙烯、α-甲基间羟烷基苯乙烯、α-甲基对羟烷基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、羟乙基丙烯酸酯、羟甲基丙烯酸酯和乙酸乙烯酯。最优选的化合物是芳环上取代的卤烷基，卤素例如为Cl、Br、I和F，直链和/或支链饱和烃具有2-15个碳原子。多官能单体的实例包括二乙烯苯、三乙烯苯、二乙烯甲苯、三乙烯甲苯、二乙烯萘、三乙烯萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亚甲基双甲基丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺。

可通过后反应导入各种离子交换基团。基体材料的制备包括第一步骤，其中单官能单体和多官能单体按适当比例称出，添加精确称出的稀释剂或溶剂(用于调整形成的粒子中的孔)以及类似地精确称出的聚合引发剂，随后充分搅拌。然后对混合物进行水包油型悬浮聚合，其中将混合物添加到溶解了预先精确称出的悬浮稳定剂的水溶液中，通过用搅拌器混合形成目标大小的油滴，通过逐渐加热混合溶液进行聚合。单官能单体对多官能单体的比例一般为约1摩尔单官能单体和约0.01-0.2摩尔多官能单体，以便获得基体材料软颗粒。聚合引发剂也没有具体限制，使用常用的偶氮二型和/或过氧化物型。

还可使用悬浮稳定剂，例如离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和有两亲性的聚合物或其混合物，以防止油滴自身之间的聚集。

用于纯化质粒DNA的离子交换层析的填料优选具有相对大的孔直径，具体是在1500-4000埃的范围内。将离子交换基团导入基体材料的表面改性在本领域众所周知。

两种类型的洗脱液可用于离子交换层析。可以使用含低浓度盐的第一洗脱液和含高浓度盐的第二洗脱液。洗脱方法为从第一洗脱液向第二洗脱液的逐步转换和连续地改变从第一洗脱液到第二洗脱液的组成的梯度洗脱方法。可以使用在这些离子交换层析洗脱液中通常使用的缓冲液和盐。对于含低浓度盐的第一洗脱液，特别优选缓冲剂浓度10-50mM、pH值6-9的水溶液。对于含高浓度盐的第二洗脱液，特别优选洗脱液C中加入0、1至2M钠盐的水溶液。对于钠盐，可使用氯化钠和硫酸钠。

此外，可以使用二价金属离子的鳌合剂，例如乙二胺四乙酸，用于抑制由于大肠杆菌裂解物中的DNA降解酶而造成的质粒降解。二价金属离子鳌合剂的浓度优选为0.1-100mM。

各种各样的商业上可获得的阴离子交换基质适用于本发明，包括但不限于可从POROS Anion Exchange Resins、Qiagen、Toso Haas、Sterogene、Spherodex、Nucleopac和Pharmacia获得的阴离子交换基质。例如，柱(Poros II PI/M，4.5mm×100)初始用pH 7.5的20mMBis/TRIS丙烷和0.7M NaCl平衡。上样，并用相同的初始缓冲液流洗。然后应用约25倍柱体积的0.5M-0.85M NaCl的洗脱梯度，收集级分。优选的阴离子交换层析包括Fractogel TMAE HiCap。

三股螺旋亲和层析特别描述于专利US 6,319,672、6,287,762以及申请人经WO 02/77274公开的国际专利申请。

三股螺旋亲和层析基于寡核苷酸和双链DNA内的靶序列的特异性杂交。这些寡核苷酸可含有以下碱基：

-胸腺嘧啶(T)，其能与双链DNA的A.T双联体形成三联体(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)；

-腺嘌呤(A)，其能与双链DNA的A.T双联体形成三联体；

-鸟嘌呤(G)，其能与双链DNA的G.C双联体形成三联体；

-质子化胞嘧啶(C+)，其能与双链DNA的G.C双联体形成三联体(Rajagopal等，loc.Cit.)；

-尿嘧啶(U)，其能与A.U或A.T碱基对形成三联体。

优选地，使用的寡核苷酸包含富胞嘧啶的同型嘧啶序列，存在于DNA中的特异性序列为同型嘌呤-同型嘧啶序列。胞嘧啶的存在使具有三股螺旋成为可能，三股螺旋在胞嘧啶质子化的酸性pH下稳定，在胞嘧啶被中和的碱性pH去稳定。

寡核苷酸和存在于DNA中的特异性序列优选互补，以容许形成三股螺旋。通过使用完全互补的寡核苷酸和特异性序列，可获得最佳收率和最佳选择性。例如，寡核苷酸为聚(CTT)，特异性序列为聚(GAA)。优选寡核苷酸具有序列5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)₇)(SEQ ID NO：1)，其中碱基GAAG不形成三股螺旋，但能使寡核苷酸序列(CTT)₇和连接臂间隔开。这些寡核苷酸能够与含有互补单元(GAA)的特异性序列形成三股螺旋。如实施例中所述，所述序列具体可为含有7、14或17个GAA单元的区域。

特别令人关注的另一个序列是序列5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(SEQ ID NO：2)。此序列与寡核苷酸5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID NO：3)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：4)形成三股螺旋。在此情况下，寡核苷酸以反平行方向结合多嘌呤链。这些三股螺旋仅在存在Mg²⁺的情况下稳定(Vasquez等，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，Science，1991，251，1360-1363)。

如上所述，所述特异性序列可以是天然存在于双链DNA中的序列，或是人工导入到双链DNA中的合成序列。特别有利的是使用能与天然存在于双链DNA(例如质粒复制起点或标记基因)中的序列形成三股螺旋的寡核苷酸。对此，通过序列分析知晓，这些DNA的某些区域，具体地说是复制起点中，可能具有同型嘌呤-同型嘧啶区域。合成能与这些天然同型嘌呤-同型嘧啶区域形成三股螺旋的寡核苷酸，有利地能使本发明方法应用于未修饰质粒，尤其是市售质粒pUC、pBR322、pSV等类型。在天然存在于双链DNA中的同型嘌呤-同型嘧啶序列中，可提及包含存在于大肠杆菌质粒ColE1复制起点中的序列5′-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQ ID NO：5)的全部或部分的序列。在这种情况下，形成三股螺旋的寡核苷酸具有序列：5′-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID NO：6)，并交替地与双螺旋的两条链结合，如Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)以及Jayasena和Johnston(Nucleic Acids Res.1992，20，5279-5288)所述。还可以提及质粒pBR322β-内酰胺酶基因的序列5′-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID NO：7)(Duval-Valentin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)。

已经在质粒ColE1以及质粒pCOR的复制起点中鉴定出能与特定寡核苷酸形成三股螺旋结构的合适靶序列。pCOR质粒是具有条件性复制起点的质粒，特别描述于US 2004/142452和US 2003/161844。ColE1衍生的质粒含有12聚体的同型嘌呤序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO：8)，作图于参与质粒复制的RNA-II转录物上游(Lacatena等，1981，Nature，294，623)。该序列与12聚体互补5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO：9)寡核苷酸形成稳定的三股螺旋结构。pCOR骨架含有14个非重复碱基的同型嘌呤片段(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO：10)，其位于pCOR的γ起点复制子的富A+T节段中(Levchenko等，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。该序列与14聚体互补寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQID NO：11)形成稳定三股螺旋结构。相应的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO：8)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQID NO：11)有效地和特异性地靶向位于ColE1 ori或pCOR(oriγ)的复制起点内的其各自的互补序列。实际上，单个不规范三联体(T*GC或C*AT)可导致三股螺旋结构完全去稳定。

使用能与存在于复制起点或标记基因中的序列形成三股螺旋的寡核苷酸特别有利，因为其使得有可能使用相同寡核苷酸纯化含所述复制起点或所述标记基因的任何DNA。因此，不必要修饰质粒或双链DNA以将人工特异性序列掺入到其中。

尽管优选完全互补序列，但要理解的是，在寡核苷酸序列和DNA中存在的序列之间可容许一些错配，只要它们不导致太大的亲合性损失。可提及存在于大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ ID NO：12)。就其而言，中断多嘌呤序列的胸腺嘧啶可由第三条链的鸟嘌呤识别，从而形成G*TA三联体，当其位于两个T*AT三联体侧翼时是稳定的(Kiessling等，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。

按照具体实施方案，本发明寡核苷酸包含序列(CCT)_n、序列(CT)_n或序列(CTT)_n，其中n是1-15的整数，包括1和15。使用(CT)_n或(CTT)_n型序列特别有利。实际上，申请人证实，纯化收率受寡核苷酸中C量影响。具体地说，如实施例7所示，当寡核苷酸含较少胞嘧啶时，纯化收率升高。要理解的是，本发明的寡核苷酸也可以组合(CCT)、(CT)或(CTT)单元。

使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修饰天然碱基组成)或化学修饰的。具体地说，寡核苷酸有利地可具有某些化学修饰，所述修饰能使其对核酸酶的抗性或保护性或对具体序列的亲合性增强。还应理解的是，寡核苷酸指任何连接的连续核苷，其经历了骨架修饰，目的是使其对核酸酶更有抗性。在可能的修饰当中，可提及能与DNA形成三股螺旋的寡核苷酸硫代磷酸酯(Xodo等，Nucleic Acids Res.，1994， 22，3322-3330)以及具有缩甲乙醛或磷酸甲酯骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。还有可能使用用核苷酸的α异头物合成的寡核苷酸，其也与DNA形成三股螺旋(LeDoan等，Nucleic Acids Res.1987， 15，7749-7760)。对骨架的另一种修饰是氨基磷酸酯连接。例如，可提及Gryaznov和Chen描述的N^3′-P^5′核苷酸间氨基磷酸酯连接，其产生与DNA形成特别稳定的三股螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994， 116，3143-3144)。在骨架的其它修饰之中，还可以提一下2′-O-甲基核糖、磷酸二酯等的核糖核苷酸的用途(Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.， 116，3143-3144)。最后，基于磷的骨架可被也能形成三股螺旋的PNA(肽核酸)中的聚酰胺骨架(Nielsen等，Science，1991， 254，1497-1500；Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993， 115，6477-6481)或DNG中的基于胍的骨架(脱氧核糖核胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995， 92，6097-6101)或也形成三股螺旋的DNA聚阳离子类似物取代。

第三条链的胸腺嘧啶还可被5-溴尿嘧啶替代，5-溴尿嘧啶增加寡核苷酸对DNA的亲合性(Povsic和Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。所述第三条链还可含有非天然碱基，在这些碱基之中可提及7-脱氮-2′-脱氧黄嘌呤核苷(Milligan等，Nucleic Acids Res.，1993， 21，327-333)、1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992， 114，1470-1478)、8-氧腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2′-O-甲基伪异胞苷或本领域技术人员已知的任意其它修饰(关于综述，参见Sun和Hélène，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993， 3，345-356)。

更特别地讲，另一种类型的寡核苷酸修饰具有改进寡核苷酸和特异性序列之间的相互作用和/或亲合性的目的。具体地说，本发明最有利的修饰在于使寡核苷酸的胞嘧啶甲基化。因此，如此甲基化的寡核苷酸显示出值得关注的特性：在更接近中性的pH范围(≥5)与特异性序列形成稳定的三股螺旋。因此，其有可能在比现有技术的寡核苷酸高的pH值起作用，也就是说在质粒DNA降解风险小得多的pH值起作用。

用于本发明的方法的寡核苷酸长度在5-30个碱基之间。有利地使用长度超过10个碱基的寡核苷酸。本领域技术人员可针对各个独立情况改变所述长度，以适合所期望的相互作用的选择性和稳定性。

本发明的寡核苷酸可通过任何已知技术合成。具体地说，它们可利用核酸合成仪制备。非常明显地可以使用本领域技术人员已知的任何其它方法。

为使寡核苷酸与支持体共价偶联，通常官能化寡核苷酸。因此，它可以在5′或3′位置被硫醇、胺或羧基末端基团修饰。具体地说，添加硫醇、胺或羧基使得能够例如将寡核苷酸偶联到带有二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物、澳化氰或醛官能团的支持体。这些偶联通过在寡核苷酸和支持体之间建立二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺连接形成。可使用本领域技术人员已知的任何其它方法，例如双功能偶联试剂。

此外，为改进与偶联寡核苷酸的杂交，寡核苷酸含有“臂”和“间隔区”碱基序列可能有优势。臂的使用使在距支持体的选定距离结合寡核苷酸在实际上成为可能，使其与DNA相互作用的条件得到改善。所述臂有利地由线性碳链和胺组成，所述线性碳链包含1-18个、优选6或12个(CH₂)基团，所述胺允许结合柱。所述臂连接至寡核苷酸或“间隔区”的磷酸酯，所述“间隔区”由不干扰杂交的碱基组成。因此，所述“间隔区”可包含嘌呤碱基。举例来说，所述“间隔区”可包含序列GAGG。所述臂有利地由含6或12个碳原子的线性碳链组成。

三股螺旋亲和层析对除去RNA和基因组DNA非常有效。这些层析可为散装或预装在柱中的官能化层析支持体、官能化塑性表面或有磁性或无磁性的官能化乳胶珠。优选使用层析支持体。举例来说，能使用的层析支持体例如为琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖以及其衍生物(例如Sephadex、Sepharose、Superose等)；聚合物，例如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)；或接枝或未接枝硅。层析柱可以扩散或灌注模式操作。

为了获得更好的纯化收率，特别有利的是在质粒上使用含有几个寡核苷酸杂交位置的序列。几个杂交位置的存在实际上促进所述序列和寡核苷酸之间的相互作用，导致纯化收率提升。因此，对于含n个重复的(CCT)、(CT)或(CTT)基序的寡核苷酸，优选使用含至少n个互补基序、优选n+1个互补基序的DNA序列。带有n+1个互补基序的序列因而提供了与寡核苷酸杂交的两个位置。有利地，DNA序列含有多达11个杂交位置，也就是说n+10个互补基序。

本发明方法可用于纯化任何类型的双链DNA。后者的实例是环状DNA，例如质粒，其通常带有一个或多个治疗重要基因。该质粒还可带有复制起点、标记基因等。本发明方法可直接应用于细胞裂解物。在此实施方案中，通过转化后的细胞培养扩增的质粒在细胞裂解之后直接纯化。本发明方法还可应用于澄清裂解物，也就是说应用于在细胞裂解物中和和离心之后获得的上清液。其很明显还可应用于通过已知方法预纯化的溶液。该方法还能够从包含不同序列的DNA混合物中纯化带有重要序列的线性或环状DNA。本发明方法还可用于纯化双链DNA.

细胞裂解物可为原核细胞或真核细胞的裂解物。

对于原核细胞，可举细菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)或链霉菌(Strepomyces)作为实例。对于真核细胞，可举动物细胞、酵母、真菌等，更特别地可举克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酵母属(Saccharomyces)酵母菌或COS、CHO、C127、NIH3T3等细胞。

可以采用包括至少三股螺旋亲和层析步骤的本发明方法为所产生的pDNA产品提供更高纯度。在三股螺旋亲和层析中，寡核苷酸与支持体结合，例如层析树脂或其它基质。然后，例如通过将样品施加到含有结合至层析树脂的寡核苷酸的层析柱，将待纯化的样品与结合的寡核苷酸混合。样品中的目标质粒将与寡核苷酸结合，形成三股螺旋。在寡核苷酸和质粒之间的键可为Hoogsteen键。此步骤可在pH≤5、高盐浓度、20分钟或更多接触时间的条件下发生。可采用洗涤步骤。最后，在中性缓冲液中发生胞嘧啶去质子化，将所述质粒从结合寡核苷酸的树脂上洗脱下来。

疏水作用层析使用基质上的疏水部分来吸引待纯化样品中分子中的疏水区。应当指出的是，这些HIC支持体通过“群集”效应来起作用；当这些分子结合时没有形成或共用共价键或离子键。疏水作用层析的好处在于其非常有效地去除开环质粒形式和其它杂质，例如gDNA、RNA和内毒素。

疏水作用层析基体材料的合成以及用于制备、聚合和官能化疏水作用层析和通过其洗脱和分离质粒DNA的方法在本领域众所周知，特别地描述于美国专利第6,441,160号，其在此通过引用结合到本文中。

为合成用于疏水作用层析填料的基体材料而使用的化合物可为任何化合物，条件是具有疏水性的各种官能团或各种离子交换基团可在合成基体材料之后通过后反应导入。单官能单体的实例包括苯乙烯、邻卤甲基苯乙烯、间卤甲基苯乙烯、对卤甲基苯乙烯、邻卤烷基苯乙烯、间卤烷基苯乙烯、对卤烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-邻卤甲基苯乙烯、α-甲基间卤甲基苯乙烯、α-甲基对卤甲基苯乙烯、α-甲基-邻卤烷基苯乙烯、α-甲基间卤烷基苯乙烯、α-甲基对卤烷基苯乙烯、邻羟甲基苯乙烯、间羟甲基苯乙烯、对羟甲基苯乙烯、邻羟烷基苯乙烯、间羟烷基苯乙烯、对羟烷基苯乙烯、α-甲基邻羟甲基苯乙烯、α-甲基间羟甲基苯乙烯、α-甲基对羟甲基苯乙烯、α-甲基邻羟烷基苯乙烯、α-甲基间羟烷基苯乙烯、α-甲基对羟烷基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、羟乙基丙烯酸酯、羟甲基丙烯酸酯和乙烯乙酸酯。最优选的化合物是芳环上取代的卤烷基基团，卤素例如为Cl、Br、I和F，直链和/或支链饱和烃具有2-15个碳原子。

多官能单体的实例包括二乙烯苯、三乙烯苯、二乙烯甲苯、三乙烯甲苯、二乙烯萘、三乙烯萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亚甲基双甲基丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺。

可通过后反应导入各种疏水官能团或各种离子交换基团。由于基体材料自身具有的疏水性或由盐浓度变化和pH值变化引起的基体材料自身的膨胀或缩小，会对要分离的目标产物有影响，为使此影响最小，优选使用相对亲水的单体制备基体材料，例如甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、羟乙基丙烯酸酯、羟甲基丙烯酸酯和乙烯乙酸醋。基体材料的制备包括第一步骤，其中单官能单体和多官能单体按适当比例称出，添加精确称出的稀释剂或溶剂(用于调整形成的粒子中的孔)以及类似地精确称出的聚合引发剂，随后充分搅拌。然后对混合物进行水包油型悬浮聚合，其中将混合物添加到溶解了预先精确称出的悬浮稳定剂的水溶液中，通过用搅拌器混合形成目标大小的油滴，通过逐渐加热混合溶液进行聚合。单官能单体对多官能单体的比例一般为约1摩尔单官能单体和约0.01-0.2摩尔多官能单体，以便获得基体材料软颗粒。多官能单体的比率可增加至约0.2-0.5mol，以便获得基体材料硬颗粒。单独的多官能单体可用于获得比以往更硬的颗粒。

聚合引发剂也没有具体限制，使用常用的偶氮二型和/或过氧化物型。

还可使用悬浮稳定剂，如离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和具两亲性的聚合物或其混合物，以防止油滴自身之间的聚集。

形成颗粒的直径通常约2-500μm。优选的颗粒直径包括2-30μm，更优选约2-10μm。当目的是以高纯度大规模纯化核酸时，所述颗粒直径为约10-100μm，当从粗制母液分离目标产品时，所述颗粒直径可为100-500μm，更优选约200-400μm。为调整颗粒直径，可以在聚合期间调整搅拌器转速。当需要小直径颗粒时，转数可以增加，当期望大颗粒时，转数可以降低。在此，由于使用的稀释剂用于调整所形成颗粒中的孔，所以稀释剂的选择特别重要。作为一个基本概念，对于要用于聚合的溶剂，通过以不同方式组合单体的不良溶剂和单体的优良溶剂来进行调整。孔直径大小可根据计划分离的核酸的分子大小适当地选择，但对于疏水作用层析填料优选在500-4000埃的范围内，对于离子交换层析填料优选在1500-4000埃的范围内。

在疏水作用层析中，优选分别利用具有不同疏水性的填料分离具有不同疏水性的核酸，对此，基体材料的表面改性很重要。

疏水基团可从长链或分支基团中选择，包括具有2-20个碳原子的饱和烃基或不饱和烃基。芳香环也可包含在烃基中。

疏水基团也可以在具有下式的化合物中选择：

其中n＝0至约20，亚甲基可为直链的或分支的，m＝0至约3，烃基可为直链的或分支的，A是C＝O基团或醚基，但亚甲基可在没有A的情况下直接与基体材料结合。

疏水基团还可包括具有2-20个碳原子的烷撑二醇的醚基，其由0-10个重复单元组成，其中与基体材料反应的官能团的对端可为原样的OH基团，或可用具有1-4个碳原子的烷基加帽。

上述疏水基团可单独使用，或在混合物中使用，以修饰表面。

具有6-20个碳原子的烷基链优选用于象质粒一样的低疏水性。具有2-15个碳原子的长链烃基用于分离高疏水性化合物，例如来源于大肠杆菌的RNA以及人类和动物细胞中的RNA。具有4-18个碳原子的烃基用于分离具有相对低疏水性的化合物，例如来源于大肠杆菌的DNA以及人类及动物细胞中的DNA。

在分离这些化合物时，不限于所述实例，可适当地选择化合物来修饰表面。实际上，填料的疏水性程度根据培养基中的盐浓度或用于吸附的洗脱液中的盐浓度而变化。此外，填料的疏水性程度根据导入基体材料中的基团数量而有所不同。

具体地说，疏水作用层析基体材料的孔直径优选为500-4000埃，但其可根据要分离核酸的分子大小而从所述范围中适当地选择。一般地，因为填料上的核酸保留以及吸附能力(样品超前量)根据孔直径而有所不同，所以优选对大分子量核酸使用具有大孔直径的基体材料，对小分子量核酸使用具有小孔直径的基体材料。

例如，可使用含卤素化合物和/或碳酰卤和催化剂(例如FeCl₃、SnCl₂或AlCl₃)，并利用Friedel-Craft反应，使苯乙烯基体材料与包含长链烷基的疏水基团反应，可作为脱卤素化合物和/或酰化化合物直接加入到基体材料中的芳环。在基体材料为含卤素基团的颗粒的情况下，例如，使用具有OH(其包含在待添加官能团中)的化合物，如丁醇，以及利用Williamson反应和强碱催化剂例如NaOH或KOH，有可能通过醚键导入所述官能团。在期望添加的官能团为含氨基化合物如己胺的情况下，有可能使用强碱催化剂如NaOH或KOH并利用脱卤素酸反应来添加。相反地，对于含OH基的基体材料，如果预先将环氧基、卤素基团或碳酰卤基团导入到期望加入的官能团中，则有可能通过醚或酯键导入官能团。对于含环氧基的基体材料，如果与具有包含在期望加入的官能团中的OH基或氨基的化合物反应，则有可能通过醚或氨基键导入官能团。而且，在期望加入的官能团含卤素基团的情况下，有可能使用酸催化剂通过醚键加入官能团。由于欲分离的目标产物的疏水性影响导入到基体材料中的官能团比例，所以该比例可不受限制，但一般来说，每1g干基体材料加入具有约0.05-4.0mmol官能团的填料是适合的。

对于表面改性，描述了在形成基体材料或颗粒之后通过后反应加入官能团的方法。按照相同方法进行表面改性，其中基体材料在使用具有聚合前加入的所述官能团的单体聚合之后形成。

基体材料也可以是多孔硅胶。一种生产硅胶的方法包括：使用例如烷基三甲氧基硅烷的化合物将硅烷直接偶联到按照“LatestHigh-Speed Liquid Chromatography”，289页及以后(Toshio Nambara和Nobuo Ikegawa撰写，Tokyo Hirokawa Bookstore 1988年出版)中所述方法生产的颗粒上。在使用含环氧基的硅烷偶联剂偶联硅烷之前或之后，可按照上述方法加入官能团。以每1g干基体材料约0.05-4.0mmol添加官能团导入的官能团比例是适合的。

将洗脱液用于疏水作用层析分离或纯化步骤。通常，使用两类洗脱液。一类洗脱液含高浓度盐，而第二类洗脱液含低浓度盐。洗脱方法包括从具有高浓度盐的洗脱液向具有低浓度盐的洗脱液的逐步转换，可使用连续地改变一种洗脱液至另一种洗脱液的组成的梯度洗脱方法。可使用通常用于疏水作用层析的缓冲液和盐。对于含高浓度盐的洗脱液，特别优选具有1.0-4.5M的盐浓度和6-8的pH值的水溶液。对于含低浓度盐的洗脱液，具有0.01-0.5M的盐浓度和6-8的pH值的水溶液是特别优选的盐。通常，硫酸胺和硫酸钠可用作盐。

可通过依次组合导入弱疏水性官能团的填料和导入强疏水性官能团的填料，进行疏水作用层析质粒DNA纯化步骤。实际上，培养大肠杆菌的培养基含有大量疏水性不同的各种组分，例如多糖、大肠杆菌基因组DNA、RNA质粒和蛋白质。还知晓的是，即便在核酸自身当中也存在疏水性差异。与质粒相比，变成杂质的蛋白质具有更高的疏水性。

许多疏水作用层析树脂可由商业渠道获得，例如Fractogelpropyl、Toyopearl、Source isopropyl或任何其它具有疏水基团的树脂。最优选的树脂是Toyopearl散装聚合介质。Toyopearl是结合了高机械和化学稳定性的甲基丙酸烯聚合物。树脂可以以非官能化的“HW”系列树脂获得，可以用于离子交换层析或疏水作用的表面化学衍化。可使用以不同表面化学和疏水性水平为特征的四类Toyopearl HIC树脂。Toyopearl HIC树脂的疏水性经由以下顺序增加：醚、苯基、丁基和己基。优选Toyopearl HIC树脂(即具有1000埃孔直径的ToyopearlHW-65)的结构显示如下：

上述Toyopearl树脂可具有不同粒度级别。Toyopearl 650C具有约50-150μm的粒度，优选约100μm，而Toyopearl 650M具有约40-90μm的粒度，优选约65μm，Toyopearl 650S具有约20-50μm的粒度，优选约35μm。众所周知，粒度影响分辨率，即，分辨率由C至M至S粒度级别提高，因此随粒度减小而增加。在本发明质粒DNA的分离和纯化方法中，HIC层析步骤使用的最优选的Toyopearl树脂是Toyopearl丁基-650S，其由Tosoh Bioscience商品化。

可进行进一步的渗滤步骤。按照本领域已知的标准技术，在该方法中适合使用标准的、商业上可获得的渗滤材料。优选的渗滤方法是根据质粒大小而使用具有30,000-500,000范围截留分子量的超滤膜的渗滤。此渗滤步骤容许进行缓冲液交换，随后进行浓缩。通过切向流过滤(膜截留值30kDa)将洗脱液浓缩3-4倍，达到约2.5-3.0mg/mL的目标浓度，浓缩物通过以恒定体积用10倍体积盐水渗滤进行缓冲液交换，用盐水调节到目标质粒浓度。根据浓缩物样品在260nm的吸光度计算质粒DNA浓度。通过0.2μm囊式过滤器过滤质粒DNA溶液，并分成几等份，保存于2-8℃冷藏室中的容器内，直至进一步处理。这产生了纯化的浓缩物，超螺旋质粒的质粒DNA浓度为约70％、75％、80％、85％、90％、95％和优选99％。使用此方法的总质粒回收率为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率60％。

按以下条件进行此渗滤步骤：用于步骤a)和步骤b)的缓冲液：

i)第一次渗滤(步骤a)对12.5-13.0倍体积的50mM Tris/HCl、150mM NaCl，pH 7.4(称为缓冲液I)进行，和

ii)使以上步骤a)的保留物对3.0-3.5倍体积的盐水赋形剂(150mMNaCl)进行第二次渗滤(步骤b)。本发明的此优选渗滤步骤有效且彻底地除去硫酸铵和EDTA。此外，在此渗滤步骤之后，获得了合适的生理NaCl浓度(约150mM)和1mM以下(200μM-1mm之间)的最终Tris浓度。

优选所使用的包含纯化质粒DNA的质粒DNA组合物基本没有杂质或在亚ppm杂质范围内，因此是药物级DNA。药物级质粒DNA组合物可包含亚ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg/100mg质粒DNA)的gDNA、RNA和蛋白杂质。

药物级质粒DNA组合物可含有低于约0.01％或低于0.001％、优选低于0.0001％或优选低于0.00008％(＜0.0008％，即＜0.00008mg/100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。

药物级质粒DNA组合物可含有低于约0.01％或低于0.001％、优选低于0.0001％或优选低于0.00002％(＜0.0002％，即＜0.0002mg/100mg质粒DNA)的RNA杂质。

药物级质粒DNA组合物可含有低于约0.0001％、最优选低于0.00005％(＜0.00005％，即＜0.00005mg/100mg质粒DNA)的宿主细胞蛋白杂质。

药物级质粒DNA组合物还可包括含有低于0.1EU/mg的内毒素的质粒DNA制品。

因此，药物级质粒DNA组合物主要含环形质粒DNA，更确切地说，含80％、85％、90％、95％或99％以上的闭环形式质粒DNA。

可具有低于约0.01％的可检测水平宿主细胞基因组DNA和低于约0.001％宿主细胞RNA的药用组合物可包括在本发明中。最优选所述药物级质粒DNA组合物可具有低于约0.00008％的宿主细胞基因组DNA和低于约0.00002％的宿主细胞RNA和低于约0.00005％的宿主细胞蛋白。实际上，上述纯度水平的任意组合都可用于本发明范围内任意具体药物级质粒DNA组合物。所述组合物还可包含其它药物可接受的组分、缓冲剂、稳定剂或改善基因转移(具体地说是改善质粒DNA向细胞或有机体中的转移)的化合物。

如此获得的质粒DNA然后可按照本发明配制在作为盐水赋形剂的NaCl和合适浓度的Tris缓冲液中，以便保持或控制pH值在6.2-9之间，优选在6.5-8之间，更优选在7-7.5之间。本申请的质粒DNA制剂由于可令人惊奇地在这些条件下于5℃直到25℃(即在室温)以稳定的非降解形式储存延长的时间段而特别有用。

如上所述，纯化的质粒DNA存在于溶液中，内毒素低于或约为0.1EU/mg，宿主细胞蛋白杂质低于或约为0.00005％，宿主细胞RNA杂质低于或约为0.00002％，宿主细胞基因组DNA杂质低于或约为0.00008％。药物级质粒DNA组合物包含亚ppm(＜0.00001％)宿主细胞gDNA、RNA和蛋白杂质。更确切地讲，所述药物级质粒DNA组合物基本无可检测的gDNA、RNA和蛋白杂质。另外，所述药物级质粒DNA组合物基本无可检测的细菌宿主染色体DNA，因此含低于约0.01％或低于约0.001％或低于约0.0001％或优选低于0.00008％的染色体DNA或基因组DNA。再者，所述药物级质粒DNA组合物基本无可检测的宿主细胞染色体RNA，更确切地讲含低于约0.01％或低于0.001％、优选低于0.0001％或优选低于约0.00002％的宿主细胞RNA杂质。再者，所述药物级质粒DNA组合物基本无可检测的宿主细胞蛋白杂质，更确切地讲低于约0.0001％、最优选低于0.00005％的宿主细胞蛋白杂质。最后，所述药物级质粒DNA组合物基本无可检测的内毒素杂质，更确切地讲低于0.1EU/mg内毒素。所述质粒DNA基本上以超螺旋形式存在，更确切地讲包含约99％或以上的闭环形式质粒DNA。

在将纯化的质粒DNA分装入小瓶前可进行除菌过滤步骤。还提供可通过这些方法获得的纯化质粒DNA小瓶。

可对具有不同大小的任意类型载体进行纯化。可分离的质粒DNA的大小范围为约5kb至约50kb，优选15kb-50kb，所述DNA包括约3kb的载体骨架、治疗基因和相连的调节序列。因此，可用于本发明的载体骨架能携带约10-50kb或更大的插入片段。所述插入片段可包括来自任何有机体的DNA，但优选为哺乳动物来源，除编码治疗蛋白的基因之外其还可包含调节序列，例如启动子、聚腺苷酸化序列、增强子、基因座控制区等。编码治疗蛋白的基因可为基因组来源，因此含有其基因组结构中所示的外显子和内含子，或者可来源于互补DNA。这种载体可包括例如可以高拷贝数复制、具有用于治疗基因插入的多接头的载体骨架、编码选择标记(例如SupPhetRNA、四环素卡那霉素抗性基因)的基因，在物理上小且稳定。质粒的载体骨架有利地允许哺乳动物、其它真核动物、原核动物或病毒DNA片段插入，产生的质粒可纯化并用于体内或活体外的基于质粒的疗法。载体具有相对高的拷贝数，即在20-40拷贝/细胞至1000-2000拷贝/细胞的范围内，可通过本发明方法分离和纯化。例如，按照本发明方法优选含pUC复制起点的载体。pUC复制起点允许更有效的质粒DNA复制，使质粒拷贝数/细胞比例如pBR322起点高达10倍。优选地，可通过本发明方法分离具有条件复制起点的质粒DNA或如US 2003/1618445描述的pCOR。产生的高拷贝数大大提高了质粒DNA对染色体DNA、RNA、细胞蛋白和辅因子的比率，提升了质粒收率，使下游纯化更容易。因此，根据本发明可以使用任何载体(质粒DNA)。代表性载体包括但不限于NV1FGF质粒。NV1FGF是编码酸性成纤维细胞生长因子或1型成纤维细胞生长因子(FGF-1)的质粒，用于治疗患有末期外周动脉阻塞性疾病(PAOD)或外周动脉疾病(PAD)的患者。Camerota等(J Vasc.Surg.，2002，35，5：930-936)描述，对患有不可重现末期PAD、具有静息疼痛或组织坏死的51名患者，将提高的单剂量或重复剂量的NV1FGF肌内注射入缺血性大腿和小腿中。随后评定各种参数，例如经皮氧分压、踝肱指数和趾肱指数、疼痛评估和溃疡愈合。在给予NV1FGF后观察到肱指数显著升高、疼痛减轻、溃疡面积消退和灌注改善。

所述质粒DNA组合物还可包含至少一种用于改善质粒DNA向细胞中转移的聚合物。所述质粒DNA组合物还可包含药物可接受的载体或赋形剂。可配制所述质粒DNA组合物，用于通过注射、静脉注射、肌内注射、肿瘤内注射、小颗粒轰击或局部施用传递至组织。在这些组合物中的质粒DNA基本上为超螺旋闭环DNA形式。

用于本发明的宿主细胞可为任何细菌株，即既可是革兰氏阳性株，也可是革兰氏阴性株，例如能够保持高拷贝数(例如20-200个拷贝)的上述质粒的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella.typhimurium)或芽胞杆菌。大肠杆菌宿主菌株可按照本发明使用，包括HB101、DH1和DH5αF、XAC-1和XAC-1pir 116、TEX2和TEX2pir42(WO04/033664)。一般不优选含F质粒或F质粒衍生物的菌株(例如JM109)，因为F质粒可与治疗性质粒产物共纯化。

实施例

克隆和分子生物学的一般技术

分子生物学的传统方法，例如用限制性内切酶消化、凝胶电泳、转化大肠杆菌、核酸沉淀等，如文献( Maniatis等，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook，1989.Molecular cloning：a laboratory manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork；Ausubel F.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.GSeidman和K.Struhl.1987.Current protocols in molecular biology1987-1988.John Willey and Sons，New York.)所述。通过依照已公开方法(Ausubel等，1987)的链终止法确定核苷酸序列。

限制性酶由New England B iolabs，Beverly，MA(Biolabs)提供。

为了进行连接，DNA片段在包含50mM Tris/HCl pH 7.4、10mMMgCl₂、10mM DTT、2mM ATP的缓冲液中、在存在噬菌体T4 DNA连接酶(Biolabs)的情况下保温。

用Biosearch 8600自动化DNA合成仪，使用生产商的建议，用在β位被氰乙基保护的亚磷酰胺，使用亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus和H.Kster，1984.Polymer supportoligonucleotide synthesis，XVIII：Use of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis ofDNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product，Nucl.Acids Res.，12，4539-4557：Giles，J.W.1985.Advances inautomated DNA synthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec.)。

使用连接DNA或检验其转化效力的DNA转化以下已为感受态的菌株：大肠杆菌DH5α[F/ endAl，hsdR17， supE44， thi-1， recAl，gyrA96， relA1，Δ( lacZYA- arqF)U169， deoR，Φ80dlac( lacZΔM15)](用于任何ColE1质粒)；或大肠杆菌XAC-pir(用于任何pCor衍生质粒)。

根据Klein等，1980的方案制备质粒DNA的小量制备物。

LB培养基用于大肠杆菌菌株生长(Maniatis等，1982)。菌株在37℃温育。细菌在补充有适合抗生素的LB培养基皿上涂布。

实施例1

直径对所使用速率的调整由连续裂解系统盘管中的雷诺数的计算结果得出。因为以下分析假定流体特性是牛顿特性，所以以下报告的计算仅在B1a中完全有效，在B2中一定程度有效。

雷诺数的数值容许本领域技术人员确定遇到的特性类型。在此，我们将仅关注管道中的流体流动(水力工程)。

1)非牛顿流体

在工业中最常遇到的两种非牛顿流体是Bingham和Ostwald deWaele。

在此情况下，雷诺数(Re)如下计算：

Re_N是广义雷诺数

Re_N＝(1/(2^n-3))×(n/3n+1)ⁿ×((ρ×Dⁿ×w^2-n)/m) (1)

D：横截面内径(m)

ρ：流体的体积质量(kg/m³)

w：流体的空间速度(m/s)

n：流动特性指数(无量纲)

m：流体稠度系数(dyn.sⁿ/cm²)

n和m凭经验确定(流变特性研究)。

2)牛顿流体

对于第一节，在式(1)中我们有：

Re＝f(内径、μ、ρ和u)，因为n和m是μ的函数。

Re＝(u×D×ρ)/μ (2)

ρ：流体的体积质量(kg/m³)

μ：流体粘度(Pa.s，1mPa.s＝1cP)

D：横截面内径(m)

u：流体的平均空间速度(m/s)

n＝1时式(1)简化成式(2)。

Q＝流速(m³/h)和S＝横截面的表面积(m²)，如果μ以cP给出，则：

Re＝(4×(Q/3600)×ρ)/((μ/1000)×∏×D) (3)

在圆形管道中，雷诺数低于2500的流动是层流，雷诺数在2000-500,000之间的流动是水力光滑湍流。在2000-2500之间的界限被有意地含糊，在该界限内使用两种类型的特性，以确定随后会发生什么，并凭经验选择。

3)计算

因为n和m通常是未知的，所以使用以下的近似值估计趋势：

牛顿流体(在所有横截面中)

ρ＝1000kg/m³(用于所有流体)

μ＝B1a中为5cP，B1b中为40cP(我们的数据)

B2中为2.5cP(我们的数据)

对于所测试的称为构型1和构型2(没有B1b管道)的两种标准管道构型，使用式(3)进行以下计算：

表2

盘管	构型1		构型2
	构型1		构型2		B1a	B2	B1a	B2
	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	512.760	2.59.5105	5612	B1a	B2	B1a	B2	2.5621
雷诺数过程	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	512.760	2.59.5105	5612	334	1564	141	495	2.5621
	层流	层流	层流	层流	334	1564	141	495

在这两种构型中，流动在所有阶段都是层流，溶液不能充分混合在一起。

对于其他管道构型(无B1b管道)，我们有：

表3

盘管	高速/标准直径		高速/16mm ID		高速/6mm ID
	高速/标准直径		高速/16mm ID		高速/6mm ID		B1a	B2	B1a	B2	B1a	B2
	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	512120	2.510210	516120	2.516210	56120	B1a	B2	B1a	B2	B1a	B2	2.56210
雷诺数过程	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	512120	2.510210	516120	2.516210	56120	707层流	2971湍流	531层流	1857层流	1415层流	4951湍流	2.56210

对于同时具有B1a和B1b管道的不同管道构型，使用式(3)进行类似的计算：

表4

盘管	高速			高速/最大搅拌
	高速			高速/最大搅拌			B1a	B1b	B2	B1a	B1a	B1a
	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	56120	516120	2.56210	53120	52120	B1a	B1b	B2	B1a	B1a	B1a	53160
雷诺数过程	粘度^*(cP)直径(mm)流速(L/h)	56120	516120	2.56210	53120	52120	1415层流	531层流	4951湍流	2829湍流	4244湍流	3773湍流	53160

明显地，可以通过调整管道直径和流速获得预定的雷诺值。

对于B2或Bl的两段(B1a和B1b)，本领域技术人员可预想许多直径和长度的组合。例如，B1的第一段可由6mm减少到3mm，以缩短长度和提高搅动。另外，n和m可通过对流体流变特性的研究来确定，并用来确定管道的正确特征。

除了搅动效率之外，还可考虑搅动持续时间，在本发明的某些实施方案中其通过调整盘管长度来获得。

对非牛顿流体，管道的直径或流体速度在式(1)中似乎不占主导地位(数据未显示)。换句话说，如果式(1)用于计算B1b和B2中的情况，与改变流速相比，改变直径看起来不会更有效。当需要高流速时，直径可以随流速一同改变。

这些原则可用作尽可能地在B1b和B2中限制搅动的基础，以避免片段化gDNA。

在裂解期间，搅动可相当剧烈，只要gDNA不变性。在B1起点处降低直径使得有可能增加搅动(提高Re)，以充分混合溶液2和细胞。另一方面，当细胞被裂解时，可降低搅动和对壁的摩擦力，以避免核酸片段化。增加直径使得有可能降低搅动(降低的Re)和摩擦(降低的速度)。

M1：混合流体。

B1a：在裂解开始时对混合进行微调：对流现象(宏观混合)。

B1b：使变性发生加上扩散现象(微观混合)。

假定广义雷诺数对非牛顿流体具有的含义与标准雷诺数对牛顿流体具有的含义相同。具体地说，假定在圆形截面管道中层流区的界限是Re_N＜2300。

中和在B2内进行。高流速往往由于引起太剧烈的搅动和在壁处的摩擦力(机械应力)而增加基因组DNA的片段化。使用大直径管道使降低搅动(Re)和摩擦力(速度)成为可能。我们在此放置了小直径管道(6mm)来避免不充分的搅动。我们的观察结果表明，为避免“猛烈和快速”地搅动被中和的裂解物，B2最好仅具有小直径管道。

实施例2

我们可以将CL系统分解成5个步骤。在一个具体实施方案中，所述构型如下：

1)混合：细胞(在溶液1中)+溶液2(M1+3m的6mm管道)。开始时通过SDS裂解细胞，只要DNA不变性就没有片段化的风险。

2)裂解结束和gDNA变性(13m的16mm管道)。

3)混合：裂解物+溶液3(M2+3m的6mm管道)。

4)在4℃收获中和的裂解物

5)在4℃过夜沉降絮状物和gDNA大片段。

以下条件可用于进行连续裂解：

-溶液1：EDTA 10mM、葡萄糖(Glc)9g/l和Tris HCl 25mM，pH 7.2。

-溶液2：SDS 1％和NaOH 0.2N。

-溶液3：乙酸2M和乙酸钾3M。

-流速60l/h：溶液1和溶液2

-流速90l/h：溶液3。

-细胞用溶液1调整到38.5g/l。

溶液1中的细胞通过3个喷嘴，这3个喷嘴将细胞分散到从反方向到达的溶液2中。

-混合器M1具有的几何结构使其有可能优化两种流体的混合(参见图2，混合器的示意图)。

-混合器M1后管道的第一段是B1a，下一段是B1b。

B1a：3m长，6mm直径，2.5秒停留时间

B1b：13m长，16mm直径，77秒停留时间

本发明的方法提供了效率方面的优势，概述为：分散、短暂的剧烈混合和利用扩散的温和混合。

使用本发明的方法，裂解的细胞数增加，因而增加了回收的质粒DNA的量。

扩散概念特别重要，原因是这些流体由于其特性(具体地说是粘弹性)而产生的混合难度。

本发明方法使得有可能限制剪切应力并由此限制gDNA片段化，这有利于其在随后的层析纯化中的去除。

然后，问题是与溶液3混合，溶液3可冷却到4℃。在一个实施方案中，本发明方法使用：

-混合器M2，其是内径约10mm的Y。

-管道B2段放置在混合器M2之后。

B2：2m的6mm管道；停留时间：1秒

以下的表5给出了在对比检测中获得的结果，显示了我们的连续裂解法相比于分批裂解的优势。

表5

	裂解物中的gDNA/pDNA比率	每g细胞提取的质粒量(mg/g)
	裂解物中的gDNA/pDNA比率	每g细胞提取的质粒量(mg/g)	分批裂解	16.9	1.4
采用实施例1中描述的CL系统的连续裂解	1.6	1.9	分批裂解	16.9	1.4

实施例3

使用的柱是用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，Pharmacia)活化的1mlHiTrap柱，连接到蠕动泵(输出＜1ml/min)。使用的特异性寡核苷酸在5′末端具有NH₂基团，其序列如下：

5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO：1)

用于此实施例的缓冲液如下：

偶联缓冲液：0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3。

缓冲液A：0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH 8.3。

缓冲液B：0.1M乙酸盐，0.5M NaCl，pH 4。

所述柱用6ml的1mM HCl洗涤，然后将稀释在偶联缓冲液(1ml中50nmol)中的寡核苷酸施加到柱上，在室温保持30分钟。所述柱按6ml缓冲液A然后6ml缓冲液B的顺序洗涤三次。寡核苷酸由此通过CONH连接共价结合到柱上。将柱于4℃保存在PBS、0.1％NaN₃中，可使用至少4次。

合成以下两种寡核苷酸：寡核苷酸4817：5′-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAGAGAGAAGAAGAAGAAGG-3′(SEQ ID NO：13)和寡核苷酸4818：5′-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTTTCTCG-3′(SEQ ID NO：14)。

如上所述，这些寡核苷酸在杂交并克隆到质粒中时，向对应质粒中导入同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)₁₇(SEQ ID NO：15)。

对应于这两个杂交寡核苷酸的序列被克隆在质粒pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的多克隆位点，该质粒携带氨苄青霉素抗性基因。为此，按以下方式杂交寡核苷酸：1μg的这两种寡核苷酸一同放置在40ml终缓冲液中，所述终缓冲液包含50mMTris-HCl pH 7.4，10mM MgCl₂。将此混合物加热到95℃，然后置于室温，使得温度缓慢降低。在30μl终缓冲液中，10ng杂交寡核苷酸的混合物与用 BamHI和 EcoRI消化的200ng质粒pBKS+(StratageneCloning System，La Jolla CA)连接。连接后，将等份转化入DH5α中。将转化的混合物涂布到补加氨苄青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培养基上。在此培养基上重组克隆应当显示没有着成蓝色，与允许大肠杆菌β-半乳糖苷酶的ω片段α互补的亲本质粒(pBKS+)相反。在由6个克隆小量制备质粒DNA之后，它们全部显示位于pBKS+的 EcoRI和 BamHI位点之间的 PstI位点消失，含多克隆位点的448-bp PvuII条带的分子量增加。选择一个克隆，对应质粒命名为pXL2563。通过使用质粒pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的引物-20(5′-GACCGGCAGCAAAATG-3′(SEQ ID NO：16))(Viera J.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system forinsertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)测序检验克隆的序列。依靠Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)按照供应商的建议纯化质粒pXL2563。此质粒DNA制备物用于下述实施例。

在如1.1.所述的与寡核苷酸偶联的HiTrap柱上由还含有质粒pBKS+的溶液纯化质粒pXL2563。

用于此纯化的缓冲液如下：

缓冲液F：2M NaCl，0.2M乙酸盐，pH 4.5-5。

缓冲液E：1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。

所述柱用6ml缓冲液F洗涤，将质粒(20μg pXL2563和20μgpBKS+的400μl缓冲液F)上柱，在室温下保温2小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。在1％琼脂糖凝胶上电泳和溴化乙锭染色后检测质粒。溶液中质粒的比例通过检测它们对大肠杆菌的转化活性来估计。

从含有30％pXL2563和70％pBKS+的混合物开始，在柱出口回收含100％pXL2563的溶液。由260和280nm的OD比值估计的纯度从1.9升高到2.5，这表明通过此方法除去了污染蛋白质。

实施例4

寡核苷酸(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ IDNO：1))与柱的偶联如实施例3所述进行。为进行偶联，通过含6个碳原子的臂(Modified oligonucleotide Eurogentec SA，Belgium)用连接至间隔区磷酸酯的胺基在5′末端修饰寡核苷酸。依靠Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)按照供应商的建议纯化质粒pXL2563。用于该实施例的缓冲液如下：

缓冲液F：0-2M NaCl，0.2M乙酸盐，pH 4.5-5。

缓冲液E：1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。

所述柱用6ml缓冲液F洗涤，然后将稀释在400μl缓冲液F中的100μg质粒pXL2563上柱，在室温保温2小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。通过检测260nm的光密度定量质粒。

在此实施例中，结合在缓冲液中进行，缓冲液的NaCl摩尔浓度由0至2M(缓冲液F)变化。当NaCl的摩尔浓度下降时，纯化收率下降。结合缓冲液的pH可由4.5-5变化，在4.5时纯化收率较好。也有可能使用碱性pH的另一种洗脱缓冲液：因而洗脱用包含50mM硼酸盐、pH 9、0.5mM EDTA的缓冲液进行。

寡核苷酸(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ IDNO：1))与柱的偶联如实施例3所述进行。使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)按照供应商的建议纯化质粒pXL2563。用于此实施例的缓冲液如下：

缓冲液F：0.1M NaCl，0.2M乙酸盐，pH 5。

缓冲液E：1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。

所述柱用6ml缓冲液F洗涤，然后将稀释在400μl缓冲液F中的100μg质粒pXL2563上柱，在室温保温1小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。检测通过寡核苷酸柱之前和之后存在于质粒样品中的基因组或染色体大肠杆菌DNA的含量。使用大肠杆菌galK基因中的引物通过PCR定量此基因组DNA。依照以下方案：这些引物的序列由Debouck等(Nucleic Acids Res.1985， 13，1841-1853)描述：

5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(SEQ IDNO：17)和

5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(SEQ ID NO：18)。

反应培养基在25μl PCR缓冲液(Promega France，Charbonnières)中包含：1.5mM MgCl₂；0.2mM dXTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/ml Taq聚合酶(Promega)。按照以下顺序进行反应：

-95℃，5分钟

-30个循环：95℃，10秒

60℃，30秒

78℃，1分钟

-78℃，10分钟。

在存在SybrGreen I(Molecular Probes，Eugene，USA)的情况下，通过在3％琼脂糖凝胶上电泳分离长度为124个碱基对的扩增DNA片段，然后参比得自大肠杆菌菌株B(Sigma，ref D4889)的Ultrapur基因组DNA系列进行定量。

实施例5

此实施例描述了以所谓“小量制备”规模从细菌培养物的澄清裂解物纯化质粒DNA：离心1.5ml含质粒pXL2563的DH5α菌株过夜培养物，将沉淀重悬浮在100μl的50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl、pH 8、10mM EDTA中。添加200μl 0.2M NaOH、1％SDS，翻转试管混合，然后添加150μl的3M乙酸钾、pH 5，翻转试管混合。在离心后，回收上清液，上样到如实施例1所述获得的寡核苷酸柱上。结合、洗涤和洗脱与实施例3所述相同。从1.5ml培养物回收了约1μg质粒。获得的质粒通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析，呈“超螺旋”环状DNA的单一条带形式。在通过此方法纯化的质粒中没有可检测的痕量高分子量(染色体)DNA或RNA。

实施例6

此实施例描述了在与实施例5相同的条件下进行的质粒DNA纯化实验，从20ml含质粒pXL2563的DH5α菌株的细菌培养物开始。细胞沉淀溶解在1.5ml 50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl、pH 8、10mMEDTA中。用2ml 0.2M NaOH、1％SDS进行裂解，用1.5ml 3M乙酸钾、pH 5中和。然后用3ml 2-丙醇沉淀DNA，沉淀溶解在0.5ml 0.2M乙酸钠、pH 5、0.1M NaCl中，上样到如以上实施例所述获得的寡核苷酸柱上。柱的结合、洗涤和洗脱如以上实施例所述进行，不同之处是洗涤缓冲液，其NaCl摩尔浓度为0.1M。获得的质粒通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析，呈“超螺旋”环状DNA的单一条带形式。纯化质粒中没有可检测的痕量高分子量(染色体)DNA或RNA。用限制性内切酶消化质粒得到预期分子量3千碱基对的单一条带。所述质粒含有表达盒，其含有巨细胞病毒启动子、萤光素酶编码基因和来源于质粒pXL2563的同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)₁₇(SEQ ID NO：15)。含有此质粒的菌株DH1(Maniatis等，1989)在7升发酵罐中培养。从200克细胞制备澄清裂解物：细胞沉淀溶解在2升25mM Tris、pH 6.8、50mM葡萄糖、10mM EDTA中，向其中添加2升0.2M NaOH、1％SDS。通过添加1升3M乙酸钾中和裂解物。在渗滤后，按照实施例3中描述的方法将4ml此裂解物上5mlHiTrap-NHS柱，该柱与序列为5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO：1)的寡核苷酸偶联。如以上实施例所述进行洗涤和洗脱。

实施例7

此实施例描述了带有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸的用途。使用的寡核苷酸序列如下：

5′-GAGG^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCCT^MeCTT^MeCTT-3′(SEQ IDNO：19)

此寡核苷酸在5′末端具有NH₂基团。^MeC＝5-甲基胞嘧啶。此寡核苷酸能使质粒pXL2563在实施例1的条件下用pH 5的结合缓冲液纯化(从而降低了质粒降解的风险)。

实施例8

在以上实施例中，使用的寡核苷酸在5′末端用胺基修饰，所述胺基通过含6个碳原子的臂：NH₂-(CH₂)₆与磷酸酯连接。在此实施例中，胺基通过含有12个碳原子的臂：NH₂(CH₂)₁₂与5′末端的磷酸酯连接。寡核苷酸的偶联和过柱用缓冲液F：2M NaCl、0.2M乙酸盐、pH 4.5如实施例3所述进行。此寡核苷酸使得有可能获得更好的纯化收率：获得了53％的收率，而在使用含6个碳原子的寡核苷酸的情况下，该收率在相同条件下约为45％。

实施例9

在实施例3描述的克隆策略之后，构建另外两个携带同型嘌呤-同型嘧啶序列的质粒：含序列(GGA)₁₆(SEQ ID NO：20)的质粒pXL2725和含序列(GA)₂₅(SEQ ID NO：21)的质粒pXL2726。

类似于质粒pXL2563的质粒pXL2725和pXL2726按照实施例3中描述的克隆策略使用以下寡核苷酸对构建：

5986：5′-GATCC(GA)₂₅GGG-3′(SEQ ID NO：22)

5987：5′-AATTCCC(TC)₂₅G-3′(SEQ ID NO：23)

5981：5′-GATCC(GGA)₁₇GG-3′(SEQ ID NO：24)

5982：5′-AATT(CCT)₁₇CCG-3′(SEQ ID NO：25)

寡核苷酸对5986和5987用于通过将寡核苷酸克隆到pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的 BamHI和 EcoRI位点来构建质粒pXL2726，而寡核苷酸5981和5982用于构建质粒pXL2725。使用与质粒pXL2563的构建相同的实验条件，仅仅改变寡核苷酸对。类似地，克隆序列通过对质粒测序证实。由此可见，质粒pXL2725相对于预期序列具有修饰：不是序列GGA重复17次，而是存在GGAGA(GGA)₁₅(SEQ ID NO：26)。

实施例10

与这些同型嘌呤序列形成三股螺旋的寡核苷酸按照实施例1.1所述技术偶联到HiTrap柱。使用序列5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3′(SEQ ID NO：27)的寡核苷酸纯化质粒pXL2725，使用序列5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQ ID NO：28)的寡核苷酸纯化质粒pXL2726。

由此获得的两个柱能够使相应的质粒按照实施例2中描述的技术使用以下缓冲液纯化：

缓冲液F：2M NaCl，0.2M乙酸盐，pH 4.5。

缓冲液E：1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。

对于pXL2725和pXL2726，获得的收率分别为23％和31％。

实施例11

此实施例说明了存在于质粒中的特异性序列的长度对纯化收率的影响。

用于这些实验以证实本发明组合物活性的报告基因是萤光素酶(Luc)编码基因。

质粒pXL2621含有一个表达盒，其含661-bp的巨细胞病毒(CMV)启动子，该启动子克隆在载体pGL basic Vector(Promega Corp.Madison，WI)中萤光素酶编码基因上游的 MluI和 HindIII位点处。使用标准分子生物学技术构建此质粒。

按以下方式构建质拉pXL2727-1和pXL2727-2：

用 BamHI线性化2μg质粒pXL2621；通过在65℃处理10分钟失活酶；同时，如对质粒pXL2563构建的描述杂交寡核苷酸6006和6008。

6006：5′-GATCT(GAA)₁₇CTGCAGATCT-3′(SEQ ID NO：29)

6008：5′-GATCAGATCTGCAG(TTC)₁₇A-3′(SEQ ID NO：30)。

将此杂交混合物克隆在质粒pXL2621的 BamHI末端，在转化入DH5α中之后，利用 PstI酶限制性分析鉴别重组克隆，因为寡核苷酸导入了 PstI位点。选择两个克隆，克隆片段的核苷酸序列使用引物(6282，5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(SEQ ID NO：31))作为测序反应引物来证实(Viera J.和J.Messing，1982)。pUC质粒，一种用于插入诱变的M13mp7来源的系统，用合成通用引物测序。(Gene 19：259-268)。

第一个克隆(pXL2727-1)含有重复10次的序列GAA。第二个克隆(pXL2727-2)含有序列5′-GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO：32)。

使用如在实施例3中描述的柱，其与寡核苷酸5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO：1)偶联。

质粒pXL2727-1携带序列GAA的14个重复。如上所述的寡核苷酸仅含有对应杂交序列CTT的7个重复，因而可以在8个不同位置与质粒杂交。相比之下，质粒pXL2727-2具有与结合到柱上的寡核苷酸相同长度的杂交序列(GAA)₇(SEQ ID NO：36)。此寡核苷酸因而可在pXL2727-2上的仅一个位置上杂交。

实验与实施例4中描述的相同，使用以下缓冲液：

缓冲液F：2M NaCl，0.2M乙酸盐，pH 4.5。

缓冲液E：1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。

纯化收率对于质粒pXL2727-1为29％，对于pXL2727-2为19％。

使用的细胞是NIH 3T3细胞，在实验前基于50,000细胞/孔接种到24孔培养平板中。质粒在150mM NaCl中稀释，并与脂转染剂RPR115335混合。使用的脂转染剂正电荷/DNA负电荷比例等于6。涡旋混合物，在室温放置10分钟，在无胎牛血清的培养基中稀释，然后以1μg NNA/培养孔的比例添加至细胞。在37℃达2小时后，添加10％体积/体积的胎牛血清，在存在5％CO₂的情况下于37℃温育细胞48小时。细胞用PBS洗涤两次，按照所描述的方案(Promega kit，Promega Corp.Madison，WI)用Lumat LB9501光度计(EG and GBerthold，Evry)检测萤光素酶活性。如实施例8.2所述纯化的质粒pXL2727-1得到的转染率为用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化的相同质粒所获得的转染率的两倍。

实施例12

以下实施例阐明了使用三股螺旋亲和层析进行的pCOR衍生质粒的纯化。业已表明，此技术去除核酸杂质(具体地说是宿主基因组DNA和RNA)，降至常规层析方法未曾达到的水平。

三股螺旋亲合凝胶用Sephacryl S-1000SF(Amersham-PharmaciaBiotech)作为层析基质来合成。首先用m-高碘酸钠(3mM，室温，1小时)的0.2M乙酸钠(pH 4.7)溶液活化Sephacryl S-10000。然后，如早先对蛋白偶联的描述一样(Hornsey等，J.Immunol.Methods，1986， 93，83-88)，在存在抗坏血酸(5mM)的情况下，通过还原胺化作用，使寡核苷酸经其5′-NH₂末端部分偶联至活化基质的醛基。用于这些实验的同型嘧啶寡核苷酸(来自Eurogentec，HPLC纯化)具有与存在于pCOR质粒复制起点(oriγ)中的短14聚体同型嘌呤序列(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO：10)互补的序列(Soubrier等，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)。如上所述，同型嘧啶寡核苷酸的序列是5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO：11)。

对以下质粒进行层析：pXL3296(无转基因的pCOR，2.0kpb)、pXL3179(pCOR-FGF，2.4kpb)、pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)、pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)、pXL3227(pCOR-lacZ，5.4kbp)和pXL3397(pCOR-B缺失的FVIII，6.6kbp)。所有这些质粒都通过两个阴离子交换层析步骤从如实施例4所述获得的澄清裂解物中纯化。还研究了通过在CsCl中超离心纯化的质粒pBKS+(得自Stratagene的pBluescript II KS+)，该质粒为ColE1衍生的质粒。使用的所有质粒都处于其超螺旋(＞95％)拓扑状态或形式。

在每个质粒DNA纯化实验中，将在6ml 2M NaCl、0.2M乙酸钾(pH 5.0)中的300μg质粒DNA以30cm/h的流速加载到含上述寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO：11)的亲和柱上。在用5倍体积的相同缓冲液洗涤柱之后，用1M Tris/HCl、0.5mM EDTA(pH9.0)洗脱结合质粒，并通过UV(260nm)定量，用Millipore Gen-Pak柱进行离子交换层析(Marquet等，BioPharm，1995，8，26-37)。收集级分中的质粒收获量为：质粒pXL3296为207μg、pXL3179为196μg、pXL3579为192μg、pXL3678为139μg、pXL3227为97μg、pXL3397为79μg。

当pBKS在此柱上层析时，未能检测到质粒结合(＜3μg)。这表明寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO：11)与存在于pCOR(oriγ)中的互补14聚体序列5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(SEQ ID NO：10)形成稳定的三股螺旋结构，但不与存在于pBKS中的紧密相关序列5′-AGAAAAAAAGGA-3′(SEQ ID NO：8)形成三股螺旋结构。这表明，单个不规范三联体(在此为T*GC)的引入导致三股螺旋结构完全去稳定。

作为对照，当pXL3179在于严格相似条件下合成但没有寡核苷酸的空白柱上层析时未观察到质粒结合(＜1μg)。

对于pXL3296制备物，通过在于此报告的条件下操作此亲合纯化柱，宿主基因组DNA的污染水平从2.6％降低到0.07％。类似地，对于pXL3179制备物，当通过相同亲和柱层析样品时，宿主DNA的污染水平从0.5％降低到0.008％。

实施例13

以下实施例阐明了使用三股螺旋亲和层析的ColE1衍生质粒纯化。业已表明，此技术去除核酸杂质(具体地说是宿主基因组DNA和RNA)，降低至常规层析方法未曾达到的水平。

如上述实施例所述，通过将具有序列5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO：9)的寡核苷酸偶联到高碘酸盐氧化的Sephacryl S-1000 SF上来合成三股螺旋亲合凝胶。

质粒pXL3296(没有转基因的pCOR)和ColE1衍生质粒pBKS在如实施例9所述的条件下在含寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO：9)的1-ml柱上层析。收集级分中的质粒收获量为：pBKS为175μg，pXL3296为＜1μg。这表明寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO：9)与存在于pBKS中的互补12聚体序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO：8)形成稳定的三股螺旋结构，而不与存在于pCOR中的非常紧密相关的12聚体序列(5′-AGAAAAAAAAGA-3′)(SEQ ID NO：34)形成三股螺旋结构。这表明，单个不规范三联体(在此为C*AT)的引入可能导致三股螺旋结构完全去稳定。

实施例14

通过以下方法在无挡板锥形瓶中生产种子培养物。将工作细胞库接种到含M9modG5培养基的锥形瓶中，接种率0.2％(v/v)。菌株以220rpm在旋转摇床中于37℃±1℃下培养约18±2小时，直到葡萄糖耗尽。这产生200ml种子培养物。培养物的光密度预期是A₆₀₀约2-3。

然后在第一发酵罐中产生预培养物。种子培养物无菌转移到含M9modG5培养基的预发酵罐中，以确保0.2％(v/v)接种率，在通气和搅动下培养。pO₂维持在40％以上的饱和度。当在16小时后葡萄糖被耗尽时收获培养物。这产生约30升预培养物。培养物的光密度预期是A₆₀₀约2-3。

然后在第二发酵罐中产生主培养物。将30升预培养物无菌转移到装有270升已灭菌FmodG2培养基的发酵罐中，以确保约10％(v/v)接种率。以分批模式开始培养，以达到一定生物量。一旦初始糖在约4小时后被耗尽就开始葡萄糖补料。控制通气、搅拌、pO₂(40％)、pH(6.9±0.1)、温度(37±1℃)和葡萄糖补料，以维持比生长速率接近0.09h^-1。在补料约35小时后结束培养。这产生约400升培养物。培养物的光密度预期是A₆₀₀约100。

进行第一分离步骤，称为细胞收获。用碟片式离心机收获生物质。浓缩培养基3至4倍，以缩减所使用的培养基，连续重悬浮在400升无菌S1缓冲液中。这产生约500升预条件化生物质。DCW＝25±5g/L。

进行第二分离步骤，称为浓缩步骤。在S1缓冲液中重悬浮/匀浆后，再用分离器处理细胞，以产生浓缩淤浆。这产生约60-80升洗涤并浓缩过的淤浆。DCW＝150±30g/L；质粒DNA＝300±60mg/L。

然后进行冷冻步骤。将淤浆无菌分配到20-L Flexboy^TM袋中(填充到其容量的50％)，随后在进一步的下游处理之前于-20℃±5℃冷冻。这产生冷冻生物质。pDNA＝300±60mg/L；超螺旋形式＞95％。

然后进行细胞解冻步骤。将冷冻袋加热到20℃，细胞淤浆用100mm Tris盐酸、10mM EDTA、20mM葡萄糖稀释到40g/L，pH 8.0，使悬浮液在细胞裂解前于20±2℃搅拌1小时。这产生解冻生物质淤浆。pH＝8.0±0.2。

在此步骤当中可使用约20℃的温度。

然后进行碱裂解步骤。细胞裂解步骤包括将稀释的细胞悬液与0.2N NaOH-35mM SDS(溶液S2)经管线中混合器泵入，随后是在盘管中的连续接触步骤。连续接触步骤是为了确保完全细胞裂解以及基因组DNA和蛋白质的变性。裂解细胞的溶液与冷却的3M乙酸钾-2N乙酸的溶液3(S3)在管线中混合，之后收集到冷却的搅动容器中。加入溶液S3引起基因组DNA、RNA、蛋白质和KDS沉淀。

接下来进行裂解物过滤。中和的裂解物然后在不搅拌的情况下在5±3℃保温2-24小时，通过3.5mm网格过滤器过滤，除去大部分沉淀物(絮凝相)，之后深层过滤，作为精纯过滤步骤。这产生澄清的裂解物，超螺旋质粒的浓度超过90％。

然后进行阴离子交换层析。澄清裂解物溶液用纯化水稀释至目标电导率值50mS/cm，通过双层过滤器(3μm-0.8μm)过滤，上样到阴离子交换层析柱上。使用11.0L FractogelTMAE HiCap(M)树脂(Merck；#1.10316.5000)填装的300-mm柱。将澄清裂解物加载到柱上，使用分步梯度NaCl进行洗脱。结合到柱上的大部分杂质用约61mS/cm的NaCl溶液洗脱，DNA质粒用约72mS/cm的NaCl溶液洗脱。这产生具有高浓度质粒DNA的离子交换层析洗脱液。

在这之后是三股螺旋亲和层析。阴离子交换层析柱洗脱液用约0.5倍体积的含4.8M NaCl的500mM乙酸钠溶液(pH 4.2)稀释，泵过用含2M NaCl的50mM乙酸钠(pH 4.5)平衡的三股螺旋亲和层析柱。柱直径为300mm，含10.0L THAC Sephacryl^TM S-1000凝胶(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)。柱用含1M NaCl的50mM乙酸钠溶液(pH 4.5)洗涤，NVlFGF用含0.5mM EDTA的100mM Tris(pH 9.0)洗脱。这产生具有高质粒浓度的三股螺旋亲和层析洗脱液。

之后进行疏水作用层析步骤。亲和层析柱洗脱液用3.6倍体积的3.8M硫酸铵的Tris溶液(pH 8.0)稀释。通过0.45μm滤器过滤后，滤过液以60cm/h上样到装填9.0L ToyopearlButyl-650S树脂(TosoHcorp.，Grove City，OH)的疏水作用柱(直径300mm)上。柱用硫酸铵溶液以约240mS/cm洗涤，NV1FGF用硫酸铵以220mS/cm洗脱。这产生无松弛形式的HIC洗脱液。

按照优选实施方案，进行进一步的渗滤步骤。按照本领域已知的标准技术，在此步骤中适合使用商业上可获得的标准渗滤材料。优选的渗滤方法是根据质粒大小而使用具有30,000-500,000范围的截留分子量的超滤膜。此渗滤步骤容许缓冲液交换，随后进行浓缩。步骤12的洗脱液通过切向流过滤(膜截留值30kDa)浓缩3到4倍，至约2.5-3.0mg/mL的目标浓度，浓缩物通过以恒定体积用10倍体积的盐水渗滤进行缓冲液交换，用盐水调节到目标质粒浓度。由浓缩物样品的260nm吸光率计算NV1FGF浓度。NV1FGF溶液通过0.2μm囊式过滤器过滤，保存在2-8℃冷藏室的容器中，直至进一步处理。这产生了纯化的浓缩物，其中超螺旋质粒的质粒DNA浓度约为70％、75％、80％、85％、90％、95％，优选99％。采用此步骤的总质粒回收率为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率为60％。

实施例15

包括离子交换层析(AEC)步骤、三股螺旋亲和层析(THAC)步骤和疏水层析(HIC)步骤的以上实施例方法，产生比先前已知方法更纯的质粒DNA制备物。此新方法业已同先前已知方法对比，该新方法产生的质粒DNA制备物具有低得多的基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素量。这反映在图3中。这些实验表明，与有效去除所有杂质的一些2步组合相比，AEC、THAC和HIC提供了令人惊讶的更高纯化收率。就质粒DNA与其它生物材料和杂质(例如蛋白质和内毒素、RNA和基因组DNA以及开环质粒)的分离效率而言，这些步骤的组合提供了明显的协同作用。此外，本发明的协同步骤组合(即AEC/THAC/HIC)不仅能够获得高度纯化的药物级质粒DNA，而且能够获得高度纯化且完全超螺旋、超过80％、85％、90％、95％和超过99％的质粒DNA的组合物。

实施例16

用于制备高度纯化的质粒DNA制备物的上述实施例方法包括离子交换层析步骤、三股螺旋亲和层析步骤和疏水层析步骤，其与先前已知方法对比。如图4所示，本发明方法令人惊讶地产生了具有少得多的基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素量(处于亚ppm范围中)的pDNA制备物。此外，如图4所示，本发明方法显示获得的产量(product quality)达到10g。

实施例17

根据以下条件进行如实施例14所述的渗滤步骤：用于步骤a和步骤b的缓冲液用于确定对以下最佳的条件：

iii)对12.5-13.0倍体积的50mM Tris/HCl、150mM NaCl、pH 7.4(称为缓冲液I)进行第一次渗滤(步骤a)，和

iv)以上步骤a)的保留物对3.0-3.5倍体积的盐水赋形剂(150mMNaCl)进行第二次渗滤(步骤b)。

本发明的此替代性渗滤步骤有效彻底地除去硫酸铵和EDTA。并且，在此渗滤步骤之后，获得了约150mM的适宜目标NaCl浓度和400μM-1mm之间的Tris终浓度。下表6中提供了质粒DNA制剂组合物的实例。

表6

物质	终浓度
	终浓度			第一次渗滤	第二次渗滤	活性药物成分
	硫酸铵	10μM	＜1μM	第一次渗滤	第二次渗滤	活性药物成分	＜1μM
EDTA	硫酸铵	10μM	＜1μM	4μM	＜1μM	＜1μM	＜1μM
EDTA	Tris	50mM	1.48mM	4μM	＜1μM	＜1μM	740μM
NaCl	Tris	50mM	1.48mM	154mM	154mM	154mM	740μM

实施例18

按照实施例13和17，用实施例17中描述的渗滤处理步骤，生产工业化批次的质粒DNA NV1FGF API(活性药物成分)，称为LS06。洗脱液首先以约2mg API/mL对约13倍体积的缓冲液I渗滤，产生的保留物对约3倍体积盐水赋形剂渗滤。随后，最终保留液通过0.2μm滤器过滤，调节到1mg/mL。最终API(pH 7.24)于5℃储存在玻璃瓶中，直至DP生产。

对储存在Duran玻璃瓶(API)以及8-mL小瓶中用于药品生产的LS06样品进行稳定性研究。在+5℃、90天后，所有样品的脱嘌呤和开环化程度作用均几乎不可检测(≤0.3％)。在+25℃、90天后，LS06样品的脱嘌呤和开环化速率也相当低。由此研究计算的脱嘌呤和开环化速率为≤1％/月(图8)。

此研究表明，质粒DNA NV1FGF的稳定性性质在本发明制剂中非常稳定，其中pH值维持在约7.0-7.5。这清楚表明，质粒DNA在+25℃以非降解形式长期稳定保持，脱嘌呤和质粒产生切口的速率低。

实施例19

按照实施例13，用实施例17中描述的渗滤处理步骤，生产数批质粒DNA NV1FGF API(活性药物成分)，称为LS04、LS04、LS06、LS07和LT05。洗脱液首先以约2mg API/mL对约13倍体积的缓冲液I渗滤，产生的保留物对约3倍体积盐水赋形剂渗滤。随后，最终保留液通过0.2μm滤器过滤，调节到1mg/ml，储存于8ml小瓶中。获得的质粒DNA具有约150mM的NaCl浓度和1mM-2mM的Tris终浓度。对储存于8-mL小瓶中用于药品生产的所有以上提及样品进行稳定性研究。

在+25℃下的150天内，质粒DNA组合物的pH没有可检测的变化，如图6A所示。在203天后，LS04的pH急剧下降至6.54(-0.27单位)。

对于LS04之外的所有批次，+25℃时脱嘌呤和产生切口的速率为约1.0％/月，在140天内似乎线性依赖于时间。LS04的脱嘌呤速率明显较高(2.7％/月)，因为该API批次的pH明显较低(T₀时＞0.4单位)。LS04的切口产生速率稍微慢于其脱嘌呤速率(2.4％/月)。

在+5℃时，所有溶液的pH都随时间保持稳定，脱嘌呤和产生切口的程度非常低(在200天后低于0.5％；图6B)。

此研究表明，在+5℃和+25℃，质粒DNA NV1FGF在本发明制剂中的稳定性性质随时间非常稳定，脱嘌呤和产生切口的程度非常低。

本说明书应当被理解为考虑了说明书内引用的参考文献的讲述内容。说明书中的实施方案提供了本发明实施方案的示例，而不应视为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明包括许多其它实施方案。在本文公开内容中引述的所有出版物和专利都通过引用整体结合到本文中。对通过引用合并的材料抵触本说明书或与本说明书不一致的情况，本说明书优于任何这种材料。本文对任何参考文献的引述都不是认可所述参考文献为本发明的现有技术。

除非另有陈述，否则在说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分数量、反应条件等的数字，都被认为是在所有情况下由用语“约”修饰。因此，除非另有相反的陈述，否则数字参数是近似值，可根据试图通过本发明获得的期望特性而改变。最低限度上，且不作为将等价原则的应用限于权利要求范围的尝试，每个数字参数都应被解读为考虑了有效数字的数目和常规舍入法。

除非另有陈述，否则在一系列要素之前的用语“至少”应被理解为指系列中的每个要素。本领域技术人员使用不超过常规的实验会认识到或能够确定本文描述的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意图由以下的权利要求包括。

本领域技术人员可依靠本文引用的任何参考文献或文件的内容，每个参考文献或文件都通过引用整体结合到本文中。但是，在本文引用的参考文献或文件中没有什么会改变本文件中具体定义的任意术语或概念的含义。参考文献和文件以及本领域技术人员可获得的知识应允许本文描述的具体实施方案的改变和变更。本文提到的实施例和具体实施方案不应被视为限制本发明的范围或界限。

序列表

<110>申特莱恩公司

<120>质粒DNA的稳定液体制剂

<130>GC03001B-PCT

<150>PCT/EP2004/011437

<151>2004-09-17

<150>PCT/EP2005/005213

<151>2005-04-19

<160>34

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>1

gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>2

aagggaggga ggagaggaa 19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>3

aaggagagga gggagggaa 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>4

ttggtgtggt gggtgggtt 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>5

cttcccgaag ggagaaagg 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>6

gaagggcttc cctctttcc 19

<210>7

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>7

gaaaaaggaa gag 13

<210>8

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>8

agaaaaaaag ga 12

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>9

tctttttttc ct 12

<210>10

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>10

aagaaaaaaa agaa 14

<210>11

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成核苷酸

<400>11

ttcttttttt tctt 14

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>12

aaaaaaggga ataaggg 17

<210>13

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>13

gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58

<210>14

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>14

aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 58

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>15

gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>16

tgaccggcag caaaatg 17

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>17

ccgaattctg gggaccaaag cagtttc 27

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>18

ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>5-甲基胞嘧啶

<400>19

gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25

<210>20

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>20

ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48

<210>21

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>21

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50

<210>22

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>22

gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58

<210>23

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>23

aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58

<210>24

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>24

gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58

<210>25

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>25

aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58

<210>26

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>27

aatgcctcct cctcctcctc ctcct 25

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>28

agtgctctct ctctctctct ctctct 26

<210>29

<211>66

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>29

gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60

agatct 66

<210>30

<211>66

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>30

gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60

tcttca 66

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>31

acagtcataa gtgcggcgac g 21

<210>32

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>32

gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 39

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>33

gaagaagaag aagaagaaga a 21

<210>34

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>34

agaaaaaaaa ga 12

Claims

1.一种稳定的质粒DNA液体储存组合物，所述组合物包含质粒DNA和缓冲溶液，其中所述缓冲液以低于2mM的浓度存在，以将所述组合物的pH保持在6-9之间，所述组合物包含主要为超螺旋形式的质粒DNA。

2.权利要求1的组合物，其中所述质粒DNA在约4℃-25℃的温度稳定。

3.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述质粒DNA稳定达几个月、1年、2年、3年、4年、5年直到10年。

4.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述质粒DNA在约4℃稳定达几个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、15年直到20年。

5.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物包含至少80％的超螺旋或闭环质粒DNA。

6.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物包含约80％、约85％、约90％、约95％和约99％或99％以上的超螺旋或闭环质粒DNA。

7.前述权利要求中任一项的组合物，其中脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/月。

8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液以高达2mM的浓度存在。

9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液以2mM-1mM的浓度存在。

10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液以低于1mM的浓度存在。

11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液以250μM-1mM的浓度存在。

12.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液以约400μM的浓度存在。

13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.2-8.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.2-8.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3，所述质粒DNA储存于约+4℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/年，储存于约+25℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/月。

15.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.7-8.0之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

16.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在6.7-8.0之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3，所述质粒DNA储存于约+4℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于2％/年，储存于约+25℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于2％/月。

17.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在7.0-7.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

18.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述制剂或组合物的pH保持在7.0-7.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3，所述质粒DNA储存于约+4℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于1％/年，储存于约+25℃时具有的脱嘌呤和产生切口的速率低于1％/月。

19.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液包含：(a)Tris或赖氨酸和选自强酸或弱酸的酸；(b)Hepes和强碱；或(c)磷酸盐缓冲液。

20.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲溶液包含Tris/HCl、赖氨酸/HCl、Tris/马来酸、Tris/苹果酸、Tris/乙酸或Hepes/氢氧化钠。

21.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液为Tris。

22.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物还包含盐水赋形剂。

23.权利要求22的组合物，其中所述盐水赋形剂为NaCl。

24.权利要求23的组合物，其中NaCl以100-200mM、优选约150mM的浓度存在。

25.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述质粒DNA被高度纯化或为药物级质粒DNA。

26.一种含质粒DNA和缓冲溶液的稳定质粒DNA组合物，其中所述缓冲溶液存在的浓度足以在约+4℃直到+25℃的温度以稳定形式保存质粒DNA。

27.一种含质粒DNA和缓冲溶液的稳定质粒DNA组合物，其中所述缓冲溶液存在的浓度足以将具有至少80％超螺旋质粒DNA的质粒DNA在约+4℃的温度保存达至少约4年。

28.一种含质粒DNA和缓冲溶液的稳定质粒DNA组合物，其中所述缓冲溶液存在的浓度足以保存质粒DNA，所述质粒DNA在储存于约+4℃直至+25℃时的脱嘌呤和产生切口的速率低于5％/年至5％/月。

29.一种含质粒DNA和缓冲溶液的稳定质粒DNA盐水组合物，其中所述缓冲溶液的存在浓度足以使质粒DNA以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式在4℃-25℃保存达延长的时间段。

30.一种含质粒DNA和缓冲溶液的稳定质粒DNA组合物，其中所述缓冲溶液的存在浓度足以使质粒DNA以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式在4℃-25℃保存达20个月。

31.权利要求26-30中任一项的组合物，所述组合物还包含盐水赋形剂。

32.权利要求31的组合物，其中所述盐水赋形剂为NaCl，所述NaCl以100-200mM的浓度、优选约150mM的浓度存在。

33.权利要求26-30中任一项的组合物，其中所述质粒DNA被高度纯化或为药物级质粒DNA。

34.一种在组合物中以稳定形式保存质粒DNA的方法，所述方法包括：

制备质粒DNA的纯化样品；

将所述质粒DNA的纯化样品和浓度达2mM的缓冲溶液混合，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间；和

储存所述质粒DNA。

35.权利要求34的方法，其中所述质粒DNA包含至少80％超螺旋质粒DNA。

36.权利要求34和35中任一项的方法，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述组合物的pH保持在6.2-8.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

37.权利要求36的方法，其中所述质粒DNA在约+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于5％至每年低于5％。

38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述组合物的pH保持在6.7-8.0之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3。

39.权利要求38的方法，其中所述质粒DNA在约+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于2％至每年低于2％。

40.权利要求34-39中任一项的方法，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，以便将所述组合物的pH保持在7.0-7.5之间，约+/-0.3。

41.权利要求40的方法，其中所述质粒DNA在约+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于1％至每年低于1％。

42.权利要求34-41中任一项的方法，其中所述缓冲液以高达2mM的浓度加入。

43.权利要求42的方法，其中所述缓冲液以2mM-1mM之间的浓度加入。

44.权利要求43的方法，其中所述缓冲液以低于1mM的浓度加入。

45.权利要求43的方法，其中所述缓冲液以250μM-1mM的浓度加入。

46.权利要求45的方法，其中所述缓冲液以400μM的浓度加入。

47.权利要求34-46中任一项的方法，其中盐水赋形剂也加入到所述质粒DNA和缓冲溶液中。

48.权利要求47的方法，其中所述盐水赋形剂为NaCl。

49.权利要求48的方法，其中所述NaCl以100-200mM、优选约150mM的浓度加入。

50.权利要求34-49中任一项的方法，其中高度纯化的质粒DNA或药物级质粒DNA与所述缓冲溶液混合。

51.一种保存质粒DNA的方法，所述质粒DNA在达到约25℃的温度在液体组合物中以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式达几个月，所述方法包括：

制备质粒DNA的纯化样品；

混合所述质粒DNA的纯化样品和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液以低于2mM的浓度存在；和

在达到约25℃的温度储存所述质粒DNA组合物。

52.一种保存质粒DNA的方法，所述质粒DNA在达到约25℃的温度在液体组合物中以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式达几个月，所述方法包括：

制备质粒DNA的纯化样品；

混合所述质粒DNA的纯化样品和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液以1-2mM之间的浓度存在；和

在达到约25℃的温度储存所述质粒DNA组合物。

53.一种保存质粒DNA的方法，所述质粒DNA在达到约25℃的温度在液体组合物中以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式达几个月，所述方法包括：

制备质粒DNA的纯化样品；

混合所述质粒DNA的纯化样品和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液以达1mM的浓度存在；和

在达到约25℃的温度储存所述质粒DNA组合物。

54.一种保存质粒DNA的方法，所述质粒DNA在达到约25℃的温度在液体组合物中以至少80％超螺旋质粒DNA的稳定形式达几个月，所述方法包括：

制备质粒DNA的纯化样品；

混合所述质粒DNA的纯化样品和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液以约250μM至1mM的浓度存在；和

在达到约25℃的温度储存所述质粒DNA组合物。

55.权利要求51-54中任一项的方法，其中所述质粒DNA在约+4℃至+25℃的温度保存，脱嘌呤和产生切口的速率为每月低于5％至每年低于5％。

56.权利要求51-55中任一项的方法，其中盐水赋形剂也加入到所述质粒DNA组合物中。

57.权利要求56的方法，其中所述盐水赋形剂为NaCl。

58.权利要求57的方法，其中所述NaCl以100-200mM、优选约150mM的浓度存在。

59.一种稳定质粒DNA组合物，所述组合物通过权利要求34-58中任一项的方法获得。

60.权利要求59的稳定质粒DNA组合物，其中所述质粒DNA被高度纯化或为药物级。

61.一种制备在达约25℃的温度稳定的质粒DNA组合物的方法，所述方法包括：

-裂解细胞的步骤，其包括使细胞通过(a)湍流设备流动，以快速混合细胞悬液与裂解细胞的溶液；和使细胞通过(b)层流设备流动，以允许在基本没有搅动的情况下温育在(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物由湍流设备流入层流设备，任选还包括(c)加入中和所述裂解溶液的第二溶液的设备，在(b)中温育的混合物由层流设备流入添加第二溶液的设备中，以便由细胞释放质粒DNA；

-一个层析步骤，用于纯化如此释放的质粒DNA；

-混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6-9之间，和

-将所述质粒DNA组合物储存在达约25℃的温度。

62.一种制备在达约25℃的温度稳定的质粒DNA组合物的方法，所述方法包括：

-一个层析步骤，用于纯化如此释放的质粒DNA；

-混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6.2-8.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和

-将所述质粒DNA组合物储存在达约25℃的温度。

63.一种制备在达约25℃的温度稳定的质粒DNA组合物的方法，所述方法包括：

-一个层析步骤，用于纯化如此释放的质粒DNA；

-混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在6.7-8.0之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和

-将所述质粒DNA组合物储存在达约25℃的温度。

64.一种制备在达约25℃的温度稳定的质粒DNA组合物的方法，所述方法包括：

-一个层析步骤，用于纯化如此释放的质粒DNA；

-混合所述纯化的质粒DNA与浓度达2mM的缓冲溶液，所述缓冲溶液足以将所产生组合物的pH保持在7.0-7.5之间或距一个或两个这些值的约+/-0.3；和

-将所述质粒DNA组合物储存在达约25℃的温度。

65.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述缓冲溶液以低于2mM的浓度存在。

66.权利要求61-65中任一项的方法，其中所述缓冲溶液以约1-2mM的浓度存在。

67.权利要求61-66中任一项的方法，其中加入所述缓冲溶液，以在所述质粒DNA组合物中达到约250μM至低于1mM的浓度。

68.一种制备在达约25℃的温度稳定的质粒DNA组合物的方法，所述方法包括：

-一个层析步骤，用于纯化如此释放的质粒DNA；

-混合所述纯化的质粒DNA与浓度低于2mM、或低于1mM、或在250μM-1mM之间、优选400μM的缓冲溶液；和

-将所述质粒DNA组合物储存在达约25℃的温度。

69.权利要求61-68中任一项的方法，其中盐水赋形剂也加入到所述质粒DNA组合物中。

70.权利要求69的方法，其中所述盐水赋形剂为NaCl。

71.权利要求70的方法，其中NaCl以100-200mM、优选约150mM的浓度存在。

72.权利要求61-71中任一项的方法，其中所述裂解溶液是一种含裂解剂的溶液，所述裂解剂选自强碱、变性剂、有机溶剂和酶或其混合物。

73.权利要求61-72中任一项的方法，其中所述质粒DNA通过至少一个层析步骤纯化，所述层析步骤包括阴离子交换层析、三股螺旋亲和层析或疏水作用层析。

74.权利要求73的方法，其中所述阴离子交换层析步骤与三股螺旋层析步骤组合，用于质粒DNA纯化。

75.权利要求74的方法，所述方法还包括疏水作用层析步骤。

76.权利要求61-75中任一项的方法，其中所述质粒DNA通过3步层析法纯化，所述3步层析法包括下列次序的阴离子交换层析、三股螺旋亲和层析和疏水作用层析。

77.权利要求61-76中任一项的方法，其中所述第一步层析在裂解物过滤之后进行。

78.权利要求61-77中任一项的方法，其中所述第一步层析在絮凝物去除之后进行。

79.权利要求61-78中任一项的方法，其中所述最后一步层析之后为渗滤和/或缓冲液交换的步骤。

80.权利要求61-79中任一项的方法，其中所述絮凝物去除的在先步骤通过使所述溶液穿过网格滤器和穿过深层过滤进行。

81.权利要求61-80中任一项的方法，其中所述渗滤步骤用于达到合适的盐、缓冲液和pH目标值。

82.权利要求61-81中任一项的方法，其中所述渗滤步骤包含以下步骤：

由最后的层析步骤收集溶液；

对Tris/NaCl缓冲液进行第一个渗滤步骤；

在适于控制最终缓冲液浓度和稳定最终质粒DNA制剂pH的条件下对盐水进行第二个渗滤步骤。

83.权利要求61-82中任一项的方法，所述方法还包括除菌过滤、配制和分装所述纯化质粒DNA至小瓶的步骤。

84.一种高度纯化的质粒DNA的小瓶，所述小瓶通过权利要求83的方法获得。

85.权利要求84的小瓶，其中所述纯化质粒DNA是称为NV1FGF的质粒，其为携带编码FGF-1基因的表达盒的pCOR质粒。

86.权利要求85的小瓶，所述小瓶用于治疗外周肢体缺血，包括外周动脉病(PAOD或PAD)和严重肢体缺血(CLI)。

87.权利要求61-83中任一项的方法，其中所述层析步骤能够去除杂质，例如蛋白质、变性基因组DNA、RNA、蛋白质、寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、变性质粒DNA和脂多糖。

88.权利要求61-83中任一项的方法，其中层析步骤在固相支持体上进行，所述支持体为适于层析分离的任意有孔、超多孔或无孔的有机、无机或复合材料，其用赋予所述支持体疏水特征的聚烯二醇、烷、烯、炔、芳烃或其它分子衍化。

89.权利要求1-33中任一项的组合物，其中所述质粒DNA包含治疗性序列和/或免疫原编码序列。

90.权利要求89的组合物，其中所述治疗性基因为哺乳动物基因。

91.权利要求89的组合物，所述组合物作为DNA疫苗。

92.权利要求89或90的组合物，所述组合物作为基于质粒的疗法，例如基因疗法。

93.权利要求1-33中任一项的组合物，所述组合物用于通过疗法治疗人或动物的方法。