CN1275988A - 用于鉴定酰胺化多肽激素前体的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的寡核苷酸及其作为鉴定编码酰胺化多肽激素前体的mRNA的探针、和由此作为鉴定新的酰胺化多肽激素的探针的用途。本发明还涉及所公开核苷酸序列的寡核苷酸和用于鉴定酰胺化激素前体的方法。

Description

用于鉴定酰胺化多肽激素前体的寡核苷酸
本发明涉及新的寡核苷酸及其作为鉴定编码酰胺化多肽激素前体的mRNA的探针的用途，并涉及鉴定新的酰胺化多肽激素的方法。因此，本发明涉及寡核苷酸(下文中描述了其核苷酸序列)及其用于鉴定激素前体的方法。
酰胺化多肽激素合成为前体形式，该前体要进行成熟化。这一成熟过程包含酰胺化反应。
C-末端的酰胺化反应是酰胺化多肽激素的特征性反应。这一在1或多个激素前体上发生的反应使激素成熟，并保证它在生理环境中的生物稳定性：所形成的酰胺基团比游离的酸官能团更不易受攻击。因此，激素更能抵抗羧肽酶，它在细胞中的活性将维持更长时间并能保持对受体位点的最佳亲和力。
对于酰胺化已有广泛的描述(“肽酰胺化”，Alan F.Bradbury和Derek G.Smyth，TIBS16：112-115，1991年3月以及“催化肽酰胺化第二步反应之肽基酰胺甘醇酸酯裂解酶的功能和结构鉴定”，A.G.Katopodis，D.S.Ping，C.E.Smith和S.W.May，生物化学30(25)：6189-6194，1991年6月)，其作用机制如下：
1-由内切蛋白酶在两个碱性氨基酸，即精氨酸和/或赖氨酸间切割激素的前体肽链，
2-随后由羧肽酶切割两次，最终产生延伸的甘氨酸中间体，
3-酶PAM(肽基甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶)包含两种不同的酶促活性：首先，它将延伸的甘氨酸中间体转化为α-羟基甘氨酸衍生物，参与该步的酶PAM亚基是PHM(肽基甘氨酸-α-羟基化单加氧酶)。所得衍生物作为PAM第二个亚基(称为PAL：肽基-α-羟基甘氨酸-α-酰胺化裂合酶)的底物，PAL将甘氨酸的胺官能团固定到紧邻N-末端的氨基酸上，并释放乙醛酸。
这个反应涉及存在位于激素前体上的识别位点，该位点总包含以下序列：甘氨酸和两个碱性氨基酸(精氨酸或赖氨酸)(参见A.G.Katopodis等，生物化学，30(25)，6189-6194，1991年6月，以及该文的引用文献)。
已知将要分泌到内质网外的酰胺化多肽激素包含一个大约15到30个氨基酸的共有信号肽序列，该序列位于多肽链的N-末端。它在后来被信号肽酶切割下来，因此分泌出来的蛋白质中没有该序列(参见F.Cuttitta，The Anatomical Record，236，87-93(1993)以及该文的引用文献)。
目前，要发现一种新蛋白质是不容易的。可以通过各种技术分离和纯化蛋白质：等电点沉淀、用某些溶剂选择性萃取，然后经结晶、逆流分配、吸附、分配或离子交换层析、电泳等来纯化。但是，这些技术要求知道待分离蛋白质的特性。而且，如果得到了一种治疗水平的新目的蛋白质纯样品，要得到能合成该蛋白质的基因修饰的微生物还有多个阶段。
本发明提出的方法，通过使用目前已知的所有酰胺化激素前体的肽序列特征，具有能同时检测多种新的这类激素的优点。通过直接在从能合成这些激素前体的组织制备得到的cDNA文库中鉴定编码所述前体的核苷酸序列，可完成这种检测。
用该方法进行寻找受到的限制比上面提到的常规生物化学技术小得多，因为这种方法：
-可以通过相同的原理分离到存在于同一组织中的几种不同前体。
-能在相同的技术条件下检测具有迥异的生化和生物学特性的激素的前体。
-能同时鉴定包含在同一前体中的所有肽类激素。
因此，在那些研究和开发费用在销售额中占据非常高比例的领域中，本发明能够显著地节约时间和财力。
利用本发明还可以对哺乳动物机体内有重要生理作用的活性物质：激素以及特别是酰胺化多肽神经激素进行药理学研究。一旦首次获得活性物质所对应的cDNA，就可能通过基因工程用克隆载体经由微生物来合成具有治疗用途的激素。
本发明首先涉及单链寡核苷酸OX，它能在温和的条件下与序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表2个有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。
核苷酸是RNA或DNA的单体，它具有核苷磷酯的化学结构。嘌呤碱基(嘌呤，腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物)或嘧啶碱基(嘧啶，胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物)与核糖或脱氧核糖结合就产生核苷。寡核苷酸是核苷酸的聚合物，表示引物序列、探针或者RNA或DNA片段。
可以通过合成来获得上述寡核苷酸，以下出版物中有一篇文献描述了一种自动合成方法：“DNA合成”，S.A.Narang，四面体，39，3(1983)和“合成性寡核苷酸的合成与应用”，K.Itakura，J.J.Rossi和R.B.Wallace，生物化学年评，53，323(1984)。
优选地，OX可以在严谨条件下与OY杂交。
更优选地，OX可以与序列为Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交。
还要优选的是，OX可以与序列为Y1-Y2-Y3-Y4或Y2-Y3-Y4的寡核苷酸OY杂交。
特别是，OX可以与Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9的寡核苷酸OY杂交，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。更特别的是，OX可以与没有Y1和Y9的寡核苷酸OY杂交。
尤其特别的是，OX可以与下面的寡核苷酸OY杂交，其中Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸序列。
该序列是通过对27个已知酰胺化位点的统计学研究确定的，由此确定出一种跨越6个位点的特定氨基酸模式：Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Glu。
由于遗传密码的简并性以及Gly、Arg和Ser对应的密码子(Gly有4个，Arg有6个，Ser有6个密码子)很多，利用两个顾及筒并性的步骤来构建寡核苷酸序列：
-利用次黄苷(这种核苷酸的氮碱基次黄嘌呤与构成DNA的4种氮碱基无选择性地配对)的某些位点。
-某些位点处引入的氮碱基的性质改变，从而与所引入的不同碱基数成比例地产生许多寡核苷酸组合。
本发明还涉及含有9到42个核苷酸、序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自独立地代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。优选，本发明涉及一种没有Y1或Y5的寡核苷酸OY。
本发明特别涉及Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9的寡核苷酸OY，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。
本发明更特别涉及没有Y1和Y9的寡核苷酸OY。
本发明尤其特别涉及寡核苷酸OY，其特征在于没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸的序列。
本发明还涉及单链寡核苷酸OZ，其特征在于含有15到39个核苷酸，并能与酰胺化多肽激素所特有的共有信号序列杂交，其中所述序列具有Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7的通式，其中Z1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Z1，Z2和Z3代表编码Leu的两个三核苷酸，Z4和Z5代表编码任意两个氨基酸的两个三核苷酸，Z6代表编码Leu的三核苷酸，Z7代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Z7。
在本发明中，激素应被理解为意指内分泌系统的酰胺化多肽激素，特别是神经激素。
所述共有信号序列是成熟后由细胞分泌出来的蛋白质的前体所携带的序列。
最后，本发明涉及一组能构成组合文库的寡核苷酸OX或OZ。
在所述发明中，组合文库应理解为意指一组寡核苷酸，这些寡核苷酸是通过以编码氨基酸序列(可以改变其中的某些氨基酸)的核苷酸序列为模型合成的。由于遗传密码的简并性，这将获得一组不同的寡核苷酸。
本发明还涉及鉴定具有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，其特征在于具有以下步骤：
1-得到DNA文库；
2-将1或多个寡核苷酸OX与所述DNA文库杂交；
3-鉴定所述文库中能与寡核苷酸OX杂交的DNA序列；
4-在这个(些)序列中鉴定1或多个可能有酰胺化C-末端的肽。
优选那些DNA文库是cDNA文库的方法。
互补DNA(cDNA)是一种核苷酸链，该链序列与mRNA的序列互补，由逆转录酶催化的反应将形成单链cDNA。利用DNA聚合酶的作用能得到双链cDNA，然后可以借助连接酶将其插入质粒或来源于λ噬菌体的载体。
cDNA文库含有与提取自给定细胞的胞质mRNA对应的cDNA。如果对于每个起始mRNA，文库都包含至少一个细菌克隆，就认为该文库是完整的。
如果两个寡核苷酸具有实质上互补的核苷酸序列，它们就能发生杂交，并通过在互补碱基之间建立氢键而全长结合在一起。
特别优选的方法是可以借助标记试剂，比如32P或洋地黄毒苷来检测寡核苷酸OX的方法。
最常用的核苷酸放射标记试剂是发射β射线的元素，例如3H、12C、32P、33P和35S。
通过在寡核苷酸5’末端添加(γ-32P)-ATP携带的磷酸基团可以标记寡核苷酸，该反应由T4多核苷酸激酶催化。经洋地黄毒苷标记是免疫酶学方法，将洋地黄毒苷与氮碱基结合并掺入到寡核苷酸中。利用针对洋地黄毒苷并偶联了碱性磷酸酶的抗体可以显示它的存在。利用由碱性磷酸酶水解的底物显现的颜色揭示其存在情况。
其他可以采用的标记技术包括：经化学修饰而含有金属络合剂(经常使用镧系络合剂)的寡核苷酸，含有生物素或吖啶酯的基团，荧光化合物(荧光素、若丹明、德克萨斯红)或其他。
尤其优选在杂交步骤中使用寡核苷酸OX的组合文库的酰胺化多肽激素前体鉴定方法。
本发明还涉及用于鉴定带有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，包括以下步骤：
1-得到DNA文库；
2-利用PCR技术，借助一组寡核苷酸OX和另一组寡核苷酸OZ来扩增目的片段；
3-鉴定所述文库中能与寡核苷酸OX杂交并被PCR反应扩增的DNA序列；
4-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的1或多个肽。
目的片段应理解为意指编码1或多个酰胺化多肽激素的前体的cDNA序列。
经PCR(聚合酶链式反应)扩增DNA的反应需要将DNA制品于95℃加热变性。然后将该制品与过量的两个互补寡核苷酸在DNA相对链上，待扩增序列的两侧进行配对。每个寡核苷酸作为复制DNA各链的DNA聚合酶(提取自栖热水生菌型嗜热细菌：Taq聚合酶)的引物。通过连续的变性-退火可自动地重复该循环。
有大量文献详细地描述了PCR方案：美国专利4683192、4683202、4800159和4965188，“PCR技术：DNA扩增的原理和应用”，H.Erlich编，Stockton Press，New York(1989)以及“PCR方案：方法和应用指南”，Innis等编，Academic Press，San Diego，California(1990)。
优选地，所述DNA文库为cDNA文库。
更优选地，可以借助标记试剂(比如32P或洋地黄毒苷)来检测所述寡核苷酸OX。
尤其优选在扩增阶段使用寡核苷酸OX的组合文库和另一个寡核苷酸OZ的组合文库的酰胺化多肽激素前体鉴定方法。
本发明还涉及用于鉴定带有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，它包括以下步骤：
1-得到DNA文库；
2-利用PCR技术，借助一组寡核苷酸OX扩增目的片段；
3-鉴定所述文库中能与寡核苷酸OX杂交并被PCR反应扩增了的DNA序列；
4-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的1或多个肽。
该方法的目的是鉴定编码有一个以上酰胺化位点的前体的核苷酸序列。
优选地，所述DNA文库为cDNA文库。
更优选地，可以借助标记试剂(比如32P或洋地黄毒苷)来检测所述寡核苷酸OX。
尤其优选在扩增阶段使用寡核苷酸OX的组合文库的酰胺化多肽激素前体鉴定方法。
本发明另外建议的一种用于鉴定带有酰胺化C-末端的多肽的前体的方法，其特征在于有以下步骤：
1-得到DNA文库；
2-利用PCR技术，借助寡核苷酸OX和另一个能在温和或严谨条件下与质粒载体序列中所含普遍共有序列(比如引物T3、T7、KS、SK、M13及反向引物)进行杂交的单链寡核苷酸来扩增目的片段；该质粒载体中克隆了所述DNA文库的DNA；
3-鉴定所述文库中能与寡核苷酸OX杂交的DNA序列；
4-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的1或多个肽。
该普遍共有序列是克隆了文库DNA的载体所携带的序列。该序列可以作为测序的引物。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，“分子克隆，实验指南”(第二版，1989，Colel Spring HarborLaboratory Press)提供了这些引物的核苷酸序列。
PCR反应需要将两种寡核苷酸固定到载体中克隆的cDNA上以便进行扩增。在只有一个属于待扩增DNA片段的序列已知的情况下，解决这个问题的一种方法是利用能与克隆了cDNA的载体上的核苷酸序列(比如普遍共有序列)杂交的寡核苷酸。
优选地，所述DNA文库为cDNA文库。
优选可以借助标记试剂(比如32P或洋地黄毒苷)来检测的寡核苷酸OY。
尤其优选的是在扩增步骤使用寡核苷酸OX的组合文库。
实施例：
将其应用于一种已经分离的激素来验证本发明所述的方法。所选的神经激素是缩胆囊肽(CCK)，它是一种主要存在于大脑中的神经介质。
1.1由STRATAGENE(Lafolla.USA)的市售文库λZapp II(大鼠脑cDNA文库载体，ref.936 501)制备用于PCR反应的DNA基质。
这个Stratagene cDNA文库含有大鼠脑细胞cDNA克隆。
1.1.1.以Bluescript噬菌粒(Stratagene，Lafolla，USA)的形式释放克隆的cDNA。
按以下方案进行：将250μl cDNA文库(2.108PFU/ml)、200μl XL1Blue细菌(基因型：recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1lac[F’proAB lacIq ZΔM15 Tn10(Tetr)]c-参阅Bullock，Fernandez，Short，Biotechniques，5，376-379(1987)-600nm光密度：OD＝2.5)和1μl 1010PFU/ml噬菌体ExAssistTM(参阅Hay，B.，Short，J.，Strategies，5，16-18(1992))于37℃接触15分钟。然后将整个系统在50ml LB培养基(组成：每升无菌生理水中混有10g NaCl、5g酵母提取物和10g Bactotryptone)中于37℃边搅拌温育3小时。将培养物离心，并将上清液于70℃加热20分钟进行灭活。
1.1.2.制备双链质粒文库形式的cDNA。
这个步骤需将100μl灭活的上清液和200μl SOLRTM细菌(基因型：e14-(McrA-)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbcC recB recJ uvrCumuC∷Tn5(Kanr)lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1λR[F’proAB lacIqZΔM15]c Su-(未抑制)-参阅Hay，B.，Short，J.M.，Strategies，5(1)，16-18(1992)-600nm OD＝1)在37℃温育15分钟。加入50μl氨苄青霉素(100mg/ml)和50ml LB培养基后，将整个系统于37℃搅拌过夜培养。用QIAGEN Plasmid Midi Kit和QIAGEN的柱子(QIAGEN的柱子含表面带有正电的二乙氨基乙醇基团的阴离子交换树脂，该基团与DNA骨架的磷酸相互作用)从50ml培养物中制备质粒。这样得到了1.37μg/μl的DNA溶液。
1.2.由以上制备的质粒文库扩增CCK前体的一部分
1.2.1.确定PCR反应所需两个寡核苷酸的序列
两个寡核苷酸之一含有与编码CCK酰胺化位点(该位点是已知的，含有Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu)的序列互补的序列。这个寡核苷酸(它被称为oligo CCK amide)的核苷酸序列如下：
              5’CTCAGCACTGCGCCGGCC 3’
第二个寡核苷酸称为oligo CCK5’，对应于共有信号序列：
              5’GTGTGTCTGTGCGTGGTG 3’
预期扩增产物的大小为315个碱基对，这是CCK前体序列上与两个寡核苷酸对应的序列之间的距离。
1.2.2.PCR反应
制备含有1μl Taq聚合酶Goldstar 5U/μl(参阅Reynier，P.，Pellissier，J.F.，Harle，J.R.，Malthiery，Y.，生物化学和生物物理学研究通讯，205(1)，375-380(1994))，1μl浓缩10倍的标准聚合酶缓冲液和8μl水的稀释液D1。
将1μl 250ng/μl的oligo CCK5’、1μl 250ng/μl的oligo CCKamide、1μl各10mM的dNTP、1μl 250ng/μl的cDNA文库、5μl浓缩10倍的标准聚合酶缓冲液、2μl 25mM的MgCl2、1μl稀释液D1和37μl水混合。
扩增条件如下：热处理首先于95℃进行5分钟，然后重复30个循环。于95℃变性45秒，于60℃杂交30秒，于72℃延伸1分钟。最后，于72℃延伸10分钟进行一个附加循环。
1.2.3.结果
将1/10 PCR反应产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳来读取结果。在有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(溴乙啶)的情况下，显示出一条略大于分子量300的标记的明显条带。
1.3.将PCR产物亚克隆到能进行测序的载体中
所用载体为pGEM T-easy Vector(PROGEMA公司销售，Madison，USA，ref.A1380-序列见附录I)。步骤如下：
-经电洗脱纯化PCR产物对应的条带，
-与1μl 50ng/μl的载体pGEM T-easy和1μl浓缩10倍的连接酶缓冲液于16℃过夜连接，
-从纯化条带中提取到3μl产物，估计在20ng/μl，
-用水补至10μl。
预先用CaCl2使JM109细菌(基因型：e14-(McrA-)recA1 endA1gyrA96 thi-1hsdR17(rk-mk+)supE44 relA1Δ(lac-proAB)[F’traD36 proAB lacIq ZΔM15]-参阅Yanish-Perron，C.，Viera，J.，Messing，J.，基因33，103-199(1985))达到感受态，然后将1/5的连接产物于42℃热休克处理45秒进行转化。将细胞在培养皿内的LB-氨苄青霉素培养基上于37℃培养过夜。
制备一些重组克隆的质粒DNA。用EcoRI酶切来验证亚克隆。
1.4.测序
通过常规的SANGER双脱氧技术在载体pGEM T-easy上测序，该载体已整合了315个碱基对的PCR产物(用QIAGEN tip 100kit大量制备)。测序所用引物是位于pGEM T-easy载体质粒上的通用寡核苷酸T7。
1.5.结果
所得大概序列如下：
GTG TGT CTG TGC GTG GTG ATG GCA GTC CTG GCA GCA GGC GCC CTG
GCG CAG CCG GTA GTC CCT GTA GAA GCT GTG GAC CCT ATG GAG CAG
CGG GCG GAG GAG GCG CCC CGA AGG CAG CTG AGG GCT GTG CTC CGA
CCG GAC AGC GAG CCC CGA GCG CGC CTG GGC GCA CTG CTA GCC CGA
TAC ATC CAG CAG GTC CGC AAA GCT CCC TCT GGC CGC ATG TCC GTT
CTT AAG AAC CTG CAG GGC CTG GAC CCT AGC CAC AGG ATA AGT GAC
CGG GAC TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTC GGC CGG CGC AGT GCT GAG
将所得序列翻译得到以下氨基酸序列：
   VCLCVV     MAVLAAGALA    QPVVPEAVD     PMEQRAEEAP
RRQLRAVLRP    DSEPRARLGA    LLARYIQQVR    KAPSGRMSVL
KNLQGLDPSH    RISDRDYMGW    MDFGRRSAE
这使得能很容易地发现CCK前体的核苷酸序列(该序列由Swissdatabank prot.no.p01355提供)。
氨基酸的缩写如下：丙氨酸               A                亮氨酸         L精氨酸               R                赖氨酸         K天冬氨酸             D                甲硫氨酸       M天冬酰胺             N                苯丙氨酸       F半胱氨酸             C                脯氨酸         P谷氨酸               E                丝氨酸         S谷氨酰胺             Q                苏氨酸         T甘氨酸               G                色氨酸         W组氨酸               H                酪氨酸         Y异亮氨酸             I                缬氨酸         V
                  附录1
          pGEM-T Easy载体质粒序列
下面给出了pGEM-T Easy载体质粒序列，用EcoRV在该序列中第60位碱基处(星号表示)线性化。向2个3’末端加入T。所添加的T不包括在以下序列中。下面的序列对应于由T7 RNA聚合酶合成的RNA，与由SP6 RNA聚合酶合成的RNA互补。1  GGGCGAATTG  GGCCCGACGT  CGCATGCTCC  CGGCCGCCAT  GGCGGCCGCG51  GGAATTCGAT*ATCACTAGTG  AATTCGCGGC  CGCCTGCAGG  TCGACCATAT101  GGGAGAGCTC  CCAACGCGTT  GGATGCATAG  CTTGAGTATT  CTATAGTGTC151  ACCTAAATAG  CTTGGCGTAA  TCATGGTCAT  AGCTGTTTCC  TGTGTGAAAT201  TGTTATCCGC  TCACAATTCC  ACACAACATA  CGAGCCGGAA  GCATAAAGTG251  TAAAGCCTGG  GGTGCCTAAT  GAGTGAGCTA  ACTCACATTA  ATTGCGTTGC301  GCTCACTGCC  CGCTTTCCAG  TCGGGAAACC  TGTCGTGCCA  GCTGCATTAA351  TGAATCGGCC  AACGCGCGGG  GAGAGGCGGT  TTGCGTATTG  GGCGCTCTTC401  CGCTTCCTCG  CTCACTGACT  CGCTGCGCTC  GGTCGTTCGG  CTGCGGCGAG451  CGGTATCAGC  TCACTCAAAG  GCGGTAATAC  GGTTATCCAC  AGAATCAGGG501  GATAACGCAG  GAAAGAACAT  GTGAGCAAAA  GGCCAGCAAA  AGGCCAGGAA551  CCGTAAAAAG  GCCGCGTTGC  TGGCGTTTTT  CCATAGGCTC  CGCCCCCCTG601  ACGAGCATCA  CAAAAATCGA  CGCTCAAGTC  AGAGGTGGCG  AAACCCGACA 651  GGACTATAAA  GATACCAGGC  GTTTCCCCCT  GGAAGCTCCC  TCGTGCGCTC701  TCCTGTTCCG  ACCCTGCCGC  TTACCGGATA  CCTGTCCGCC  TTTCTCCCTT751  CGGGAAGCGT  GGCGCTTTCT  CATAGCTCAC  GCTGTAGGTA  TCTCAGTTCG801  GTGTAGGTCG  TTCGCTCCAA  GCTGGGCTGT  GTGCACGAAC  CCCCCGTTCA851  GCCCGACCGC  TGCGCCTTAT  CCGGTAACTA  TCGTCTTGAG  TCCAACCCGG901  TAAGACACGA  CTTATCGCCA  CTGGCAGCAG  CCACTGGTAA  CAGGATTAGC951  AGAGCGAGGT  ATGTAGGCGG  TGCTACAGAG  TTCTTGAAGT  GGTGGCCTAA1001  CTACGGCTAC  ACTAGAAGGA  CAGTATTTGG  TATCTGCGCT  CTGCTGAAGC1051  CAGTTACCTT  CGGAAAAAGA  GTTGGTAGCT  CTTGATCCGG  CAAACAAACC1101  ACCGCTGGTA  GCGGTGGTTT  TTTTGTTTGC  AAGCAGCAGA  TTACGCGCAG1151  AAAAAAAGGA  TCTCAAGAAG  ATCCTTTGAT  CTTTTCTACG  GGGTCTGACG1201  CTCAGTGGAA  CGAAAACTCA  CGTTAAGGGA  TTTTGGTCAT  GAGATTATCA1251  AAAAGGATCT  TCACCTAGAT  CCTTTTAAAT  TAAAAATGAA  GTTTTAAATC1301  AATCTAAAGT  ATATATGAGT  AAACTTGGTC  TGACAGTTAC  CAATGCTTAA1351  TCAGTGAGGC  ACCTATCTCA  GCGATCTGTC  TATTTCGTTC  ATCCATAGTT1401  GCCTGACTCC  CCGTCGTGTA  GATAACTACG  ATACGGGAGG  GCTTACCATC1451  TGGCCCCAGT  GCTGCAATGA  TACCGCGAGA  CCCACGCTCA  CCGGCTCCAG1501  ATTTATCAGC  AATAAACCAG  CCAGCCGGAA  GGGCCGAGCG  CAGAAGTGGT1551  CCTGCAACTT  TATCCGCCTC  CATCCAGTCT  ATTAATTGTT  GCCGGGAAGC1601  TAGAGTAAGT  AGTTCGCCAG  TTAATAGTTT  GCGCAACGTT  GTTGGCATTG1651  CTACAGGCAT  CGTGGTGTCA  CGCTCGTCGT  TTGGTATGGC  TTCATTCAGC1701  TCCGGTTCCC  AACGATCAAG  GCGAGTTACA  TGATCCCCCA  TGTTGTGCAA1751  AAAAGCGGTT  AGCTCCTTCG  GTCCTCCGAT  CGTTGTCAGA  AGTAAGTTGG1801  CCGCAGTGTT  ATCACTCATG  GTTATGGCAG  CACTGCATAA  TTCTCTTACT1851  GTCATGCCAT  CCGTAAGATG  CTTTTCTGTG  ACTGGTGAGT  ACTCAACCAA1901  GTCATTCTGA  GAATAGTGTA  TGCGGCGACC  GAGTTGCTCT  TGCCCGGCGT1951  CAATACGGGA  TAATACCGCG  CCACATAGCA  GAACTTTAAA  AGTGCTCATC2001  ATTGGAAAAC  GTTCTTCGGG  GCGAAAACTC  TCAAGGATCT  TACCGCTGTT2051  GAGATCCAGT  TCGATGTAAC  CCACTCGTGC  ACCCAACTGA  TCTTCAGCAT2101  CTTTTACTTT  CACCAGCGTT  TCTGGGTGAG  CAAAAACAGG  AAGGCAAAAT2151  GCCGCAAAAA  AGGGAATAAG  GGCGACACGG  AAATGTTGAA  TACTCATACT2201  CTTCCTTTTT  CAATATTATT  GAAGCATTTA  TCAGGGTTAT  TGTCTCATGA2251  GCGGATACAT  ATTTGAATGT  ATTTAGAAAA  ATAAACAAAT  AGGGGTTCCG2301  CGCACATTTC  CCCGAAAAGT  GCCACCTGTA  TGCGGTGTGA  AATACCGCAC2351  AGATGCGTAA  GGAGAAAATA  CCGCATCAGG  CGAAATTGTA  AACGTTAATA2401  TTTTGTTAAA  ATTCGCGTTA  AATATTTGTT  AAATCAGCTC  ATTTTTTAAC2451  CAATAGGCCG  AAATCGGCAA  AATCCCTTAT  AAATCAAAAG  AATAGACCGA2501  GATAGGGTTG  AGTGTTGTTC  CAGTTTGGAA  CAAGAGTCCA  CTATTAAAGA2551  ACGTGGACTC  CAACGTCAAA  GGGCGAAAAA  CCGTCTATCA  GGGCGATGGC2601  CCACTACGTG  AACCATCACC  CAAATCAAGT  TTTTTGCGGT  CGAGGTGCCG2651  TAAAGCTCTA  AATCGGAACC  CTAAAGGGAG  CCCCCGATTT  AGAGCTTGAC2701  GGGGAAAGCC  GGCGAACGTG  GCGAGAAAGG  AAGGGAAGAA  AGCGAAAGGA2751  GCGGGCGCTA  GGGCGCTGGC  AAGTGTAGCG  GTCACGCTGC  GCGTAACCAC2801  CACACCCGCC  GCGCTTAATG  CGCCGCTACA  GGGCGCGTCC  ATTCGCCATT2851  CAGGCTGCGC  AACTGTTGGG  AAGGGCGATC  GGTGCGGGCC  TCTTCGCTAT2901  TACGCCAGCT  GGCGAAAGGG  GGATGTGCTG  CAAGGCGATT  AAGTTGGGTA2951  ACGCCAGGGT  TTTCCCAGTC  ACGACGTTGT  AAAACGACGG  CCAGTGAATT3001  GTAATACGAC  TCACTATA

Claims (25)

1.单链寡核苷酸OX，其特征在于含有9到42个核苷酸，并能在温和的条件下与序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自独立地代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。
2.权利要求1的寡核苷酸OX，其特征在于含有9到42个核苷酸，并能在严谨条件下与序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自独立代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。
3.权利要求1或2的寡核苷酸OX，其特征在于寡核苷酸OY中没有Y1。
4.权利要求1、2或3的寡核苷酸OX，其特征在于寡核苷酸OY中没有Y5。
5.权利要求1、2或3的寡核苷酸OX，其特征在于，OY中的Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。
6.权利要求5的寡核苷酸OX，其特征在于OY中没有Y1和Y9。
7.权利要求6的寡核苷酸OX，其特征在于能与所述寡核苷酸OY杂交，其中Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸的序列。
8.单链寡核苷酸OY，其特征在于含有9到42个核苷酸，序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自独立地代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。
9.权利要求8的寡核苷酸OY，其特征在于没有Y1。
10.权利要求8或9的寡核苷酸OY，其特征在于没有Y5。
11.权利要求8或9的寡核苷酸OY，其特征在于Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。
12.权利要求11的寡核苷酸OY，其特征在于没有Y1和Y9。
13.权利要求12的寡核苷酸OY，其特征在于Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸的序列。
14.单链寡核苷酸OZ，其特征在于含有15到39个核苷酸，并能与酰胺化多肽激素所特有的共有信号序列在温和或严谨条件下杂交，其中所述序列具有Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7的通式，其中Z1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Z1，Z2和Z3代表编码Leu的两个三核苷酸，Z4和Z5代表编码任意氨基酸的两个三核苷酸，Z6代表编码Leu的三核苷酸，Z7代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Z7。
15.权利要求1到7中任何一项所述寡核苷酸OX或权利要求14所述寡核苷酸OZ的组，其特征在于构成一个组合文库。
16.鉴定具有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，其特征在于具有以下步骤：
-获得DNA文库；
-将权利要求1到7中任何一项的1或多个寡核苷酸与所述DNA文库杂交；
-鉴定所述文库中与权利要求1到7中任何一项的寡核苷酸杂交的DNA序列；
-在这个(些)序列中鉴定可能有酰胺化C-末端的肽的1或多个前体。
17.权利要求16的方法，其特征在于杂交步骤中使用了权利要求15所述的组合文库。
18.鉴定具有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，其特征在于具有以下步骤：
-得到DNA文库；
-利用PCR技术，借助权利要求1到7中任何一项所述的一组寡核苷酸和权利要求14所述的另一组寡核苷酸来扩增目的片段；
-鉴定所述文库中能与权利要求1到7中任何一项的寡核苷酸杂交的DNA序列；
-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的肽的1或多个前体。
19.权利要求18的方法，其特征在于扩增步骤中使用了权利要求15所述的组合文库。
20.用于鉴定带有酰胺化C-末端的肽的前体的方法，其特征在于包括以下步骤：
-得到DNA文库；
-利用PCR技术，借助权利要求1到7中任何一项所述的一组寡核苷酸来扩增目的片段；
-鉴定所述文库中能与权利要求1到7中任何一项所述寡核苷酸杂交的DNA序列；
-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的肽的1或多个前体。
21.权利要求20的方法，其特征在于扩增步骤中使用了权利要求15所述的组合文库。
22.用于鉴定带有酰胺化C-末端的多肽的前体的方法，其特征在于包括以下步骤：
-得到DNA文库；
-利用PCR技术，借助权利要求1到7中任何一项所述的寡核苷酸和能在温和或严谨条件下与质粒载体序列中所含的普遍共有序列，比如引物T3、T7、KS、SK、M13及反向引物，杂交的另一种单链寡核苷酸来扩增目的片段；其中所述质粒载体中克隆了所述DNA文库的cDNA；
-鉴定所述文库中能与权利要求1到7中任何一项所述寡核苷酸杂交的DNA序列；
-鉴定该序列中可能有酰胺化C-末端的肽的1或多个前体。
23.权利要求22的方法，其特征在于扩增步骤中使用了权利要求15所述的组合文库。
24.权利要求16到23中任何一项所述的方法，其特征在于DNA文库为cDNA文库。
25.权利要求16到24中任何一项所述的方法，其特征在于可以借助标记试剂，比如32P或洋地黄毒苷来检测单链寡核苷酸。
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